表观遗传学创新实验

5’- 氮胞苷处理水稻幼苗对基因组 DNA 甲基化的影响 庞劲松 刘宝

东北师范大学生物基础实验教学中心

表观遗传学与DNA甲基化 DNA甲基化作用

DNA的甲基化及其方式 DNA甲基化的生物学意义 DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成

DNA胞嘧啶甲基化检测 检测方法： MSAP， bisulfite sequencing

5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 实验目的 实验材料 仪器 试剂 实验方法

5’- 氮胞苷处理水稻幼苗 植物基因组DNA的提取与纯化 基因组 DNA 酶切 - 连接接头 PCR扩增：预扩增，选择性扩增 PAGE电泳

预期实验结果 注意事项与建议 思考题 参考文献

表观遗传学： 不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括 DNA 的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。 表观遗传变异包括 : X －染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。 表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如

DNA 甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。 DNA 甲基化： 在 DNA 复制后，经 DNA 甲基转移酶（ DMT ）催化，将 S- 腺苷酰 -L- 甲硫氨酸 (SAM) 上的甲基基团连接到 DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行

DNA 修饰的过程。

DNA 甲基化的方式 胞嘧啶甲基化

腺嘌呤甲基化DAM (DNA 腺嘌呤甲基转移酶 ) 识别回文序列 GATC, 在此位置两条链的腺嘌呤 N-6 位置上同时甲基化，同时 SAM转变为 SAH(S- 腺苷高半胱氨酸 )

在 DMT(DNA 甲基转移酶）的作用下， CpG （ CNG,CCGG ）位点胞嘧啶 C5 被甲基化

DNA 甲基化作用

图 1 胞嘧啶甲基化过程

图 2 腺嘌呤甲基化过程

DNA 甲基化的生物学意义 影响基因表达状态：通过该表基因调控区 DNA 甲基化程度调控基因转录

图 3 甲基化与基因沉默 参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源 DNA （如转座子）处于沉默状态 提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型

DNA 胞嘧啶甲基化的种类和形成 从头甲基化 (de novo methylation)

DNMT3a ， DNMT3b 在完全没有甲基化的 DNA 上加上甲基。

维持甲基化 (maintenance methylation) Met1 ， DNMT1 较特异地识别半甲基化状态的 DNA ，负责 在细胞分裂过程中依据 DNA 母链的甲基化 状态给新合成的 DNA 链上加上甲基。

图 4 两种胞嘧啶甲基化方式

DNA 胞嘧啶甲基化检测方法 使用对胞嘧啶 5’- 甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：

甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)

胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing) GCmTACT 重亚硫酸钠 GCmTATT 测序 测序

此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG 岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等

MSAP 用途：

最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段 原理：

利用对 DNA 甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割 DNA ，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行 PCR 扩增、 PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知 DNA 甲基化信息。 甲基化状态分析：

在不同泳道相对应的位置上，如果 Msp I 酶切产物有扩增带、而 Hpa II 酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是 CCmGG ；若都有扩增带，说明此处是 CCGG 。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。 表 1 甲基化敏感酶对不同甲基化状态 DNA 的切割结果

原始序列内切酶

CCGG CCmGG CmCGG

Hpa II CC GG 不切割 不切割Msp I CC GG CCm GG 不切割

MSAP流程： 提取基因组 DNA （注意发育时期和成长状态相同）

………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC…… ………TAGGCCACCGAACGG CCTG……

Msp I 酶切 + 接头 Hap II 酶切 + 接头ATCC GGTGGCTTGCCm GGAC ATCC GGTGGCTTGCC

mGGACTAGG CCACCGAACGG CCTG TAGG CCACCGAACGG

CCTG

PCR PCR

PAGE电泳 PAGE电泳

Msp I5’ …CC(m)G G… 3’3’ …GG C(m)C… 5’

Hpa II5’ …CCGG… 3’3’ …GGCC… 3’

重亚硫酸盐测序

图 5 重亚硫酸盐测序原理

5’ 氮胞苷处理对水稻 DNA 甲基化的影响 实验目的

使用不同浓度的 5’ 氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组 DNA 胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用 MSAP 方法检测 DNA 胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因 DNA 甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。 实验材料

水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare)

5’ 氮胞苷如何影响基因组 DNA 甲基化水平： 5’ 氮胞苷可以与DNA 甲基转移酶（ DMT ）结合从而抑制其活性，在 DNA 复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的 DNA 甲基化水平降低。

