1

BIOFIZYKA

Wydział Biologii III rok: „Biotechnologia”

PLAN WYKŁADU

1. Fizyczne podstawy struktur cząsteczek oraz oddziaływań wewnątrz- i między-

cząsteczkowych (2 wykłady)

(a) energia cząsteczki; przybliżenie pola siłowego dla dużych biomolekuł

(b) parametry termodynamiczne układu cząsteczek w roztworze (energia swobodna

Gibbsa)

(c) struktura przestrzenna (konformacja) cząsteczki i oddziaływania stabilizujące

(wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe, oddziaływania warstwowe i

kation-)

(d) specyficzność wzajemnego rozpoznawania biomolekuł (komplementarność zasad,

wzajemne dopasowanie konformacyjne – „induced fit”).

2. Metody badania struktur i dynamiki białek i kwasów nukleinowych (4 wykłady)

(a) rozdział na podstawie różnic masy cząsteczkowej (ultrawirowanie, elektroforeza)

(b) spektrometria masowa (MS)

(c) spektroskopia molekularna ze szczególnym uwzględnieniem magnetycznego

rezonansu jądrowego (wielowymiarowy NMR, in vivo NMR, nieinwazyjne

obrazowanie MRI)

(d) dyfracja promieniowania rentgenowskiego na monokryształach (rentgenografia)

(e) mikroskopia sił atomowych (AFM)

(f) symulacje komputerowe dynamiki molekularnej (MD).

3. Budowa kwasów nukleinowych DNA i RNA (3 wykłady)

(a) struktura pierwszorzędowa – sekwencjonowanie

(b) struktury wyższorzędowe: drugorzędowe struktury helikalne i niehelikalne,

pseudowęzeł RNA, motyw A-minor, struktura tRNA

(c) modyfikacje DNA przez działanie czynników mutagennych.

4. Budowa białek globularnych, włóknistych i błonowych (3 wykłady)

(a) struktura pierwszorzędowa - sekwencjonowanie

(b) struktury wyższorzędowe: wykres Ramachandrana, domeny, podjednostki

(c) zwijanie białek (protein folding): komputerowe, in vitro, in vivo

5. Specyficzne oddziaływania międzycząsteczkowe z udziałem białek i kwasów

nukleinowych: enzym-ligand i zastosowania w projektowaniu leków, czynniki

interkalujące; aptamery; kompleksy białko-kwas nukleinowy, mikromacierze (2

wykłady)

LITERATURA

"Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów" pod red. M. Bryszewskiej i W. Leyko,

PWN Warszawa 2000.

S. Doonan „Białka i peptydy” PWN 2008

W. Saenger "Principles of nucleic acid structures"

T.E. Creighton "Proteins. Structures and molecular properies"

2

Wykład 1

Wstęp. Wykład BIOFIZYKA (PLANSZA 1) będzie obejmował zagadnienia

(PLANSZA 2) struktury, dynamiki i oddziaływań dwóch typów biopolimerów,

kwasów nukleinowych i białek, o fundamentalnym znaczeniu w funkcjonowaniu,

budowie i podziale komórki, oraz najważniejsze, biofizyczne techniki badania tych

zagadnień. Nie będą omawiane szczegółowo równie (oczywiście !) ważne ale bardziej

wyspecjalizowane biopolimery jak lipidy, składniki błon biologicznych (krótka

charakterystyka przy okazji omawiania błon) i polisacharydy pełniące funkcje materiału

zapasowego i budulcowego. Omówię także niektóre przykłady praktycznego

zastosowania osiągnięć biofizyki molekularnej w naukach medycznych. Plansze i tekst

wykładu: www.biogeo.uw.edu.pl/biofizyka_biologia (PLANSZA 1); dwa podstawowe

podręczniki: (PLANSZA 2; plus zaawansowane monografie w języku angielskim).

Kwasy nukleinowe i białka odgrywają kluczową rolę w procesie ekspresji genów,

czyli przekazywaniu informacji genetycznej z kwasu deoksyrybonukleinowego DNA do

funkcjonalnych cząsteczek białek i kwasów rybonukleinowych RNA (PLANSZA 3):

- kwasy nukleinowe DNA (genom): nośniki informacji genetycznej o budowie,

funkcjonowaniu i podziale komórkowym;

- kwasy nukleinowe RNA (transkryptom): bezpośrednie „robocze” kopie informacji

genetycznej, składniki struktur komórkowych, cząsteczki o funkcjach regulatorowych;

- peptydy i białka (proteom): wielofunkcyjne polimery decydujące o „materiałowych”

podstawach zachodzenia procesów biologicznych oraz ich regulacji.

Kompleksowe podejście do wymienionych zagadnień jest rozwijane w ramach

nowopowstałych dziedzin na styku biologii i biofizyki molekularnej: genomiki,

transkryptomiki, proteomiki i metabolomiki.

Założenie metodologiczne (paradygmat), które warunkuje przyjęte powszechnie

ujęcie zagadnienia roli biopolimerów, polega na przypisaniu ich szeroko rozumianej

strukturze na poziomie molekularnym zasadniczego znaczenia w określaniu mechanizmów

ich biologicznego funkcjonowania w żywej komórce, co określa się terminem SAR

(structure - activity relationship). Struktury chemiczne oraz przestrzenne biomolekuł i

dynamika ich ruchów molekularnych oraz przekształceń strukturalnych warunkują

zdolność do tworzenia funkcjonalnych kompleksów molekularnych o różnym stopniu

złożoności (PLANSZA 4). Wzajemne specyficzne rozpoznawanie biomolekuł

wchodzących w kompleksy jest niezbędne dla zachodzenia skoordynowanych, podległych

3

regulacji, wspólnych działań biomolekuł w procesach biochemicznych. Współczesne

metody strukturalne, głównie rentgenografia, pozwalają określać z rozdzielczością

atomową struktury kompleksów i fragmentów subkomórkowych o masie cząsteczkowej ~3

mln jednostek masy atomowej (Da): rybosom bakteryjny (2,7 mln Da) i rybosom

eukariotyczny drożdżowy (3,3 mln Da; Ben-Shem et al. Science 330, 1203, 2010).

Funkcjonalna analiza biopolimerów w ujęciu SAR wykroczyła w przypadku białek

i kwasów nukleinowych (PLANSZA 3) poza ramy badań ściśle podstawowych w

kierunku masowej („przemysłowej”) analizy wszystkich białek kodowanych przez coraz

szybciej sekwencjonowane genomy. W 2000 r. określono sekwencję genomu ludzkiego

6 x 109 par zasad (bp) i genomów szeregu innych organizmów, co stanowi jedno z

podstawowych zadań genomiki. Z kolei proteomika jako zasadniczy cel stawia pełne

scharakteryzowanie proteomu, czyli w przypadku człowieka charakterystyka ok. 300

tys. białek kodowanych przez ok. 30 tys. genów. W ramach proteomiki strukturalnej

działalność bardzo dużych, często międzynarodowych grup badawczych zrzeszonych w

LSF (large scale facilities) koncentruje się na kompleksowym i wysoceprzepustowym

(high throughput) wyznaczaniu struktur dużych klas białek (docelowo: wszystkich białek

proteomu), współdziałających w ramach określonych odcinków szlaków metabolicznych.

Pozwala to konstruować molekularne mechanizmy procesów biochemicznych, a w

konsekwencji dokonywać wyboru tzw. „tarcz” czyli receptorów białkowych, w tym

enzymów, dla których znana struktura na poziomie molekularnym umożliwia racjonalne

projektowanie specyficznie wiązanych przez nie ligandów jako środków

farmakologicznych (rational drug design): antynowotworowych, antywirusowych,

antybakteryjnych. Badania w zakresie transkryptomiki wymagają z kolei zastosowania

metod pozwalających na wyznaczanie profili ekspresji genów funkcjonującej komórki,

czyli transkryptomu (mikromacierze, sekwencjonowanie RNA).

1. Fizyczne podstawy oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych (a)

Utworzenie przez biomolekułę niezbędnej do właściwego działania natywnej struktury

w roztworze wodnym lub błonie i tworzenie przez nią funkcjonalnych kompleksów z

innymi molekulami jest uwarunkowane PO PIERWSZE budową chemiczną. Z fizycznego

punktu widzenia (PLANSZA 5), niezbędnego w wyjaśnianiu stabilizacji struktury

molekuły i kompleksów molekuł, cząsteczka organiczna jest zbiorem tzw. zrębów

atomowych: jąder i elektronów powłok wewnętrznych, połączonych między sobą

wiązaniami kowalencyjnymi, utworzonymi przez elektrony powłok zewnętrznych, tzw.

4

elektrony walencyjne, które są odpowiedzialne za wiązania chemiczne. Ten stabilny układ

dodatnich i ujemnych ładunków jest opisany przez prawa mechaniki kwantowej,

rządzące procesami zachodzącymi w mikroświecie. Podstawowym postulatem mechaniki

kwantowej jest dualizm korpuskularno-falowy: przypisanie cząstkom tworzącym

molekułę, dodatnio naładowanym jądrom i ujemnie naładowanym elektronom własności

falowych. Własności te będą się przejawiać przede wszystkim w przypadku obiektów o

małej masie, tzn. elektronów i protonów, a w mniejszym stopniu cięższych jąder

składowych biomolekuł: węgli, tlenów, azotów, fosforów i siarki (najważniejsze

pierwiastki składowe) oraz jonów metali, często związanych z białkami i kwasami

nukleinowymi, lub tworzących dla nich środowisko buforowe: Na+, K

+, Mg

+2, Zn

+2, Ca

+2 i

in. Obiektowi kwantowemu: cząstce, cząsteczce chemicznej, przypisuje się długość fali

= h/mv, m - masa, v - prędkość ruchu obiektu, h = 6.62610-34

Js - stała Plancka.

Ponieważ cząsteczki składają się zarówno z cięższych jąder i lżejszych elektronów

klasyczne podejście, preferowane jako prostsze pojęciowo i obliczeniowo, zawsze

będzie tylko przybliżeniem, możliwym do zastosowania jeśli chodzi o niektóre aspekty

zachowania dużych cząsteczek.

W ścisłym opisie kwantowomechanicznym wszystkie parametry ruchu cząsteczki

jako obiektu fizycznego i jej elementów składowych uzyskuje się przez rozwiązanie

równania Schrödingera które jest kwantowym odpowiednikiem równania Newtona w

klasycznym świecie obiektów makroskopowych. Ma to dwie zasadnicze konsekwencje,

które będą podstawą dalszych rozważań (PLANSZA 6):

1. Energia cząsteczki nie ma charakteru ciągłego, ale przyjmuje wartości skwantowane,

tworzące układu poziomów energetycznych charakterystyczny dla tej cząsteczki i

zależny od jej budowy chemicznej i struktury przestrzennej a także, w znacznie

mniejszym stopniu od jej oddziaływań z innymi cząsteczkami i oddziaływań z polami

(siłami) zewnętrznymi.

2. Obowiązuje tzw. zasada nieoznaczoności Heisenberga: jednoczesne uzyskanie

pewnych informacji o układzie kwantowym NIE jest możliwe z dowolną precyzją, np.

możemy JEDNOCZEŚNIE wyznaczyć energię danego poziomu i czas życia tego

poziomu TYLKO ze skończoną dokładnością E ħ/2 (ħ = h/2). Jest to cecha

fizyczna a nie niedokładność przyrządów pomiarowych.

Na energię pojedynczej cząsteczki składa się w przybliżeniu zaniedbania

wpływu jąder jako obiektów ciężkich na ruch lekkich elektronów (stosunek mas

proton/elektron = 1836): energia elektronowa Eel (energia ruchu elektronów w polu jąder

5

cząsteczki i energia oddziaływania między elektronami), energia oscylacyjna Eosc (drgań

jąder), energia rotacyjna Erot (obroty całej cząsteczki i wewnętrzne wokół wiązań), energia

translacyjna Etr (ruch postępowy cząsteczek), jedyna o charakterze ciągłym,

nieskwantowanym dla cząsteczki swobodnej i, w przypadku przyłożenia pól

zewnętrznych, np. magnetycznego o indukcji B lub elektrycznego o natężeniu E, energia

oddziaływania elektronów i jąder z tym polem Eex. Tak wprowadzony podział energii

cząsteczki pozwala wyznaczyć schematycznie układ poziomów energetycznych ważnych

np. przy analizie widm spektroskopowych przy oddziaływaniu promieniowania

elektromagnetycznego z cząsteczkami. Układ poziomów pokazuje wzajemne relacje

między wartościami energii pochodzącymi od poszczególnych rodzajów ruchów:

Eel > Eosc > Erot > Eex; energia translacyjna jest nieskwantowana dla cząsteczek

swobodnych w gazie i roztworze i może być bardzo różna (proporcjonalna do

temperatury); odpowiednie różnice energii między poziomami są rzędu Eel ~ 10 eV,

Eosc ~ 10−2

eV, Erot ~ 10−4

eV, Eext ~ 10−6

eV, gdzie 1 elektronovolt = 1.610−19

J jest

energią kinetyczną elektronu przyspieszonego w polu elektrycznym o różnicy potencjałów

1 V (miara energii powszechnie stosowana w fizyce subatomowej). Na wykładzie

będziemy operowali energią w joulach: 1J = 1N 1m (1 joule = 1 newton razy 1 metr).

Wszystkie skwantowane poziomy energetyczne z wyjątkiem podstawowego, na

którym cząsteczka ma najniższą energię elektronową, tzw. zerowe oscylacje (cząsteczka

nie może całkowicie przestać drgać) oraz nie rotuje i nie oddziałuje z polami

zewnętrznymi, mają skończony średni czas życia . Cząsteczka która się tam znalazła

wraca w takiej skali czasowej na poziom podstawowy oddając energię na różne sposoby.

Z zasady nieoznaczoności każdy taki poziom ma skończoną szerokość E (E ħ/2).

W przypadku badania niektórych problemów związanych z ruchami

molekularnymi i oddziaływaniami cząsteczek można je traktować w przybliżeniu

KLASYCZNYM. Zrębom atomowym połączonym wiązaniami chemicznymi elektronów

walencyjnych, np cząsteczka kwasu octowego (PLANSZA 5):

H O H H O : H

| | . .

. .

H C C w innym zapisie H : C : C gdzie „:” oznacza parę elektronową,

| || . .

: :

H O H O

przypisuje się fragmenty rozkładu elektronowego (ruchy elektronów nie podlegają wtedy

analizie w tym ujęciu) uzyskując MODEL CZĄSTECZKI jako zbiór klasycznych

6

"atomów" C, O i H, o ładunku q dodatnim lub ujemnym każdy, czyli jąder wraz z

określonym rozkladem ładunku elektronów powłok wewnętrznych i walencyjnych,

trzymanych w cząsteczce przez siły wiązań chemicznych o naturze elektrycznej. Jest to

szczególnie przydatne dla dużych biomolekuł, białek i kwasów nukleinowych, których

pełny opis kwantowy, jako znacznie bardziej skomplikowany numerycznie i analitycznie,

jest obecnie niemożliwy. Dla nierotującej i spoczywającej cząsteczki złożonej z N

atomów o danej strukturze chemicznej energia minimalna odpowiada pewnemu

przestrzennemu ustawieniu atomów czyli strukturze przestrzennej.

Struktura przestrzenna jest zadana przez wartości współrzędnych przestrzennych

ir = (xi yi zi) wszystkich atomów składowych i = 1, 2,…, N w dowolnie przyjętym

układzie współrzędnych (kartezjańskim).

Zmiany struktury przestrzennej wynikają z możliwości obrotu wokół wiązań pojedynczych

i częściowo podwójnych, i prowadzą do różnych, dopuszczalnych przez strukturę

chemiczną form, tzw. konformacji cząsteczki. Każdej konformacji odpowiada określona

energia i istnieje jedna lub kilka konformacji o energii najniższej. Zwykle (chociaż

znane są wyjątki), najniższą energię przyjmuje funkcjonalna forma natywna

biopolimeru (białka, kwasu nukleinowego)

Klasyczne atomy cząsteczki obdarzone są wypadkowymi ładunkami

elektrycznymi i oddziałują ze sobą i z otaczającymi molekulami rozpuszczalnika jak

punkty materialne za pośrednictwem sił opisanych przez klasyczny potencjał

oddziaływania elektrycznego V (siły działające na punkt i-ty są pochodnymi potencjału

po położeniu tego punktu ir):

V = potencjały kowalencyjnych wiązań chemicznych (opisują drgania harmoniczne

wiązań, kątów płaskich i torsyjnych)

+ długozasięgowy potencjał kulombowski oddziaływania atomów odległych o r oraz o

więcej niż 3 wiązania chemiczne; zależność od odległości r między atomami jak 1/r

oraz od stałej dielektrycznej ośrodka

+ krótkozasięgowy potencjał van der Waalsa oddziaływania atomów odległych o r

oraz więcej niż 3 wiązania chemiczne; człon przyciągający o zależności 1/r6 i

odpychający o zależności 1/r12

oraz zależy od tzw. stałych Lenarda-Jonesa.

Atomy związane chemicznie przez jedno, dwa i trzy wiązania trzymane są w polu

wytwarzanym przez elektrony wiązań, a odległe o więcej wiązań w strukturze chemicznej

poprzez siły Coulomba i van der Waalsa. Oddziaływanie z otaczającym

7

rozpuszczalnikiem wodnym i jonami w nim zawartymi można uwzględnić przez

wprowadzenie stałej dielektrycznej (ekranowanie ładunków) lub traktując każdą

cząsteczkę otaczającej wody jako dodatkowe trzy punkty (H2O) oddziałujące z

biomolekuła i między sobą. To przybliżenie nosi nazwę pola siłowego (ang. force field

FF) i jest stosowane np. przy komputerowych symulacjach ruchu w ramach tzw.

klasycznej dynamiki molekularnej. Kwantowość jest tu ukryta w wartościach ładunków

przypisywanych „atomom”, wartościach stałych siłowych (wiązania chemiczne) i stałych

Lenarda-Jonesa (oddziaływania van der Waalsa), które można wyznaczyć tylko przez

rozwiązanie równania Schrödingera. Jeśli jednak potraktujemy np. białko jako obiekt

złożony zasadniczo z 20 (czy 22) typów aminokwasów a kwas nukleinowy z 4 typów

nukleotydów, potrzebne wielkości liczymy kwantowo dla małych elementów składowych

i przypisujemy odpowiednim cegiełkom składowym w polimerze. Możliwość klasycznego

podejścia zapewnia twierdzenie Hellmanna-Feynmana:

„jeśli rozkład gęstości ładunku w cząsteczce jest wyznaczony metodami kwantowymi

to ruch tych ładunków odbywa się pod wpływem klasycznych sił elektrostatycznych”

Wszystkie oddziaływania warunkujące kształt przestrzenny cząsteczki (konformacja) i

stabilizujące kompleksy molekularne mają więc charakter elektrostatyczny, z

wyróżnieniem hydrofobowych (pojęcie omówione na następnym wykładzie).

Oddziaływanie odpychające elektronów walencyjnych 1/r12

wyznacza

powierzchnię van der Waalsa albo powierzchnię molekularną cząsteczki, która

stanowi barierę dostępu innych fragmentów tej samej cząsteczki, i innych molekuł, w tym

cząsteczek rozpuszczalnika (PLANSZE 4 i 5). Powierzchnia ta powstaje przez połączenie

sfer van der Waalsa poszczególnych zrębów atomowych. Można ją również określić jako

powierzchnię kontaktu tocząc wokół danej cząsteczki cząsteczkę wody w postaci sfery o

promieniu 1.4 Å. Tak zdefiniowana powierzchnia odgranicza wnętrze molekuły, którego

zręby atomowe nie wchodzą w kontakt z otoczeniem. Cząsteczki wody i jony przy

powierzchni makrocząsteczki tworzą tzw. sferę hydratacyjną (ogólnie przy dowolnym

rozpuszczalniku sferę solwatacyjną), w której cząsteczki rozpuszczalnika są sztywniej

związane (mniej ruchliwe) i mają inne własności, np. gęstość, niż w jego dalszej części.

Między sferą hydratacyjną i pozostałym rozpuszczalnikiem zachodzi oczywiście wymiana

jonów i cząsteczek wody.

8

Wykład 2

1. Fizyczne podstawy oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych (b)

Klasyczne metody badania cząsteczek zajmują sie makroskopowymi układami

molekularnymi w ciele stałym, cieczy czy roztworze lub w fazie gazowej, gdzie

obowiązują prawa termodynamiki i mechaniki statystycznej. Należy zaznaczyć, że

pojawiły się ostatnio metody badania pojedynczych cząsteczek tzw. nanotechniki, o

których jeszcze wspomnę. Jednak komórka czy organizm funkcjonują jako układy

makroskopowe i stosują się do praw termodynamiki. Procesy fizyczne i chemiczne w skali

makro są regulowane nie tylko relacjami energetycznymi (PLANSZA 6) ale również

stopniem uporządkowania (lub nieuporządkowania) struktur molekularnych, który jest

opisany przez pojęcie entropi. Jest to funkcja termodynamiczna, która jest parametrem

opisu (podobnie jak energia) zbioru cząsteczek (PLANSZA 7) Im więcej możliwych,

dostępnych stanów mikroskopowych P (struktur, konformacji) może przyjąć układ

cząsteczkowy w danych warunkach ciśnienia p, temperatury T, objętości V, masy M i

innych parametrów makroskopowych, które go opisują, tym większa jest wartość entropii

S, zgodnie ze wzorem:

S = klnP(p, T,...) k = 1.3804510-23

JK-1

jest stałą Boltzmanna;

a wartość maksymalną entropi układ izolowany (adiabatycznie w ścisłej terminologii

fizyki) przyjmuje w warunkach równowagi. Przykładowo, wprowadzenie ciepła Q do

układu powoduje wzrost entropii:

Q = TS gdzie T jest temperaturą wyrażoną w stopniach Kelvina [K]

Wszelkie procesy zachodzące w makroskopowym układzie molekularnym o energii tzw.

wewnętrznej U (oznaczenie inne dla odróżnienia od energii pojedynczej cząsteczki), który

wymienia ciepło Q, pracę W i masę M z otoczeniem opisane są przez pierwszą i drugą

zasadę termodynamiki, które łącznie można zapisać jako:

U = W + Q + M gdzie: W = -pV + Wnieobjętościowa, M = i

i ni

i oznaczają potencjały chemiczne poszczególnych składników i układu, w ilości ni

moli każdego

Każdy układ dąży do stanu równowagi termodynamicznej, który to stan musi

jednocześnie spełniać dwa kryteria:

(1) minimum energii wewnętrznej U

(2) maksimum entropii S (nieuporządkowania)

9

Układy w których zachodzi dużo sprzężonych procesów biochemicznych, takie jak żywa

komórka lub cały organizm stosują się do praw termodynamiki ale, znajdują się daleko

od położenia równowagi. Ten stan utrzymywany jest przez stały dopływ energii z

zewnątrz w postaci substancji odżywczych, tlenu, światła (rośliny). W końcu jednak każdy

żywy organizm znajdzie się w stanie równowagi termodynamicznej z otoczeniem, która

oznacza śmierć.

Stosunkowo proste (w porównaniu z całą komórką) procesy molekularne, które są

przedmiotem badań biofizyki molekularnej a więc i naszego wykładu, zachodzą wtedy,

gdy pewne, opisujące je potencjały termodynamiczne, dążą do minimum. Rozpatrywane

na wykładzie przypadki procesów zmian struktury chemicznej i konformacji biomolekuł

oraz tworzenie kompleksów molekularnych będą się z reguły odbywały w warunkach

stałej temperatury i ciśnienia. Procesy takie zachodzą w kierunku osiągania minimum

przez jeden z takich potencjałów energię swobodną Gibbsa G zwaną inaczej entalpią

swobodną:

G = U + pV - TS

Minimalizacja G obejmuje jak widać oba kryteria: osiągnięcie minimalnej energii (małe

U) i maksymalnej entropii (duże S - znak minus). Przykładowo:

(a) jeśli mamy do czynienia z tworzeniem kompleksu molekularnego złożonego z kilku

cząsteczek to:

G = Gkompleks - (Gskładnik_1 + G składnik_2 +.......) < 0

i w równowadze G = 0 tyle samo cząsteczek kompleksu powstaje ile się rozpada;

(b) jeśli w danych warunkach otoczenia białko globularne tworzy funkcjonalną formę

natywną to:

Gnatywna < Gzdenaturowana inaczej Gprzejścia = Gnatywna- Gzdenaturowana < 0

a w przypadku podziałania np. mocznikiem relacja między wartościami G dla obu form

białka ulegnie odwróceniu i zachodzi denaturacja.

Dotychczas wprowadziliśmy pojęcie energii pojedynczej cząsteczki E i energii

makroskopowego układu cząsteczek U. Energia U jest sumą energii Ei (energii

wewnątrzcząsteczkowych) i energii oddziaływań między cząsteczkami Eij, w tym

oddziaływania z rozpuszczalnikiem. W przybliżeniu słabych oddziaływań

międzycząsteczkowych w porównaniu z wewnątrzcząsteczkowymi U jest bliska sumie Ei:

U = i

ii

iji

i EEE

10

Poszczególne cząsteczki zajmują skwantowane poziomy energetyczne (PLANSZA 6)

zgodnie z rozkładem Boltzmanna (PLANSZA 7); ilości cząsteczek Ni na każdym z nich:

Ni = N0Z−1

exp(Ei /kT) N0 liczba wszystkich cząsteczek; Z = kexp(Ek/kT)

maleje eksponencjalnie ze wzrostem energii poziomu Ei tym szybciej im wyższa

temperatura T. Energia makroskopowego układu molekularnego jest więc proporcjonalna

do ilości cząsteczek i wyraża się w zwykle w [J/mol] lub częściej [kJ/mol] (1J = 0,239

cal). Ponadto, im wyższa temperatura tym większa energia układu ponieważ więcej

cząsteczek zajmuje wyżej położone poziomy energetyczne, a w ruchu translacyjnym

(energia nieskwantowana) cząsteczki poruszają się szybciej.

1. Fizyczne podstawy oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych (c)

Struktura przestrzenna cząsteczek (spoczywających i nierotujących dla uproszczenia) o

określonej budowie chemicznej (skład atomów i układ wiązań) i przestrzennej

(konformacja) jest uwarunkowana przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe między

poszczególnymi „atomami” i oddziaływania międzycząsteczkowe z otaczającymi

cząsteczkami, w tym cząsteczkami rozpuszczalnika, czyli w przypadku białek i kwasów

nukleinowych z cząsteczkami wody, jonami buforu lub cząsteczkami kwasów

tłuszczowych dla białek zakotwiczonych w błonach biologicznych. W sumie

oddziaływania te składają się na stabilizację określonej struktury poprzez czynniki

energetyczne i entropowe.

Ilość dopuszczalnych konformacji w cząsteczkach białek i kwasów nukleinowych

jest olbrzymia, np. białko o 100 aminokwasach może przyjąć ponad P = 2100

(1030

)

różnych konformacji. Czynniki entropowe sprzyjają więc strukturze w której w

równowadze dynamicznej istnieje olbrzymia ilość różnych form przestrzennych

biomolekuły. Jest to struktura tzw. kłębka statystycznego jaką mają białka zdenaturowane i

pojedyncze nici kwasów nukleinowych. Aby powstała funkcjonalna struktura natywna

lub niewielka ilość funkcjonalnych konformacji ten niekorzystny czynnik entropii

konformacyjnej musi być przezwyciężony przez wewnątrzcząsteczkowe

oddziaływania stabilizujące w biocząsteczce z udziałem oddziaływań makromolekuła

- cząsteczki rozpuszczalnika i oddziaływań wewnątrz samego rozpuszczalnika. Każde z

nich ma charakter energetyczny i entropowy.

Wyróżnia się następujące oddziaływania stabilizujące konformację natywną

biomolekuły (PLANSZA 8) ORAZ wyznaczające specyficzność wzajemngo

oddziaływania czasteczek przy tworzeniu kompleksów:

11

1. Wiązania wodorowe. Polegają na uwspólnieniu protonu między dwoma atomami

elektroujemnymi, donorem i akceptorem, np. O lub N. Niekiedy donorem w słabych

oddziaływaniach wodorowych może być węgiel. Tworzy się w ten sposób liniowy układ

trzech atomów: donor - wodór - akceptor z wolną parą elektronową, o nadmiarowych

ładunkach minus - plus - minus. Przy silnych wiązaniach wodorowych donor i akceptor są

odległe od ok. 2.7 Å do 3.1 Å a układ trzech atomów jest zbliżony do liniowego

(odstępstwa od 180 dla kąta D-H-A nie przekraczają 25). Energia wiązania,

zdominowana przez oddziaływanie kulombowskie 1/r (r – odległość oddziałujących

ładunków) jest znacznie mniejsza niż energia typowego wiązania kowalencyjnego, rzędu

kilka razy energia związana z ruchami cieplnymi atomów, których miarą jest RT = 2.5

kJ/mol w temperaturze pokojowej 300 K (R = 8.3143 kJ/(molK) - stała gazowa, (patrz

dalej PLANSZA 9)

2. Mostki solne. Tworzą się między grupami atomów silnie naładowanych, o

przeciwnych znakach, w wyniku dysocjacji protonu H+ z jednej grupy (ładunek ujemny) i

przyłączeniu protonu przez drugą (ładunek dodatni). Siła Coulomba stabilizuje taką parę

np. dodatno naładowana grupa boczna lizyny CH2CH2CH2CH2NH3+ i ujemnie naładowana

reszta kwasu glutaminowego CH2CH2COO w białku, lub reszta lizyny i tlen grupy

fosforanowej -O-PO2-O- kwasu nukleinowego.

