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实验 19

Northern blotNorthern blot

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目 的目 的1 ．定量分析某一特定基因 mRNA 的转录转录与否，

以及转录的水平水平。2 ．比较两个或两个以上不同组织某一已知基因已知基因转

录的差异。3 ．比较两个或两个以上不同组织某一未知基因未知基因转

录的差异。

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由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多年来一直深受广大研究者的喜爱。其结果可以同时反映某一特定基因 RNA 分子量的大小及其数量。在中医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。例如我们的 GnRH 、 N-ras 、白蛋白等研究。

通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平的和核酸水平的。两者的含量变化均与其生成、代谢有关，而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等因素，这些变化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的，所以对 Northern blot 的结果要有客观的分析。

类似的实验主要为 RT-PCRRT-PCR 。

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原 理原 理采用变性凝胶电泳，使 RNA 分子由小到大排列于

凝胶之中。应用虹吸原理，将 RNA 转移至硝酸纤维素膜，烘干，使 RNA 牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，将硝酸纤维素膜放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量 mRNA 的条带。最后，对条带进行光密度扫描，并统计分析。

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实验准备实验准备（参考教材）

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实验步骤实验步骤11 ．． RNARNA 电泳电泳取 10ug RNA 旋转真空干燥，溶于 20ul 新配的样

品缓冲液。置样品于 65℃水浴中 5 分钟，迅速移入冰中冷却，再加 4ul 上样缓冲液，混匀。移胶至电泳槽内，注入电泳缓冲液 1×MOPS ，浸没凝胶，轻轻拔去疏子。接通电源，负极靠近上样孔。吸取样品 24ul ，注入上样孔内。开启电源，电压调至 100V 。电泳约 2小时，至溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。

轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查电泳结果。在凝胶一侧放把尺尺，拍照拍照。

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22 ．． RNARNA 转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜取一洁净的容器，注入 20×SSC ，容器上缘架一

水平玻璃板。取 2～ 4 层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以经玻璃板两侧浸入 20×SSC 中。待滤纸全都湿透后，滚动移液管赶走滤纸间及其与玻璃板间的气泡气泡。切去凝胶上样孔及以上部分，在凝胶第一上样孔处切去一小角，作为记号，把凝胶底朝上放于滤纸上，用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤维素膜裁成凝胶大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸水中，再浸于 20×SSC 中，取出平放于凝胶之上，缺角处与凝胶缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气泡。膜上置 2～ 4 层 20×SSC 浸湿的滤纸，用移液管赶走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡。

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用 4张保鲜膜保鲜膜沿凝胶 4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路虹吸短路，以及容器内的缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方，铺 4～ 6厘米厚的卫生纸，上置一平玻板，玻板上压一 300300 ～～ 500500 克克的重物。过夜。

次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在透射紫外灯仪上确认 RNA 已全部转移至硝酸纤维素膜上。把该膜夹于两张洁净的滤纸间，在 80℃真空干燥箱中真空干燥两小时。

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33 ．探针标记．探针标记（此工作与膜转移于同一天进行）水 14 ulOLB 5 ulBSA （ 10mg/ml ） 1 ulDNA （ 30～ 50 ng ） 2 ul100 ×5min, 37 ×10min, 4 ×5min℃ ℃ ℃α[32P]dCTP （ 50uCi ） 2.5 ul大肠杆菌聚合酶 K 片段 0.5 ul混匀， 4 ℃ 过夜，次日再加：大肠杆菌聚合酶 K 片段 0.5 ul半小时后加入终止液 50 ul

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44 ．离心柱分离探针．离心柱分离探针（（ 11 ）柱的）柱的制备制备取消毒过的蓝吸头，用小玻璃珠或玻璃纤维放入

吸头，堵住出口，将混匀的 Sephadex G50 （中号）移入吸头至满。取 1.5ml Eppendorf管，剪去盖，放入 10ml 离心管中。将蓝吸头插入 Eppendorf管，可自制一套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部，以保证吸头尖距 1.5ml管底部约 1～ 2厘米。 1600×g 离心 4 分钟，弃去 1.5ml管中的 TE 液，再用 100ul TE 液加入小柱，离心，如此反复两次平衡柱子。

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（（ 22 ）分离）分离用镊子取出原 1.5ml管，取一新的 1.5ml管放入 1

0ml 离心管，插上平衡过的小柱。将标记的探针液，加入小柱， 1600×g 离心 4 分钟，小心取出 1.5ml管，将分离的到的探针移入一标签过的 1.5ml管，盖紧盖子。

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55 ．探针变性．探针变性将含探针的 1.5ml管置于沸水中 5 分钟变性变性，迅速迅速