所需仪器

离心机 PCR 仪 气浴摇床 水浴摇床 植物生长箱

电泳仪 电泳槽 微量移液器 紫外分析仪 分析天平 图 6 所需主要仪器

试剂 植物基因组 DNA 改良 CTAB 提取液：

buffer A: 0.35mol/L Sorbitol ， 0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 ， 0.5mmol/L EDTA; buffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5 ， 0.05mol/L EDTA ， 2mol/L NaCl ， 2%CTAB; buffer C: 5%N-lauroylsarcosine

PCR 试剂： Takara rTaq ， 10X PCR buffer ， ddH2O ， PCR引物

预扩增引物：H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)

选择性扩增引物：H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´ 。

酶切 - 连接试剂： EcoRI (NEB) ， Hap II (NEB) ， Msp I (NEB) ， T4 DNA ligase ， T4 10 x reaction buffer

接头： EcoRI adapter: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ CATCTGACGCATGGTTAA

HapII/MspI adapter: 5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’ AGTACTCAGGACGAGC

PAGE 试剂：聚丙烯酰胺，尿素， AgNO3 ， Na2CO3 ，溴酚蓝， 银染固定 /终止液 (10%冰乙酸 ) ，染色液 (2升双蒸水预冷，用时加 2克硝酸银， 3ml 3

7% 甲醛 ) ，显影液 (2升双蒸水中溶解 60克碳酸钠，冷却至 10-12ºC ，用时，加入 3ml 37% 甲醛， 400ul 硫代硫酸钠（ 10mg/ml ） ) 。

其它试剂： 5’- 氮胞苷 (100mg/mL) ，蒸馏水， PVP (20%) ，氯仿 : 异戊醇 (24:1) ，异丙醇， 70%乙醇， RNA 酶 A (DNase-free) ， TE ， TAE ，琼脂糖， EB ，未酶切的 λ DNA ， 1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ， 3x loading buffer (300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue) 。

实验方法 5’- 氮胞苷处理水稻幼苗： 26℃，暗培养

(1) 取水稻 Nipponbare 种子 10粒 X 4 组，分别置于 90mm培养皿内的双层滤纸上，加入 15mL蒸馏水浸种 24h ；（第一天） (2) 分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用 25mg/mL, 50mg

/mL, 100mg/mL5’- 氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液 1次；（第二 ~十一天）

图 7 5’- 氮胞苷处理的水稻幼苗（右）和对照植株（左）

植物基因组 DNA 的提取与纯化 改良 CTAB 法 (Kidwell and Osborn, 1992)

不同处理的叶片 1g液氮中研磨成粉转入 50ml 离心管加入等体积 DNA 提取缓冲液 (A:B:C=1:1:0.4混合，加 1%PVP 于 B液 ) 65℃恒温水浴摇床， 40-50rpm振摇 90 分钟加入等体积的氯仿：异戊醇 (24 ： 1) ，轻轻上下颠倒 10-15 分钟4 3000rpm℃ 离心 10-15 分钟 上层水相加入 2/3 体积的预冷异丙醇，上下颠倒 5 分钟并置 4℃冰箱内 10minDNA 沉淀后于 4 3000rpm℃ 离心收集 DNA 于管底DNA 于 70%乙醇中过夜。 DNA 沉淀 （第十二天）

风干 DNA

Genomic DNA2ml Eppendorf 中加 1ml TE溶解沉淀待 DNA 完全溶解后，加入 5μl 不含 DNA 酶的 RNA 酶，

37℃保温 30 分钟以除去 DNA 中的 RNA 。加入等量氯仿 : 异戊醇 (24:1) 纯化 DNA ，轻轻上下颠倒

10-15 分钟4 3000rpm℃ 离心 10-15 分钟

DNA 沉淀70%乙醇过夜洗涤 DNA溶于 DNA 于 200-500μl TE 中

Genomic DNA溶液0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查 DNA 的质量并据已知的 DN

A Marker （未酶切的 λDNA ）估计其浓度。调整 DNA浓度，置於 -20℃备用。

基因组 DNA 酶切 - 连接接头 甲基化分析采用两种甲基化敏感酶 HapⅡ和 MspⅠ（ NEB ）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构 ( 序列见试剂部分 ) ，即 100℃变性 5 分钟 , 缓慢冷却至室温， -20℃冷冻保存备用。 水稻 MSAP 限制性酶切和连接体系如下：