3. Kontakty van der Waalsa. Atomy i grupy atomów w cząsteczce, nawet jeśli cała

cząsteczka jest elektrycznie obojętna lub zjonizowane/uprotonowane grupy równoważą

się, mają nadmiarowe ładunki dodatnie lub ujemne. Fragment lekko naładowany dodatnio

indukuje zwiększony ładunek ujemny w sąsiednim fragmencie i następuje przyciąganie

(słabe) - oddziaływanie indukcyjne i dyspersyjne van der Waalsa; w przeciwieństwie do

wiązań wodorowych oddziaływania te nie mają charakteru kierunkowego.

4. Oddziaływania hydrofobowe. Fragmenty cząsteczkowe źle oddziałujące z wodą

(źle rozpuszczalne w wodzie) wolą agregować ze sobą np. grupy alifatyczne CH3 czy

pierścienie benzenowe. Dobrym wizualnym modelem takiego oddziaływania jest

agregacja kropli tłuszczu w wodzie. Mówimy wtedy o oddziaływaniu hydrofobowym, w

którym decydujące znaczenie mają efekty entropowe, związane z reorganizacją wzajemną

cząsteczek wody w obecności hydrofobowych powierzchni cząsteczek rozpuszczonych.

Związanie reszt hydrofobowych minimalizuje powierzchnię kontaktu z wodą, która

jest tu bardziej uporządkowana (wyższa entropia), a więc pojawia się więcej wody

nieuporządkowanej i entropia rośnie. Typowym przykładem dużego udziału

12

oddziaływania hydrofobowego jest oddziaływanie warstwowe (stacking) dwóch

pierścieni aromatycznych. Ustawiają się one równolegle w odległości ok. 3.4 Å a woda

jest wyparta spomiędzy nich. W stackingu jest również udział sił van der Waalsa, a jeśli z

pierścieniem aromatycznym oddziałuje fragment naładowany dodatnio, pierścieniowy lub

nie, jak np. reszta lizyny, mówimy o tzw. oddziaływaniu lub stackingu kation - ze

znacznym udziałem sił van der Waalsa. (w przypadku tylko jednego pierścienia słowo

„stacking” nie jest w pełni adekwatne).

1. Fizyczne podstawy oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych (d)

Specyficzne, silne wiązanie biomolekuł jest podstawą współdziałania różnych cząsteczek

w skomplikowanych i podlegających regulacji procesach biologicznych, takich jak

replikacja, transkrypcja czy translacja. Aby współdziałać, makromolekuły muszą się

rozpoznać i utworzyć funkcjonalne kompleksy molekularne. Miarą siły a więc także

specyficzności wiązania jest równowagowa stała asocjacji kompleksu wyrażona przez

stężenia [ ] poszczególnych składników (PLANSZA 9):

Kas = [kompleks]/([składnik_1][składnik_2] ....[skladnik_n]

Im wyższa stała asocjacji tym stabilniejszy kompleks. Niekiedy używa się odwrotności

stałej asocjacji czyli stałej dysocjacji:

Kd = 1/Kas

Stała asocjacji wiąże się bezpośrednio ze standardową energią swobodną Gibbsa

utworzenia kompleksu w warunkach równowagi termodynamicznej:

G = Gkompleks - (Gskładnik_1 + Gskładnik_2 +.......) = RTln Kas gdzie stała gazowa

R = 8.3143 kJ/(molK); symbol „” oznacza „standardowość” czyli odniesienie G do

stężeń jednomolowych.

Elektrycznie obojętne makromolekuły, ze względu na niesymetryczny rozkład ładunku

elektrycznego zwykle przyciągają się (siły van der Waalsa), ale tego typu oddziaływanie

nie jest silne i ma charakter niespecyficzny. - stałe asocjacji nie przekraczają 104 M

-1 (dla

kompleksów dwuskładnikowych). Oddziaływanie specyficzne charakteryzuje się

dopasowaniem powierzchni van der Waalsa biomolekuł i dopasowaniem ich rozkładów

ładunków tak aby maksymalizować stabilizujące oddziaływania elektrostatyczne:

wiązania wodorowe, mostki solne, słabe oddziaływania van der Waalsa i oddziaływania

hydrofobowe. Najsilniejsze, specyficzne kompleksy białko - kwas nukleinowy

charakteryzują się stałymi asocjacji:

13

Kas 1013

M-1

co odpowiada G 80 kJ/mol (energia wiązania kowalencyjnego

~300 400 kJ/mol).

Najsilniej związanym ze znanych kompleksów jest układ biotyny (heterocykl, witamina H

inaczej B7) z białkiem streptawidyną, Kas 1015

M-1

, stosowany np. jeśli obiekt typu

„mikro” lub „nano” chce się przyczepić do POJEDYNCZEJ MOLEKUŁY w celu

manipulowania tą molekułą.

Tworzenie kompleksu nie ma charakteru statycznego ale oddziałujące biomolekuły

zmieniają swoje konformacje, często w znacznym zakresie, aby wzajemnie dopasować do

siebie powierzchnie - wzajemne dopasowanie konformacyjne (ang. induced fit), co

zapewnia krótsze odległości między ładunkami, a w konsekwencji silniejsze związanie

(szerzej o modelach tworzenia kompleksów przy omawianiu oddziaływań z udziałem

białek i kwasów nukleinowych)

Tworzeniu kompleksu towarzyszą efekty związane z rozpuszczalnikiem o

charakterze entropowym (korzystne lub nie), takie jak:

(a) efekt polielektrolityczny: wymiana jonów (w tym protonów) między sferami

hydratacyjnymi biomolekuł lub wnętrzem molekuły i resztą rozpuszczalnika wodnego;

(b) hydratacja/dehydratacja: wymiana cząsteczek wody między sferami

hydratacyjnymi oddziałujących cząsteczek i rozpuszczalnikiem.

Typowym przykładem specyficznego rozpoznawania komplementarnych nici

polinukleotydowych jest struktura podwójnej helisy, oparta na tworzeniu

komplementarnych par zasad Watsona- Cricka: G : C i A : T lub A : U. Piewsza z par

stabilizowana jest przez trzy wiązania wodorowe , druga przez dwa wiązania (PLANSZA

10), a pary niekomplementarne mogą się tworzyć tylko z udziałem mniejszych ilości

wiązań wodorowych. W parach WC donory i akceptory protonu obu oddziałujących zasad

są odpowiednio zlokalizowane przestrzennie względem siebie. Powierzchnie

molekularne (kształty) zasad pozwalają na dostateczne zbliżenie donor - akceptor tak, że

ich ujemne ładunki przedzielone dodatnim ładunkiem protonu dają w efekcie

elektrostatycznie stabilny układ (siły elektrostatyczne zależą od odległości ładunków !).

14

Wykład 3

2. Metody badania struktur i dynamiki białek i kwasów nukleinowych

Ponieważ duże i skomplikowane biopolimery badane są z punktu widzenia różnych

informacji, jakie chcemy uzyskać o ich strukturze i funkcjonowaniu w komórce,

rozwinięto w tym celu znaczną ilość różnych metod. Na wykładzie skoncentruję się na

tych metodach, które pozwalają uzyskać przede wszystkim dane o strukturach

molekularnych, od struktur pierwszorzędowych czyli sekwencji monomerów

składowych, do struktur przestrzennych: drugo-, trzecio- i ew. czwartorzędowych. W tej

drugiej grupie skoncentruję się na metodach doświadczalnych dostarczających informacji

o strukturach przestrzennych białek i kwasów nukleinowych z rozdzielczością do

położenia poszczególnych „atomów”, czyli określenia współrzędnych atomów w

przestrzeni trójwymiarowej. Komputerowe metody projektowania struktur krótko omówię

w temacie zwijanie białek. W mniejszym stopniu będę omawiał metody badania dynamiki

ruchów molekularnych. Omawiane metody można zasadniczo podzielić na kilka typów

(PLANSZA 11), zależnie od informacji które chce się uzyskać:

(A) Metody wyznaczania mas cząsteczkowych i separacji cząsteczek na podstawie

różnic mas; na niektórych z tych metod oparta jest analiza struktur

pierwszorzędowych biopolimerów:

ultrawirowanie

elektroforeza żelowa (GE) i kapilarna (CE); sekwencjonowanie DNA i RNA

spektrometria masowa (MS); sekwencjonowanie białek

(B) Metody wyznaczania struktur przestrzennych z rozdzielczością atomową:

dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego (rentgenografia)

magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)

(C) Metody strukturalne (na średnim poziomie rozdzielczości) określania ogólnego

kształtu makrocząsteczek:

mikroskopia sił atomowych (AFM, atomic force microscopy) i mikroskopia

elektronowa pojedynczej cząsteczki (cryoEM)

(D) Metody badania dynamiki ruchów molekularnych:

magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) i inne metody spektroskopowe

(fluorescencja)

komputerowe symulacje dynamiki molekularnej (MD, molecular dynamics i

rMD, restrained molecular dynamics)

15

(a) Ultrawirowanie analityczne (PLANSZA 12) było jedną z pierwszych metod

określania masy cząsteczkowej i rozdziału dużych biomolekuł. Obecnie metoda przeżywa

swój „renesans” ze względu na nowe zastosowania. Cząsteczka w roztworze poddana

szybkiemu wirowaniu z częstością do 80 tysięcy obrotów na minutę (rpm; rotations per

minute) porusza się ze stałą prędkością w od osi rotora wskutek zrównoważenia siły

odśrodkowej, skierowanej od osi rotora (odpowiednik siły grawitacji w jednostkach g pola

ziemskiego) i sumy sił wyporu oraz tarcia, skierowanych do osi rotora. Dla cząsteczek w

odległości r od osi rotora (granica: zawiesina/klarowna ciecz) można wyznaczyć prędkość

ich ruchu, czyli szybkość sedymentacji w = dr/dt przez pomiar zmian stężenia c w czasie,

w funkcji r (równanie Lamma), metodami optycznymi np. pomiar absorpcji w zakresie

UV lub fluorescencji (prawa Lamberta-Beera). Stąd wyznacza się tzw. profil

sedymentacji:

g(S*) = ln[r/rm]/2t rm – odległość menisku cieczy w probówce wirowniczej

którego maksimum daje współczynnik sedymentacji

S = w/(2r) wyrażony w svedbergach, S = 10

-13 s.

Masa cząsteczkowa M może być wyznaczona z wartości S i niezależnie wyznaczonego

współczynnika dyfuzji D, np. z szerokości profilu sedymentacji g(S*):

M = NAvom = RTS/[D(1 - )]

NAvo=6.02252 1023

- liczba Avogadro, m - masa cząsteczki, - objętość właściwa

cząsteczki, - gęstość rozpuszczalnika, D - współczynnik dyfuzji, R - stała gazowa,

T- temperatura w K

Masa cząsteczek M jest proporcjonalna do S i w ten sposób można również rozdzielać

cząsteczki różniące się masą cząsteczkową - większe poruszają się szybciej. Lepsze

rozdziały uzyskuje się przez wirowania w gradiencie gęstości np. cukru lub chlorku cezu.

Gradient zapobiega ruchom konwektywnym i daje wyraźne przesuwające się pasma dla

poszczególnych cząsteczek.

Biolodzy molekularni często operują wielkościami makrocząsteczek, kompleksów

molekularnych, struktur subkomórkowych lub całych wirusów i komórek poprzez

podawanie odpowiednich wartości współczynników sedymentacji S. Do wyznaczenia

masy cząsteczkowej można także zastosować nieco inny, stacjonarny eksperyment

równowagi sedymetacji. Długie wirowanie (kilkadziesiąt godzin) przy relatywnie

niewielkich częstościach obrotu ok. 5000 rpm prowadzi do ustalenia gradientu stężenia

16

makromolekuł w wyniku równowagi termodynamicznej siły dyfuzji i siły odśrodkowej

minus siła wyporu. Pomiar stężenia metodami absorpcji w przynajmniej dwóch punktach

probówki wirowniczej pozwala określić wartość masy cząsteczkowej (wzoru nie podaję).

Metoda ultrawirowania daje możliwość wyznaczenia masy cząsteczkowej z dokładnością

do kilku procent wartości (lub współczynnika sedymentacji), w bardzo szerokim zakresie

wielkości cząsteczek, przy użyciu niewielkich, mikromolowych ilości substacji

(zależnie od czułości detekcji).

Spektakularnym przykładem zastosowania ultrawirowania analitycznego do

rozwiązania problemu biologicznego był eksperyment Meselsona-Stahla, uznany za

„najpiękniejszy” eksperyment biofizyczny. Wirowanie kwasu DNA bakterii hodowanych

na pożywkach wzbogaconych azotem N-15 pokazało semikonserwatywny charakter

replikacji DNA.

Elektroforeza żelowa (GE, gel electrophoresis PLANSZA 13), podobnie jak

ultrawirowanie pozwala oszacowywać masy cząsteczkowe i rozdzielać mieszaniny

makromolekuł na podstawie różnic mas. Cząsteczki naładowane poruszają się w roztworze

pod wpływem pola elektrycznego o natężeniu E (np. przez przyłożenie napięcia ok. 200 V)

z prędkością v proporcjonalną do natężenia pola oraz ładunku Z a odwrotnie

proporcjonalną do współczynnika tarcia f. Z kolei współczynnik tarcia zależy od masy

cząsteczkowej M, lepkości roztworu i w pewnym stopniu od kształtu cząsteczki. W

konsekwencji tzw. ruchliwość elektroforetyczna = v/E, która opisuje szybkość migracji

cząsteczki jest tym większa im mniejsza masa cząsteczkowa. Ściślej, zależność jest

logarytmiczna. Elektroforezę przeprowadza się na żelach czyli długich polimerach

liniowych o różnym stopniu usieciowania (rozmiarach porów). Żele działają jak sita

molekularne zwiększając zdolność rozdziału.

Białka poddaje się elektroforezie na żelach poliakrylamidowych CH2CH(CONH2)

w postaci zdenaturowanej tzn. po zniszczeniu struktury natywnej drugo- i

trzeciorzędowej (w tym mostków dwusiarczkowych), po rozpuszczeniu białka w

detergencie, soli sodowej siarczanu dodecylu CH3(CH2)11SO42

Na+

2, który wiążąc się z

aminokwasami nadaje białku duży ładunek elektryczny. Stąd skrótowa nazwa SDS

PAGE: sodium dodecyl sulphate poliacrylamide gel electrophoresis. Położenie białek na

żelu uzyskuje się w postaci prążków przez wybarwianie substancjami absorbującymi w

zakresie widzialnym, lub przez znakowanie przeciwciałami z grupami fluoryzującymi.

17

Czułość metody sięga 10 nanogramów (10-8

g) białka a dokładność oznaczenia masy

cząsteczkowej wynosi ~2% na podstawie równoległej elektroforezy markerów

białkowych o znanych masach cząsteczkowych. W przypadku konieczności rozdzielenia

mieszanin dużej ilości białek, nawet do 1000, stosuje się elektroforezę dwuwymiarową.

Najpierw białka separuje się w nieobecności SDS w gradiencie pH - wstępna elektroforeza

małych, wielonaładowanych polimerów ustala gradient. Białka migrują pod wpływem

własnego ładunku do punktu w którym są obojętne i tam zatrzymują się; tzw.

ogniskowanie izoelektryczne (isoelectric focusing). Rozdzielczość w tym wymiarze sięga

0.01 jednostki pH. W prostopadłym kierunku poddaje się białka zwykłej elektroforezie

SDS, gdzie rozdział zachodzi na podstawie różnic mas cząsteczkowych.

Kwasy nukleinowe mają własny duży ładunek ujemny grup fosforanowych więc

migrują na żelu bez SDS. Na żelach poliakrylamidowych fragmenty jednoniciowego DNA

i RNA do ok. 400 nukleotydów dzielą się pod względem długości z dokładnością do

jednego nukleotydu, a czułość jest podobna jak w przypadku białek. Dla dłuższych

fragmentów, także dwuniciowych, do 10 000 par zasad (bp) stosuje sie bardziej porowaty

żel agarozę. Rozdzielczość jest w tym przypadku mniejsza. Duże fragmenty, 105 do 10

7 bp

można rozdzielać przy zastosowaniu techniki pulsujących pól elektrycznych. Szybkie,

naprzemienne sekwencje dwóch pól elektrycznych pod odpowiednim kątem zmuszają

cząsteczki do reorientacji, co dłuższym zabiera więcej czasu i dlatego migrują wolniej.

Elektroforeza kapilarna (CE - capillary electrophoresis, PLANSZA 14) jest

szybko rozwijającą się ostatnio techniką, stosowaną w automatycznych sekwenatorach

DNA. Rozdzielanie cząsteczek następuje w wyniku ich migracji w poruszającym się

buforze, w cienkiej kapilarze, zwykle kwarcowej długości 30 - 100 cm i średnicy 20 do

100 m, między dwoma naczyniami wypełnionymi buforem. Zarówno tzw. przepływ

elektroosmotyczny buforu jak i migracja rozpuszczonych w nim cząsteczek następuje po

przyłożenia pola elektrycznego do elektrod zanurzonych w obu naczyniach przy różnicy

potencjałów do 30 kV (pola do 500 V/cm). Limit natężenia pola wynika z silnego

ogrzewania przez prąd płynący w kapilarze. Migrująca substancja jest oznaczana w

detektorze np. absorpcyjnym UV/VIS, fluorescencyjnym czy w spektrometrze masowym

MS. Od detektora zależy czułość metody; maksymalna jest w przypadku detektorów MS.

Przepływ cząsteczek buforu następuje w wyniku jonizacji ujemnej grup =SiOH =SiO

na ściankach kapilary (pH buforu > 3), tylko częściowo zrównoważonych kationami

buforu. Pozostałe grupy oddziałują z kationami warstwy ruchomej. Tworzy się dyfuzyjna

warstwa podwójna kationów dająca napięcie ścinające, które jest czynnikiem

18

różnicującym ruchliwość elektroforetyczną, podobnie jak sita molekularne w

elektroforezie żelowej. Ruchoma warstwa kationów porusza się w polu elektrycznym od

anody do katody "ciągnąc" bufor. Ruch cząsteczek rozpuszczonych w buforze jest

wypadkową ruchu buforu i wpływu pola elektrycznego na same cząsteczki i zależy od

pH buforu; im wyższe pH tym więcej kationów w warstwie. Ogólnie biorąc: cząsteczki

naładowane dodatnio poruszają się szybciej niż bufor (przepływ od anody do katody),

obojętne tak samo jak bufor a ujemne wolniej. W konsekwencji ruchliwość

elektroforetyczna substancji zależy masy cząsteczki, jej ładunku, lepkości i pH buforu.

Małe cząsteczki o dużym ładunku poruszają się szybciej niż duże cząsteczki o małym

ładunku, podobnie jak w elektroforezie żelowej.

(b) W spekrometrii masowej (MS, mass spectrometry) (PLANSZA 15)

cząsteczki poddaje się jonizacji do ładunku Z i wstępnie przyśpiesza w polu elektrycznym

o potencjale V. Po zogniskowaniu wiązka jonów wchodzi w obszar działania detektora. W

detektorze magnetycznym (już rzadko stosowany) siła Lorentza zakrzywia tor ruchu

jonów, a promień krzywizny r zależy od stosunku masy jonu m do ładunku Z:

m/Z = (H2/2V) r

Innym sposobem określania m/Z jest pomiar czasu przelotu jonu t w technice detekcji

TOF (time-of-flight) na drodze d (e - ładunek elementarny):

m/Z = (2V/ed2)t

2

W detektorze kwadrupolowym QIT (quadruple ion trap) pułapkuje się jony w

odpowiednio ukształtowanym (zmiennym) polu elektrycznym.

Wykres intensywności sygnału jonów mierzonych w detektorze w funkcji m/Z daje

widmo masowe, co przy znanym ładunku pozwala określić masę jonu. Technika jest

bardzo czuła: wymaga jedynie nanogramów substancji. Dla mniejszych cząsteczek

osiąga dokładność wyznaczania masy poniżej 5 ppm (0.0005%) - odseparowane piki od

cząsteczek lub ich fragmentów o różnym składzie izotopowym. Problem w tym, że przy

jonizacji cząsteczka ulega fragmentacji i nie zawsze można zarejestrować pik

odpowiadający pełnej masie cząsteczkowej tzw. jon molekularny. Z drugiej strony

fragmenty o różnych masach powstające z pękania określonych wiązań (znane preferencje

miejsc rozszczepiania) mogą dostarczyć informacji o strukturze chemicznej cząsteczki.

Przez długi czas biomolekuły trudno było zjonizować i przeprowadzić do fazy gazowej

bez fragmentacji, czyli poddać desorpcji niezbędnej dla wykonania widm MS.

19

Znaczące rezultaty dla biomolekuł uzyskano techniką desorpcji MALDI (matrix-

assisted laser desorption ionization) pod wpływem promieniowania lasera w silnie

absorbującym roztworze małych cząsteczek organicznych, tzw. matrycy. Drugą techniką

desorpcji dużych białek i fragmentów kwasów nukleinowych jest technika rozpylania w

polu elektrycznym czyli elektrosprej ESI (electrospray ionization). Biomolekuły są

zawieszane w kropelkach rozpuszczalnika formowanych na końcu igły i ładowane

elektrycznie przez pole elektryczne między igłą a elektrodą (3 - 6 kV). Podczas ruchu w

kapilarze kropelki szybko parują w przeciwbieżnym strumieniu gazu uzyskując duży

ładunek powierzchniowy, który je rozrywa wytwarzając sprej bardzo drobniutkich i dalej

szybko parujących kropelek. Pojedyncze cząsteczki w drobniutkich kropelkach spreju

przechodzą do fazy gazowej po odparowaniu reszty rozpuszczalnika. Widmo masowe

MSI stanowi seria pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie naładowanym i

uprotonowanym jonom molekularnym [M+zH]z+

, bez fragmentacji. Stąd można określić

masę cząsteczkową M z dużą dokładnością do kilku Da dla białek ok. 100 kDa, po

dekonwolucji do piku o pojedynczym ładunku Z = 1 na podstawie serii pików o ładunku

wzrastającym kolejno o jedną jednostkę.

20

Wykład 4

(c) Spektroskopia molekularna obejmuje dużą ilość technik badania cząsteczek w

różnych stanach skupienia (ciało stałe, ciecz, roztwór, gaz) poprzez rejestrację

oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego (światła) z cząsteczkami.

Zasadniczo można wyróżnić trzy sposoby takiego oddziaływania: (PLANSZA 16):

(1) Absorpcja kwantu promieniowania (fotonu) o częstości czyli długości fali =

c/, przez cząsteczkę (c - prędkość światła), czyli wzbudzenie cząsteczki, zachodzi jeśli

energia fotonu wzbudzającego h odpowiada różnicy energii między poziomem na którym

jest cząsteczka i poziomem energetycznym na który przechodzi:

Em - En = h lub: Em - En = ħ

ħ = h/(2) = 2

Z pomiarów absorpcji i fluorescencji można wyznaczyć stężenia substancji w roztworze;

(2) Emisja kwantu promieniowania (fluorescencja) po wzbudzeniu cząsteczki na

wyższy poziom energii z przejściem na poziom niższy, ten sam z którego zachodziła

absorpcja lub inny; emitowany foton ma częstość odpowiadającą różnicy energii obu

poziomów (analogiczny wzór jak przy absorpcji);

(3) Rozproszenie promieniowania przez cząsteczkę z zachowaniem lub zmianą

częstości (efekt Ramana) rozpraszanego fotonu.

Ponieważ cząsteczka ma wiele poziomów energetycznych związanych z różnymi

rodzajami ruchów (PLANSZA 6) przejścia absorpcyjne mogą zachodzić z poziomu

podstawowego lub blisko niego położonych poziomów rotacyjnych (tylko te poziomy są

obsadzone w standardowych temperaturach badania makrocząsteczek) do bardzo różnych

wyższych poziomów wzbudzonych: rotacyjnych, oscylacyjnych i elektronowych. Stąd w

różnych zakresach długości fali obserwuje się różne typy wzbudzenia i mamy do czynienia

z różnymi rodzajami spektroskopii absorpcyjnej, odpowiednio: zakres mikrofal MV

(micro wave), podczerwień IR (infra red) zakres widzialny i ultrafiolet UV-VIS.

Fluorescencję obserwuje się tylko w zakresie widzialnym i ultrafioletowym gdyż przy

większych długościach fali przejścia na niższe poziomy energii zachodzą tylko

bezpromieniście. Również nie wszystkie cząsteczki które zaabsorbowały energię i

przeszły na wzbudzony poziom elektronowy fluoryzują, gdyż zachodzą konkurencyjne

przejścia bezpromieniste z elektronowego poziomu wzbudzonego do niższych

poziomów. Przykładowe widma absorpcji i fluorescencji w zakresie UV-VIS pokazuje

PLANSZA 17.

21

Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR - nuclear magnetic resonance) jest

szczególną metodą spektroskopową (PLANSZA 18), standardowo stosowaną m. in. do

WYZNACZANIA STRUKTUR PRZESTRZENNYCH BIOMOLEKUŁ W

ROZTWORZE, a ostatnio również w ciele stałym (próbki amorficzne). W metodzie NMR

obserwuje sie tzw. rezonansowe przejścia pomiędzy poziomami energii, jakie jądra

danego typu w cząsteczce uzyskują w silnym, zewnętrznym, stałym polu magnetycznym o

indukcji B rzędu od 2.5 do 22 T [tesli] (zależnie od zastosowań i typu eksperymentu), co

odpowiada absorpcji promieniowania fal radiowych od ok. 10 do 900 MHz. Warunkiem

zachodzenia rezonansu jest posiadanie przez jądro momentu magnetycznego , co ma

miejsce wtedy gdy jądro charakteryzuje się niezerowym spinem I, parametrem ściśle

kwantowy, który odpowiada klasycznemu obrotowi wewnętrznemu jądra; I może być

równe 1/2, 1, 3/2,... itd. W zewnętrznym polu B jądro uzyskuje skwantowaną energię Em:

Em = B = ħmB, m = -I, -I+1,.., I-1, I,...itd.

Współczynnik żyromagnetyczny zależy od rodzaju jądra. Dla jąder o spinie I = 1/2, np.

1H,

13C,

15N oraz

31P, izolowane jądro ma tylko dwa poziomy E1/2 i E-1/2 między którymi

zachodzi przejście rezonansowe po wzbudzeniu polem elektromagnetycznym o częstości

rezonansowej:

= B

w wyniku oddziaływania ze składową magnetyczną B1 tego pola. Widać, że rezonans dla

różnych typów jąder zachodzi przy innej częstości rezonansowej , tzn. np. protony 1H

mają inną częstość niż węgle 13

C.

Jest bardzo dużo różnych eksperymentów NMR służących do wyznaczania

różnych parametrów molekularnych. Najprostszy, jednoimpulsowy eksperyment

NMR w celu uzyskania tzw. widma jednowymiarowego polega na wzbudzeniu jąder

określonego typu przez dostarczenie do niewielkiej próbki o objętości ok. 1 mililitra, w

środku magnesu nadprzewodzącego (PLANSZA 19), impulsu pola magnetycznego B1 o

niewielkiej mocy (impuls radiowy) i odpowiedniej dla danego typu jądra częstosci.

Całkowita magnetyzacja jądrowa M układu (PLANSZA 18), czyli suma momentów

magnetycznych wszystkich jąder, ustawia się prostopadle do pola statycznego B.

Rejestruje się powrót M do stanu równowagi wzdłuż pola B czyli zanik wzbudzenia w

czasie, w wyniku oddawania przez wzbudzone jądra energii do otoczenia molekularnego w

tzw. procesach relaksacji bezpromienistej. Procesy relaksacji prowadzą do równowagi

22

układu jąder po zaburzeniu przez absorpcję energii impulsu i zachodzą z szybkością

opisaną przez dwa tzw. czasy relaksacji T1 i T2. Te czasy można mierzyć w odpowiednich

eksperymentach NMR i ich wartości wynoszą w granicach od milisekund do sekund.