移入冰中冷却冰中冷却。66 ．杂交．杂交将硝酸纤维素膜在 2×SSC 中浸湿，以防碎裂，然

后放入杂交袋中，四周封口，剪去一角注入 10毫升预杂交液，挤去气泡，封口，置此袋于 40℃水浴摇床中摇晃预杂交 1 小时以上。取出袋，拭干，剪去一角，将变性了的探针加入，挤去气泡，封口。为防止含同位素的探针泄漏，外再封一杂交袋。置此袋于 40℃水浴摇床中摇晃杂交过夜。

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77 ．洗膜．洗膜取出袋，拭干，剪去一角，将杂交液注入 50ml管

中，存于 4℃冰箱，以备再用。剪去袋的四周，置此袋于 2×SSC/0.1％ SDS 液中，取出膜，晃洗于此液。移膜入新的 2×SSC/0.1％ SDS 液中，于 50℃中晃洗半小时，如此重复一次。

88 ．曝光．曝光取上膜封于杂交袋中。在暗室中打开片盒，放 X

光胶片于增感屏上，再放上膜，盖上盒，将片盒存于 -70℃冰箱中。一天后冲片，视显影强弱，缩短或延长曝光时间。

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实验结果实验结果1 ．电泳后，凝胶在紫外透射反射分析仪上可清楚

地见到 18S 、 28S 两条明显的橘红条带，以及前后不等强度的橘红显色。

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2 ． X 光胶片上可见杂交带。杂交背景低。3 ．如果比较不同样品的话，可能会见到在同一分

子量的区域见有曝光深浅不等的杂交带，为了准确定量，可以借助于激光光密度计扫描分析。

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注意事项注意事项1 ．本方法采用同位素标记，整个实验过程中务须

严格遵守同位素同位素操作规则，注意安全。2 ．实验过程中，由于 RNA容易被 RNA酶降解，

因此，要注意无菌操作，以防 RNA酶污染。3 ．硝酸纤维素膜在剪取等操作过程中，不要被污

染与破碎，更不能直接用手拿，而应用扁平摄子小心摄取。

4 ．在使用虹吸法将 RNA 转移至硝酸纤维素膜上时，要注意将气泡排除干净，并且用保鲜膜封好凝胶四周，以免形成短路，使转移失败，这样的事例不少见。

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5 ．含有 RNA 的硝酸纤维素膜 80℃干燥后，如果实验必须中断，可将硝酸纤维素膜用保鲜袋包好，保存于 -20℃冰箱中。

6 ．如果作某一基因表达的半定量分析，可以同时或分别与内参基因探针杂交，以明确不同样本的上样量是否一致。方法是将目的基因光密度与内参基因光密度的比值作为半定量参数，进行统计分析。

7 ．硝酸纤维素膜洗去探针后可用于新探针的杂交。洗去探针的方法如下：把硝酸纤维素膜置于 70℃的 0.1×SSC/0.1％ SDS

中晃洗 20 分钟，弃去此液，如此条件洗 3 次。通常一张膜可以反复杂交 3 次以上。

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8 ．用于 Northern blot 实验中固定 RNA 的材料主要有硝酸纤维素膜与尼龙膜。其中硝酸纤维素膜具有成本低、杂交信号本底较低等优点；同时，也有对结合力不够强、重复使用的次数不多等缺点。而尼龙膜具结合力强、可反复使用等优点；却有成本高、杂交信号高等缺点。可以根据实验室的具体情况和经验选用。

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9 ．用于核酸杂交的分子探针有 DNA 探针、 cDNA 探针、 RNA 探针以及人工合成的寡核苷酸探针等多种。 Northern blot技术最合适的探针为 cDNA 探针。如果选用基因组 DNA 探针时，要尽可能使用基因的编码序列（外显子部分）作为探针，而避免使用内含子及其它非编码序列，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性结果。 RNA 探针因为操作不方便，常不被采用。寡核苷酸探针较适合于基因点突变分析，但是由于这类探针分子量小，标记后不容易纯化，往往给实验带来困难。

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10 ．用于核酸杂交的分子探针的标记物标记物有同位素、生物素、地高辛、荧光素等。其中，同位素是目前国内外研究中应用最多的一类探针标记物，因其具有灵敏度高、特异性强、杂交本底低等优点。而且，其曝光时间可以随意调节，以获得最佳曝光效果；实验结束，膜经洗脱后可以反复使用多次，这也是其优点。

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11 ．探针的同位素标记方法有多种，其中缺口平缺口平移移法与随机引物随机引物法最为常用。采用缺口平移法标记同位素时，使用的标记物应在脱氧核三磷酸的 α-磷酸位上；所使用的 DNase I 浓度一定要适当，过高则导致缺口过多，从而使探针长度过短，过低则不足以形成足量的缺口，从而使标记效率下降；反应温度一定要控制在 14～ 16℃之间；另外，单链 DNA 和 RNA 不能采用此方法进行标记。随机引物法除能进行双链 DNA 标记外，也可用于单链 DNA 和 RNA 探针的标记。此法操作方便，标记活性高，因而为多数实验室所采纳。目前已经有许多种探针标记的试剂盒，可以方便的择用。

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