western blot 实验技术

Western blot 实验技术

#

• Western 免疫印迹（ Western Blot ）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

• Western 实验是一项连贯的有多个步骤的实验技术，在实验过程中会遇到很多的问题，每一个环节出现问题都可能导致最后结果的失败。

#

蛋白提取SDS 凝胶配制电泳电转封闭及一抗显色

实验流程√

#

蛋白提取稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂

变性裂解液变性裂解液

非变性裂解液非变性裂解液

#

细胞和组织的处理•问题一 . RIPA 裂解液裂解细胞，离心后，还有很多粘稠物质？

RIPA 裂解细胞后的粘稠物质主要是 DNA ， 10000rpm 以上离心五分钟就可以沉淀，取上清液。如果一次离心后还有粘稠可重复一次。

#

细胞和组织的处理• 问题二 . 组织应该如何裂解最合适？1 、对于有韧性的组织比如血管，神经等，

不能选用玻璃匀浆器，可以选择手动匀浆器和液氮研磨

2 、对于一般较柔软的组织比如脑，肝脏等，使用上述三种方法均可。

#

细胞和组织的处理• 问题三 . 液氮研磨后离心样本不能分层•研磨的时候不充分，会形成絮状的液态物质，如有手动匀浆器可以再进行处理

注意：•裂解时抑制剂的添加非常重要，做一般的蛋白加入 PMSF 即可，个别蛋白需要加 ApAprotininrotinin ，， Leupeptin Leupeptin ，做磷酸化的蛋，做磷酸化的蛋白需要加入磷酸酶抑制剂（白需要加入磷酸酶抑制剂（ cocktailcocktail ））

#

细胞和组织的处理• 问题四 . 提取的蛋白样本如何保存最合适？解答：温度越低越好 1 、液氮 2 、 -80 度冰箱 3 、 -30 度冰箱 4 、加入 loading buffer 煮后保存于 -20

度。

#


实验流程

√

#

SDS － PAGE 电泳

• （ 1 ）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗

• 过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。• （ 2 ）灌胶与上样• 1 、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。• 2 、按前面方法配 10 ％分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。然后胶

上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面• 快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才• 不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）• 3 、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固• 就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。• 4 、按前面方法配 5 ％的浓缩胶 , 加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余

空间• 灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免• 胶中有气泡产生。 TEMED 原溶液 N ， N ， N’N’ 四甲基乙二胺催

化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

#

• 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）

#

SDS 凝胶配制• 问题一 . 胶凝的效果不好是什么原因？ 1 、 AP 时间过长，重新配制 AP 2 、可以适当多加入 TEMED 3 、室温低 4 、混合不均匀

#

SDS 凝胶配制

问题二、丙烯酰胺母液可以储存多久？1、丙烯酰胺隔月重新配制2、配制完分离胶要覆盖一层 0.01% 的 SDS溶液，防止表面与空气接触。如果加一层水也可以，但由于水具有表面张力，会使胶不平。

#


实验流程

√

#

电泳• 电泳时间一般 2 ～ 3 h ，电压为根据分

子量需要，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

#

电泳• 问题一 . 如果所做蛋白分子量很大，比如

220KD ，大分子的 Marker 跑不下去，怎么办？小分子量的蛋白如 10KD 左右应该注意什么？

大分子：使劲跑；小分子：谨慎跑

#

电泳• 问题二 . 跑电泳的时候配的胶总是“缩”

是什么原因呢？是有的成分不对吗？胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。

也可能母液（ 30% 聚丙烯酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察

#

电泳• 问题三 . 怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和

band 都能很直，是不是上样的量很重要，灌胶有什么技巧吗？想跑漂亮，是不是应该先小电压，再高电压 ?

影响跑胶跑的质量，有以下几个因素： 1 、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶 80v ，分离胶 100v 就能跑得很好。

2 、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。

#

电泳

• 问题四：电泳时上样量应为多少？这个没有确切的定值，一般来说 20 微克就可以，但是如果你的样品中目的蛋白含量很少，可以加大上样量到 60 微克甚至更高（进行预实验）

#


实验流程

√

#

电转•问题一 .电转选择什么样的膜最好？ PVDF 膜价格较贵，可重复使用，特别

适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。

NC 膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如 PVDF ，不能重复使用。

#

•膜的选择还要考虑到目的蛋白分子量的大小，如果目的蛋白分子量为 20KD 以下，最好用 0.22 微米的膜，大于 20KD 可以选择 0.45 微米的膜。

电转

#

电转• 问题二 .电转时膜、滤纸、胶大小有何讲究？

如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小 1－ 2mm，而膜的长宽分别比胶大 1－ 2mm。

绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

#

电转• 问题三 . 不能很好地将大分子量蛋白转移到

膜上，转移效率低怎么样解决？　　可以考虑：转移缓冲液中加入 20% 甲醇，因为甲醇可增加蛋白质和膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间

转移缓冲液加入终浓度 0.1%SDS ，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的膜（ 0.2微米）

#


实验流程

√

#

封闭及一抗•问题一 .封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在 4度下 ?

均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后 4度过夜。

#

封闭及一抗•问题二 .一抗的浓度为多少合适？

不同的抗体效价是不一样的，一些好的公司的抗体可以稀释到 1： 1000或更多，一般的抗体稀释比例为 1： 200——1： 500,如果低于这样的稀释比例，说明抗体质量太差。

#

封闭及一抗•问题三 .洗脱的时候用 PBST 还是 TBST ，也有人用 PBS 和 TBS ，到底用那个合适？

都可以，最好用加 tween-20 的缓冲液，也就是 PBST 和 TBST 。

#

封闭及一抗•问题四 . 封闭液的选择有什么区别吗？

一般用 BSA或者脱脂奶粉脱脂奶粉封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋白则用 BSA （因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会形成干扰）

#


实验流程

√

#

显色•问题一 .发光液用 DAB显色好还是用 ECL 好？

一般的说， ECL 比 DAB更灵敏，从实验的结果来看，个人认为 ECL更好一些。（选择进口发光液）

#

显色•问题二 .加上 ECL 发光液能看到很亮的条带，而放入显影液和定影液洗完后，却发现条带很模糊，这是为什么？

显影液使用次数太多，已经失效。更换新的显影液。显影液在使用数次后会发黄，这时要及时更换。而定影液只要是清亮的就可以一直用。（注意避光保存）

#

显色•问题三 .背景很脏是什么原因？1.没有洗干净（使用 PBST或者 TBST ）2. 一抗浓度过大，可以降低一抗浓度3. 二抗浓度过大4. 封闭时间短5. 抗体稀释液效果不好

#

显色•问题四 .同一张膜如何进行蛋白的反复检测？

使用膜修复液洗 15-30 分钟，再用 PBST或 TBST洗 3×10min 。然后再封闭，加一抗。一般每张膜可以反复检测 4-5次。

#

显色• NC膜是通过疏水作用来和蛋白质相连，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。

• PVDF 膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，虽然也有疏水作用，但相对较弱。这样的话， PVDF 膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

#


实验流程

#

[email protected] [email protected]

电话： 0311-87881081-812

http://www.bhsw.net.cn/

western blot 实验技术

Documents