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실험 3. 식물 엽록체 색소 분리 및 정량 검출

1. 실험 목적

Chromatography 기법을 이용한 엽록소 분리 실험을 통해 각 색소의 특성을 이해한다. 또한

분리시킨 색소의 흡수 스펙트럼을 측정하여 흡광도를 알아보고, 생리학적 과정인 광합성에 해

탐구해 본다.

2. 실험 원리

1) 식물 엽록체

- 엽록소 a, b (chlorophyll a, b)

엽록소는 식물이 광합성을 하는 데 필요한 빛을 흡수하는 색소이다. 여러 가지 종류가 있지만,

가장 보편적으로 볼 수 있는 것은 엽록소 a 와 b 이다. 이 가운데 엽록소 a (chlorophyll a)의

분자식은 C55H72O5N4Mg 이며, 분자량과 융점은 각각 892, 117∼120℃ 이다. 660 ㎚와 429 ㎚의 주

흡수극 를 가지며, 농도를 표시할 때 단위는 입방미터(㎥)당 밀리그램(㎎)으로 한다. 엽록소 a,

b 는 세균을 제외한 모든 광합성 생물에 존재하나, 특히 수계 환경 내의 식물 플랑크톤 세포에서

가장 보편적으로 나타나고, 많이 분포해있는 것을 확인할 수 있다. 따라서 우리는 수계 환경 내의

엽록소 a, b 의 양을 측정함으로써 식물 플랑크톤의 분포를 알 수 있고, 총인(total phosphorus)과

같은 화학적 성분들과 더불어 엽록소 a, b 역시 수계환경의 부영양화에 한 지표가 될 수 있다.

그림 3-1 엽록소 a 와 b 의 화학 구조식 (http://www.emc.maricopa.edu)

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- 크산토필 (Xanthophyll)

1837 년 베르첼리우스가 노랑잎 속에 함유되어 있고, 알코올에 잘 녹는 황색색소에 하여

처음으로 ‘크산토필’이라 명명하였다. 이후 1907 년 빌슈테터가 이를 녹색잎 속에서도 추출하게

되면서 C40H56O2 의 분자식을 결정하게 되었다. 크산토필은 단일 색소가 아니며 크산토필에

속하는 색소로는 루테인 등이 있다. 현재는 산소를 함유하지 않는 탄화수소계의 카로틴류와

구별하여, 카로티노이드 중에서 수산기, 카르보닐기, 에테르상 산소 등을 함유하는 한 무리의

색소를 크산토필류라고 한다.

그림 3-2 Xanthophyll 의 화학 구조식 (http://www.freepatentsonline.com)

- 카로틴 (carotene)

카로틴에는 α-카로틴, β-카로틴, 및 리코펜 등이 속한다. α-카로틴은 β-카로틴에 수반해서

존재하며, 양도 β-카로틴에 비해 적기 때문에 처음에는 한 종류의 것으로 간주되었다.

카로틴이라는 명칭 역시 이들의 혼합물을 가리키고 있었다. 당근의 적색은 β-카로틴이, 수박이나

토마토의 적색은 리코펜이 색소를 띠는 것이다. 이들은 산소에 불안정하여, 산화되면 무색으로

변한다. 그 중 리코펜은 특히 산화되기 쉽다.

그림 3-3 α-carotene, β-carotene, lycopene 의 화학 구조식 (http://www.protein.bio.msu.ru)

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2) 엽록소 분리 혼합물은 각 용매의 용해도 차이를 이용하여 chromatography 를 써서 분리할 수 있다.

chromatography 는 각 성분들의 혼합물을 적당한 흡착매에 흡착시킨 뒤 전개 용매를 사용하여

개개의 성분을 분리하는 기법이다. chromatography 에서 시료를 함유하는 물질(이동상)이 다른

물질(고정상)에 접촉해서 이동할 때, 시료의 각 성분은 이 고정상에 의해 분배 또는 흡착되며

서로 분리되게 된다.

3) 색소 흡광도

광합성은 빛에 의해서 일어나는 많은 식물의 사 과정에서 가장 중요한 것이다. 이 과정은

색소와 여러 색소의 빛 흡수에 의해 시작되며, 이 때 흡수된 에너지를 이용하여 진행된다. 따라서

색소의 흡수 특성이 광합성 과정의 기능 및 화학적 특성을 결정하게 된다. 흡수 특성들은 보통

흡광도와 빛의 파장과의 관계 그래프로 나타내어진다. 이러한 그래프를 “흡수 스펙트럼”이라고

한다. 분광 광도계(Spectrophotometer)는 흡수 측정 및 자동적으로 파장을 변경하는 기능이 있어,

동시 여러 파장에서 측정 가능하여, 흡수 스펙트럼을 기록할 수 있다.

4) spectrophotometer (분광광도계)

분광광도계란 물리학에서 전자 스펙트럼에 한 정량적 연구방법인 분광광도법을 시행하기

위한 기기이다. 물질은 빛 에너지를 흡수할 때 각각의 특성에 따라 전자전이 및 회전과 같은

여러 가지 분자운동을 일으키면서 고유의 흡수 스펙트럼을 나타내게 되는데, 분광광도계는

이때의 스펙트럼을 측정하는 장치이다. 우리는 흡수하는 파장 값을 앎으로써 물질의 원자 또는

분자구조를 예측할 수 있고, 흡수하는 빛의 세기를 측정하여 그 물질의 농도를 결정할 수 있다.

이러한 원리를 이용하여 분광광도계는 유기/무기 화합물의 정량, 정성분석에 주로 사용되고 있다.

한편, 분광광도계를 이용하면 일정 파장에서의 흡광도 측정뿐만 아니라 시간의 추이에 따른

흡광도의 변화, 일정 범위에 걸친 파장에 따른 흡광도의 변화 역시 측정할 수 있다.

그림 3-4 spectrophotometer 의 기본적인 구조 (http://chemwiki.ucdavis.edu)

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그림 3-5. 다양한 색소의 흡수 스펙트럼

3. 실험 기구 및 시약

엽록소 sample, 분필, petri dish, spectrophotometer, quartz cuvette, pipette, D.W.

4. 실험 방법

- 분필 chromatography

1) 추출한 엽록소 아세톤 용액을 그릇에 넣고 분필을 세운다.

2) 분필을 따라 위로 이동하는 엽록소를 관찰 후 사진촬영 한다.

- 색소 흡광도 측정

1) quartz cuvette 에 90% 아세톤 500 μL 을 넣고 spectrophotometer 에서 blank 로 설정한다.

4) 추출한 엽록소 용액을 quartz cuvette 에 넣고 wavelength scan 기능을 실행한다. (220nm~900nm)

5) wavelength 그래프 관찰해서 peak 가 높은 곳의 파장과 흡광도를 확인 한다.

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5. 실험 결과 및 토의

1) 분필을 따라 이동한 엽록소를 관찰하고 색상 별로 어떤 색소인지 결정한다.

2) 엽록소 추출을 위해 acetone 을 사용하는 이유를 알아본다.