Rejestracja zaniku sygnału rezonansowego i jego przetworzenie komputerowe z zależności

czasowej na częstotliwościową (transformacja Fouriera) otrzymuje się widmo NMR jąder

danego typu np. widmo 1H NMR,

13C NMR,

15N NMR itp.(dla wszystkich jąder I różne

od 0), czyli zależności intensywności sygnału od częstości impulsu, jak w każdej

metodzie spektroskopowej. Intensywność sygnału jest proporcjonalna do ilości jąder w

próbce a także zależy od typu jądra czyli . Dlatego w prostym jednoimpulsowym

eksperymencie NMR można uzyskać widmo jedynie dla jąder o dużej czułości czyli dużej

zawartości izotopowej, np. 1H. Nota bene, spektroskopia NMR jest techniką znacznie

mniej czułą od innych technik spektroskopowych. Aby zarejestrować widma NMR

takich jąder jak 13

C, których jest 1% w składzie izotopowym węgiel czy 15

N, których jest

0.3% trzeba albo stosować związki znakowane blisko 100% tymi izotopami lub stosować

wielokrotną rejestracją sygnału rezonansowego i dodawać te sygnały do siebie. W

przypadku większych biomolekuł stosuje się oba podejścia. W najbardziej optymalnych

warunkach pomiaru dowolnego widma NMR w roztworze (1H NMR,

13C NMR itd.)

wymagane są rutynowo stężenia substancji rzędu 1 milimola w próbce ok. 1 ml, czyli

10 mg białka czy fragmentu kwasu nukleinowego o masie cząsteczkowej 10 kDa (i

odpowiednio więcej miligramów przy wzroście masy cząsteczkowej biomolekuły).

Najnowocześniejsze rozwiązania w zakresie detekcji sygnału (kriosondy) pozwalają

obniżyć stężenia do kilkudziesięciu mikromoli.

Postać widma zależy w decydującym stopniu od stanu skupienia układu

cząsteczkowego. Jądra danego typu cząsteczki w stanie stałym dają jedną szeroką linię

rzędu kilka- do kilkudziesięciu tysięcy Hz (kHz) szerokości. W cieczach i roztworach (a

także gazach) obserwuje się na widmie szereg wąskich linii o szerokościach od

dziesiątych części Hz dla małych cząsteczek organicznych do kilkudziesięciu Hz dla

biopolimerów. Przykładowe widmo np. 1H NMR prostej cząsteczki bromku etylu

(PLANSZA 20) pokazuje kilka charakterystycznych cech, które zadecydowały o

niezwykle szerokim zastosowaniu tej techniki, od fizyki ciała stałego po medycynę

kliniczną.

(A) Częstości rezonansowe poszczególnych protonów w cząsteczce różnią się wskutek

przesłaniania (ekranowania) zewnętrznego pola magnetycznego przez elektrony. Zjawisko

23

to nazywa się przesunięciem chemicznym , które można mierzyć w jednostkach ppm

(parts per million) względem sygnału rezonansowego wybranego wzorca:

= [( − wzorzec)/wzorzec] 106

Protony grupy metylowej ulegają rezonansowi przy nieco innej częstości (mają inne

przesunięcie chemiczne) niż protony etylenowe. Podobnie byłoby z sygnałami węgli 13

C.

Różnice częstości w ramach jednego typu jądra w różnych otoczeniach chemicznych

są rzędu kilku do kilkudziesięciu kHz a więc znacznie mniejsze niż różnice częstości

rezonansowych pomiędzy jądrami różnych typów, które wynoszą MHz - tysiąc razy

więcej.

(B) Sygnały rezonansowe poszczególnych jąder w cząsteczce mogą się rozszczepiać

wskutek tzw. sprzężeń skalarnych z innymi jądrami, takimi samymi i innego typu.

Sprzężenia skalarne zachodzą przez elektrony wiązań. Odpowiednie różnice położeń linii

w multipletach noszą nazwę stałych sprzężenia między każdymi dwoma jądrami, i-tym i j-

tym J(i,j). Wynoszą kilkaset - kilkadziesiąt Hz gdy oba sprzęgające się jądra dzieli jedno

wiązanie i szybko maleją do zera gdy ilość wiązań staje się większa niż 4. Z reguły

obserwuje się niezerowe sprzężenia dla jąder oddzielonych o 1 do 3 wiązań.

(C) Na podstawie widma danego typu można więc zidentyfikować poszczególne jądra

w cząsteczce czyli wykonać tzw. przyporządkowanie sygnałów widma NMR jądrom.

W przeciwieństwie do tego typu widm wysokiej zdolności rozdzielczej ("high

resolution") widmo naszego bromku etylu w ciele stałym dałoby jedną szeroką linię

pokrywającą cały zakres przesunięć chemicznych. Nie można wtedy identyfikować

poszczególnych jąder ale można z analizy kształtu tej linii wnioskować o parametrach

kryształu i samej cząsteczki (zagadnieniami NMR w ciele stałym nie będziemy się dalej

zajmować). Zależność widma NMR od struktury chemicznej cząsteczek legła u podstaw

niezwykle szerokiego zastosowania metody (PLANSZA 21). Najważniejsze z

biologicznych zastosowań to:

(I) BIOFIZYKA MOLEKULARNA:

(a) identyfikacja struktury chemicznej związków w roztworze;

(b) wyznaczanie struktury przestrzennej cząsteczek o znanej strukturze chemicznej,

zarówno małych molekuł organicznych jak i dużych polimerów biologicznych;

(c) analiza oddziaływań międzycząsteczkowych, np. z porównania widm

kompleksów molekularnych i cząsteczek składowych.

24

(II) BIOCHEMIA: śledzenie metabolizmu w żywych komórkach i tkankach na

podstawie rejestracji widm „in vivo NMR” i badanie dużych biopolimerów in vivo

metodami „in cell NMR”.

(III) MEDYCYNA KLINICZNA: nieinwazyjne obrazowanie narządów

wewnętrznych i tkanek oparte na zjawisku NMR - magnetic resonance imaging MRI.

Pierwsza klasa zagadnień jest najbardziej istotna z punktu widzenia głównej tematyki

wykładu, ale będą również omówione w skrócie podstawy pozostałych, istotnych dla

biologa zagadnień, in vivo NMR i MRI.

NMR w badaniach białek i fragmentów kwasów nukleinowych zwykle znajduje

zastosowanie w wyznaczaniu struktur przestrzennych tych biomolekuł o znanych

sekwencjach monomerów (znanej budowie chemicznej) w roztworze wodnym. Widmo

1H NMR niewielkiego białka 58 aminokwasów BPTI (inhibitor trypsyny trzustki wołowej;

PLANSZA 22) wskazuje na brak możliwości przyporządkowania sygnałów protonom

cząsteczki. Można "z grubsza" podać zakresy sygnałów protonów łańcuchów bocznych

alifatycznych np. treonin, aromatycznych np. tyrozyn, H i NH łańcucha peptydowego.

Opracowano więc eksperymenty NMR polegające na dostarczeniu do układu jądrowego

cząsteczki kilku impulsów i detekcji sygnału rezonansowego pod ich działaniem. W ten

sposób można zarejestrować widma dwuwymiarowe 2D NMR (PLANSZA 23). W

widmach tego typu obserwujemy sygnały pochodzące od par jąder, np. pary protonów o

różnych przesunięciach chemicznych lub dowolnej pary innych jąder, z których jedno jest

zazwyczaj protonem, i które oddziałują ze sobą magnetycznie.

Istnieją zasadniczo dwa typy takich oddziaływań:

(a) sprzężenie skalarne (omówione) momentów magnetycznych jąder przez elektrony

wiązań - różne od zera stałe sprzężenia J i rozszczepienia linii rezonansowych;

(b) oddziaływania dipolowe momentów magnetycznych jąder "przez przestrzeń";

intensywność oddziaływania rejestruje się poprzez intensywność pozadiagonalych

sygnałów widma efektu Overhausera NOE (nuclear Overhauser effect; eksperyment na

PLANSZY).

Widmo w formie przestrzennej, trzeci wymiar - intenywność sygnału, zwykle przedstawia

się w postaci przekroju poziomicowego, gdzie na osiach znajdują się odpowiednie

25

przesunięcia chemiczne. Odseparowanie nakładających się sygnałów od

poszczególnych jąder wynika z:

(a) rozciągnięcia widma jednowymiarowego w 2 wymiarach (jak elektroforeza 2D);

(b) rejestracja tylko tych sygnałów, które pochodzą od jąder oddziałujących ze sobą

magnetycznie; edycja czyli strata części sygnałów kosztem uproszczenia widma.

Jednakże w miarę wzrostu wymiarów biomolekuły nakrywanie się sygnałów wraca i dla

ich separowania rejestruje się widma trójwymiarowe (3D NMR; PLANSZA 24) a nawet

czterowymiarowe 4D NMR. Dzięki widmom wielowymiarowym 2D, 3D i 4D NMR

można uzyskiwać sygnały jednocześnie od protonów, węgli, azotów itd a także

kombinować ze sobą różne typy eksperymentów NMR np. rejestrować jednocześnie

sprzężenia skalarne i efekt NOE.

Wyznaczanie struktur przestrzennych białek i kwasów nukleinowych w

roztworze metodami NMR przebiega według następującego schematu (PLANSZA 25):

(A) Wykonanie przyporządkowania sygnałów NMR poszczególnym jądrom

cząsteczki o znanej sekwencji aminokwasów lub nukleotydów: przypisanie sygnałów

poszczególnym typom monomerów (aminokwasy, nukleotydy) i przyporządkowanie

sekwencyjne wzdluż łańcucha na podstawie znanej sekwencji i rejestrowanym

oddziaływaniom skalarnym i dipolowym jąder na sąsiednich monomerach (w miarę

standardowa procedura, której nie będę omawiał).

(B) Wyznaczenie parametrów opisujących strukturę przestrzenną cząsteczki:

- odległości proton − proton lub proton − heterojadro z efektu Overhausera;

intensywność oddziaływania dipolowo - dipolowego NOEij zależy jak rij-6

od odległości

między tymi protonami;

- kąty dwuścienne ij wokół wiązań z wartości stałych sprężenia skalarnego dwóch

jąder odległych o trzy wiązania (relacja Karplusa): 3J(i,j) = Acos

2ij + Bcosij + C, A,

B, C -stałe zależne od typu fragmentu chemicznego i rodzaju sprzęgających się jąder i-

tego i j-tego;

- inne parametry np. resztkowe sprzężenie dipolowe RDC (nie omawiam), które dają

informację o „globalnych” relacjach przestrzennych fragmentów molekularnych, np.

wzajemnym ustawieniu fragmentów drugorzędowych białek;

26

(C) Przejście od odległości, kątów i innych informacji przestrzennych na podstawie

struktury chemicznej (długości wiązań, kąty płaskie) do położeń zrębów atomowych

cząsteczki czyli współrzędnych atomowych:

- metody geometryczne tzw. geometria odległościowa (distance geometry);

- dynamika molekularna z wiązami doświadczalnymi NMR rMD.

(D) Weryfikacja uzyskanej struktury.

Przebieg łańcucha peptydowego czynnika 4E inicjującego translację w eukariotach, w

postaci zbioru 20 niskoenergetycznych struktur zgodnych z parametrami (więzami) z

eksperymentów 3D NMR, prezentuje PLANSZA 26. Dla porównania: 5 nałożonych

struktur białka BPTI, pierwszego, dla którego wyznaczono strukturę metodami 2D NMR.

Istnienie kilku podobnych struktur wynika z niepewności wartości doświadczalnych

parametrów: odległości proton-proton i kątów dwuściennych ALE jednocześnie większe

odchylenia w poszczególnych fragmentach sugerują obszary o większej ruchliwości

(dynamiczne) w białku.

Podobnie, strukturę przestrzenna w ramach nakreślonego schematu (A) - (D)

można uzyskać dla biomolekuł w ciele stałym - próbki proszkowe, co ma szczególne

znaczenie w przypadku białek nierozpuszczalnych i niekrystalizujących, takich jak

białka strukturalne, formy amyloidalne i (częściowo) białka błonowe. Zastosowanie

eksperymentów wieloimpulsowych i wielowymiarowych z użyciem techniki szybkiego

wirowania próbki ustawionej pod kątem tzw. „magicznym” (54,7 deg) w polu B, z

częstością kilkunastu - kilkudziesięciu tysięcy obrotów na sekundę MAS (magic angle

spinning) daje widma wysokiej zdolności rozdzielczej w ciele stałym.

27

Wykład 5

Widmo NMR można rejestrować nie tylko dla wyizolowanego związku

chemicznego w odpowiednio przygotowanej próbce ale także in vivo, dla nienaruszonych

zawiesin komórek bakteryjnych, roślinnych i drożdżowych, wypreparowanych tkanek lub

ich fragmentów w zapewniających ciągłość procesów metabolicznych specjalnych

układach perfuzyjnych, lub całkowicie nieinwazyjnie, dla wybranego obszaru całego

żywego organizmu, umieszczonego wewnątrz magnesu aparatu NMR. Te ostatnie

eksperymenty wymagają dodatkowego zastosowania technik obrazowania, o których

powiem w dalszej kolejności. W warunkach eksperymentu in vivo NMR (in vivo MRS -

magnetic resonance spectroscopy) wysokiej zdolności rozdzielczej rejestruje się sygnały

pochodzące od jąder cząsteczek metabolitów wykazujących:

(a) stosunkowo niewielką masę cząsteczkową;

(b) dostateczną ruchliwość tzn. nie związanych w kompleksach molekularnych lub w

błonach;

(c) dostatecznie wysokie stężenie powyżej ~10 M.

Nie rejestruje się sygnałów pochodzących od biopolimerów i struktur komórkowych w

stałym stanie skupienia. Przykładowe widma 31

P NMR, 13

C NMR, 1H NMR,

14N NMR

mięśnia wołowego (PLANSZA 27) pozwalają zidentyfikować szerg różnych metabolitów,

m. in. zawierającą fosfor fosfokreatynę i ATP, kwas mlekowy, dwupeptyd karnozynę,

glikogen. Wykonując widma NMR w określonych odstępach czasu można śledzić zmiany

zawartości metabolitów i ich przekształcanie w inne metabolity, np. wnikanie związku

do komórek i reakcje biochemiczne zachodzące wewnątrz. Przykładowo, zasadnicze

reakcje w mięśniach (PLANSZA 28) to transfer reszty fosforanowej między

wysokoenergetycznymi związkami: ATP i fosfokreatyną, katalizowany przez kinazę

kreatyny i hydroliza ATP do ADP. W procesie niedotlenienia mięśnia sercowego

(PLANSZA 29) widać na widmie 31

P NMR początkowo spadek zawartości fosfokreatyny

a następnie wyczerpywanie sie ATP i powstawanie fosforanu nieorganicznego. Powtórne

doprowadzenie tlenu przywraca poziom ATP i fosfokreatyny.

Podobna technika „in cell NMR” stara się uzyskać dane na temat białek w

naturalnym środowisku komórkowym. Rejestruje się widma białek wzbogaconych C-

13/N-15 wytwarzanych w komórce w odpowiednim stężeniu w procesie sterowanej

ekspresji. Chociaż jeszcze nie wyznacza się standardowo dokładnych struktur

28

przestrzennych białek z rozdzielczością atomową, ale badania zmierzają w tym kierunku

(Hamasu et al. J. Am. Chem. Soc. 135, 1688, 2013)

NMR pozwala również na nieinwazyjne obrazowanie struktur wewnętrznych

organizmu (PLANSZA 30) głównie poprzez mapowanie protonów wody, której zawartość

zmienia się w zależności od typu tkanki: mała zawartość w kościach, znaczna i

zróżnicowania w tkankach miękkich i największa w płynach ustrojowych (krew). W

przeciwieństwie do rejestracji widm w małej próbce (spektroskopia), na podstawie sygnału

1H NMR buduje się obraz tkanek i narządów wewnętrznych: MRI (magnetic resonance

imaging). Idea eksperymentu jest prosta. Gdybyśmy umieścili obiekt, np. dwa próbniki z

wodą w stałym polu magnetycznym Bo otrzymalibyśmy jeden zbiorczy sygnał NMR.

Jeżeli wzdłuż osi x ustawienia próbników przyłożymy liniowy gradient gx pola B

zjawisko rezonansu będzie zachodziło przy innych częstościach dla każdego z tych

próbników:

= (Bo + gxx).

Otrzymamy dwa sygnały osobno od każdego z próbników, a mierzonym różnicom

częstości rezonansowych odpowiada zmiana położenia x próbników:

x = /(gx).

Przykładając dwa gradienty gx i gy wzdłuż dwóch kierunków, o zmiennym czasie trwania

każdy, w eksperymencie dwuwymiarowego NMR rejestruje sie sygnały rezonansowe,

które można przetworzyć na obraz w postaci dwuwymiarowego przekroju przez obiekt

(kodowanie informacji o punkcie x przez modulację fazową rejestrowanego sygnału).

Złożenie kolejnych płaszczyzn uzyskiwanych przy pomocy trzeciego gradientu wzdłuż osi

z daje obraz trójwymiarowy. Obrazowanie wynika z różnic ilości protonów i czasów

relaksacji w sąsiednich punktach obiektu, przy czym te ostatnie decydują o kontraście. W

ten sposób ujawnią się zmiany chorobowe, np. tkanka nowotworowa daje inny sygnał

MRI niż normalna (PLANSZA 31). Można dodatkowo wprowadzać czynniki

kontrastujące w określone i pożądane miejsca.

Obrazować można bardzo różne obiekty, od całego człowieka do obiektów o

bardzo małych wymiarach - mikroskopia NMR, np. pojedynczej komórki (PLANSZA

32). W nowoczesnych aparatach MRS/MRI łączy się eksperymenty in vivo NMR i

obrazowanie spinowe przez rejestrację obrazu, wydzielenie pożądanego fragmentu i

rejestrację widma określonego typu od tego małego obszaru (PLANSZA 30). Tzw.

29

funkcjonalny MRI (fMRI) umożliwia rejstrację obrazów obszarów „pracującego” mózgu -

możliwość przyporządkowywania określonych typów aktywności grupom neuronów

(PLANSZA 33) i przeprowadzania eksperymentów psychologicznych (PLANSZA 34).

Rejestracja „czynnościowa” wynika z napływu krwi do aktywnych neuronów i zmian

własności magnetycznych żelaza w hemoglobinie wskutek redukcji.

(d) Rentgenografia czyli uzyskiwanie struktur przestrzennych cząsteczek w

monokryształach przez rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego jest najszerzej

stosowana metodą w przypadku białek, kwasów nukleinowych i ich kompleksów. Kryształ

molekularny np. białka (PLANSZA 35) tworzy regularną strukturę makroskopową

wynikającą z symetrii mikroskopowej jednej cząsteczki lub kilku cząsteczek w komórce

elementarnej sieci nkrystalicznej (PLANSZA 36). Przesuwanie takiej komórki wzdłuż

trzech osi a , b , c wypełnia całą przestrzeń bez pustych miejsc regularnie ułożonymi

cząsteczkami tworząc jedną z 14 możliwych sieci Bravais „abstrakcyjnych punktów”,

zebranych pod względem symetrii w 7 układów krystalograficznych. Obok symetrii

translacyjnej kryształ ma lokalną symetrię w każdym punkcie sieci, związaną z

odbiciami i obrotami wokół osi, czyli elementami symetrii cząsteczek w komórce (32

grupy symetrii, tzw. klasy). Wszystkie elementy symetrii mikroskopowej kryształu można

zebrać w przestrzenną grupę symetrii, jedną z 230 możliwych, i jednoznacznie

scharakteryzować przez podanie jej symbolu. Promieniowanie rentgenowskie o długości

fali rzędu odległości międzyatomowych (1 Å) ulega dyfrakcji, czyli ugięciu na

elektronach „atomów”. W pewnych kierunkach następuje interferencja wzmacniająca i

pojawia się prążek dyfrakcyjny zgodnie z prawem Bragga:

2dsin = n

n - liczba całkowita 1, 2, 3 itd.; d - odstęp płaszczyzn sieciowych (dających jeden prążek)

(A) Układ czyli położenie prążków dyfrakcyjnych jest uwarunkowany przez grupę

symetrii kryształu i wymiary komórki elementarnej (wartości a, b, c, i , );

(B) Intensywności prążków dyfrakcyjnych są uwarunkowane przez rodzaje

atomów i ich położenia w komórce elementarnej.

Mierząc intensywności poszczególnych prążków na dyfraktogramie można

wyznaczyć mapy gęstości elektronowej w komórce elementarnej a stąd wstawić w

odpowiednich miejscach poszczególne atomy i wiązania cząsteczki. Podstawowym

problemem w uzyskaniu mapy gęstości elektronowej z dyfraktogramu jest tzw. problem

30

fazowy. Wynika on stąd (PLANSZA 37), że zależny od położeń atomów i ich siły

rozpraszania czynnik strukturalny, który umożliwia wyliczenie intensywności prążków

dyfrakcyjnych, jest liczbą zespoloną F = a + bi = ba22

(cos + isin), i = 1 . Mając

strukturę można łatwo policzyć czynnik strukturalny F i intensywność I jako kwadrat jego

wartości bezwzględnej: I = |F|2. Aby wyznaczyć czynnik strukturalny z intensywności

trzeba niezależnie wyznaczyć fazę = arctg(a/b) dla każdego prążka, czyli liczbę z

przedziału [0, 360]. Problem fazowy rozwiązuje się jedną z trzech metod:

(1) podstawienie molekularne: zastosowanie znanych faz podobnych cząsteczek, które

podobnie wykrystalizowały, a których struktura przestrzenna w krysztale została już

wyznaczona;

(2) podstawienie izomorficzne MIR (multiple isomorphous replacement): rejestracja

dyfraktogramów od jednakowych (izomorficznych) kryształów: jeden „zwykły”, drugi i

trzeci z ciężkimi atomami (jonami) w każdej komórce elementarnej, silnie rozpraszającymi

promienie X, skąd można określić ich położenia w komórce jako punkt odniesienia;

(3) rozpraszanie anomalne w kilku długościach fali MAD (multiwave anomalous

diffraction) przy użyciu promieniowania synchrotronowego; w przypadku białek, które

zamiast metioniny z siarką zawierają selenometioninę.

Procedura wyznaczania struktury w krysztale jest następująca:

- uzyskanie kryształu o odpowiednio dobrej zdolności rozpraszania;

- wstawienie kryształu do dyfraktometru (PLANSZA 38) lub na wyjściu wiązki z

akceleratora, i zwykle szybkie zamrożenie (witryfikacja) kryształu w strumieniu ciekłego

azotu;

- uzyskanie dyfraktogramu w detektorze np. typu imaging plate (klisze fotograficzne

odeszły już do lamusa);

- wyznaczenie wstępnej struktury na podstawie intensywności prążków i

rozwiązanego problemu fazowego;

- iteracyjne uzgadnianie dyfraktogramu doświadczalnego i liczonego teoretycznie aż

do uzyskania wystarczającej zgodności opisanej przez tzw. czynnik R, który powinien być

mniejszy od 25%; czynnik R określa procentowe odstępstwo intensywności mierzonych

dla prążków na dyfraktogramie i liczonych teoretycznie dla danej struktury:

R = )obs(I/)]cal(I)obs(I[ kkk

k

31

)obs(Ik - obserwowana intensywność prążka dyfrakcyjnego

)obs(Ik - liczona teoretycznie intensywność prążka dyfrakcyjnego

Czynnik R zależy oczywiście od jakości kryształu (regularność, brak defektów), opisanej

przez tzw. zdolność rozdzielczą w Å: zdolność rozdzielcza poniżej 2Å zapewnia

określanie położeń wszystkich ciężkich atomów cząsteczki (tzn. z wyjątkiem wodorów) z

dokładnością do tysięcznych części Å. Jest to minimalna odległość między płaszczyznami

sieciowymi (rodzina płaszczyzn), które dają mierzalny prążek dyfrakcyjny.

Obok rozpraszania na monokryształach stosuje się rozpraszanie promieniowania X

na tzw. włóknach kwasów nukleinowych, wytrąconych z roztworu. Taki dyfraktogram

nie daje możliwości określenia struktury z dokładnością atomową, ponieważ włókno jest

regularne tylko w jednym kierunku. Pozwala jednak uzyskać wiele cennych informacji

strukturalnych np. o helikalności DNA czy RNA. Na podstawie rentgenografii włókien

Watson i Crick podali model podwójnej helisy DNA na początku lat 50-tych XX w.

Kluczowym zagadnieniem dla rentgenografii jest relacja między strukturą

przestrzenną biomolekuły w krysztale i jej strukturą natywną w roztworze wodnym lub

błonie, gdzie funkcjonuje. Kryształy białek i kwasów nukleinowych zawierają na szczęście

znaczne ilości wody, nawet do 60% masy kryształu. Jest to głównie woda

nieustrukturowana, nie związana w pierwszej strefie hydratacyjnej czy wewnątrz

cząsteczki, nieregularnie rozmieszczona w sieci krystalicznej i nie dająca wkładu do

prążków dyfrakcyjnych. Publikacja Garbuzynski et al. Proteins 60, 134, 2005 przedstawia

wyniki analizy rozbieżności metod NMR i rentgenografii dla 78 niehomologicznych

białek, dla których struktury uzyskano przy wykorzystaniu obu metod. Różnice w Å

mierzone wartościami parametru RMSD (root mean square deviation) czyli pierwiastka

średniego odchylenia kwadratowego położeń atomów okazały się bardziej znaczące w

przypadku 18 struktur. Zdarzają się także, chociaż stosunkowo rzadko przypadki

znaczących różnic konformacji w krysztale i roztworze, np. dla quadrupleksu

telomerowego DNA (Li et al. Nucleic Acids Research 33, 4649, 2005).

32

Wykład 6

(e) Bezpośrednie określanie struktur cząsteczek z rozdzielczością rentgenografii

czy NMR (poniżej 0,1 Å) nie jest możliwe jak na razie ani w mikroskopii optycznej ani

elektronowej. W mikroskopach optycznych granica dyfrakcyjna światła daje

rozróżnienie szczegółów powyżej 200 nm (2000 Å). Nowoczesne zdobycze optyki w

metodzie mikroskopii bliskiego pola NSOM (near-field scanning microscopy) czy

fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej pozwalają uzyskać teoretyczną rozdzielczość

ok. 20 40 nm. W przypadku najlepszych transmisyjnych mikroskopów elektronowych

pojedynczej cząsteczki w niskich temperaturach, tzw. cryoEM (cryo electron

microscopy), rozdzielczość uwarunkowana abberacją soczewek magnetycznych nie

przekracza 5 ÷ 10 Å. Do obrazowania EM wykorzystuje się falowe własności elektronu.

Porównywalną rozdzielczość jeśli chodzi o wyznaczanie kształtu makromolekuł

uzyskano za pomocą mikroskopów siły atomowej AFM (atomic force microscopy

PLANSZA 39). Pojedynczą makrocząsteczkę w kropli roztworu na płaskiej powierzchni

skanuje się bardzo ostrym rylcem. Siły molekularne van der Waalsa między ostrzem i

podłożem rzędu pikonewtonów (1 pN = 10-12

N) utrzymuje się na stałym poziomie

podczas skanowania dzięki ujemnemu sprzężeniu zwrotnemu: wychylenie wspornika po

natrafieniu na zakrzywienie powierzchni jest rejestrowane jako zmiana siły i

kompensowane odpowiednim przesunięciem rylca tak że odległość ostrze - powierzchnia

skanowania pozostaje stała. Służy do tego celu najczęściej wiązka laserowa odbita od

wspornika. W ten sposób rejestrowany jest obraz powierzchni, a więc dokładny kształt

umieszczonej na niej cząsteczki białka, kwasu nukleinowego czy kompleksu

molekularnego (PLANSZA 40). PLANSZA przedstawia fragment inicjacyjnego

kompleksu translacyjnego w eukaryotach, złożonego z trzech białek i mRNA,

przyczepionego 5'-końcem (cap) i 3'-końcem (poliA) do białek. Rejestracja obrazów w

czasie umożliwia śledzenie zmian w cząsteczkach w skali długoczasowej. W innym

modzie pracy mikroskopu AFM zaczepienie rylcem cząsteczki przytwierdzonej do

podłoża pozwala dokonywać manipulacji pojedynczą cząsteczką, poruszać nią i

rozciągać oraz mierzyć związane z tym siły molekularne od kilku do kilkuset pN, przy

odpowiednim wyskalowaniu wychyleń wspornika jak wagi sprężynowej, np. widmo sił

wymaganych do rozciągania kolejnych domen białka titin (PLANSZA 41).

Podobne manipulacje makrocząsteczką można wykonywać przy użyciu szczypiec

optycznych i szczypiec magnetycznych. W pierwszej metodzie przyczepia się do

33

makrocząsteczki paciorek dielektryczny, polistyrenowy lub krzemowy. Wiązka laserowa

utrzymuje paciorek w środku jak w pułapce (optycznej) i umożliwia jego przesuwanie

razem z przyczepioną cząsteczką. Przykład zastosowania (PLANSZA 42): śledzenie i

analiza ruchu cząsteczki białkowej kinezymy po mikrotubuli w postaci 8-nm skoków. W

szczypcach magnetycznych przyczepia się do cząsteczki paciorek ferromagnetyczny i pole

magnetyczne umożliwia zarówno przesuwanie jak i obracanie makrocząsteczki (przykład

będzie podany później w trakcie wykładu).

