Microbial Nutrition & Growth

Microbial nutritionmeet the organism’s needs

nutrientsC, N, O, P, S, H - macronutrientsK+, Ca+2, Mg+2, Fe+2, Fe+3

classification on nutritional needsC sources: CO2 – autotrophs

organic – heterotrophs energy sources: light – phototrophs

chemicals – chemotrophse- sources: inorganics – lithotrophs

organics – organotrophs

photolithotrophic autotroph chemoorganotrophic heterotroph

미생물 분류 ( 전자수용체 기준 )

생물 폐수처리 공정의 주요 미생물은 박테리아 (bacteria, 세균 )

분 류 전자수용체 폐수정화공정

절대 호기성균 산소 (O2)유기물 산화 (organic oxidation)

질산화 (nitrification):aerobic

통성 혐기성균산소 및 유기물 질산염 (NO3

-) 탈질화 (denitrification) : anoxic

절대 혐기성균

유기물황산염 (SO4

2-)

탄산가스 (CO2)

발효 (fermentation) : anaerobic

황산염환원 (sulfate reduction)

메탄생성 (methanogenesis)

Microbial nutrition growth factors – organic compounds the cell can’t make

vitamins, amino acids, purines, pyrimidines, etc. Auxotroph

Culture medium (media) meet the organism’s needs adequate C, N, P, vitamins, etc.

(also temperature, oxygen, pH, etc.)

medium compositionsynthetic or defined medium – known composition e.g., glucose saltscomplex medium – composition unknown beef extract, yeast extract, blood

Microbial nutrition culture medium (media)

liquid medium – brothsolid medium – agar

other factorsenrichment mediumselective mediumdifferential medium

Microbial growth bacteria – binary fission eukaryotes – mitosis, budding

growthincrease in protoplasm hard to measure in individual; measure population

measurementviable cell count

ATP

turbidity absorbance vs. cell number: linear to a point

growth in batch culturesigmoidal pattern – bacterial growth curve

Bacterial growth curveBatch, pure culture

lag phase

log phase – logarithmicphase

stationary phase

death phase

Mathematics of growth

Nt = 2n∙N0 n = t/g g = 0.301t log Nt –log N0

g = generation time, 세대시간 (1->2->4->8->16---)

미생물의 대사 (Metabolism)

기질 (substrate) 사용 및 미생물 증식의 화학양론 (stoichiometry) 과 반응속도를 규명하는 동력학 (kinetics) 에 대한 이해가

필요 .

기질 : 탄소원 : 유기물 , 이산화탄소 영양염 : 질소 , 인 에너지원 : 전자공여체 (electron donor): 유기물 , 태양 호흡원 : 전자수용체 (electron acceptor): 산소 , 질산염 생육인자 (growth factor) 등 .

미생물 성장 영향 환경인자 : 수분 , 온도 , pH, 삼투압 , 이온강도 등 .

대사 화학양론(Metabolic Stoichiometry)

분해

: (catabolism) 대사 이화작용 + (anabolism)동화작용

( + )에너지 및 중간체 생성 세포합성

기질

( )에너지 생산

( )중간체 생성 ( )세포합성

( )생존

세포 ( , )내생호흡 에너지 생산

CO2, H2O, NH3, ( )잔존물질 유기물

미생물 대사 : 기질 분해 및 미생물 증식

화학양론 개념적 이론식

세포전자공여체 + 전자수용체 {+ 탄소원 + 영양염 } --> 세포 + 부산물 ( 산화 ) ( 환원 ) ( 환원 )                                                           

- -d e a s cR R f R f RR : 총괄 화학양론식Rd : 전자공여체 (e-donnor) 반쪽 반응식Ra : 전자수용체 (e- acceptor) 반쪽 반응식Rc : 세포 (cell) 합성 반쪽 반응식fe : 전자 공여체 중 에너지를 위한 사용비율fs : 전자 공여체 중 세포합성을 위한 사용비율

산화 반쪽 반응식• 세포합성 반쪽 반응식 (Rc)

- 질소원 : 암모니아 , 질산염• 전자수용체 반쪽 반응식 (Ra)

- 산소 , 질산염 , 황산염 , 이산화탄소• 전자 공여체 반쪽 반응식 (Rd)

- 유기물 공여체 ( 종속성 반응 ) : 생활하수 , 단백질 ,

탄수화물 , 지방 , 아세트산 , 프로피온산 , 벤조익산 등 - 무기물 공여체 ( 독립성 반응 ) : 이산화철 , 암모니아 ,

황 , 황화수소 , 산화황 , 수소 , 황산이온

fs + fe = 1

r

gVSY

COD gCOD

[ ]

Y ;

s

s

eqf

eq

f

g 세포생성, yi el d = 수율

g 제거

세포생성당량=세포합성을 위해 사용한 에너지비율

기질소비당량단위환산

• 기질 ( 유기물 = 전자공여체 + 탄소원 ) = [COD]• 세포 = [VSS]

fs = aY

세포 = [VSS]

기질 : 유기물 : 전자공여체 ( 탄소원 포함 ) : [COD]

세포 : C5H7O2N

하수 : C10H19O3N

carbohydrate : CH2O

Protein : C16H24O5N4

Lipid : C8H16O

총괄 화학양론식 (R)

: 세 개의 half reaction ( 반쪽 반응식 : 전자공여체 , 전자수용체 , 세포 ) 의 합

: 반쪽 반응식은 기존 자료 활용

- 세포 (Rc) 및 전자수용체 (Ra) 에 관한 half reaction 은 합하기 전에 식의 좌우 바꿈→ “ -” 를 붙임 .