T4 10 x buffer 2.5μl

BSA (10mg/L) 0.1μl

EcoR I adaptor (5pM) 0.5μl

H/M adaptor (50pM) 0.5μl

EcoR I (20U/μl) 0.5μl

H/M HpaII (20U/μl) 0.25μlMspI (10U/μl) 0.5μl

T4 ligase 0.1μl

Genomic DNA 300ng

AFLP-Water 补足总反应体积 20μl

混匀体系， 37℃， 6小时， 8℃， 4小时， 4℃保存。 共四个处理组，即Nipponbare 25mg/mL 处理组， Nipponbare 50mg/

mL 处理组， Nipponbare 100mg/mL 处理组， Nipponbare 对照组；每组分别用 HapII/MspI 酶切，共需切 8管 （第十五天）

表 2 水稻 MSAP 限制性酶切、连接体系

PCR扩增 预扩增：水稻 AFLP 预扩增体系如右表 ( 预扩增引物 PCR引物部分 ) ： 混匀体系，按下列参数进行 PCR 扩增反应：

PCR 程序： 94 ℃ 预变性 2min, 94℃变性 30秒， 56℃复性 30秒，72℃延伸 60秒 , 共进行 30个循环，最后 72℃延伸 10 分钟。

根据检测结果，用 0.1x TE buffer稀释预扩增产物 1/10~1/40 ，作为 PCR选择性扩增的 DNA模板。

10 x PCR reaction buffer 2.5μL

dNTPs (2.5mM) 2μL

EcoR I adaptor + A (5μM) 1μL

H/M adaptor +0 (5μM) 1μL

Taq DNA polymerase (5U/μL) 0.2μL

PCR water 16.3μL

DNA 模板（酶切连接产物） 2μL

Total volume 25μL

表 3 AFLP 预扩 PCR 体系

水稻 AFLP选择性扩增体系如下：

按以下参数进行 PCR 扩增反应： 94 ℃ 预变性 2 分钟 , 94℃变性 30秒， 65℃复性 30秒， 72℃延伸 80秒，以后每轮循环温度递减 1℃，扩增 10轮。接着 94℃变性 30秒， 55℃复性 30秒， 72℃延伸 80秒，共进行 40个循环，最后 72℃延伸 10 分钟。 （第十七天）

10 x PCR reaction buffer 1.5μLdNTPs (2.5mM) 0.6μLEcoR I primer (5μM) 0.6μLH/M primer (5μM) 0.6μLTaq DNA polymerase (5U/μL) 0.12μLPCR water 9.58μLDNA 模板（预扩增稀释产物） 2μLTotal volume 15μL

表 4 AFLP选扩 PCR 体系

PAGE电泳 电泳装置图 玻璃板分为大板和小板 ( 上部凹形 ) 。自来水清洗

95％酒精擦两遍硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面5 分钟后， 95％酒精再擦两遍，

装板 灌胶

图 8 PAGE电泳系统

尿素 -PAGE胶配制

灌胶前，加入四甲基乙二胺（ TEMED ） 30μL ， 10% 过硫酸铵（ APS ） 160μl ，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜 15度。胶聚合 1小时以上才可以电泳。 电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂 DYY-10C 型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新 JY-CX2B 型。电泳缓冲液为 1xTBE ， 85W 预电泳 1小时，胶板的温度达到

55˚C 。点样前， DNA样品 95˚C 变性 5 分钟，立即冰浴，加3x loading buffer, 混匀，瞬时离心，点样量 16μL ， 恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。

尿素 (分析纯 ) 16.8g

10xTBE 4mL

40%丙烯酰胺胶贮液 (Acrylamide/Bis 19:1)

16mL

超纯水 加到总体积 40mL

灌胶图 电泳图

表 5 PAGE胶配方

银染操作 电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将附着胶的大板置于固定 /终止液中，轻摇

20 分钟，直至指示染料消失。 凝胶洗涤，回收固定 /终止液，用双蒸水洗涤凝胶 3次，每次至少 2 分钟，凝胶板从水中取出后，竖起空水 15秒。 染色，将胶板移至染色液中，轻摇 30 分钟。 凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中 5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过 10秒。） 终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定 /终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。 固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全 (溶液不再有二氧化碳产生 ) ，用双蒸水洗涤凝胶 2次，每次至少 2 分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干备用。 （第十九天）

图 9 PAGE胶银染

预期实验结果 同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。 （第二十天）

图 10 预期结果 PAGE电泳图

注意事项与建议 五氮胞苷（ 5-azacytidine ； MW:244.21 ）：粉末于 -20℃保存，见光或遇热分解，使用时配母液于 4℃保存，保存时间不宜超过半个月； 丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；

思考题 5’- 氮胞苷为什么能使 DNA 甲基化水平降低？ MSAP 的原理是什么？ 如何分析MSAP电泳图？

参考文献 [1] Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry

and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40.

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[4] Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512.