(f) Dynamika ruchów molekularnych cząsteczek biologicznych jest obok struktury

chemicznej i przestrzennej drugim zasadniczym elementem, który warunkuje mechanizm

działania na poziomie molekularnym. Opis dynamiki cząsteczki jest trudniejszy w języku

fizyki niż opis struktury. Podstawowym modelem jest model dyfuzyjny, w którym

cząsteczki wykonują przypadkowe ruchy:

(a) globalne translacje i obroty całej czasteczki;

(b) wewnętrzne ruchy lokalne: obroty wokół wiązań (zmiany konformacyjne), transfer

protonów i jonów między grupami naładowanymi;

(c) drgania wiązań, kątów płaskich i torsyjne (nieistotne z punktu widzenia biologii

układu molekularnego)

Mierzonymi doświadczalnie parametrami, które opisują ruchy tego typu są:

- średnie czasy życia danej formy przestrzennej [s] i średnie szybkości przejścia od

jednej formy do drugiej k = 1/ [s1

];

- średnie amplitudy ruchów, wyrażone w Å (zmiany odległości), stopniach (zmiany

kątowe) lub procentowo.

Parametry te wyznacza się najczęściej z:

(1) pomiarów czasów relaksacji T1 i T2 technikami NMR;

(2) pomiarów czasowych zmian anizotropii fluorescencji po wzbudzeniu

elektronowym cząsteczki impulsem (laserowym) światła spolaryzowanego liniowo;

Obrazy milisekundowych zmian strukturalnych uzyskuje się w rentgenografii

Lauego przy wykorzystaniu „białego” (niemonochromatycznego) promieniowania

rentgenowskiego dużej mocy z synchrotronu. Szybka, milisekundowa, rejestracja krok po

34

kroku obrazów dyfrakcyjnych daje jakby kolejne „klatki filmu” ewoluującego układu, np.

śledzenie reakcji enzymatycznej w krysztale odpowiednio zmutowanego białka

enzymatycznego dla zapewnienia spowolnienia katalizowanej reakcji enzymatycznej.

Bardzo dużo informacji o ruchach molekularnych nie tylko w postaci podanych

parametrów ale rejestracji zmian położeń poszczególnych atomów uzyskuje się za pomocą

komputerowych symulacji dynamiki molekularnej MD (molecular dynamics;

PLANSZA 43). Dla klasycznych "atomów" cząsteczki jako punktów materialnych

wyznacza się siły ze strony innych atomów z pola siłowego FF (potencjał V omówiony

poprzednio). Ruch atomów pod wpływem tych sił uzyskuje się z numerycznego

rozwiązania w komputerze równań Newtona w krótkich skokach czasowych ok. 1

femtosekundy (1 fs = 10-15

s) przez okres taki na jaki pozwalają nowoczesne

superkomputery tzn. do mikrosekund (1 ns = 10-6

s). W każdej chwili można podać obraz

przestrzenny cząsteczki, np. ewolucja podwójnej helisy DNA od klasycznej formy B do

bliższej rzeczywistości w roztworze formy nieregularnej (PLANSZA 44). Rozpuszczalnik

można traktować jak ośrodek ciągły o określonej stałej dielektrycznej albo uwzględniać

cząsteczki wody w równaniach Newtona na takich samych zasadach jak atomy cząsteczki

rozpuszczonej. Oczywiście można w ten sposób zaobserwować tylko takie ruchy

molekularne, których średnie czasy są krótsze od czasów symulacji ( < Tsymulacji).

Dynamikę molekularną stosuje się często do uzyskiwania struktur przestrzennych

cząsteczek na podstawie mierzonych parametrów NMR (PLANSZA 26), ponieważ układ

dąży do konformacji o minimalnej energii (swobodnej). Aby to zrobić w krótkim czasie,

krótszym niż dostępne czasy symulacji wprowadza się dodatkowe pseudosiły "ściągające"

cząsteczkę do konformacji opisanej znanymi z NMR parametrami przestrzennymi:

odległościami proton - proton i kątami dwuściennymi. Taką wersję MD nazywa się

dynamiką molekularną z więzami NMR, rMD (restrained molecular dynamics;

PLANSZA 43). Przykład ściągania rozwiniętego łańcucha peptydowego do formy -

helikalnej w czasie 10 ps przedstawia PLANSZA 45.

35

3. Budowa kwasów nukleinowych DNA i RNA.

Kwasy nukleinowe są liniowymi biopolimerami, zbudowanymi z zasadniczo

czterech monomerów, nukleotydów. Dwa podstawowe typy kwasów nukleinowych, DNA

i RNA, różnią się budową chemiczną nukleotydów i funkcjonowaniem w komórkach.

Kwas dezoksyrybonukleinowy DNA (PLANSZA 10) pełni rolę nośnika

informacji genetycznej. Składa się z 2'-deoksyrybonukleotydów: dwóch zawierających

zasady purynowe dGMP, dAMP, i dwóch pirymidynowych, dCMP i TMP, w których

cukrem jest -D-2'-deoxyrybofuranoza (-D-2'-deoxyryboza) (PLANSZA 46).

Numeracja w pierścieniach zasad i w części cukrowej (cyfry primowane) jest jednakowa

dla deoxy- i rybonukleotydów. Symbole i D opisują konfiguracją wokół atomów węgla,

odpowiednio C(1') i C(4'), podstawionych czterema różnymi podstawnikami. Takie

cząsteczki z asymetrycznym(i) atomem (atomami) węgla nie pokrywają się ze swoim

odbiciem zwierciadlanym i występują w postaci izomerów optycznych, skręcających

światło spolaryzowane liniowo w przeciwnych kierunkach. Zasada azotowa: guanina,

adenina, cytozyna i tymina, plus cukier czyli nukleozyd: 2'-deoxyguanozyna, 2'-

deoxyadenozyna, 2'-deoxycytydyna i tymidyna, łączą się ze sobą poprzez grupy

fosforanowe w nić polinukleotydową o wyróżnionym kierunku od 5'-końca do 3'-

końca. Sekwencja czyli kolejność nukleotydów (zasad) w kierunku 5' 3' określa

strukturę pierwszorzędową kwasu DNA. Podwójne helisy DNA o długości ponad 108bp

(par zasad), ok. 1010

÷1011

Da, po rozwinięciu osiągałyby kilka centymetrów.

W warunkach pH komórkowego grupy fosforanowe w nici polinukleotydowej są

zjonizowane i obdarzone ładunkiem ujemnym (pK ok. 1 - 2), zneutralizowane przez

kationy roztworu, np. K+, Na

+ czy Mg

2+. Grupy fosforanowe swobodnych nukleotydów

mogą oddysocjować dwa protony i w fizjologicznym pH zachodzi częściowo druga

jonizacja (pK2 ok. 6.5 - 7). Kwasy dezoksyrybonukleinowe powstają w procesie

semikonserwatywnej replikacji (eksperyment Meselsona - Stahla) w fazie S cyklu

komórkowego (PLANSZA 47): na dwóch niciach pierwotnych syntetyzowane są przez

polimerazy DNA nici potomne na zasadzie komplementarności: naprzeciw dA w matrycy

włączane jest T w postaci trifosforanu TTP, naprzeciw dG włączane jest dC, naprzeciw T

włączne jest dA a naprzeciw dC włączane jest dG. Powstaje w ten sposób helikalna

struktura DNA (PLANSZA 10). Niektóre wirusy syntetyzują DNA na matrycy RNA w

procesie odwrotnej transkrypcji.

36

Kwas rybonukleinowy RNA (PLANSZA 48) pełni szereg funkcji zależnie od

wielkości i struktury:

(a) mRNA - informacyjny (messenger RNA) jest roboczą matrycą do syntezy łańcucha

białkowego w procesie translacji; średnie długości pre-mRNA to ok. 6 000n a

dojrzałego mRNA ok. 1 500n (średnie białko globularne ok. 300 400 AA);

(b) rRNA - rybosomalny RNA jest składnikiem rybosomu; cząsteczki o długości od

120n do 4 700n;

(c) tRNA - transferowy RNA (75n do 90n) łączy się z właściwym dla siebie

aminokwasem i wprowadza go w miejsce na rybosomie, gdzie zachodzi włączanie do

powstającej nici peptydowej;

(d) snRNA - mały jądrowy (small nuclear) RNA jest składnikiem splicesome'u w

procesie składania mRNA w jądrze komórkowym - podobny do rRNA ale krótszy;

podobnie snoRNA (small nucleous) mały jąderkowy RNA;

(e) miRNA - mikro RNA, duża rodzina małych, ok. 20n, endogennych RNA o

funkcjach regulacyjnych;

(f) RNA wirusów - materiał genetyczny niektórych wirusów (HIV)

RNA (PLANSZA 46) składa się z rybonukleotydów: dwóch purynowych GMP,

AMP, i dwóch pirymidynowych, CMP oraz UMP - brak grupy metylowej w pozycji 5

uracylu w porównaniu z tyminą. Cukrem jest -D-rybofuranoza (-D-ryboza)

zawierająca 2'-OH w przeciwieństwie do 2’-deoksyrybozy w DNA. Rybonukleozydy:

guanozyna, adenozyna, cytydyna i urydyna łączą się w nić polinukleotydową poprzez

grupy fosforanowe. Sekwencja nukleotydów (zasad) w kierunku 5' - 3' wyznacza strukturę

pierwszorzędową RNA. Jonizacja grup fosforanowych jest podobna jak w przypadku

DNA. Kwasy rybonukleinowe powstają w procesie transkrypcji (PLANSZA 49):

polimerazy RNA syntetyzują nić polinukleotydową na matrycy jednej nici DNA, na

zasadzie komplementarności zasad: dA : U, T : A, dG : C i dC : G.

Badania krystalograficzne i spektroskopowe pokazują, że płaskie zasady azotowe

w krysztale i roztworze występują w dominujących formach tautomerycznych amino i

oxo (keto) (PLANSZA 46). Czułość bezpośrednich metod doświadczalnych sięga 99%

czyli 10-2

. Zmiana ustawienia protonów i reorganizacja wiązań podwójnych stwarza

możliwość powstawania mniejszościowych tautomerów imino i enolo (hydroxy)

(PLANSZA 50). Rzadkie tautomery były postulowane przez Watsona i Cricka (teoria

37

rozwinięta przez Topal i Fresco: Nature 263, 285, 1976) jako czynnik inicjujący mutacje

punktowe wskutek niekomplementarnego parowania zasad. Wiele nukleozydów z

modyfikowanymi chemicznie zasadami ma charakter promutagenny wskutek równowagi

tautomerycznej form o porównywalnej zawartości (populacji) z których każda może

parować komplementarnie z inną zasadą, np. izoguanozyna z równowagą form

iminoamino. Potwierdzenie hipotezy W.C. wymaga aby rzadkie formy tautomeryczne

występowały z częstością większą lub równą częstości mutacji punktowych, tranzycji i

transwersji (PLANSZA 51) nieskorygowanych przez mechanizmy naprawcze, czyli ok.

104

- jedna utrwalona, niekomplementarna para zasad na 104 nowosyntetyzowanych.

Obecność systemów naprawy DNA obniża częstości mutacji do 108

do 1011

.

Zagadnienie tautomerii zasad zwykłych i modyfikowanych stało się jednym z centralnych

problemów badań doświadczalnych i obliczeń kwantowomechanicznych w biofizyce.

Problem ten okazał się złożony m. in. ze względu na silny wpływ rozpuszczalnika na

równowagę tautomeryczną oraz przesuwanie tej równowagi w kompleksach zasad. Mimo,

że odkryto ok. 50% udział rzadkiej formy hydroksy w guanozynie i ok. 10% formy imino

w cytydynie techniką spektroskopii IR w niskotemperaturowych matrycach gazowych,

hipoteza inicjacji mutacji punktowych przez rzadkie formy tautomeryczne pozostaje

nierozstrzygnięta. Dla adenozyna i urydyny (tymidyny) szacuje się udział rzadkich

tautomerów poniżej 10-8

.

Konkurencyjną hipotezą (Sowers et al. Mutation Research 177, 201, 1987) jest

inicjacja mutacji punktowych przez błędne parowanie z udziałem zasad w formach

uprotonowanych i zdysocjowanych (PLANSZA 46). Stwierdzono, że adenina naprzeciw

cytozyny w syntetycznym, helikalnym 12-merze DNA (Nature 320, 552, 1986) w

krysztale jest uprotonowana (PLANSZA 52). Wartości pK naturalnych zasad różnią się o

ok. 3 jednostki od pH komórkowego co pozwala szacować prawdopodobieństwo

wystąpienia tych form na 10-3

. W końcu, eksperymenty z włączaniem przez polimerazę I

DNA trójfosforanu deoxyrybozydu z difluorotoluenem zamiast zasady (PLANSZA 53)

naprzeciw adeniny (Kool Biopolymers 48, 3, 1998) stały się podstawą stwierdzenia, że

błędne parowanie nie wymaga żadnych szczególnnych form a komplementarność

kształtu i steryczne dopasowanie zasad odgrywa nie mniejszą rolę niż komplementarność

wynikająca z układu wiązań wodorowych. Parowanie o mniejszej liczbie wiązań

wodorowych typu wobble G:T (PLANSZA 54) - błędne w DNA, jest "normalne" jako

G:U na trzecim miejscu parowania kodon mRNA : antykodon tRNA.

38

Wieloletnie badania zagadnienia tautomerii zasad kwasów nukleinowych

metodami doświadczalnymi i obliczenia kwantowe o zaawansowanym charakterze nie

rozstrzygnęły jednoznacznie zagadnienia inicjacji mutacji punktowych. Swój udział w tym

procesie mogą mieć zarówno rzadkie formy tautomeryczne, dysocjacja/jonizacja i błędne

parowanie wynikające z praw termodynamiki procesu (brak 100% dokładności).

Zasady w DNA i RNA są tzw. chromoforami czyli fragmentami molekularnymi

odpowiedzialnymi za absorpcję promieniowania elektromagnetycznego (PLANSZA

55) w zakresie UV (nukleotydy fluoryzują, ale bardzo słabo). Nałożenie pasm absorpcji

zasad daje wypadkową absorpcje DNA (RNA) w postaci dwóch charakterystycznych

pasm o maksimach przy 260 nm i 200 nm. Szczególnie to pierwsze jest wykorzystywane

we wszystkich detektorach do spektrofotometrycznej identyfikacji kwasów nukleinowych.

39

Wykład 7

Nukleotyd jest cząsteczką konformacyjnie "giętką" tzn. ze względu na

możliwość rotacji wokół wiązań pojedynczych występuje w roztworze w równowadze

dynamicznej szeregu konformacji (PLANSZA 56), o zbliżonych wartościach energii. W

krótkim czasie rzędu nanosekund (ns) konformery przechodzą jeden w drugi pokonując

niewielkie bariery energetyczne, nie przekraczające 25 kJ/mol czyli poniżej 10RT w

temperaturze pokojowej (RT jest miarą energii ruchów cieplnych). W makroskopowym

obrazie, każda z tych konformacji jest obsadzona przez pewien ułamek (procent)

wszystkich cząsteczek czyli tzw. populację. Każda konformacja jest scharakteryzowana

przez wartość kąta dwuściennego między wybranymi podstawnikami, przyłączonymi do

wiązania wokół którego zachodzi obrót, co obrazuje rzut Newmana. Według

nomenklatury komisji IUPAC-IUB (PLANSZA 57) poszczególnym zakresom kąta

dwuściennego odpowiada nazwa. Podstawniki mogą być następująco ustawione względem

siebie i zobrazowane w rzucie Newmana:

- transoidalnie czyli antiperiplanar (ap) lub anti z kątem dwuściennym ok. 180;

- cisoidalnie czyli synperiplanar (sp) lub syn z kątem dwuściennym ok. 0;

- naprzemiennie (gauche) czyli synclinical (sc), kąty dwuścienne ok. +60 lub −60.

Swobodne nukleotydy preferują następujące konformacje (PLANSZA 56):

(a) Zasada może wykonywać obrót wokół wiązania glikozydowego i przyjmować dwa

ustawienia: syn i anti, opisane przez wartości kąta O(4')C(1') N(1)C(2)

(pirymidyny) i O(4')C(1') N(9)C(4) (puryny). Zakres syn odpowiada 90 < <

+90 a zakres anti +90 < < 270 (90);

(b) Konformacja cukru jest opisana przez 5 kątów dwuściennych wewnątrz pierścienia;

Cukier nie jest płaski i może przyjmować dwa podstawowe formy (PLANSZA 58):

kopertową E, w której jeden atom pierścienia x jest wychylony w górę (endo) xE lub w

dół (exo) xE z płaszczyzny czterech pozostałych i skręconą T , w której dwa sąsiednie

atomy x i y są wychylone z płaszczyzny w przeciwne strony Txy . W modelu

pseudorotacji każda z tych konformacji jest opisana przez dwa parametry: kąt

pseudorotacji P od 0 do 360 i maksymalne pofałdowanie pierścienia max, które

zwykle zawiera się w graniczch 35 do 45 (kątowe wychylenie maksymalne). Tylko dwa

parametry jednoznacznie wyznaczają pięć kątów dwuściennych w pierścieniu (!)

Konformacje przechodzą jedna w drugą w sposób ciągły i cały zakres P obejmuje

40

wszystkie możliwe przypadki. W cyklopentanie pseudorotacja jest rzeczywistym ruchem

wewnętrznym cząsteczki nie wymagającym przechodzenia przez bariery energetyczne. W

pierścieniach podstawionych takich jak cukrowe dopuszczalne są tylko dwie konformacje

(PLANSZA 56), z zakresu N (north na kole pseudorotacji) z P od ok. 0 do 36, T32 do

T34 czyli wokół C(3')endo i z zakresu S (south na kole pseudorotacji), z P od ok. 135 do

190, T21 do T2

3 , wokół C(2')endo.

(c) Grupa egzocykliczna C(5')H2O obraca się wokół wiązania C(4')C(5') i może

przyjmować trzy klasyczne formy naprzemianległe +sc, -sc i ap, z kątami dwuściennymi

bliskimi odpowiednio +60, -60 i 180.

(d) Grupa fosforanowa może przyjmować w zasadzie trzy klasyczne formy wokół

wiązania C(5')O podobnie jak egzocykliczna, ale silnie preferowana jest jedna

konformacja ap z transoidalnym ustawieniem P i C(4'), kąt ok. 180. Ponieważ dla

nukleotydu w łańcuchu polinukleotydowym nie można jednoznacznie przypisać fosforanu

pozycji 5' trzeba również rozpatrywać 3'-nukleotydy. Fosforan preferuje silnie

konformację zbliżoną do transoidalnego ustawienia P i C(4') z kątem ~ 220 (40

odchylenia od ap).

Po włączeniu nukleotydu do łańcucha polinukleotydowego DNA lub RNA

pojawia się możliwość obrotu wokół wiązań fosfoestrowych i dodatkowe konformacje

opisane kątami i (PLANSZA 59). W sumie strukturę przestrzenną łańcucha

polinukleotydowego opisuje 6 wartości kątów dwuściennych dla każdego

nukleotydu, a pełen opis cząsteczki kwasu nukleinowego wymaga dodatkowo wartości

kąta glikozydowego oraz konformacji pierścienia cukru, parametry P i max (kąt ,

wspólny dla łańcucha i pierścienia nie definiuje jednoznacznie konformacji tego

ostatniego). Struktura przestrzenna cząsteczki kwasu nukleinowego może tworzyć różne

formy (typy) lokalne i globalne, które określa się terminem STRUKTUR

WYŻSZORZĘDOWYCH: drugorzędowych i trzeciorzędowych.

(a) Pierwszy krokiem w ustaleniu pełnej struktury cząsteczki kwasu nukleinowego

jest określenie sekwencji nukleotydów od 5'- do 3'-końca czyli STRUKTURY

PIERWSZORZĘDOWEJ. Naczelnym zadaniem genomiki jest ustalenie pełnej

sekwencji nukleotydowej DNA człowieka i innych organizmów. W czerwcu 2000 badacze

w ramach Human Genom Project i prywatna compania Celera Genomics ogłosiły

41

wykonanie sekwencjonowania DNA wszystkich chromosomów ludzkich - 6109 par

zasad (bp) na 46 chromosomach. Niezależnie od zastosowanej w obu przypadkach

techniki cząsteczkę DNA trzeba:

- pociąć endonukleazami (restrykcyjnmi) na krótkie fragmenty jednoniciowe;

- sklonować fragmenty (przypadkowe biblioteki), np. w E. coli;

- ustalić sekwencję każdego fragmentu przy pomocy jednej z dostępnych technik;

- złożyć sklonowane fragmenty we właściwej kolejności, np. „na zakładki” jednakowych

sekwencji’.

Uzyskana sekwencja stanowi kluczowe dane do annotacji regionów kodujących czyli

„określenie genów” (gene prediction strategy; Sleator Gene 461, 1, 2010).

Ustalanie sekwencji w krótkich fragmentach do ok. 400n można wykonać za pomocą

jednej z metod:

(1) chemiczne rozszczepianie Maxam-Gilbert'a, selektywnie w stosunku do typu zasady

(starsza, rzadko obecnie stosowana);

(2) kontrolowane przerywanie replikacji Sangera. (PLANSZA 60).

Metoda Sangera polega na enzymatycznej syntezie (polimeraza I) komplementarnej kopii

do nici DNA o poszukiwanej sekwencji. Materiał DNA czyli sklonowany fragment jest

rozdzielany na 4 porcje i dla każdej z nich jest prowadzona synteza, przerywana na ściśle

określonej zasadzie, komplementarnej do zasady analogu 2',3'-dideoxy-ATP, 2',3'-

dideoxy-GTP, 2',3'-dideoxy-CTP lub 2',3'-dideoxy-TTP, który po włączeniu do nici

terminuje syntezę wskutek braku 3’OH. Odpowiednia ilość 2',3'-dideoxy-NTP w każdej

z 4 reakcji zapewnia jego włączenie do nowo-syntetyzowanego DNA średnio 1:100 w

stosunku do zwykłych NTP. To zapewnia powstanie porównywalnych ilości fragmentów

różnej długości. Primery wymagane do zapoczątkowania działania polimerazy w każdym z

układów (lub same analogi 2',3'-dideoxy-NTP) posiadają inaczej fluoryzującą etykietę

(znacznik fluorescencyjny). Elektroforeza pod detektorami czułymi na 4 różne długości

fali pozwala identyfikować fragmenty różniące się długością o jeden nukleotyd i

zakończone na 3'-końcu określonymi zasadami (identyfikacja po długości fali emisji),

dając sekwencję nici komplementarnej, a stąd wyjściowej po uwzględnieniu primera.

Dominujacą techniką składania zsekwencjonowanych fragmentów we właściwej

kolejności jest whole-genome shotgun cloning (WGS) opracowany przez J. Craig Ventera

(Celera Genomics). Wykorzystuje się w tym celu komputery dużej mocy obliczeniowej,

które dopasowują „na zakładkę” miliony fragmentów we właściwej kolejności.

42

Oba etapy: sekwencjonowanie i składanie fragmentów można w pełni

zautomatyzować. W sekwenatorze ABI Prism3730XL (jeden z ostatnich modeli) stosuje

się do rozdziału elektroforetycznego CE (PLANSZA 14) 96 kapilar, co daje wydajność

ok. 1.6105 nukleotydów/doba. Łatwo policzyć, że sekwencjonowanie genomu ludzkiego

1.21010

n przy pomocy 100 maszyn trwa 2,5 roku. Celem praktycznym genomiki jest

opracowanie wysoce „zrównoległowionej” (massively parallel) techniki umożliwiającej

zsekwencjonowanie genomu (indywidualnego) człowieka w cenie ok. $1000 w

przeciągu ok. tygodnia; przegląd różnych platform sekwencyjnych: Mardis Nature

470, 198, 2011. Obiecująca jest technologia „high throughput” SOLEXA (Illumina Hi-

Seq 2000, poprawiona wersja SOLEXA Genome Analyser), gdzie w jednym przebiegu

sekwencjonowane jest kilkaset milionów przypadkowych, krótkich fragmentów DNA.

Krótkie (< 150n) fragmenty mocuje się do płaskiej, przepuszczającej światło powierzchni

celki przepływowej (flow cell) o gęstości ~10 mln fragmentów DNA/cm2. Fragmenty

namnaża się do ~1000 identycznych kopii każdy (bridge amplification) tak, że tworzą

klastry cząsteczek. Sekwencjonowanie polega na przyczepianiu i identyfikacji krok po

kroku pojedynczych, komplementarnych nukleotydów odwracalnie terminujących

syntezę przez polimerazę DNA. Identyfikacja jest oparta na wzbudzonej laserowo

fluorescencji etykiet o różnej długości fali emisji w przypadku każdego rodzaju

nukleotydu. Ze względu na krótkość fragmentów wydajne składanie całych sekwencji

odbywa się przez uszeregowanie względem sekwencji znanych, co zapewnia sukces przy

wyszukiwaniu różnic w stosunku do wzorca, np. identyfikacja różnic osobniczych, SNP

(single nucleotide polimorphism), ale raczej nie w sekwencjonowaniu nowego genomu.

Inne platformy sekwencyjne to: Roche 454 GS-FLX system, ABI SOLID sequencing

system, Pacific Biosciences (platforma III generacji).

Alternatywne podejścia sekwenatorów III generacji bazują na sekwencjonowaniu

POJEDYNCZEJ CZASTECZKI DNA - „minimum materiału, maksimum informacji”.

Przykładem jest praca opublikowana w 2006 r. (Greenleaf & Block Science 313, 801,

2006). Do jednego z końców DNA jest przyczepiony paciorek polistyrenowy

utrzymywany w laserowej pułapce szczypiec optycznych a drugie szczypce optyczne

trzymają paciorek polistyrenowy przyczepiony do polimerazy RNA, która na matrycy

DNA syntetyzuje nić RNA. Ruch polimerazy w trakcie transkrypcji zmienia długość

fragmentu nici DNA łączącej oba paciorki, co można rejestrować z dokładnością do kilku

Å czyli jednej pary zasad. Transkrypcje prowadzi się w 4 układach; w każdym z nich jeden

z czterech NTP jest w niskim stężeniu w stosunku do 3 pozostałych. Konieczność

43

włączenia mniejszościowego nukleotydu na zasadzie komplementarności z nukleotydem

matrycy DNA zatrzymuje na pewien czas ruch polimerazy a sekwencję nukleotydów

odczytuje się z „sekwencji zatrzymań”: pozycja włączenia vs. czas. Prawidłowość

odczytu wymaga właściwego uszeregowania względem siebie czterech zapisów na

podstawie regionów „flankujących” DNA o znanej sekwencji i znanych układach pauz

(odpowiednik primeru w metodzie Sangera). Długość sekwencjonowanego DNA jest

limitowana procesywnością polimerazy RNA czyli ok. 2000n, a dokładność ok. 95%.

(b) Globalna, funkcjonalna struktura przestrzenna DNA i RNA różni się od

siebie w znaczący sposób w wyniku odmiennych funkcji biologicznych obu rodzajów

kwasów nukleinowych. Bardzo długie cząsteczki DNA, 106bp (bakterie) ÷ 10

9bp

(chromosomy organizmów wyższych) są zintegrowane z białkami w nici

chromatynowej jako nośnik informacji genetycznej. Różne rodzaje RNA, o długości od

20n (miRNA) i 75-95n (tRNA) do ok. 5000 n (rRNA), przyjmują zróżnicowaną strukturę

globularną, raczej przypominającą białka globularne. Lokalne zwinięcie nici

polinukleotydowej i związane z tym różne formy struktury drugorzędowej są podobne w

DNA i RNA, i uwarunkowane przyjmowaniem określonych konformacji (PLANSZA

56) przez pojedyncze nukleotydy.

W omawianych łącznie strukturach drugorzędowe DNA i RNA można wyróżnić

następujące formy:

(1) helisy podwójne (dupleksy);

(2) helisy złożone z większej ilości nici, potrójne (tripleksy) i poczwórne (tetrapleksy

lub quadruplexy);

(3) pętle: typu szpilki do włosów (hairpin) i wewnętrzne w duplexach, oraz

wybrzuszenie (bulge).

Klasyczne dupleksy są złożone z dwóch przeciwnie skierowanych,

komplementarnych nici i zostały wymodelowane na podstawie obrazów dyfrakcyjnych we

włóknach. Wyróżnia się trzy główne rodziny helis podwójnych: B, A i Z (PLANSZA

61). DNA może występować w każdej z tych form drugorzędowych, natomiast RNA nie

występuje w formach z rodziny B ze względu na steryczne przeszkody między

fosforanami i 2'-OH. Każda z rodzin zawiera dodatkowe typy helis, nieco odmienne, ale o

podobnej strukturze, np. A', Z', a rodzina B: helisy C, D, E. Mogą również powstawać

helisy złożone z jednej nici DNA i jednej RNA (nie będę ich omawiał szczegółowo).

44

Niektóre z nich np. D czy E obserwuje się nie w DNA, ale w syntetycznych

polinukleotydach jak poli(dA-T), poli(dG-dC). Duplexy mieszane DNA/RNA powstają

przy transkrypcji. W każdej z tzw. klasycznych, regularnych helis wszystkie nukleotydy

składowe opisane są przez jeden zestaw wartości kątów dwuściennych czyli konformację

(PLANSZA 62; zaznaczone są nazwy konformacji w nukleotydach: grupa egzocykliczna

(), cukier przy kącie zdefiniowanym dla łańcucha () i zasada ()).

KĄTY DWUŚCIENNE

B-DNA

314 214 36 (+sc) 156 (S) 155 264 262(anti)

A-RNA

293 186 50 (+sc) 82 (N) 207 294 202(anti)

Z-DNA

dG

dC

52

250

207

192

187 (ap)

54 (+sc)

76 (N)

147 (S)

288

257

102

296

89 (syn)

201(anti)

PARAMETRY HELIKALNE

syme-

tria

Xk

skok

P (Å)

skok/

bp

h=P/X

skręt

=360/X

()

nachy-

lenie bp

()

środek

bp

D(Å)

duża

bruzda

S G (Å)

mała

bruzda

S G(Å)

B-

DNA

101

33.8

3.38

36

-6

0.5

11.7 8.5

5.7 7.5

A-

RNA

111

30.0

2.73

32.7

18

4.4

2.7 13.5

11.0 2.8

Z-

DNA

65

43.5

7.25

-60

(-45 -15)

-5

brak

3.7 8.8

Podane parametry różnią się w niewielkim stopniu w przypadku A-RNA i A-DNA oraz Z-

DNA i Z-RNA. Wartości kątów dwuściennych w pełni opisują konformację helis, ale nie

oddają wizualnie kształtu poszczególnych helis. Dlatego wprowadza się tzw. parametry

helikalne. Helisa ma symetrię śrubową oznaczaną symbolem Xk. Obrót helisy o kąt =

k360/X i jednoczesne przesunięcie wzdłuż osi o (k/X)P, gdzie P jest długością jednego

skrętu helisy (PLANSZA 63), zachowuje te same co poprzednio położenia

poszczególnych nukleotydów. Symetria nie jest pełna, gdyż taka operacja nie

przeprowadza atomów w identyczne atomy, ale całe nukleotydy w inne, niekoniecznie

identyczne nukleotydy. Helisa może być prawoskrętna jak B lub A gdy obrót zachodzi

45

zgodnie z ruchem śruby prawoskrętnej lub lewoskrętna jak Z, gdy jest przeciwny. Obrót o

300 w prawo i przesunięcie o 5/6 skoku jest równoważny obrotowi o -60 czyli w lewo i

przesunięciu o 1/6 skoku. W przypadku helis A i B każdy nukleotyd przechodzi w sąsiedni

wzdłuż nici lub para zasad (nukleotydów) komplementarnych w sąsiednią parę - każdy

nukleotyd jest równoważny. W helisie Z, którą zaobserwowano dla naprzemiennych

sekwencji poli(dG-dC) i poli(G-C), cytozyna nie jest równoważna konformacyjnie

guanozynie (PLANSZA 62) i dwunukleotydowy fragment przechodzi w

dwunukleotydowy fragment obok w sekwencji lub dwie pary zasad komplementarnych w

dwie pary zasad komplementarnych. Na jedną parę zasad przypada skręcenie kolejno o 45

i 15. Z parametrów helikalnych widać charakterystyczne cechy kształtu helis (PLANSZA

61): nachylenie par zasad do osi opisane kątem : małe dla B i Z, duże dla A, odstęp

geometrycznego środka par zasad od osi helisy D, i wielkość dwóch wcięć w walcowym

kształcie helis, dużej i małej bruzdy, o szerokości Sz i głębokości Gł. Dupleksy są

stabilizowane przez dwa rodzaje oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych:

(1) wiązania wodorowe w parach zasad komplementarnych, trzy w parze GC i dwa w

parze AT;

(2) oddziaływania warstwowe (stacking) między sąsiednimi parami zasad

oraz

(3) oddziaływanie z rozpuszczalnikiem: odpychanie elektrostatyczne ujemnie

naładowanych nici jest ekranowane przez dodatnie kationy związane z ujemnymi

resztami fosforanowymi.

Trzy wiązania wodorowe oraz stacking są silniejsze w przypadku par GC, a więc

fragmenty helis DNA i RNA bogate w te pary są stabilniejsze niż obszary bogate w pary

AT lub AU.

Ostateczne potwierdzenie struktury helikalnej kwasów nukleinowych nastąpiło

dopiero po badaniach krystalograficznych na monokryształach (a nie włóknach) i NMR

w roztworze, krótkich, syntetycznych fragmentów self-komplementarnych. Miało to

szczególne znaczenie dla DNA, gdzie cały model przekazu informacji genetycznej: kod

genetyczny, replikacja i transkrypcja jest oparty na strukturze podwójnej helisy.

46

Wykład 8

Badania krótkich fragmentów helikalnych DNA i RNA rzędu jednego skrętu helisy

pokazały, że struktura helis najczęściej odbiega od regularnej, klasycznej i każdy

nukleotyd jest opisany przez indywidualny, nieco różny, zestaw kątów dwuściennych. W

dalszym ciągu jednak nieregularne helisy należą do ściśle określonej rodziny A, B lub Z.

Trzeba więc wprowadzić więcej parametrów helikalnych opisujących te nieregularności

(PLANSZA 64); głównie chodzi o nieregularności we wzajemnym ustawieniu zasad, co

przenosi się na nieregularności łańcucha fosfocukrowego. Parametry te mają zerowe

wartości w helisach regularnych. Podane już parametry: , h, i D dalej obowiązują,

ale mają inne wartości w każdym fragmencie helisy (PLANSZA 65). Przykład

nieregularnej helisy A-RNA w monokrysztale pokazuje (PLANSZA 66), m. in. załamania

samej osi helisy, która w helisach regularnych jest linią prostą.

Przyjęcie przez DNA i RNA określonego typu struktury helikalnej jest uwarunkowane

przez dwa czynniki:

(1) sekwencja zasad:

(2) warunki środowiska: temperatura, stężenie soli, pH, warunki krystalizacji.

W krysztale obserwuje się krótkie DNA we wszystkich trzech formach: A, B i Z. Forma Z

wymaga naprzemiennych sekwencji dG-dC. RNA występuje w krysztale w formie A a

naprzemienne sekwencje G-C w formie Z. W roztworze wodnym fragmenty DNA

występują w formie B. Dodanie etanolu wymusza formę A. Naprzemienne sekwencje dG-

dC (DNA) i G-C (RNA) przechodzą w Z przy znacznych stężeniach soli, przy czym

formie Z znacząco sprzyja metylacja cytozyny w pozycji 5. Natywne, funkcjonalne

DNA przyjmuje najprawdopodobniej wszystkie trzy typy form helikalnych - istnieją

dowody biologiczne na obecność formy Z (przeciwciała anty-Z).

Struktura helikalna jest stabilna w roztworze w określonych warunkach

środowiska. Wzrost temperatury, obniżenie stężenia soli - szczególnie w przypadku

krótkich helis, skrajne pH powodują denaturację helisy i przejście do formy

pojedynczoniciowej. Proces jest odwracalny i helisa odtwarza się przy powrocie do

warunków sprzyjających. Takie odwracalne topienie helis np. wywołane zmianami

temperatury można go śledzić (PLANSZA 67) np.:

(a) spektrofotometrycznie w maksimum absorpcji UV 260 nm: absorpcja helisy jest

mniejsza niż dwu pojedynczych nici - hypochromazja;

47

(b) kalorymetrycznie (DSC – differential scanning calorimetry; różnicowa kalorymetria

skaningowa): zmiana pojemności cieplnej układu.

Topienie i powstawanie helisy zachodzi w wąskim przedziale temperatur i ma charakter

kooperatywny: przy tworzeniu helisy już utworzona struktura sprzyja łączeniu się

następnych par zasad i proces przypomina zamykanie zamka błyskawicznego; stała

równowagi K = sN, gdzie N- ilość nukleotydów w łańcuchu, - parametr nukleacji ~10

4,

s - parametr propagacji helisy ~10 dla T << Tm. W temperaturze Tm, tzw. temperaturze

topnienia helisy, współistnieje 50% formy helikalnej i 50% pojedynczo-niciowej. Im

wyższa wartość temperatury topnienia tym stabilniejsza helisa. Wzrost Tm następuje przy:

(a) wzroście długości helisy;

(b) wzroście stężenia soli w roztworze - lepsze ekranowanie ujemnych ładunków

fosforanów;

(c) wzroście zawartości par zasad GC - liniowa zleżność Tm od % par GC.

"Spłaszczanie" profilu topienia i jego "pofałdowanie" świadczy o zmniejszeniu

kooperatywności przejścia helisa - pojedyncze nici. Topienie i odtwarzanie helisy może

wtedy następować niezależnie w różnych fragmentach i charakteryzować się nie jedną ale

kilkoma wartościami Tm. Zmiany warunków środowiska mogą prowadzić również do

przekształcenia jednej formy helikalnej w inną, np. do przejść AB czy BZ.

Przykładowo, przy dużej zawartości naprzemiennych sekwencji dGdC znaczne stężenie

soli (chlorek litu) wymusza przejście od B-DNA do Z-DNA (PLANSZA 68) lub od A-

RNA do Z-RNA. Zanik formy B i pojawianie się formy Z widać na widmach 31

P NMR:

zanik pojedynczego sygnału od równoważnych fosforów formy B i powstawanie dwóch

sygnałów od nierównoważnych fosforów formy Z wskutek "załamania" łańcucha

fosfocuktrowego i nierównoważność chemicznego otoczenia fosforów: dGpdC i dCpdG.

W końcu lat 90-tych XX w. pojawiły się prace dotyczące kilku nowych, ciekawych

struktur helis podwójnych. M-DNA jest kompleksem DNA z dwuwartościowymi jonami

metali Zn+2

, Co+2

lub Ni+2

(PLANSZA 69). W warunkach lekko alkalicznych (pH > 8)

(badania NMR) protony iminowe NH wiązań wodorowych par komplementarnych

wymieniają się na jony metali, co wprawdzie w niewielkim stopniu modyfikuje strukturę

typu B-DNA ale nadaje helisie własności przewodzącego drutu molekularnego.

Praca Allemand et al. w PNAS (PLANSZA 70) relacjonuje uzyskanie nowej

struktury w 17 kDa plazmidowym B-DNA o dodatniej superskrętności (bufor fosforanowy

pH 8). W wyniku zastosowania szczypiec magnetycznych, ciagnięcie ze skręceniem z siłą

48

3 pN magnesem za paciorek magnetyczny przyczepiony do jednego końca helisy łączem

streptavidynabiotyna; drugi koniec unieruchomiony na płaskiej powierzchni szklanej

łączem digoxygenin (DIG)przeciwciało (antyDIG), daje tzw. strukturę P-DNA. Struktura

ta, dłuższa o 75%, z łańcuchami fosfocukrowymi splecionymi w środku, zasadami na

zewnątrz, 2.62 nukleotydu na skret helisy, była postulowana przez Corey’a i Paulinga w

1953 r. jako konkurencyjny model w stosunku do Watsona & Cricka. Pojawiły się

doniesienia o możliwości tworzenia tego typu struktury in vivo w fagu Pf1.

xDNA (PLANSZA 71), nazwa wzięta z nomenklatury oznaczeń rozmiarów

garderoby (X large) jest eleganckim przykładem modelowania molekularnego. Rozmiary

zasad azotowych zwiększono przez wprowadzenie dodatkowych skondensowanych

pierścieni benzenu TxT i dAdxA, bez naruszenia układu potencjalnych wiązań

wodorowych. Pojedyncze dupleksy z udziałem powiększonych zasad: xT:dA i T:dxA

destabilizują wprawdzie helisę, ale DNA zbudowane z naprzemiennych sekwencji tego

typu par lub helisy z jedną nicią xT a druga dA jest stabilniejsze niż analogiczne,

zwykłe DNA, ze względu na wzrost stackingu.

Podobnie jak w przypadku struktur duplexów zmiany warunków środowiska przy

odpowiedniej sekwencji nukleotydów oraz oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe mogą

prowadzić do przejścia cząsteczki kwasu nukleinowego w różne od helisy podwójnej

struktury drugorzędowe. W helisach podwójnych, złożonych z jednej nici

homopurynowej i jednej homopirymidynowej, poli(dA)poli(T), poli(A)poli(U),

poli(dA)poli(U), poli(A)poli(T), oraz w podobnych z udziałem G i C: poli(dG)poli(dC)

itd., w obecności jonów magnezu Mg+2

następuje rozseparowanie nici jednej z helis i

powstanie helisy potrójnej czyli tryplexu i jednej nici pojedynczej:

2poli(dA)poli(T) = poli(T)poli(dA)poli(T) + poli(dA)

2poli(dG)poli(dC) = poli(dG)poli(dG)poli(dC) + poli(dC)

lub w obniżonym pH (5-6):

2poli(dG)poli(dC) = poli(dC+)poli(dG)poli(dC) + poli(dG)

poli(dA)poli(T) + poli(dG)poli(dC) = poli(dA+)poli(dG)poli(dC) + poli(T)

i podobnie dla nici RNA i nici mieszanych DNA/RNA. Trzecia nić wiąże się w dużej

bruździe helisy podwójnej i wiąże z jedną z nici duplexu poprzez parowanie typu

Hoogsteena (PLANSZA 72). Długości dwóch wiązań wiązań wodorowych Hoogsteena są

takie jak W.C., 2.8 2.9 Å a kąty D-H...A nie odbiegają więcej niż 20 od liniowości;

49

podobne energie stabilizacji w obu typach parowania. PLANSZA obrazuje tryplex DNA

zbudowany z pojedynczej nici DNA o odpowiednio dobranej sekwencji. Tryplex jest

biologicznie ważną strukturą przejściową w procesie rekombinacji DNA (general

recombination; crossing over; mejoza) (PLANSZA 73), który prowadzi do wymiany

części nici w dwóch homologicznych podwójnych helisach DNA.

Homopirymidynowe nici oligo(dC) w obniżonym pH ok. 4.5 mogą tworzyć

ciekawą strukturę tetrapleksu, tzw. I-motif DNA (PLANSZA 74), złożoną z dwóch

równoległych dupleksów (a nie antyrównoległych jak w zwykłych duplexach).

Równoległe duplexy są stabilizowane przez 3 wiązania wodorowe dC+:dC i ustawione

antyrównolegle do siebie z naprzemiennym stackingiem par cytozynowych, tzn. para od

jednego duplexu interkaluje między dwie pary drugiego. Cała helisa jest prawoskrętna, jej

wszystkie cztery nici są konformacyjnie równoważne i należą do rodziny B-DNA. Motyw

występuje w wielu przypadkach DNA zawierających trakty oligoC/oligoG (nici bogate w

cytozyny) w Tetrahymena thermophilia, telomerach chromosomów ssaczych (3’-

"zwisające", niezwiązane komplementarnie końce chromosomów eukaryotycznych),

sekwencjach centromerycznych i promotorach onkogenów związanych ze wzrostem i

proliferacja komórek.

Inną strukturę tetrapleksową (G-quadruplex) mogą wykazywać fragmenty DNA

bogate w guanozyny, komplementarne do fragmentów bogatych w cytozyny, zawierające

sekwencje tandem repeat d(AlubT)(14)dG(18), np. w telomerach. Badania NMR w

roztworze pokazały przechodzenie w obecności jonów K+ dupleksów

d(G3T4G3)/d(C3A4C3) (PLANSZA 75) w dwuniciowe tetrapleksy d(G3T4G3)2 i dwie nici

pojedyncze d(C3A4C3). Stabilizacja 4xdG zachodzi poprzez parowanie Hoogseen'a.

DNA i RNA mają potencjalna możliwość tworzenia helis równoległych

stabilizowanych przez wiązania wodorowe par A:T typu odwrócona para W.C. (reverse

W.C.; do samodzielnego narysowania). Postuluje się, że psDNA (parallel stranded DNA)

może mieć istotne znaczenie w regulacji replikacji, transkrypcji, splicingu itd. Helisę

równoległą zaobserwowano we fragmencie 12-merowym:

5’-d(CCATAATTTACC-3’

5’-d(CCTATTAAATCC-3’

o pełnej komplementarności środkowego oktameru w ustawieniu równoległym i braku

komplementarności w ustawieniu antyrównoległym (Parvathy et al. Nucleic Acids Res.

30, 1500, 2002). Helisa jest dodatkowo spinana przez pary C+:C na końcach.

50

W przypadkach osłabienia stabilizacji struktury helikalnej:

(1) brak komplementarności na dwóch niciach podwójnej helisy;

(2) struktura helikalna oligo(T)/oligo(dA), np. w warunkach niższego stężenia soli,

mogą tworzyć się różnego rodzaju pętle. Dobrze scharakteryzowane strukturalnie są tzw.

wybrzuszenia (bulges) (PLANSZA 76), przykładowo dla extra dA5 lub dAATAA

obserwuje się ostre załamania (kink), których pozycja zależy od sekwencji warunkującej

stacking w wybrzuszeniu i na styku wybrzuszenie-helisa. Struktura wybrzuszenia DNA

jest potencjalnym miejscem wiążącym środki farmaceutyczne oraz białko p53 (tumor

supression protein). W RNA wybrzuszenia są ważnym elementem strukturalnym w

procesie self-splicingu i zwijania RNA (tertiary folding)

Kolejną strukturą drugorzędową jest pętla hairpin (PLANSZA 77), występująca

w RNA i w krzyżowych formach DNA. Szpilka do włosów jest zbudowana z helikalnego

trzonu i jednoniciowej pętelki, w której zasady pozostają zestackingowane. Najbardziej

stabilne są pętle DNA złożone z 4 do 5 nukleotydów i pętle RNA z 6 do 7 nukleotydów,

co wynika z budowy pętli (PLANSZA 78). Jeżeli w helisie B-DNA urwiemy jedną nić z

zachowaniem końcowej grupy fosforanowej a drugą kontynuujemy w kierunku 3', to

minimum odległości między fosforanami wystąpi dla trzeciego z kolei dobudowywanego

nukleotydu. Tę lukę ok. 12 Å można zamknąć jednym lub dwoma nukleotydami o

charakterze "ostrego zwrotu". W helisie A-RNA, tu hairpin antykodonu tRNAPhe

,

minimum odległości PP ok. 13 Å następuje przy rozbudowie nici w kierunku 5' dla

piątego nukleotydu. Lukę znów można zamknąć jednym lub dwoma nukleotydami. Pętle

mogą być dodatkowo stabilizowane wiązaniami wodorowymi, np. w hairpin antykodonu

między U33N(1)H i tlenem grupy fosforanowej A35p(+2)A36 (PLANSZA 77).

Omówione zasady konstrukcji nie wykluczają innych struktur typu pętli:

czteropętla (tetraloop) sekwencji 5’-GNRA (N - dowolny nukleotyd, R = G lub A) w

intronach grupy I, rRNA, retrowirusach, oraz trzypętle UNR.

Struktury trzeciorzędowe czyli organizacja przestrzenna struktur

drugorzędowych - ogólny fold cząsteczki różnią się zasadniczo w kwasach DNA i w

kwasach RNA. Funkcjonalne DNA tworzy, z wyjątkami takimi jak niektóre wirusy DNA,

strukturę trzeciorzędową chromosomu w powiązaniu z białkami (PLANSZA 79).

Następuje silne zwinięcie helikalnego DNA w następujących po sobie etapach:

nukleosomy (PLANSZA 80) w formie "paciorków na nici", 30 nm nić chromatynowa,

51

itd., aż do upakowania w sięgającego od 103 do 10

5 razy w jądrze eukaryotów o

wymiarach ok. 2 m (długość nici DNA/średnica bakterii lub jądra komórkowego).

Zdolność do takiego upakowania wynika z giętkości długich podwójnych helis DNA,

które bada się również w zrelaksowanym, pozbawionym białek DNA np. plazmidów. Ta

zdolność, i elementy struktury trzeciorzędowej DNA, które ją warunkują spełniają ważną

biologiczną rolę przez umożliwienie kontaktu fragmentów DNA odległych w

strukturze pierwszorzędowej. Przykładem takiej lokalnej struktury, która wykracza poza

prostą strukturę drugorzędową jest forma krzyżowa DNA, obserwowana pod

mikroskopem AFM (PLANSZA 81). Forma ta może powstać w sekwencjach tzw.

odwróconego powtórzenia (inverted repeat) przedzielonych fragmentem bogatym w

mniej stabilne pary A:T. Tworzą się wtedy dwie, skierowane do siebie trzonami szpilki do

włosów. Inną ważną cechą struktur trzeciorzędowych DNA, także funkcjonującego w

chromosomie, jest superskrętność (PLANSZA 82). Przejawia się w DNA kolistym jak w

plazmidach lub DNA, którego fragment jest unieruchomiony na bliskopołożonych

końcach jak w nukleosomie (PLANSZA 80). DNA nie może wtedy zmieniać

topologicznej liczby skrętów L czyli tego ile razy jedna nić jest opleciona wokół drugiej.

Jeżeli L jest mniejsze niż ilość skrętów T narzucanych przez typ helisy (ok. 10

nukleotydów na jeden skok helisy w B-DNA) pojawiają się ujemne superskręty w liczbie

W, tak aby:

L = T + W

Odwijanie helisy (bez rozcinania) w jednym miejscu powoduje jej "super" zapętlanie w

drugim. DNA w nukleosomach jest superskrętne w stopniu = (L Lo)/Lo ~W/Lo od -

0.03 do -0.09, gdzie Lo jest topologiczną liczbą skrętów w zrelaksowanym DNA.

Enzymami regulującymi topologiczną ilość skrętów są topoisomerazy, które przejściowo

rozcinają jedną (typ I) lub dwie (typ II) nici i zwijają lub odwijają je przy udziale ATP.

Struktura trzeciorzędowa cząsteczek RNA jest bardzo bogata i przypomina

struktury przestrzenne białek globularnych. W niewielkich, 75 do 90n cząsteczkach tRNA

(PLANSZA 83), elementy struktury drugorzędowej (głównie szpilki do włosów) tworzą

charakterystyczny motyw liścia koniczyny, i przez wewnątrzcząsteczkowe oddziaływania

tworzą strukturę trzeciorzędową, przypominającą literę L. Dwa A-helikalne trzony, T i

aminokwasowy tworzą jedną pseudociągłą helisę czyli złącze helis, a dwa pozostałe: D i

52

antykodonowy drugą, w sumie dwa ramiona L na giętkim zawiasie. Dwa podstawowe

typy oddziaływań stabilizują strukturę trzeciorzędową:

(1) interkalacyjny stacking, w którym zasada z jednego fragmentu nici wchodzi

pomiędzy dwie stackingujące zasady drugiego fragmentu np. C13 miedzy U8/A9,

zwykle na styku trzech nici, tu ściąganej przez wiązanie wodorowe W.C. i H.

m7G46:G22:C13 (ozn. h na PLANSZY); w sumie w układ połączenia (zawiasu)

zaangażowanych 10 nukleotydów;

(2) nietypowe wiązania wodorowe: wobble (a), Hoogsteen (b), puryna-puryna (d),

trójki zasad (f, g, h), zwykle z udziałem nukleotydów modyfikowanych, których jest ok.

10%, np. pseudourydyna , 7-metyloG.

Powszechnie spotykanym w RNA elementem trzeciorzędowym jest pseudowęzeł

(pseudoknot) (PLANSZA 84) W rozpowszechnionej wersji H (od: hairpin) następuje

parowanie W.C. nukleotydów w pętli hairpin z jednoniciowym fragmentem, co prowadzi

do struktury zbudowanej z dwóch obszarów helikalnych i trzech pętli. W niektórych

wersjach tego pseudowęzła jedna z pętli może być zredukowana do zera. Pseudowęzły

zapewniają ściągnięcie odległych fragmentów jednoniciowego RNA w zwartą strukturę

przestrzenną, np. w 5S RNA rybosomów. Spełniają różne funkcje:

-regulacja ekspresji genu na poziomie translacji wirusów, np. ribosomal frameshifting

onkogennego wirusa sutka myszy (mouse mammary tumor virus); dwa białka z jednego

RNA w określonym stosunku ilościowym przez przesunięcie ramki odczytu;

- regulacja procesu translacji: pseudowęzły na 5’UTR w regionie IRES (internal

ribosome entry side) mRNA do rekrutacji rybosomu w kap-niezależnej translacji;

- mimikra tRNA (TLS) ramienia akceptorowego 3’-końca genomu wirusów roślinnych

dla zapewnienia reaktywności katalizowanej przez enzym rozpoznający tRNA.

Przegląd innych typów pseudowęzłów: B, I, H-H kissing loops, podwójny (nested)

podaje praca Bierley et al. Nature Rev. 5, 598, 2007).

Motyw A-minor (PLANSZA 85). jest powszechnie występującym elementem

upakowania dużych cząsteczek RNA, w którym helikalne fragmenty wiążą się przez

oddziaływanie niesparowanej adeniny jednego elementu drugorzędowego z

komplementarną parą G:C drugiego elementu drugorzędowego od strony małej bruzdy.

Klasyfikacja: typ I lub typ II oparta jest na położeniu 2’OH adenozyny względem grup

2’OH cukrów pary G:C. Stabilizacja motywu zachodzi poprzez wiązania wodorowe

między grupą N2H2 guaniny par G:C i N3 lub N1 adeniny, oraz przez wiązania wodorowe

z udziałem grup 2’-hydroksylowych cukrów.

53

Zamek rybozowy (PLANSZA 86) między helisami stabilizowany jest przez

wiązania wodorowe grup 2’OH obu helis oraz między hydroksylami 2’ a N3 (puryny) i

C2=O (pirymidyny).

Motyw Z-kotwicy (Z-anchor; PLANSZA 87) w spliceosomie wiążący helisy IC i

I(ii) w ustawieniu „side-by-side” w formie „architektonicznej” przypominającej P-DNA

(PLANSZA 70).

Wymienione MOTYWY STRUKTURALNE plus ODDZIAŁYWANIA między nimi:

interkalacyjny stacking, nietypowe parowanie zasad, wiązania wodorowe z udziałem

grup hydroksylowych 2’OH, zapewniają zwinięcie RNA w funkcjonalne struktury

natywne, działające w kompleksach takich jak np. rybosom (PLANSZA 88).

(c) Duże cząsteczki kwasów nukleinowych podlegają stałym,

niekontrolowanym zmianom i modyfikacjom jako złożone układy termodynamiczne.

Jest to szczególnie istotne w przypadku olbrzymich i "nieodnawialnych" (w

przeciwieństwie do RNA) cząsteczek DNA, które powinny być możliwie trwałe w czasie

ze względu na niesioną informację genetyczną. Systemy naprawcze obniżają częstości

mutacji z 10-4

w systemach replikacyjnych in vitro do 10-8

do 10-11

w żywych komórkach,

od bakterii do eukaryotów. Latentne DNA w komórce podlega procesom (PLANSZA 89):

(a) spontanicznym, np. dezaminacja cytozyny do uracylu, który paruje z A zamiast z

G, depurynacja (odłączenie zasady purynowej);

(b) indukowanym przez czynniki chemiczne kancero- i mutagenne, które reagują z

zasadami (czynniki alkilujące, metoksyamina) i modyfikują je do form o innym typie

parowania (tautomeria) lub zaburzają strukturę helisy przez interkalację jak związki

wielopierścieniowe (piren)

(c) indukowanym przez czynniki fizyczne: promieniowanie jonizujące,

promieniowanie ultrafioletowe prowadzące do reakcji fotochemicznych zasad w

elektronowym stanie wzbudzonym (PLANSZA 16), np. dimeryzacja tymin lub oksydacja

zasad purynowych do pochodnych 8-oxo (pod działaniem rodników tlenowych).

Zaburzenia chemiczne i strukturalne, które mogą być przyczyną mutacji są

ustawicznie usuwane przez systemy naprawy DNA. W szczególności rozpoznawane są

błędne pary zasad po replikacji i usuwana jest zasada niekomplementarna w nowej nici a

zachowana "właściwa" na nici starej. Można wyróżnić szereg typów procesów usuwania

54

błędów w DNA, nakierowanych specyficznie na określone rodzaje uszkodzeń. U ich

podstaw leżą dwa zasadnicze mechanizmy:

(A) bezpośrednie przywrócenie nieuszkodzonego DNA (direct reversal);

(B) naprawa przez wycięcie (excision pathway).

Pierwszy system naprawy funkcjonuje przy usuwaniu niektórych modyfikacji

chemicznych i fotodimeryzacji pirymidyn (PLANSZA 90). Enzym fotoreaktywujący

rozpoznaje uszkodzenie nici DNA i przy pomocy absorbowanego światła z zakresu

widzialnego (a nie UV jak przy uszkodzeniu) katalizuje reakcję fotochemiczną

rozcinania dimeru do dwóch niepołączonych zasad. Drugi system naprawczy jest

kompleksem enzymatycznym. Uszkodzenie na nici (błędną parę czy fotodimer) jest

specyficznie rozpoznawane przez odpowiednią endonukleazę, która wycina uszkodzoną

zasadę lub cały fragment nici, która ją zawiera. Polimeraza DNA syntetyzuje brakujący

kawałek na matrycy drugiej, nieuszkodzonej nici, a ligaza zszywa nowopowstały fragment

na końcu z pozostałym fragmentem nici.

55

Wykład 9

4. Budowa białek

(a) Po zsekwencjonowaniu genomu ludzkiego i ponad 100 innych organizmów

naczelnym zadaniem biologii molekularnej stało się ustalenie funkcjonalnych struktur

wszystkich białek kodowanych przez genomy, których liczbę szacuje się na kilkaset

tysięcy, ok. 300 tys. w samym genomie ludzkim, kodowanych przez ok. 30 tys. genów.

Proteomika strukturalna stara się do tego problemu podejść w sposób kompleksowy,

przez wysoce wydajne (high throughput) ustalanie struktur całych klas białek

współdziałających w ramach określonych odcinków szlaków metabolicznych tak, aby

można było konstruować molekularne mechanizmy współdziałania całych kompleksów

białkowych. Wymaga to szerokiego wsparcia BIOINFORMATYKI („ontologia”

proteomiki). Celem praktycznym badań strukturalnych i dynamicznych jest wybór

właściwych "tarcz" czyli receptorów, głównie bialkowych dla różnego typu inhibitorów

czy aktywatorów jako środków leczniczych: antywirusowych, antynowotworowych,

cytostatycznych lub sprzyjących proliferacji określonych typów komórek. Zespoły

naukowe krystalografów i spektroskopistów NMR powołane do realizacji badań

strukturalnych w ramach tzw. Large Scale Facilities (w USA finansowanych przez NIH, w

EU finansowane w ramach Programów Ramowych) ściśle współpracują z firmami

farmaceutycznymi.

Białka są biopolimerami liniowymi, zbudowanymi z zasadniczo 20 typów

aminokwasów włączanych w procesie translacji mRNA, a w niektórych archea i

eubacteria z 22 typów aminokwasów, tzw. -aminokwasów (PLANSZA 91). Każdy

aminokwas ma przy węglu dwie grupy funkcyjne: aminową NH2 i karboksylową

COOH, a poszczególne aminokwasy różnią się typem reszty bocznej R (C i następne

atomy). Każdy aminokwas ma co najmniej dwie wartości pK, odpowiadające protonacji do

NH3+ i dysocjacji do COO

-. W pH zbliżonym do obojętnego dominują więc formy jonów

obojnaczych a wartość pH w której wszystkie cząsteczki są obojętne nosi nazwę punktu

izoelektrycznego pHi. Wylicza się ten punkt jako średnia z wartości dwóch pierwszych

pK: 1/2(pK1 + pK2), z wyjątkiem aminokwasów zasadowych z dodatkową grupą zasadową

w R: lizyny, argininy i histydyny, gdzie pHi = 1/2(pK2 + pK3). Aminokwasy w biochemii

oznacza się standardowymi trzyliterowymi skrótami (PLANSZA 92), a na potrzeby

komputerowych baz danych sekwencji białkowych skrótami jednoliterowymi. W

56

momencie utworzenia przez aminokwasy łańcucha peptydowego o ich własnościach w

białku decydują reszty boczne:

(a) aminokwasy alifatyczne, hydrofobowe, których łańcuchy boczne preferują

kontakty między sobą lub ze środowiskiem niepolarnym a unikają wody: glicyna, alanina,

walina, leucyna, izoleucyna i prolina; prolina jest iminokwasem z drugorzędową grupą

aminową po połączeniu między C reszty bocznej i azotu aminowego; spotyka się w

białkach także pochodną, -hydroksyprolinę (modyfikacja post-translacyjna, patrz dalej);

(b) aminokwasy zasadowe: lizyna, arginina i histydyna, w dwóch pierwszych reszty

boczne w białkach są zwykle naładowane dodatnio, w histydynie pK jest bliskie pH

fizjologicznego i może mieć ładunek dodatni lub nie, zależnie od otoczenia białkowego;

(c) aminokwasy kwaśne, ujemnie naładowane z grupą karboksylową w reszcie

bocznej: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy;

(d) aminokwasy amidowe, silnie hydrofilowe ale niezjonizowane, preferujące

środowisko wodne: asparagina i glutamina; ich grupy boczne CONH2 są jednocześnie

donorami i akceptorami protonów w wiązaniach wodorowych;

(e) aminokwasy zawierające siarkę, słabo hydrofobowe; cysteina i metionina, oraz

zwierające hydroksyl, słabo hydrofilowe: seryna i treonina; grupa SH cysteiny jest bardzo

reaktywna i połączenie (utlenienie) dwóch grup cysteinowych daje mostek

dwusiarczkowy SS, wiązanie kowalencyjne, które stabilizuje struktury białkowe

(aminokwas taki nazywa się cystyną);

(f) aminokwasy zawierające pierścienie aromatyczne: fenyloalanina, tyrozyna i

tryptofan; dwie ważne ich cechy to:

(1) absorpcja (A) i fluorescencja (F) w zakresie ultrafioletu (PLANSZA 93, która

powoduje, że białka absorbują promieniowanie UV z maksimum ok. 280 nm (kwasy

nukleinowe 260 nm) i, w przeciwieństwie do kwasów nukleinowych, emitują

promieniowanie ze znaczną wydajnością;

(2) wchodzenie w oddziaływania warstwowe (stacking) między sobą i z innymi

pierścieniami aromatycznymi, lub w tzw. oddziaływania kation z grupami dodatnio

naładowanymi.

„Dodatkowe” aminokwasy, 21 i 22, to pyrolizyna (ozn. Pyl, O) z podstawnikiem

pyrolowym zamiast protonu na grupie aminowej reszty bocznej lizyny i selenocysteina

(Sec, U), z atomem Se w miejscu siarki (PLANSZA 94; Atkins & Gesteland Science 296,

1409, 2002)

57

Węgiel C wszystkich aminokwasów z wyjątkiem glicyny jest asymetryczny i

aminokwasy mogą występować w jednej z form izomerycznych L lub D (PLANSZA 91).

Wszystkie aminokwasy włączane do łańcucha białkowego w procesie translacji są typu L:

po ustawieniu trzech węgli C-karbonylowy, C i C w płaszczyźnie grupa aminowa jest

skierowana "do przodu" a proton "do tyłu". Można to również przedstawić w określonej

konwencji na płaskim rysunku. Jeśli w aminokwasach występują dodatkowe izomerie

optyczne ze względu na inne węgle podstawione czterema różnymi podstawnikami to

tylko jeden typ izomeru jest wbudowywany do białka.

W łańcuchach bocznych aminokwasów mogą zachodzić obroty wokół wiązań

pojedynczych, które prowadzą do różnych konformacji reszt bocznych: przykładowe

konformacje wokół wiązania CC pokazuje (PLANSZA 95). W swobodnych

aminokwasach w roztworze występuje równowaga dynamiczna czyli szybka wymiana

między klasycznymi konformerami, a odpowiednie wartości populacji można wyznaczyć z

wartości stałych sprzężenia NMR. Konformację pierścienia proliny można opisać

analogicznie jak konformację pierścienia cukrowego zamieniając tylko tlen O(4') na azot.

W roztworze obserwuje się równowagę dynamiczną dwóch konformacji N (bliska Cendo)

i S (bliska Cexo) o populacjach po ok. 50%. Jedynym problemem tautomerycznym w

jest migracja protonu N(1)HN(3)H w (płaskim) pierścieniu histydyny nieuprotonowanej

PLANSZA 92). W formie zwitterjonowej stosunek populacji obu tautomerów jest 1 : 3.

Aminokwasy są włączane w łańcuch peptydowy w procesie translacji mRNA

(PLANSZA 96) zgodnie z informacją zapisaną w „trzyliterowym” (trójka zasad – jeden

aminokwas) kodzie genetycznym (PLANSZA 97). Pyrolizyna jest kodowana przez kodon

UAG, a selocysteina przez UGA (PLANSZA 94), które są kodonami „stopu” translacji i

ulegają „przeprogramowaniu” w przypadkach kodowania aminokwasów. Utworzenie

wiązania peptydowego (PLANSZA 98) między grupą karboksylową pierwszego i grupą

aminową następnego prowadzi do elongacji łańcucha (PLANSZA 99) liniowego polimeru

o określonej kolejności czyli sekwencji aminokwasów w kierunku od aminokwasu z

wolną grupą aminową (N-koniec) do aminokwasu z wolną grupą karboksylową (C-

koniec). Określenie kolejności aminokwasów od N- do C-końca dokonuje się metodami

sekwencjonowania:

(1) enzymatyczne (lub chemiczne) pocięcie łańcucha peptydowego na krótkie

fragmenty;

58

(2) określenie sekwencji aminokwasów w poszczególnych fragmentach metodą

spektrometrii masowej (lub rzadko obecnie stosowana metodą chemicznej degradacji

Edmana);

(3) złożenie zsekwencjonowanych fragmentów peptydowych we właściwej kolejności.

Wykorzystanie spektrometrii masowej (PLANSZA 15) dało możliwość

sekwencjonowania całych białek i kompleksów wielu białek w bardzo efektywny sposób,

co jest nieodzownym warunkiem pracy w zakresie proteomiki. Przykładowo, w jednej z

pionierskich prac tego typu grupa M. Mann'a z EMBL (European Molecular Biology

Laboratory) scharakteryzowała 19 nowych białek kompleksu spliceosom'u komórek HeLa

(Neubauer et al. Nature Genetics 20, 46, 1998). Białka poddaje się:

(a) elektroforezie na żelu

(b) trawieniu peptydazami na żelu

(c) ekstrakcji i skierowaniu mieszaniny peptydów do spektrometru masowego w

systemie tandemu MS/MS (PLANSZA 100).

Pierwszy spektrometr masowy jest wykorzystywany jako filtr masowy do selekcji

kolejnych peptydów, najczęściej obdarzonych ładunkiem +2. Peptyd przepuszczany do

komory kolizyjnej ulega kontrolowanej fragmentacji przy zderzaniu z cząsteczkami

gazu (CID). W jej wyniku powstają fragmenty (Yn) różniące się kolejno o jeden

aminokwas w wyniku pękania głównie wiązań peptydowych z jednakowym, najczęściej

pojedynczym ładunkiem dodatnim. W drugim spektrometrze następuje rozdział i powstaje

widmo fragmentów, a z różnicy mas identyfikuje się kolejne aminokwasy łańcucha, z

wyjątkiem pary leucyna/izoleucyna. Peptydy o znanych sekwencjach składa się następnie

w całe białko na podstawie bazy danych sekwencji nukleotydowych genomu EST

(expressed sequence tags) przy pomocy programów komputerowych, np. PeptideSearch.

Ilość aminokwasów w białku może być bardzo różna. W komórce funkcjonują już

krótkie peptydy o długości kilku aminokwasów. Białka z rodziny CMTI (cucurbita

maxima trypsin inhibitor) mają długość ok. 30 AA, średnia długości białek globularnych to

300 400 AA, ale spotykane są bardzo długie białka długości kilku tysięcy aminokwasów

np. kolagen (MW ok. 300 000 Da). Białka pełnią w komórce bardzo różne funkcje:

(a) materiał budulcowy struktur komórkowych;

(b) enzymy, katalizatory reakcji biochemicznych;

(c) przeciwciała, funkcje odpornościowe organizmu;

(d) transport aktywny przez błony cząsteczek organicznych i jonów;

59

(e) energetyka, udział w procesach oddychania i fotosyntezy;

(f) praca mechaniczna kosztem energii chemicznej;

(g) regulacja działania genów, enzymów i procesów hormonalnych.

Ze względu na olbrzymią liczbę różnych rodzajów białek nie można podać prostej ich

klasyfikacji w oparciu o strukturę czy funkcje. Najwcześniejsza klasyfikacja dzieliła

białka na globularne, rozpuszczalne w wodzie i strukturalne (włókniste, fibrylarne),

nierozpuszczalne w wodzie i odporne na czynniki denaturujące oraz proteazy. Ze względu

na strukturę chemiczną można podzielić białka na proste, które zawierają tylko

aminokwasy oraz złożone, w których obok aminokwasów występują dodatkowe składniki.

Do pierwszej grupy należą m. in. albuminy, globuliny, histony skleroproteidy (kolagen,

elastyna). Wśród białek złożonych można wyróżnić nukleoproteidy (zawierające

fragmenty kwasów nukleinowych), glikoproteidy (zawierające oligosacharydy),

lipoproteidy (zawierające tłuszcze), fosfoproteidy (ufosforylowane), chromoproteidy

(hemoglobina, cytochrom) itd. Ze względu na cechy strukturalne białka można podzielić

trzy klasy, które zostana kolejno omówione:

(1) białka globularne

(2) białka strukturalne

(3) białka błonowe

Konformacja łańcucha peptydowego jest uwarunkowana charakterystycznymi

cechami wiązania peptydowego C N (PLANSZA 98). Ma ono częściowo podwójny

charakter co widać z jego długości 1.33 Å, pomiędzy 1.45 Å dla typowo pojedynczego i

1.25 Å dla typowo podwójnego. Często strukturę chemiczną fragmentu przedstawia się w

postaci równowagi dwóch form mezomerycznych o różnym rozkładzie ładunków i wiązań.

Układ złożony z dwóch atomów wiązania i czterech atomów podstawników jest plaski

(PLANSZA 99). Konformację wokół wiązania peptydowego opisuje kąt , który może

przyjąć wartość bliską 180, najczęstsze. transoidalne ustawienie węgli C, lub wartość

bliską 0 z cisoidalnym ustawieniem obu węgli. Struktura każdego z układów jest sztywna

a przejście konformacyjne między nimi poprzez rotację jest zahamowane - barierę

szacuje się na 60 120 kJ/mol. Forma trans jest energetycznie uprzywilejowana ok. 8.5

kJ/mol ze względu na niekorzystne sterycznie oddziaływania w formie cis C danego

aminokwasu i łańcucha bocznego aminokwasu poprzedzającego w sekwencji. W

przypadku wiązania peptydowego poprzedzającego prolinę takie sterycznie niekorzystne

60

oddziaływanie występuje w obu formach (PLANSZA 101) i ich energia jest zbliżona:

niektóre wiązania peptydowe przed proliną mogą mieć = 0.

Konformację łańcucha peptydowego opisują wartości dwóch kątów dwuściennych dla

każdego i-tego aminokwasu w sekwencji (PLANSZA 102):

(1) kąt między węglami karbonylowymi C' we fragmencie C'i Ci Ni C'i-1,

gdzie wartości dodatnie są przy obrocie zgodnym z ruchem wskazówek zegara patrząc

wzdłuż C i N i czyli przeciwnie do kierunku łańcucha;

(2) kąt między azotami amidowymi we fragmencie Ni Ci C'i Ni+1, gdzie

wartości dodatnie są przy obrocie zgodnym z ruchem wskazówek zegara patrząc wzdłuż

Ci C'i czyli zgodnie z kierunkiem łańcucha.

Dopuszczalne wartości kątów i wynikają głównie z odziaływań atomów wokół tych

wiązań i reszt bocznych aminokwasów (zakresy silnie redukują się w porównaniu z

zakresami dostępnymi dla pojedynczych aminokwasów lub bardzo krótkich peptydów).

Można to obrazować na tzw. wykresach Ramachandrana (PLANSZA 103), które

prezentują mapy dozwolonych obszarów w funkcji kątów i : zaznaczone zakresy

kątowe dla struktur drugorzędowych (lub energie na trzeciej osi). Wartości energii

rzędu RT (2,5 kJ/mol w temperaturze pokojowej) wyznaczają obszary energetycznie

dostępne dla łańcucha i wynikające głównie z oddziaływań „1 4” (poprzez 3

aminokwasy). Z map Ramachandra wynika, że łańcuch przyjmuje zasadniczo dwa typy

konformacji: helikalną, zwiniętą prawoskrętnie z kątami i ok. 60, i zbliżoną do

rozciągniętej z kątami i do 180 w strukturze -kartki: ok. 120 ÷ 140 i

ok. +110 ÷ +120.

61

Wykład 10

Helisy zwinięte lewoskrętne są teoretycznie możliwe, ale nie występują ze względu

na sterycznie niekorzystne oddziaływania łańcuchów bocznych aminokwasów w

konfiguracji L. Poszczególne fragmenty łańcucha peptydowego o różnej długości zwijają

się więc lokalnie w struktury drugorzędowe. Wyróżnić można kilka konformacji

helikalnych, z których główne to (PLANSZA 104):

(a) prawoskrętna, klasyczna helisa , oznaczana często jako 3.613;

(b) prawoskrętna, klasyczna helisa 310;

(c) prawoskrętna, klasyczna helisa , oznaczana często jako 4.416.

Helisy te określane są jako klasyczne gdyż każdy aminokwas w takiej strukturze

drugorzędowej ma jednakowe wartości kątów i (PLANSZA 105). Poszczególne

helisy różnią się stopniem zwinięcia, najbardziej zwinięta jest helisa 310 z 3 aminokwasami

na jeden skręt, dalej helisa z 3.6 aminokwasami na skręt i helisa z 4.4 aminokwasami

na skręt, co tłumaczy znaczenie „głównego symbolu” określającego rodzaj helisy.

Struktura helikalna jest stabilizowana przez wiązania wodorowe, w których donorem

protonu jest azot amidowy wiązania peptydowego (PLANSZA 98) a akceptorem tlen

karbonylowy tego wiązania. W helisie 310 takie wiązanie występuje między każdym i-tym

i i+3-cim aminokwasem w sekwencji (1-4, 2-5, 3-6 itd), w helisie między i-tym i i+4-

tym, a w helisie między i-tym i i+5-tym. Wiązanie wodorowe "zamyka" jak gdyby

fragment łańcucha, a ilość atomów wynosi odpowiednio 10, 13 i 16 dla trzech typów helis

(PLANSZA 104), co wyjaśnia znaczenie subskryptu w symbolu każdej z helis. Helisy w

białkach mogą być różnej długości; najkrótsza musi umożliwić powstanie chociaż jednego

stabilizującego wiązania wodorowego (odpowiednio 4, 5 i 6 aminokwasów). W białkach

globularnych helisy mają długości średnio 10 15 aminokwasów, ale spotyka się niekiedy

nawet do 50 aminokwasów długości.

Dwa lub więcej fragmentów rozciągniętego łańcucha peptydowego, tzw. -nici

(PLANSZA 106) może się ustawiać równolegle (kierunki N C takie same) lub

antyrównolegle (kierunki N C przeciwne) do siebie, tworząc strukturę płaską -kartki

(-sheet). Taka struktura drugorzędowa jest stabilizowana przez wiązania wodorowe

między nićmi z udziałem grup NH i C=O wiązań peptydowych. Kąty dwuścienne

(PLANSZA 105) nie odpowiadają niciom maksymalnie rozciągniętym, i po 180, ale

62

odbiegają od nich do ok. 120, przez co -kartka jest pofałdowana. Najczęściej występują

-kartki antyrównoległe, złożone z 2 do 3 nici, rzadziej mieszane, częściowo równoległe a

częściowo antyrównoległe od 3 do 15 nici, a najrzadziej równoległe, zwykle złożone z

ponad 4 nici.

Trzecim typem struktur drugorzędowych są ciasne pętle, tzw. -skręty i -skręty

(PLANSZA 107), na końcach struktur antyrównoległej -kartki, kiedy łańcuch peptydowy

wykonuje zwrot dla uzyskania tej struktury. W przypadku skrętu jeden aminokwas

wypada z układu wiązań wodorowych, a w przypadku skrętu wypadają dwa

aminokwasy. Struktury takich skrętów są dobrze zdefiniowane poprzez wartości kątów i

(PLANSZA 105). Istnieje ok. 8 różnych rodzajów -skrętów różniących się

konformacją; dane na kąty dwuścienne przytoczone są dla jednego typu tej struktury.

Statystycznie rzecz biorą w białkach globularnych ok. 31% aminokwasów jest w

strukturach helikalnych 28% w strukturach -kartek a pozostałe w różnego rodzaju pętlach

(PLANSZA 108), z których tylko ciasne skręty i uważa się za dobrze zdefiniowane

struktury drugorzędowe. Dłuższe pętle są obszarami nieustrukturowanymi

drugorzędowo. Helisy wszystkich typów oznacza się spiralami lub walcami natomiast -

nici tworzące -kartki w postaci strzałek wskazujących kierunek NC.

Poliprolina i poliglicyna, ze względu na nieco odmienną od pozostałych

aminokwasów budową łańcuchów bocznych, tworzą odrębne typy struktur

drugorzędowych (PLANSZA 105): poliprolina I i poliprolina II oraz poliglicyna II.

Struktury drugorzędowe organizują się przestrzennie w tzw. globalny fold

pojedynczego łańcucha peptydowego czyli strukturę trzeciorzędową, która wykazuje

zróżnicowanie zależnie od typu białka: globularne, strukturalne, błonowe. Dla białek

globularnych (PLANSZA 108) stabilizacja struktury trzeciorzędowej zachodzi poprzez

następujące (główne) typy oddziaływań (PLANSZA 8).

(a) Oddziaływania hydrofobowe reszt bocznych aminokwasów alifatycznych, które

prowadzą do powstania tzw. jądra hydrofobowego. Charakter hydrofobowy ma także

oddziaływanie warstwowe (stacking) aromatycznych pierścieni takich aminokwsów jak

tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina oraz oddziaływania typu kation dodatnio

naładowanych łańcuchów bocznych (lizyna, arginina) i pierścieni aromatycznych.

(b) Aminokwasy polarne a przede wszystkim naładowane występują w przewadze na

powierzchni białka, zapewniając korzystne elektrostatycznie oddziaływanie z wodą i

63

jonami rozpuszczalnika. Woda jest w znacznym stopniu wyparta z wnętrza białek

globularnych i może tam występować jedynie w formie klastrów niewielu cząsteczek

oddziałujących z aminokwasami hydrofilowymi (polarnymi), np. tworząc wiązania

wodorowe. Woda i jony związane w sferze hydratacyjnej ulegaja wymianie z pozostałą

częścią rozpuszczalnika (bulk solvent)

(c) Pary aminokwasów naładowanych o przeciwnych znakach wewnątrz białka, np.

dodatnio naładowana lizyna czy arginina i ujemnie naładowany kwas asparaginowy czy

glutaminowy, wiążą sie w tzw. mostki solne.

(d) Kowalencyjne wiązania między grupami siarkowymi cystein SS, szczególnie w

przypadku mniejszych białek, np. CMTI (ok. 30 aminokwasów) i inhibitor trypsyny BPTI

(basic pancreatic trypsin inhibitor; 58 aminokwasów), mają po 3 mostki dwusiarczkowe.

Ponadto, występują liczne i nieukierunkowane oddziaływania stabilizujące van der

Waalsa między wszystkimi fragmentami (oddziaływania indukcyjne i dyspersyjne).

Struktura trzeciorzędowa mniejszych białek jest najczęściej globularna, "zwarta" w

pełni tego słowa znaczeniu. W przypadku białek większych, ponad 200 aminokwasów

może pojawić się struktura podzielona na domeny (PLANSZA 109). Każda domena

tworzy własną zwartą strukturę z własnym jądrem hydrofobowym, a połączenia między

domenami mają luźniejszy charakter i umożliwiają intensywniejsze ruchy molekularne

domen względem siebie.

Niekiedy pomiędzy strukturą drugorzędową i trzeciorzędową wyróżnia się

struktury pośrednie tzw. superdrugorzędowe (PLANSZA 110). Są to pewne

charakterystyczne i często spotykane motywy białkowe, zbudowa z kilku elementów

drugorzędowych blisko siebie położonych w sekwencji, np. motyw -- helisy łączącej

nici równoległej, dwuniciowej -kartki, czy klucz grecki złożony z dwóch -kartek, dwu i

trzyniciowej, ustawionych równolegle do siebie. Szereg motywów rozpoznających kwasy

nukleinowe (będę omawiał w dalszej części wykładu) np. motyw helisa-skręt-helisa,

można klasyfikować jako struktury superdrugorzędowe.

Poszczególne domeny klasyfikuje się z topologicznego punktu widzenia. Można

podzielić białka jednodomenowe i domeny pod względem struktur drugorzędowych:

(1) - zbudowane w przeważającej części z helis;

(2) - zbudowane w przeważającej części z nici rozciągniętych w kartkach;

(3) / - z przemieszanymi strukturami helikalnymi i -kartkowymi;

(4) + - z rozseparowanymi strukturami helikalnymi i -kartkowymi.

64

W ramach tak ogólnej charakterystyki definiuje się bardziej szczegółowo

scharakteryzowane topologicznie ponad 700 typów foldów (ciągle są odkrywane nowe).

Kilka przykładów dla białek enzymatycznych (PLANSZA 111) to: RRM (RNA

recognition motif), -propeller, P-loop. Klasyfikacja białek pod względem foldów w

bazach danych, takich jak SCOP, CATH, opiera się na podejściu hierarchicznym z

kolejnymi poziomami uogólnienia podobieństwa strukturalnego.

Przez długi czas uważano, że nić białkowa jest NIEZAPĘTLONA, tzn.

pociągnięcie za końce nie daje supełków. Ostatnio wzrasta liczba doniesień o białkach

tworzących supełki (ponad 100 przypadków), np. syntetaza S-adenozylometioniny.

PLANSZA 112: przedstawia mechanizm zapętlania w trakcie translacji.

Dla białek zbudowanych z jednej nici peptydowej struktura trzeciorzędowa jest

ostateczną, globalną strukturą. Funkcjonalne białka mogą być zbudowane z kilku,

najczęściej jednakowych nici peptydowych czyli podjednostek (PLANSZA 113), każda o

własnej strukturze trzeciorzędowej, połączonych ze sobą specyficznymi oddziaływaniami.

Takie białka mają określoną strukturę czwartorzędową złożoną z podjednostek (nie

mylić z domenami !!!). Ilość podjednostek może być różna: dwie, trzy, cztery, pięć, sześć

(heksamer insuliny), osiem i bardzo wiele w białkowych otoczkach wirusów.

Druga klasa białek tzw. strukturalne (włókniste, fibrylarne), w przeciwieństwie do

globularnych, charakteryzuje się nierozpuszczalnością w wodzie, odpornością na czynniki

denaturujące i enzymy proteolityczne. Struktury drugorzędowe są w białkach

strukturalnych takie jak w globularnych, ale oba rodzaje białek różnią się zdecydowanie

strukturą trzeciorzędową. Białka włókniste tworzą przeważnie bardzo wydłużone struktury

w jednym kierunku (włókna), gdzie jedna lub kilka typów struktur drugorzędowych

powtarza się. Struktura trzeciorzędowa i czwartorzędowa są jakby przedłużeniem struktury

lub struktur drugorzędowych. Omówię dwa charakterystyczne przykłady.

(1) Kolagen (PLANSZA 114), składnik szeregu tkanek ma w strukturze

pierwszorzędowej powtarzalne sekwencje aminokwasowe typu (GlyXaaYaa)n ze

znaczną zawartością proliny w miejscach Xaa i Yaa i lizyny w Yaa. Prolina jest często

hydroksylowana w pozycji do hydroksyproliny (PLANSZA 92). Kolagen tworzy

strukturę potrójnej helisy (PLANSZA 105): trzy łańcuchy peptydowe w formie

poliproliny II są zwinięte prawoskrętnie wokół siebie ze skokiem 30 Å, 10 aminokwasów

na skok. Struktura jest stabilizowana przez wiązania wodorowe między łańcuchami w

helisie (NH glicyny, C=O aminokwasu Xaa), ze znacznym udziałem -OH hydroksyprolin

65

jako donorów protonu. Obserwowano cząsteczki kolagenu o długości do 28 000 Å (ciężar

cząsteczkowy ok. 300 000 D), przy szerokości helisy 14 Å.

(2) Szereg cytoplazmatycznych białek nadających kształt komórkom tworzy

struktury superhelikalne, tzw. helisa helis (coiled coils), w których (PLANSZA 115)

dwie prawoskrętne -helisy zwinięte są równolegle i lewoskrętnie względem siebie.

Stabilizacja układu superhelikalnego zachodzi dzięki amfipatyczności. W strukturze

pierwszorzędowej występują powtarzające się kolejno sekwencje siedmiu aminokwasów

a-b-c-d-e-f-g-, gdzie dwa aminokwasy a i d są hydrofobowe (Leu, Ile, Ala), e i g

naładowane przeciwnie (Glu, Arg), a pozostałe aminokwasy są dowolne. Jedna strona helis

jest więc hydrofobowa i umożliwia ich łączenie, wspomagane przez przyciąganie

elektrostatyczne aminokwasów naładowanych. W ten sposób mogą powstawać superhelisy

złożone z trzech czy czterech helis, np. w jedwabiu pszczół.

(3) Jedwab pająków (PLANSZA 116) wykazuje strukturę (techniki solid state NMR

wirowania pod kątem magicznym CP MAS) włókien otoczonych twarda powłoką.

Pojedyncze włókna sa zbudowane z równolegle ułożonych łańcuchów peptydowych w

formie -kartek zawierających głównie glicynę i alaninę, wymieszanych („posklejanych”)

z formami helikalnymi 31 (nie mylić z helisa 310): 3 aminokwasy na skręt, = 60, =

135 (oznaczenie 31 jest ścisłym oznaczeniem Xk symetrii śrubowej PLANSZA 65)

Białka błonowe są strukturalnie podobne do białek globularnych, ale naturalne

środowisko przynajmniej dla fragmentu cząsteczki ma charakter hydrofobowy, podwójna

warstwa lipidowa w której tkwi, złożona z reszt kwasów tłuszczowych. Fragmenty białek

błonowych mogą wystawać do środowiska wodnego i stosować się do reguł budowy

charakterystycznych dla białek globularnych, jednak jako całość białka te agregują w

wodzie i są w niej nierozpuszczalne ze względu na hydrofobowość powierzchni

kontaktu z błoną. Dopiero ostatnio udało się opracować metody krystalizacji białek tego

typu w środowisku buforowym z udziałem detergentów i ilość znanych struktur (ok. 150)

jest relatywnie niewielka w stosunku do liczby znanych struktur białek globularnych.

Znane są obecnie zasadniczo dwa typy struktur białek błonowych (PLANSZA 117):

- wiązka helis ( helix bundle), np. transpoter glukozy przez błonę erytrocytów;

- -baryłka (-barrel), np. bakteriorodopsyna: napędzana energią światła pompa

protonowa.

W 492 aminokwasowowym transporterze (PLANSZA 118) helikalne struktury

drugorzędowe białka tworzą dynamiczne kanały przez błonę, które wyłapują cząsteczkę

66

cukru na zewnątrz i wypuszczają w środku komórki. W białku można zaobserwować

charakterystyczny rozkład amfipatyczny aminokwasów hydrofobowych, polarnych oraz

dodatnio i ujemnie naładowanych. Naładowane i polarne znajdują się głównie we

fragmentach kontaktujących się z wodą, ale i tam występują hydrofobowe dla utworzenia

jąder hydrofobowych odpowiednich, wystających z błony domen. Z kolei znaczna

przewaga aminokwasów hydrofobowych występuje we fragmentach zaczepionych w

błonie, ale i tu występują w odpowiednich miejscach aminokwasy polarne, stabilizujące

strukturę kanałów i ułatwiające wnikanie polarnych cząsteczek cukru przez

oddziaływanie van der Waalsa. Oddziaływania stabilizujące białka błonowe są stosunkowo

słabo poznane. Zakotwiczone w błonie fragmenty mają wysoce stabilne struktury odporne

na termiczną denaturację, pomimo braku wyraźnie ukształtowanego jądra

hydrofobowego. Postuluje się: optymalne (lepsze niż w białkach globularnych)

upakowanie reszt bocznych, wiązania wodorowe aminokwasów polarnych we wnętrzu

białka, znaczna ilość słabych wiązań wodorowych CH…O=C.

Wyznaczanie struktur białek z rozdzielczością atomową metodami rentgenografii,

NMR i przez zwijanie komputerowe (powiem o tym w dalszej części wykładu) jest

naczelnym zadaniem proteomiki strukturalnej. Struktury te, w postaci położeń

poszczególnych atomów zapisywane są w bazach danych w standardowych formatach

(internet) w postaci tzw. PDB-files. W chwili obecnej zdeponowano ponad 100 000

struktur białkowych, z czego ponad 80% to struktury uzyskane metodą dyfrakcji

promieniowania rentgenowskiego na monokryształach. Dominują struktury białek

globularnych.

67

Wykład 11

(c) Stabilizacja struktur natywnych cząsteczek białkowych nie jest wysoka.

Wynosi od kilkunastu do kilkadziesięciu kilojouli na mol (PLANSZA 119) i wynika z

oddziaływań stabilizujących (G, H), o których mówiłem przy omawianiu białek

globularnych: hydrofobowe, mostki solne, wiązania wodorowe, oddziaływania van der

Waalsa, oddziaływania z rozpuszczalnikiem, w tym wymiana jonów i cząsteczek wody

między sferą hydratacyjną białka i bulk solvent (water release), które w sumie przeważają

nad wkładem destabilizującym, głównie entropii konformacyjnej (TS). Obliczenia

poszczególnych wkładów obdarzone są niestety błędami, które kumulują się w ostatecznej

wartości teoretycznej (zsumowanie daje 170 kJ/mol). Dla białek globularnych i błonowych

zmiany warunków środowiska mogą spowodować odwrócenie relacji stabilizacja -

destabilizacja struktury natywnej i przejście białka w formę zdenaturowaną kłębka

statystycznego (PLANSZA 120). Czynnikami denturującymi dla białek globularnych są:

(a) podwyższona temperatura wzmaga ruchy cieplne, które rozbijają oddziaływania

elektrostatyczne i van der Waalsa o energiach rzędu RT;

(b) chemiczne denaturanty np. mocznik, chlorek guanidyny wiążą się z powierzchnią

białka dążąc do jej maksymalizacji, a tak jest w strukturze rozwiniętej;

(c) pH roztworu: jonizacja i protonacja grup bocznych niszczy oddziaływania

stabilizujące struktur natywnych.

Należy wspomnieć, że białka niektórych organizmów wykazują znaczną stabilność w

skrajnych warunkach np. białka bakterii termofilnych nawet do 100 120C. Jak widać z

wykresów zależności stosunku zawartości formy zdenaturowanej do formy natywnej

przejście zachodzi dla wielu białek ostro jak topnienie i ma charakter odwracalny.

Usunięcie czynnika denaturującego powoduje powtórne zwinięcie się białka

zdenaturowanego do formy natywnej czyli refolding. Wynika to stąd, że informacja o

strukturze przestrzennej formy natywnej białka jest określona przez sekwencją

aminokwasów. Znając sekwencję aminokwasów istnieje możliwość teoretycznego

zwinięcia białka do jego formy natywnej, która według tzw. hipotezy Anfinsena jest

stanem o minimum energii swobodnej G.

Ten temat: zwijanie białek (protein folding) jest centralnym problemem biofizyki

(biologii) molekularnej i obejmuje następujące dwie klasy zagadnień.

68

(a) poszukiwanie komputerowych algorytmów wyznaczania struktury natywnej z

sekwencji aminokwasów; input - sekwencja, output – współrzędne atomow białka;

(b) doświadczalne poszukiwanie molekularnych mechanizmów (dróg) zwijania różnymi

metodami i teoretyczne ich modelowanie dla białek o znanej strukturze przestrzennej.

Problem leży w znalezieniu jednej konformacji z astronomicznej ilości możliwych (ponad

1030

dla białka o 100 aminokwasach). Ponieważ czasy zwijania różnych białek wynoszą od

milisekund do minut a nawet godzin, 105

s do 102s, więc są za długie do szukania

właściwej konformacji aktualnie stosowanymi metodami dynamiki molekularnej MD.

Nawet przy najlepszych obecnie superkomputerach i stosowaniu uproszczonych

(niepełnoatomowych) modeli białek o zredukowanej ilości stopni swobody, czasy

symulacji nie przekraczają mikrosekund (10-6

s), można więc uchwycić zaledwie efekty

początkowe, zaczątki struktury natywnej, np. formowanie się helisy czy -szpilki (-

hairpin, -turn). Komputerowe techniki zwijania głównie białek globularnych stosuje

się z sukcesem w trzech typach zagadnień:

(1) Wyznaczanie struktur drugorzędowych a więc lokalnych;

(2) Wyznaczanie struktur całkowitych w białkach o dużej homologii czyli

identyczności lub podobieństwie sekwencji do białek o stukturze znanej;

(3) Wyznaczanie struktur superdrugorzędowych i trzeciorzędowych de novo niezbyt

dużych białek metodami statystycznego próbkowania konformacji dla uproszczonych

modeli cząsteczek białkowych, np. zwijanie na siatkach czyli w nieciągłej przestrzeni

konformacyjnej.

Wyznaczanie struktur drugorzędowych opiera się na preferencjach

(prawdopodobieństwie) aminokwasów do znajdowania się w określonych typach

struktur drugorzędowych (PLANSZA 121). Dla każdego i-tego z 20 (22) aminokwasów

można określić liczbowo preferencje przebywania w strukturze x: helisie, -kartce i

skręcie, na podstawie analizy statystycznej baz danych sekwencji i struktur białek. Np.

glutamina (Glu) bardzo chętnie przebywa w helisie (P > 1), niechętnie w -kartce (P <

1), i nie ma preferencji ani braku preferencji jeśli chodzi o skręty , i pętle (Pt ok. 1).

Odwrotnie zachowuje się cysteina (Cys). Na tej podstawie tworzy się algorytm (np. jeden

z pierwszych Chou i Fasmana) przekładający preferencje strukturalne kolejnych

aminokwasów fragmentu białka na jego strukturę drugorzędową. Dokładność

przewidywań sięga 80%, co oddaje lokalne uwarunkowania struktur drugorzędowych,

które mogą być prawdopodobnie dodatkowo determinowane przez globalny fold białka.

69

Zwijanie na podstawie homologii sekwencji wykorzystuje znaną zależność, że

30% identyczności (podobieństwa) sekwencji białek daje ponad 70% podobieństwa ich

struktury trzeciorzędowej. Punktem wyjścia jest właściwe uszeregowanie sekwencji

białka o nieznanej strukturze w stosunku do homologicznego białka lub kilku białek

matrycowych (tarcz, wzorców) o znanych strukturach przestrzennych (PLANSZA 122).

Problem nie jest trywialny gdyż uzyskanie identyczności w jednym miejscu wymaga jej

poświęcenia w innym i trzeba w tym celu skonstruować algorytm oparty na punktowaniu:

- punkty dodatnie za identyczność aminokwasów;

- punkty ujemne za zamiany aminokwasów i wprowadzanie luk.

Maksymalna wartość punktowa dając właściwe uszeregowanie (programy FASTA,

BLAST, CLUSTAL W) wyznacza obszary strukturalnie zachowane SCR (PLANSZA

123). Kolejny program (np. MODELLER) „wpisuje” nieznane współrzędne badanego

białka w znane współrzędne białka homologicznego. Obszary SRC (zwykle struktury

drugorzędowe) trzeba następnie połączyć, najczęściej pętlami, również wziętymi z baz

danych. Minimalizacja energii (MM, MD) usuwa steryczne naprężenia w wymodelowanej

strukturze. Weryfikacja uzyskanej struktury odbywa się na podstawie szeregu kryteriów:

optymalne kontakty hydrofobowe i powierzchnia dostępu rozpuszczalnika, „właściwe”

położenia aminokwasów na diagramie Ramachandrana.

W trzeciej grupie technik przybliża się cząsteczkę białka przez uproszczony model,

np. sfery centrowane na C, wiązaniu peptydowym CN, i C (reprezentacja łańcucha

bocznego). Odpowiednio skonstruowane oddziaływania między sferami dają energie

dyskretnych (nieciągłych) konformacji, reprezentowanych przez położenia sfer

(pseudoatomów) na siatce. Próbkowanie statystyczne energii stanów konformacyjnych

przez zmiany położeń pseudoatomów oszczędnymi czasowo metodami Monte Carlo daje

globalnego minimum energetycznego odpowiadającego strukturze natywnej.

W modelowaniu komputerowym struktur rozgrywa się "zawody sportowe" w

ramach CASP (Critical Assesment of Structure Prediction): opracowane doświadczalnie,

nieopublikowane struktury są deponowane przez organizatorów. Sekwencje są

udostępniona na www grupom badawczym, które starają się wymodelować struktury

swoimi metodami. Aktualnie w CASP rozgrywane sa zawody w czterech konkurencjach:

- modelowanie homologiczne CP (comparative modelling);

- rozpoznanie foldu FR (fold recognition);

- nowe foldy NF (new folds);

70

- przewidywanie struktur drugorzędowych.

Sposób znalezienia przez cząsteczkę białka natywnej konformacji nie może się

opierać na przeszukiwaniu dostępnej przestrzeni konformacyjnej metodą prób i błędów.

Zagadnienie formułuje tzw. paradoks Levinthala: dla łańcucha peptydowego 100

aminokwasów takie próbkowanie 1030

konformacji z czasem 10-11

s każda wymaga 1019

s

czyli 1011

lat czyli dłużej niż wiek wszechświata. Model zwijania BIAŁEK

GLOBULARNYCH dobrze oddaje lejek zdarzeń równoległych (folding funnel,

PLANSZA 124). Każdy punkt na powierzchni lejka reprezentuje energie swobodną

Gibbsa G białka w funkcji kątów i opisujących konformację. Proces zwijania ma

charakter dyfuzyjny: przypadkowe ruchy łańcucha pod wpływem fluktuacji termicznych i

sił Browna, ALE przy ruchu po powierzchni lejka wcześniejsze etapy zwinięcia

sprzyjają następnym, czyli proces jest KOOPERATYWNY. Poszczególne cząsteczki

zwijają się niezależnie od siebie „spływając” po ściankach lejka jak niezależne krople

wody, startując z różnych form kłębka statystycznego na obrzeżu lejka. Zysk energetyczny

kontaktów stabilizujących strukturę natywną kompensuje spadek entropii związany z

zacieśnianiem ilości dostępnych konformacji. Przypadkowemu, niekooperatywnemu

przeszukiwaniu przestrzeni konformacyjnej odpowiadałoby błądzenie po płaskiej

powierzchni w poszukiwaniu małego „otworu” w środku.

Wyznaczanie form pośrednich ma duże znaczenie w określeniu mechanizmów i

dróg zwijania. Formy te, jeśli występują (nie jest to cecha wszystkich białek) mogą być

reprezentowane przez minima lokalne na pofałdowanym lejku zwijania. Nawet jeśli brak

wyraźnie ustrukturowanych form pośrednich na drodze zwijania, przyjmuje się w zwijaniu

białek globularnych ukształtowanie tzw. stopionej globuły (molten globule), w ktorej

białko ma już globalny kształt struktury trzeciorzędowej, ale nie występuje jeszcze

właściwe ustawienie łańcuchów bocznych aminokwasów; nie ma jądra hydrofobowego.

Jedną z dużej ilości metod badania dróg zwijania jest wyłapywanie intermediatów z

przypadkowo utworzonymi mostkami dwusiarczkowymi jak w białku BPTI

PLANSZA 125). Trzy mostki SS muszą się utworzyć w ściśle określonej kolejności na

drodze do formy natywnej. Można przerywać tworzenie struktury natywnej w określonych

momentach czasu (dla BPTI przez zakwaszenie) i określać struktury form przejściowych.

W przypadku BPTI widać np. że wcześniejsze utworzenie właściwego mostka 14-38 niż

wymaga tego droga zwijania prowadzi do niewłaściwej formy. Forma ta musi ulec

71

rozwinięciu, żeby białko weszło na właściwą drogę zwijania. Prawidłowa droga zwijania

prowadzi przez przejściowe utworzenie niewłaściwych mostków 5-38 i 5-14. In vivo

dobranie właściwych par cystein i katalizę tworzenia wiązania SS zapewnia enzym

izomeraza dwusiarczkowa.

Mechanizm zwijania, podobnie jak algorytmy przewidywania struktury

przestrzennej na podstawie sekwencji, są ciągle dalekie od dokładnego poznania.

Kontrowersyjne są zarówno pierwsze etapy tworzenia zaczątków struktury zwiniętej jak i

problem hierarchiczności procesu zwijania: czy najpierw powstają struktury

drugorzędowe, które łączą się w ostateczny fold przestrzenny, czy inicjacją procesu jest

„kolaps hydrofobowy” z utworzeniem jądra hydrofobowego, który narzuca ukształtowanie

struktur drugorzędowych.

Zdolność samoistnego zwijanie białek in vitro jest ważną cechą zwijania in vivo.

Maszyneria komórkowa podnosi efektywność, ale nie może „wymusić” zwinięcia

łańcucha peptydowego pozbawionego tej własności in vitro. Maszyneria translacyjna

rybosomu sprzyja przynajmniej częściowemu zwijaniu białek w trakcie powstawania czyli

kotranslacyjnie. Dzięki peptydom sygnałowym na N-końcu (kilkadziesiąt AA) białko

trafia we właściwe miejsce funkcjonowania w komórce lub na zewnątrz, w procesie

topogenezy (PLANSZA 126). Proces polega na przejściowym zatrzymaniu translacji

przez czynnik SRP (signal recognition particle), związaniu maszynerii translacyjnej z

błoną i odcięciu peptydu sygnałowego przez związaną z błoną peptydazę sygnałową, z

jednoczesnym przejściem przez błonę syntetyzowanego łańcucha peptydowego lub

zakotwiczeniem w błonie (białko błonowe).

Przynajmniej część białek wymaga udziału w zwijaniu posttranslacyjnym

pomocniczego systemu białkowych kompleksów opiekuńczych tzw. chaperonów,

często związanych z białkami szoku termicznego HSP. Najlepiej poznany jest system

bakteryjny GroEL/GroES (800+70 kDa), którego obie części zostały wykrystalizowane.

Po związaniu GroES z jednej strony cylindra i przy udziale ATP do środka cylindra GroEL

(PLANSZA 127) wchodzi białko źle zwinięte i (zależnie od hipotezy/modelu):

- jest rozwijane, aby mogło się zwinąć właściwie (IAM, iterative annealing model);

-jest właściwie zwijane w środku, w otoczeniu chaperoroninowym klatki Anfinsena

(ACM, Anfinsen cage model).

Kołyska GroEL jest podobna do proteasomu, gdzie białka kończą swój żywot pocięte na

kawałki, po uprzednim oznakowaniu cząsteczkami ubiquityny (79 aminokwasów), która

wiąże oznakowane białko z proteasomem.

72

Niewłaściwe zwinięte białka jak prion w chorobie Creutzfelda-Jacoba (wściekłych

krów) czy -amyloid w chorobie Altzheimera mogą agregować tworząc złogi zabójcze dla

komórek. Spektroskopia NMR w ciele stałym i mikroskopia elektronowa (STEM,

scanning transmission microscopy; PLANSZA 128) dostarczają rosnącą ilość informacji o

strukturach i kinetyce tworzenia złogów amyloidalnych. Na lejkach zwijania formy te

mogą być reprezentowane jako drugie dno lejka (PLANSZA 124). W przypadku -

amyloidu Alzheimera (PLANSZA 129) dwa fragmenty -kartkowe z ostrym skrętem

każdy są połączone oddziaływaniami hydrofobowymi i agregują między sobą do

struktury czterowarstwowej.

W ostatnim okresie pojawiła się rosnąca ilość doniesień literaturowych o białkach

lub domenach białkowych częściowo lub całkowicie nieustrukturowanych, które

przybierają natywną formę ustrukturowaną dopiero przy wiązaniu w kompleksy. Białka te,

określane jako natywnie rozwinięte (natively unfolded, structuraly disordered, intrinsicly

disordered - ID) są często zaangażowane w procesy regulacyjne i sygnałowe, a ich ilość

szacuje się na 30% wszystkich rodzajów białek w eukaryotach. Brak lub częściowy brak

struktury ma tę funkcjonalna zaletę, że umożliwia wiązanie w kompleksy z kilkoma

różnymi partnerami, z inną strukturą przestrzenną centrum wiążącego za każdym razem.

Zapewnia to (hipoteza) możliwość tworzenia kilku centrów wiążących przy zachowaniu

minimalnej wielkości białka, tzn. ustrukturowane białko z kilkoma różnymi centrami

wiążącymi musiałoby być kilkakrotnie większe.

Tematem analogicznym do zwijania białek jest zwijanie RNA (RNA folding) i

obejmuje te same dwie klasy zagadnień: teoretyczne przewidywanie struktury RNA na

podstawie sekwencji nukleotydów i charakterystyka mechanizmów zwijania na gruncie

modelu „lejka zwijania” (temat nie będzie omawiany szczegłówo). Całkowity czas

zwijania RNA jest podobny jak w białkach, od 105

s do 102s i dzieli się na wyraźne etapy

w hierarchicznej kolejności tworzenia, najpierw struktur drugorzędowych (silniejsze

oddziaływania stabilizujące), a następnie trzeciorzędowych (słabsze oddziaływania

stabilizujące). Silne pofałdowanie lejków zwijania RNA stwarza liczne pułapki

strukturalne i kinetyczne na drodze zwijania, usuwane przez mechanizmy komórkowe.

73

Wykład 12

5. Specyficzne oddziaływania międzycząsteczkowe z udziałem białek i kwasów

nukleinowych. Białka i kwasy nukleinowe tworzą ze sobą i z innymi cząsteczkami

funkcjonalne kompleksy o różnej ilości molekuł w kompleksie i wyrażanym przez stałe

asocjacji Kas (PLANSZA 9) różnym stopniu specyficzności. Stabilizację kompleksów

warunkują te same tpy oddziaływań jak przy stabilizacji struktur natywnych biopolimerów

(PLANSZA 8). Asocjacja molekuł jest procesem dynamicznym (PLANSZA 130).

Cząsteczki nie wpasowują się sztywno jak „klucz do zamka”, ale zmieniają konformacje

dopasowując swoje powierzchnie molekularne (induced fit) dla efektywnego działania

elektrostatycznych oddziaływań stabilizujących między optymalnie rozłożonymi

ładunkami. Temin „induced fit” wprowadził Koshland (lata50-tych XX) dla wyjaśnienia

powstawania aktywnej formy enzymu E po przyłączeniu substratu E*S ES. Mimo, że

zmiana konformacyjna składników kompleksu wiąże się z dodatkowym kosztem

energetycznym, lepsze dopasowanie powierzchni molekularnych daje obniżenie bariery

tworzenia kompleksu G# zapewniające wydajniejszą kinetykę wiązania oraz optymalne

ułożenie ładunków (podwyższenie energii stabilizacji G). Alternatywnym lub

komplementarnym modelem jest preselekcja właściwych konformacji przy wiązaniu.

W przypadku gdy jeden z partnerów kompleksu jest białkiem natywnie

rozwiniętym zaproponowano model „fly-casting”: jednoczesnego zwijania i

kompleksowania. Białko częściowo lub całkowicie rozwinięte może tworzyć wstępne

kontakty stabilizujące przy większych odległościach (Rcm na PLANSZY). Chociaż

relatywnie bardzo słabe, kontakty te umożliwiają „zahaczenie” białka „na tarczy”

partnera kompleksu z następującym jego nawijaniem na „tarczy” jak przy „łowieniu

pstrąga na muchę”. Zagadnienia oddziaływań stabilizujących kompleksy oraz

charakterystycznych motywów strukturalnych czasteczek biorących udział we

wzajemym rozpoznawaniu omówię na wybranych przykładach.

Interkalatory. Liczne związki organiczne o charakterze antybiotyków,

mutagenów, kancerogenów lub odwrotnie, środków przeciwnowotworowych oraz

środków przeciwwirusowych ma postać układów wielopierścieniowych (PLANSZA 131).

Tego typu związki mogą oddziaływać z helikalnymi formami DNA interkalując, czyli

wchodząc pomiędzy dwie zestackingowane pary zasad i oddziałując z nimi warstwowo.

74

Struktura helikalna nie jest przy tym niszczona, a tylko modyfikowana, co może prowadzić

do zaburzeń w ekspresji genów i efektów takich jak mutageneza czy kancerogeneza.

Przykładowo, cytotoksyczny antybiotyk adriamycyna (hydroksydaunomycyna) wymusza

przez interkalację przejście Z B helisy DNA (PLANSZA 132). Interkalatory zwykle

wykazują częściową specyficzność poprzez większe powinowactwo do obszarów DNA

bogatych w pary GC. Przy odpowienim stężeniu i odpowiednio wysokiej stałej asocjacji

mogą zapełnić do 40% dostępnych miejsc (PLANSZA 131), czyli wejść pomiędzy prawie

co drugą parę zasad.

Poliamidy. Odpowiednio zaprojektowane cząsteczki „białkopodobne” (PLANSZA

133), złożone z trzech typów pierścieni: pyrolu (Py), 3-hydroksypyrolu (Hp) i imidazolu

(Im) połączonych wiązaniami peptydowymi, wiążą się z helisami DNA od strony małej

bruzdy. W zależności od kombinacji dwóch pierścieni w pozycjach 3 i 6 łańcucha,

rozpoznają i selektywnie wiążą poszczególne pary zasad: A:T, T:A, G:C i C:G

(„chemiczne” odczytywanie informacji genetycznej). Odróżnienie opiera się na niskiej

stałej dysocjacji, poniżej 1 nM (inaczej wysokiej stałej asocjacji)::

KD = [poliamid][DNA]/[kompleks]

w wiązaniu wyróżnionej pary zasad. W przypadku trzech pozostałych par zasad i innej

kombinacji Py/Hp/Im, stała KD jest do dwóch rzędów wielkości wyższa. Specyficzność

jest uwarunkowana układem wiązań wodorowych pierscień poliamidu/pierścień zasady

oraz komplementarności kształtu powierzchni kontaktu (shape complementarity), co

szczególnie w przypadku odróżnienia pary A:T od T:A wiąże się z rozpoznaniem bardzo

małych różnic powierzchni molekularnych.

Aptamery. Szereg oligomerycznych fragmentów RNA i pojedynczoniciowych

DNA (kilkadziesiąt nukleotydów) wykazuje własności wiązania ligandów

niskocząsteczkowych, np. aminokwasy, nukleotydy, z wysokimi stałymi asocjacji i

wysoką specyficznością. Fragmenty te, tzw. aptamery pochodzą z selekcji in vitro, w

których startując z bibliotek sekwencji przypadkowych optymalizuje się te sekwencje w

kierunku wysokiego powinowactwa wobec określonych ligandów (SELEX - systematic

evolution of ligands by exponential enrichment). Własności konformacyjne i sposób

wiązania ligandów są w wielu przypadkach podobne we wszystkich aptamerach.

Przykładem może być 34n aptamer RNA wiążący AMP (PLANSZA 134), którego

strukturę wyznaczono metodami spektroskopii NMR (fragment widma odpowiada

75

protonom wiązań wodorowych). AMP jest wiązane w kieszeni utworzonej przez giętką

pętlę RNA, która w trakcie wiązania usztywnia się i przybiera właściwą konformację

jakby dwóch zintegrowanych szpilek do włosów z jednej nici (induced fit). Obszary

helikalne szpilek są nachylone do siebie pod kątem 106. Pętla jest zamknięta przez dwie

pary zasad G7:G11 i G17:G34, a AMP jest stabilizowane przez trzy wiązania wodorowe

(jedno do A12 i dwa do G8) i stacking typu sandwich czyli interkalacyjny, z dwoma

pierścieniami, A10 i G11. Aptamery zaobserwowano w regulacji ekspresji genów na

poziomie transkrypcji i translacji w strukturach tzw. „przełączników RNA” (RNA

switches): aptamer wiążący ligand plus platforma ekspresyjna, która transmituje sygnał

stanu związania poprzez zmiany konformacyjne. Przykłady: aptamery na 5’UTR

(untranslated regions) niekodującej części mRNA, który reguluje translację.

Kompleksy białko-DNA o bardzo wysokiej specyficzności od dawna były i są

centralnym punktem zainteresowania biofizyków i biologów molekularnych jako

podstawa zachodzenia i regulacji procesów ekspresji genu na poziomie transkrypcji i

transalacji oraz reakcji enzymatycznych z udziałem endonukleaz restrykcyjnych. Ze

względu na wielkość oddziałujących cząsteczek badania strukturalne ograniczały się

początkowo do fragmentów białkowych i oligonukleotydowych, które bezpośrednio

uczestniczą we wzajemnym rozpoznaniu. Obecnie określa się już struktury kompletnych

kompleksów (szczególnie kompleksów białko - RNA omówionych dalej). Według prac

przeglądowych znane są już struktury kilkuset kompleksów białko - DNA a ich ilość

szybko wzrasta. Kolejno będą omawiane charakterystyczne przykłady.

Kompleks fragmentu długości 69 aminokwasów białka represora faga 434 z 14

bp podwójną helisą DNA operatora zbadano rentgenograficznie (PLANSZA 135). Dwie

cząsteczki (dimer) białka wiążą się z DNA w postaci charakterystycznego motywu helisa-

skręt-helisa (helix-turn-helix), który stwierdzono również w innych kompleksach białko-

DNA. Motyw długości ok. 20 aminokwasów ma 6 AA ściśle „zakonserwowanych” we

wszystkich motywach rozpoznających helisy DNA o różnych sekwencjach

nukleotydowych. Jedna z helis motywu stanowi jakby platformę dla drugiej helisy, która

bezpośrednio wchodzi w dużą bruzdę DNA w konformacji B, przy czym DNA jest nieco

wygięte, mocniej zwinięte w środku o zwężonej małej bruździe. Wiązanie między

cząsteczkami zachodzi przez:

(a) wiązania wodorowe (5 wiązań) między resztami bocznymi glutamin 28, 29 i 33

oraz parami AT1, GC2, AT4 i AT5; dwie glutaminy tworzą wiązania typu podwójnego

76

(bidentate), gdzie C=O jest akceptorem a NH2 donorem protonu do par AT (N6H/O

4 i

N6H/N7), a trzecia glutamina jedno wiązanie (donor protonu) z O

6 guaniny pary GC z

wykorzystaniem akceptora do wiązania wodorowego w samym białku;

(b) oddziaływanie kulombowskie dodatnio naładowanych arginin (43, 41, 16) z

ujemnie naładowanymi tlenami grup fosforanowych DNA (mostki solne);

(c) oddziaływanie hydrofobowe grupy metylowej tyminy pary AT3 z hydrofobową

częścią łańcucha Gln29.

Dopasowanie powierzchni obu cząsteczek i właściwe wzajemne rozmieszczenie grup

funkcyjnych o odpowiednich ładunkach zapewniających oddziaływania są niezbędnym

warunkiem silnego związania cząsteczek w kompleksie; przy niespecyficznym

odziaływaniu nastąpiłoby odsunięcie obu cząsteczek o 2 ÷ 3Å.

Omówione charakterystyczne typy oddziaływań stabilizujących kompleksy białko -

kwas nukleinowy będą się powtarzać we wszystkich przypadkach, z różnym udziałem

każdego z nich. Częściej w przypadku kompleksów z RNA, a stosunkowo rzadko w DNA

obserwuje się:

(d) oddziaływania warstwowe (stacking) pierścieni aromatycznych aminokwasów i

zasad nukleinowych.

Tego typu oddziaływanie pojawia się w potrójnym kompleksie transkrypcyjnym

(struktura krystalograficzna) eukaryotów: fragment białka TBP, które rozpoznaje TATA-

box w DNA, fragment czynnika transkrypcyjnego TFIIB i 14 bp podwójna helisa DNA

zawierająca sekwencję TATA (PLANSZA 136). Białko TBP w postaci dwudomenowej

antyrównoległej -kartki tworzy strukturę podobną do „siodła”, która wiąże DNA od

strony małej bruzdy. DNA ulega częściowemu rozwinięciu i wygięciu między dwoma

załamaniami (kinks) wywołanymi przez dwie pary fenyloalanin (F165/F148 i F57/F74),

spełniające jakby rolę „klinów” między TA3/AT4 i AT9/GC10; dwie z tych fenyloalanin

stackingują interkalacyjnie.

Motywem białkowym, rozpoznającym sekwencję par zasad z dużym udziałem GC

jest palec cynkowy (zinc finger, PLANSZA 137): struktura superdrugorzędowa, złożona z

helisy i dwuniciowej antyrównoległej -kartki, utrzymywane przez jon Zn+2

skoordynowany poprzez 4 łańcuchy boczne cystein lub 2 histydyny i 2 cysteiny. Zwykle

kilka palców połączonych linkerami o różnej długości oddziałuje (Zif263; mause

intermediate early protein) z sąsiadującymi sekwencjami po trzy pary 5’-GCG TGG GCG-

3’. Helisa białkowa wchodzi w kontakt z dużą bruzdą DNA poprzez podwójne wiązania

77

wodorowe między grupami NH2 reszty argininowej (donory) i N7/O6 guanin. Dodatkową

stabilizację tego układu dają wiązania wodorowe „niezaangażowanego” protonu grupy

NH2 Arg z kwasem asparaginowym w samym białku. Palec cynkowy jest przypadkiem

struktury rozpoznającej zarówno DNA jak i RNA, ale sposób wiązania RNA jest inny:

palec wiąże pętle RNA lub helisy RNA poprzez reszty fosforanowe a nie zasady.

W przypadku białek dimerycznych jak aktywator GAL4 drożdży (regulacja

katabolizmu galaktozy) dodatkowym czynnikiem stabilizującym kompleks DNA - białko

może być zamek leucynowy (leucine zipper). Dwie amfipatyczne helisy dimeru

białkowego oddziałują ze sobą hydrofobowo (PLANSZA 138) poprzez alifatyczne

leucyny, rozmieszczone po jednej stronie każdej z helis. W rozpoznaniu helisy bierze

udział zmodyfikowany palec cynkowy stabilizowany przez dwa jony Zn+2

.

Charakterystyczny fold dwunukleotydowy złożony z helis i -kartki (dinucleotide

fold, Rossmann fold) zaobserwowano w strukturze wysoce specyficznej endonukleazy

restrykcyjnej EcoRI tnącej palindromiczny fragment d(GAATTC) zostawiając „lepkie

końce 5’-AATT i TTAA-3’ (PLANSZA 139). Wysoka specyficzność enzymu w stosunku

do sekwencji DNA jest oparta na bardzo rozbudowanej sieci wiązań wodorowych białko-

DNA.

Kompleksy białko-RNA. Mała (o rząd wielkości) ilość poznanych struktur

kompleksów białko - RNA w porównaniu ze znaczną ilością kompleksów białko - DNA

wynika głównie z opóźnienia metodologii syntezy fragmentów RNA. Jednak właśnie w

zakresie tych kompleksów uzyskano rentgenograficzne struktury kompletnych

rybosomów: bakteryjnego (70S; 2,7 mln Da, 3 cząsteczki rRNA, 54 białka; Korostelev et

al. Cell 126, 1065, 2006) i rybosomu eukariotycznego (80S, 3,3 mln Da, 4 cząsteczki

rRNA, 79 białek; Ben-Shem et al. Science 330, 1203, 2010), plus (w każdym przypadku)

2÷3 cząsteczki tRNA oraz mRNA; rozdzielczość dyfraktogramów ~3,5 Å.

Powszechnie występującą domeną w białkach wiążących RNA jest motyw RRM

(RNA - recognition motif; RBD - RNA-bindig domain) (PLANSZA 140), pokazywany już

poprzednio jako przykład foldu trzeciorzędowego (PLANSZA 111), w postaci -kartki

otoczonej fragmentami helikalnymi i pętlami. Przy wiązaniu RNA międzycząsteczkowy

stacking obejmuje 4 układy -elektronowe pierścieni i reszty carboksylowej:

Phe56/A11/C12/Asp92.

78

Inicjacja procesu translacji w eukaryotach zachodzi poprzez specyficzne

rozpoznanie struktury kapu na 5'-końcu mRNA (PLANSZA 141) przez eukaryotyczny

inicjacyjny czynnik białkowy eIF4E (PLANSZA 142). Motyw wiążący kap w formie

kieszeni hydrofobowej utworzonej przez wygiętą jak dłoń antyrównoległą -kartkę, krótką

helisę i pętle S1,2 i S3,4 przypomina motyw RRM ale nie jest z nim tożsamy. Kluczowym

dla specyficzności oddziaływaniem jest stacking kation- typu sandwich

(interkalacyjny) dodatnio naładowanego pierścienia 7-metyloguaniny między dwoma

tryptofanmi. Podobny stacking obserwuje się w szeregu innych białek specyficznie

wiążących kap, przy czym pierścienie tryptofanu mogą być zastępowane przez tyrozyny.

Trzy wiązania wodorowe stabilizujące 7-metyloguaninę do reszty kwasu glutaminowego

E103–COO(–)

i NH w łańcuchu Trp102 NIE decydują o specyficzności, gdyż pierścień

guaninowy jest zdolny do utworzenia tych samych wiązań wodorowych ALE nie może

zastąpić 7-metyloguaninowego.

Inne motywy zaobserwowane w kompleksach białko-RNA (których nie będę

omawiał szczegółowo) to:

- fold dwunukleotydowy (podobnie jak w kompleksie endonukleaza restrykcyjna EcoRI -

DNA) w formie pięcioniciowej -kartka i czterech helis w syntetazie glutaminylo-tRNAGln

jest odpowiedzialny za wiązanie części akceptorowej tRNA i ATP;

- PWI w formie wiązki czterech helis w faktorze białkowym SRm160 w splicingu;

- motyw k-TURN w U4 snRNA w splicingu (także w rybosomie): 3-nukleotydowe

wybrzuszenie (PLANSZA 76) pomiędzy kanoniczną helisą i niekanoniczną helisą z dwu

parami G:A.

Szereg prób krystalograficznych doprowadziło do uzyskania odrębnych struktur

dużej (50S) i małej (30S) podjednostki rybosomu bakterii Thermus thermophilus, co

umożliwiło skonstruowanie modelu atomowego pełnego rybosomu prokariotycznego ze

związanym mRNA i tRNA (PLANSZA 143: duża podjednostka - „prawa strona, mała

podjednostka - „lewa strona, mRNA - żółte, rRNA - pomarańczowe, trzy tRNA -

czerwone, szare i fioletowe w reprezentacji czaszowej space filing, główne łańcuchy

białkowe - zielone i niebieskie), potwierdzony przez strukturę pełnego rybosomu (z

dwoma tRNA) w pracy Korostelev et al. 2006. Rozwiązane struktury dostarczają wielu

informacji o:

- trzeciorzędowych motywach strukturalnych RNA i oddziaływaniach składników w

kompleksach białko - RNA, a w konsekwencji:

79

- mechanizmie funkcjonowania rybosomu: np. induced fit struktury rybosomu pod

wpływem przyłączenia tRNA ze znaczącymi zmianami konformacji w centrum

katalitycznym transferazy peptydowej, rybozymu 23S rRNA katalizującego syntezę

wiązania peptydowego.

Relatywnie największa ilość badań w dziedzinie kompleksów molekularnych była (i

jest) poświęcona kompleksom warunkującym zachodzenie reakcji biochemicznych w

komórce, czyli kompleksom enzym – substrat. Terminem tym określam wszystkie typy

kompleksów związanych z reakcjami enzymatycznymi, a więc również kompleksy enzym

– inhibitor, enzym – koenzym, enzym aktywator (allosteryczny). Wyróżnić tu można

zarówno kompleksy z udziałem enzymów białkowych i enzymów RNA (rybozymów) oraz

ligandów niskocząsteczkowych, jak i kompleksy enzymatyczne z udziałem makromolekuł

typu białko – kwas nukleinowy.

Zagadnienia kompleksów enzymatycznych i kinetyki reakcji katalizowanych przez

enzymy nie będą omawiane szczegółowo, a jedynie w kontekście projektowania środków

farmakologicznych „drug design” (dalsza część wykładu).

80

Wykład 13

Badania największych kompleksów typu struktur subkomórkowych (rybosom)

jest domenę rentgenografii. Największą strukturą dla której zarejestrowano rozwiązywalne

widma NMR jest kompleks chaperoninowy GroEL/GroES o masie 872 kDa (Flaux et al.

Nature 418, 207, 2002), dla którego już wcześniej rozwiązano strukturę w krysztale

metodą dyfrakcji rentgenowskiej. Znajomość struktur tak dużych obiektów molekularnych

jest warunkiem koniecznym, ale niewystarczającym dla pełnego scharakteryzowania ich

mechanizmów działania. Pozostawia to duże pole do badań dynamiki przekształceń

konformacyjnych, technik manipulacji i spektroskopii pojedynczych cząsteczek oraz

badań strukturalnych metodami mikroskopowymi (średni poziom rozdzielczości).

Przykładowo, śledzenie działania pojedynczej cząsteczki polimerazy RNA (RNAP),

kluczowego białka enzymatycznego w procesie transkrypcji, w różnych układach (assays)

(PLANSZA 144) ze szczypcami optycznymi i magnetycznymi stwarza unikalne

możliwości analizy molekularnego mechanizmu procesu w czasie realnym, w tym:

- obrazowanie pojedynczych kompleksów;

- monitorowanie przebiegu reakcji;

- śledzenie zmian konformacyjnych biomolekuł zaangażowanych w procesie;

- pomiary względnych odległości między działającymi cząsteczkami;

- pomiary sił mechanicznych.

Różne wersje bead-based assays z zastosowaniem pułapek optycznych i magnetycznych

do manipulacji odpowiednio paciorkami dielektrycznymi (polistyren) i magnetycznymi o

mikrometrowych wymiarach pozwalają wyznaczyć parametry ruchu molekuł.

(a) W TPM assay monitorowanie zakresu fluktuacji Browna paciorka przyczepionego do

DNA daje bezpośredni odczyt wzrostu długości DNA między paciorkiem i przyczepioną

do podłoża polimerazą RNAP, czyli translokacji enzymu po nici DNA.

(b) W optical trap assays z różnymi ilościami pułapek i paciorków śledzi się ruch RNAP

z dokładnością do kilku Å w czasie oraz mierzy siłę działania RNAP poprzez wychylenie

paciorka z centrum wiązki laserowej;

(c) W pułapce magnetycznej monitoruje się skręcenie podwójnej helisy DNA, jej

zapętlanie (plectoneme) oraz momenty sił mechanicznych skręcających helisę.

Nieco odmienne podejście metodologiczne w badaniach struktur subkomórkowych

o masach cząsteczkowych rzędu 50 megadaltonów (o rząd wielkości więcej niż rybosom

eukariotyczny) zastosowano do analizy kompleksu białkowo-lipidowego NPC (nuclear

81

pore complex), złożonego z 456 białek błonowych 20 różnych typów nukleoporyn (dwie

publikacje: Alber et al. Nature 450, 683 & 695, 2007). Podejście polega na „składaniu

struktury z kawałków”:

- zebranie danych eksperymentalnych za pomocą maksymalnej ilości dostępnych

metod, dostarczających informacje o kształtach skladników kompleksu, ich lokalizacji i

wzajemnych kontaktach: ultrawirowanie, immunoblotting, mikroskopia, modelowanie itp.;

- konstrukcja więzów przestrzennych na wzajemne ustawienia składników;

- optymalizacja zbioru dopuszczalnych struktur kompatybilnych z więzami;

- wybór struktury optymalnej.

Osiągnięcie podstawowego celu GENOMIKI czyli zsekwencjonowanie genomu

ludzkiego przesunęły priorytety wysokoprzepustowych badań typu „omics” w kierunku

PROTEOMIKI STRUKTURALNEJ: wyznaczanie maksymalnej ilości reprezentatywnych

struktur cząsteczek białkowych o określonych typach foldów. Wybór dotyczy grup białek

współdziałających na określonych odcinkach szlaków metabolicznych w celu

konstruowaniu molekularnych mechanizmów procesów biochemicznych (funkcjonalne

scharakteryzowanie przez strukturę SAR). Praktyczny cel badań stanowi zaprojektowanie

środków farmakologicznych (antywirusowych, antynowotworowych) na podstawie

znajomości struktur i oddziaływań w centrach wiążących kluczowych receptorów

białkowych czyli tzw. „tarcz” (rational drug design). Ośrodki badawcze w zakresie

proteomiki dysponują szerokim i zautomatyzowanym zapleczem w zakresie inżynierii

genetycznej (Proteomic Analyser firmy Applied Biosystems; PLANSZA 145),

spektrometrami MS, NMR i dyfraktometrami rentgenowskimi. Szacuje się, że światowy

rynek na aparaturę, materiały i usługi związane z proteomiką przekroczył $6 mld w 2005 r.

Scharakteryzowanie proteomu obejmuje szereg działań (PLANSZA 146).

(1) Identyfikacja białek wytwarzanych w komórce danego typu czy tkance:

- dwuwymiarowa elektroforeza żelowa

- spektrometria masowa do określenia struktur pierwszorzędowych

(2) Określenie współdziałania białek w ramach funkcjonalnych kompleksów, np.

metoda tandem-affinity purification (Gavin et al. Nature 415, 141, 2002)

(3) Wyznaczenie struktur przestrzennych białek:

- pozyskanie przez nadekspresję w bakteriach, innych typach komórek i systemach

cell-free odpowiednich ilości białek modyfikowanych stosownie do metody

wyznaczania struktury przestrzennej:

82

zawierających selenometioninę do badań metodami dyfrakcji rentgenowskiej

(rozwiązywanie problemu fazowego metodą MAD)

I/LUB

podwójnie znakowanych 15

N/13

C i potrójnie znakowanych 15

N/13

C/2H do badań

metodami wielowymiarowego NMR

znalezienie białek o znanych strukturach i odpowiednio wysokiej homologii

sekwencji do zwijania komputerowego (data base search)

- przygotowanie próbek, często przy zastosowaniu modyfikacji (mutacje, delecje

fragmentów):

krystalizacja do eksperymentów dyfrakcyjnej rentgenowskiej

uzyskanie rozpuszczalności w wodnych roztworach buforowych i buforach

zawierających micelle lipidowe (ciekłokrystalicznych) do eksperymentów NMR

rozwiązanie struktury: budowa modelu przestrzennego czasteczki i jego

weryfikacja.

Przykładowy schemat praktycznego wykorzystania zdobyczy proteomiki do

projektowania środków farmakologicznych ilustruje (PLANSZA 147). Racjonalne

projektowanie wymaga znajomości struktury przestrzennej białka-tarczy, którego

zablokowanie (lub uaktywnienie) przez poszukiwaną cząsteczkę ligandu wywołuje

określony skutek farmakologiczny. Jest to albo nowe białko, które pojawia się w

zainfekowanej komórce i jest kluczowe dla rozwoju wirusa (bakterii) albo białko

zmodyfikowane w stosunku do funkcjonującego w normalnej komórce, najczęściej w

przypadku komórki nowotworowej. Procedury proteomiczne umożliwiają wyodrębnienie

takiego białka, uzyskanie odpowiednich ilości do badań i określenie struktury, np. metodą

dyfrakcji rentgenowskiej. Znając strukturę centrum aktywnego białka projektuje się

cząsteczkę ligandu, który efektywnie wiążę się w centrum aktywnym i blokuje działanie

białka. Projektowanie opiera się na analizie kontaktów stabilizujących w kompleksie

białko – ligand: wiązania wodorowe, mostki solne, oddziaływania hydrofobowe. W

przypadku białek enzymatycznych projektowany ligand powinien wiązać się lepiej niż

naturalny substrat. Potencjalny środek farmakologiczny powinien być przetestowany pod

kątem działań ubocznych.

Wiele wysiłku włożono w badania oddziaływań białek enzymatycznych z

ligandami różnego typu. Wymiar praktyczny dotyczy poszukiwaniu inhibitorów

określonych reakcji enzymatycznych jako środków farmakologicznych o charakterze

przeciwbakteryjnym, przeciwwirusowym i przeciwnowotworowym. Nie będę omawiał

83

szczegółowo kinetyki reakcji enzymatycznych, która dla reakcji wielosubstratowych i

wieloproduktowych z udziałem enzymów o strukturze czwartorzędowej może być złożona.

Enzymy, białka i cząsteczki RNA tzw. rybozymy, są katalizatorami biologicznymi reakcji

w żywych komórkach. W prostym (wystarczającym na potrzeby wykładu) modelu

Michaelisa-Menten reakcji z jednym substratem i jednym produktem (PLANSZA 148)

kinetykę (hiperboliczną) reakcji enzymatycznej opisują dwa parametry:

- stała Michaelisa Km (wyrażona w molach/litr [M]) charakteryzuje powinowactwo

substratu do enzymu, tzn im mniejsza wartość tym lepsze wiązanie, podobnie jak stała

dysocjacji kompleksu enzym-substrat, oraz większa efektywność zachodzenia reakcji;

- prędkość maksymalna Vmax zachodzenia reakcji w warunkach nasycenia wszystkich

miejsc wiążących enzymu przez substrat, wyrażona przez ilość mol produktu na sekundę

i stężenie enzymu (w mg białka na jednostkę objętości lub ilość jednostek enzymu U na

jedn. objętości; 1U = ilość enzymu katalizująca 1 mmol substratu w ciągu 1 min w

warunkach optymalnych).

Parametry te można wyznaczyć z hiperbolicznej krzywej zależności prędkości v reakcji od

całkowitego stężenia substratu [S0] (w nadmiarze w stosunku do stężenia enzymu), w

uproszczony sposób korzystając z liniowej reprezentacji np. Lineweavera-Burke’a:

zależność 1/v w funkcji 1/[S0].

Inhibitory osłabiają działanie enzymu np. inhibitory kompetycyjne blokują

miejsce wiążące dla substratu nie ulegając reakcji i dają podwyższenie stałej Km. Miarą

dobrego blokowania enzymu jest niska wartość stałej inhibicji:

Ki = [E][I]/[EI]

[I] - stężenie wolnego inhibitora, [E] - stężenie wolnego enzymu, [EI] - stężenie

kompleksu enzym - inhibitor

Dla analogów substratu Ki jest rzędu Km, ale np. dla analogów substratu w stanie

przejściowym może osiągać wartości do 1012

M.

Enzymy są jednymi z możliwych receptorów, których zablokowanie daje

określony efekt farmakologiczny, np. selektywne zablokowanie enzymu kodowanego

przez wirusa (komórkę nowotworu) przy słabszym wiązaniu inhibitora przez enzym

gospodarza może uniemożliwić namnażanie i spowodować zniszczenie wirusa

(nowotworu) przez system immunologiczny. Od dawna poszukiwano inhibitorów metodą

„prób i błędów” modyfikując chemicznie związek wyjściowy o pożądanym działaniu, tak

aby zwiększyć jego efektywność. Projektowanie leków (drug design) w oparciu o znaną

84

strukturę receptora – „tarczy”, np. określonego białka enzymatycznego, jest zdecydowanie

bardziej wydajne. Przykładem może być fosforylaza nukleozydów purynowych PNP

(PLANSZA 149), enzym występujący od bakterii do ssaków, który rozkłada nukleozydy

purynowe do zasady i cukru przez przecięcie wiązania glikozydowego w obecności reszty

fosforanowej. Enzym tnie różne nukleozydy, a więc i podawane z zewnątrz środki

farmakologiczne, które często są pochodnymi nukleozydów purynowych. Podanie silnego

inhibitora PNP razem z takim środkiem podniosłoby więc efektywność jego działania. W

oparciu o znaną strukturę krystalograficzną białka udało się zaprojektować związek, który

oddziałuje silnie ze wszystkimi trzema fragmentami centrum wiążącego substraty reakcji.

Przykładowa analiza oddziaływań w części wiążącej zasadę oddaje charakter

postępowania. Zamiana guaniny na 8-aminoguaninę daje jedno więcej wiązanie

wodorowe. Z kolei 9-deazaguanina zastępuje jedno słabsze wiązanie silniejszym, a

ponadto uniemożliwia enzymowi przecięcie wiązania typu CC zamiast CN. Niestety,

obie zmiany jednocześnie: podstawienie 8-NH2 i zamiana N9 na C9 dają w sumie

niekorzystny efekt steryczny i pogarszają oddziaływania w stosunku do każdej ze zmian

oddzielnie. Optymalna okazuje się 9-deazaguanina jako zasada, chlorobenzen jako

„cukier” a reszta kwasu octowego jako odpowiednik fosforanu. Uzyskany w ten sposób

inhibitor ma Ki ok. 100 razy mniejszą niż wszystkie inhibitory znalezione metodą

konwencjonalną.

Procedura rational drug design na podstawie struktury tarczy w połączeniu z

testowaniem doświadczalnym tylko dobrze rokujących związków modelowanych skraca

ok. trzykrotnie czas od badań podstawowych do klinicznych zastosowań leku.

85

Wykład 14

Niezwykle interesującym przykładem biologicznego i medycznego wykorzystania

wysokiej specyficzności rozpoznawania wzajemnego (wiązania) biomolekuł jest

konstrukcja tzw. mikromacierzy (microarrays) lub inaczej chip'ów DNA i białkowych.

W obu przypadkach łańcuchy polimerowe jednoniciowego DNA lub polinukleotydu są

unieruchomiane jednym końcem na powierzchni: szklanej, krzemowej, złotej,

syntetycznego polimeru, przez odpowiednio dobraną cząsteczkę linkera. Weźmy jako

przykład mikromacierz DNA (PLANSZA 150). Każde miejsce próbkujące tzw. probe site

lub spot zawiera jednakowe cząsteczki biopolimeru (ta sama sekwencja) o określonej

gęstości (density) czyli ilości cząsteczek na jednostkę powierzchni, a cały chip składa się z

dużej ilości takich spots, każda o innym typie sekwencji. Ilość różnych sekwencji

biopolimeru na chipie warunkuje jego tzw. gęstość informacyjną (complexity); obie

wielkości są parametrami charakteryzującymi chip. Potoczna nazwa „chip” bierze się stąd,

że pierwsze tego typu obiektu były wykonywane techniką fotolitograficzną jak w

produkcji mikroprocesorów komputerowych (computer chips).

Chipy DNA są złożone z syntetycznych oligomerów długości do 60 nukleotydów

lub cDNA (complementary DNA) - produktów PCR (polimer chain reaction) o długości do

300 nukleotydów, które mogą wiązać komplementarnie (hybrydyzacja) pojedyncze nici

DNA lub RNA. Wykorzystywane są zasadniczo do dwóch celów:

(1) Genotypowanie (genotyping): porównanie sekwencji DNA na chipie i DNA w

badanej próbce w celu określenia jakie geny występują w tej probce lub jaka jest struktura

pierwszorzędowa jeszcze niezsekwencjonowanego DNA.

(2) Wyznaczanie profilu ekspresyjnego (gene-expression profiling): które geny w

tkance uległy ekspresji.

Przykład tego drugiego zastosowania pokazuje testowanie zmian ekspresji genów np.

wątroby jako reakcja na podanie leku. Chip zawiera DNA fragmentów tysięcy genów, po

jednym na każdy spot. Po pobraniu dwóch próbek komórek wątroby, do jednej wprowadza

się testowany lek. Następnie z każdej zbiera się mRNA, przeprowadza odwrotną

transkrypcję do cDNA i wprowadza na nie znaczniki fluorescencyjne, o różnym kolorze,

np. czerwonym dla cDNA z próbki potraktowanej lekiem a zielonym dla próbki bez leku.

Po wprowadzeniu znakowanych cDNA do chipu zachodzi hybrydyzacja chip-

DNA/cDNA, dająca informację które geny uległy ekspresji czyli uległy transkrypcji i

86

powstalo mRNA. Za pomocą skanera oblicza się komputerowo stosunek czerwony/zielony

w każdym spot i generuje kolorowy "wydruk":

- silny wzrost aktywności genu po podaniu leku - czerwony,

- silny spadek aktywności po podaniu leku - zielony,

- geny jednakowo aktywne - żółty,

- brak aktywności danego genu w obu przypadkach - bez koloru.

Mając dodatkowo różne profile reakcji dla znanych toksyn wątroby można porównać z

nimi profil testowanego leku i szybko wykluczyć go na podstawie podobieństwa profilów

(kolorowego schematu) i/lub wytypować „kandydatów” nietoksycznych.

Innymi przykładem porównawczego zastosowania gene-expression profiling jest

"prognozowanie" rozwoju nowotworów.

„Wydajność" hybrydyzacji w układzie chip / badana próbka jest na tyle duża, że

pozwala na charakteryzowanie indywidulanych (osobniczych) różnic w sekwencjach

genomów SNP (single nucleotide polymorphism). Szczegóły chemiczne i techniczne

produkcji mikromacierzy DNA podaje przygląd w Angewandte Chemie International

Edition 41, 1276, 2002.

Chipy białkowe (PLANSZA 151) oparte sa na specyficznym wiązaniu antygen-

przeciwciało. Unieruchomione na chipie cząsteczki przeciwciał w stosunku do

charakterystycznych białek kodowanych przez bakterie i wirusy wiążą takie białka w

próbce krwi. Dodanie fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w stosunku do innych

fragmentów tych białek ujawnia związanie się antygenu i przeciwciał na chipie przez

kompleks typu "sandwich". Zabarwienie określonego miejsca na chipie sugeruje

wystąpienie w krwi antygenu pochodzącego od jakiegoś czynnika patogennego. W wersji

tzw. funkcjonalnych chipów białkowych wprowadza sie na chip same białka (a nie

przeciwciała). Szczegóły techniczne podaje przegląd: Zhu & Snyder Current Opinion in

Chemical Biology 7, 55, 2003.

Alternatywą dla konwencjonalnych chips przy detekcji nie tylko sekwencji ale

także różnych substancji są biosensory czyli „nosy chemiczne” (Current Opinion Chem.

Biol. 6, 816, 2002).

87

Podsumowując wykład, zwracam jeszcze raz uwagę na kluczowe zagadnienia

współczesnej BIOFIZYKI MOLEKULARNEJ (PLANSZA 152), zarówno w wymiarze

badań podstawowych jak i zastosowań biomedycznych i biotechnologicznych.

W wyznaczaniu struktur przestrzennych biomolekuł: szczególnie białka błonowe,

włókniste i agregaty amyloidalne stanowią prawdziwe wyzwanie metodologiczne.

Olbrzymie bogactwo struktur obserwuje się dla świata cząsteczek RNA, a szczególnie

intensywne badania strukturalne DNA dotyczą sposobu organizacji podwójnej helisy w

strukturę chromosomu na poziomie zwinięcia nici chromatynowej - domeny chromosomu

bakteryjnego i chromosomu eukariotycznego.

Zwijanie białek to charakterystyczny przykład ścisłego współdziałania metod

doświadczalnych i komputerowych w poszukiwaniu mechanizmów zwijania i ich

wyjaśniania na gruncie fizyki oraz przewidywania struktur przestrzennych na podstawie

sekwencji aminokwasowej.

Zastosowanie metod single molecule w zakresie spektroskopii fluorescencyjnej,

obrazowania i manipulowania stwarza unikalne możliwości śledzenia skomplikowanych

procesów biologicznych na poziomie molekularnym.

Badania nanoukładów biologicznych zaczyna mieć kluczowe znaczenie w

dostarczaniu środków farmakologicznych do komórek i tkanek oraz konstrukcji wysoce

zminiaturyzowanych układów elektrycznych i komputerowych, w tym w systemach

hybrydowych z półprzewodnikami.

Nieinwazyjne obrazowanie tkanek i narządów oraz procesów które w nich

zachodzą dają możliwość jednoczesnego wglądu w anatomię i morfologię dla celów

diagnostyki i terapii.