- 전자공여체 중 에너지 생성 및 세포합성을 위한 각각의 사용비율로 half reaction 을 → “ -feRa” , “-fsRc” 로 보정 .

예제 ) 기질은 탄수화물 (carbohydrate) 로 하고 , 질소원으로 암모니아를 사용하는 호기성 박테리아 성장에

대한 화학양론식을 쓰시오 . 단 Yobs = 0.59 g 세포 / g COD제거

상기 (1) 식을 적용하여 ,

양변을 0.25 로 나누면 최종 화학양론식이 됨 .

• 화학 양론식으로 부터 , 수질오염물질 ( 유기물 , COD 기준 ) 을 제거하기 위하여 요구되는 산소 및 질소량과 그 결과로 생성되는 미생물량을 계산할 수 있음 .

• 산소요구량은 호기성 미생물 공정의 운전관리 비용 측면에서 큰 비중을 차지함 .

• 질소요구량은 세포성장의 중요 요소임 . • 미생물량을 현장에서는 슬러지 (sludge)

발생량으로 나타내며 , 2 차오염물질로서 후속처리가 요구되는 고형폐기물임 .

화학양론식의 활용

COD 기준 수질오염물질 ( 탄수화물 )

수율 , 산소및 질소요구량 계산

Assignment #2 (due 27 Sept)

• 기질은 생활하수 , 질소원은 암모니아성 질소를 사용하며 , 호기성 조건에서 호흡하는 미생물의 성장을 나타낼 수 있는 화학양론식을 유도하시오 . (Y=0.5 gVSS/gCOD)

• 상기 화학양론식을 이용하여 장림하수처리장 ( 유입하수유량 =1,000,000 m3/d, 유입 COD = 200 mg/l, 처리수 COD = 50 mg/l) 에서 요구되는 산소량 및 슬러지 발생량을 계산하시오 .

미생물 성장 동역학(Microbial Growth Kinetic)

미생물 성장 동력학의 효용성

• 대사 화학양론 : 수질오염물질 ( 유기물 , 질소 , 인 ) 이

분해되는 반응의 양적 계산 근거를 제공 .

• 미생물 성장 동역학 : 분해 반응 속도를 제공하며

이를 근거로 반응기의 부피를 계산함 ( 설계 , Design).

200 mg/l BOD x 500 m3/day = 100 kg BOD/day

100 kg BOD/day / 0.4 kg BOD/m3-day = 250 m3

250 m3 = 3 m H x 5 m W x 20.7 m L ( 미생물 공간 )

혼합배양 미생물 성장률

• 혼합배양 (mixed culture)

- 박테리아 종에 따라 성장모형이 다름 ,

기질 및 생성물이 복합적으로 연관

- 전제 : 미생물을 회분식 혹은 연속식 반응기내 유지 일정한 환경조건 유지 반응기내 적정한 체류시간 유지 > 세대시간

질량 기준 미생물 성장율

   (2-1)

rg = 미생물 성장율 , [M/L3 T] = (g VSS/L d)

μ = 비성장율 (specific growth rate), [T-1],

(g VSS/g VSS d)

X = 미생물 농도 , VSS [M/L3], (g VSS/L)

• 미생물 성장율 : 주어진 환경조건하에서는 미생물 농도에 비례 . 그 계수 : 비성장율

• 비성장율 : 단위시간동안에 미생물이 몇배로 증식하는가를 나타냄 .

• 최대 비성장율 (μm) = f( 온도 , 염분도 , 기질 )

• 생활하수를 처리하는 폭기조 활성슬러지의 μm

값

: 일반적으로 3g VSS/g VSS ·d

기질제한시 미생물 성장률

Monod 식 : 성장제한기질 (growth limiting substrate) 의 농도와 비성장율의 상관관계를 Monod 가 실험적으로 도출하여 나타낸 식 .

실험방법 :

1) 기질의 농도를 달리한 5 개의 플라스크에 세균 배양 .

2) 일정시간 후 미생물량 (VSS) 측정하여 비성장율 계산 .

3) 기질의 농도 vs 비성장율 관계식을 그림 .

미생물 성장 곡선 : Monod 곡선

                                        

  (2-2)

      만일 ,    S >> Ks                   0 차 반응

                 S << Ks               1 차 반응

• 따라서 기질제한시 미생물 성장률은 ,

(2-3)

Monod 식

    S = 성장제한기질 농도 , [M/L3], [g BOD/L]

    μm = 최대 비성장율 (maximum specific growth rate),

[T-1], [g VSS/g VSS d] ․ : 미생물종 및 기질의 종류에 따라 달라짐    Ks = 반포화 속도상수 (half-saturation velocity

constant), [M/L3], [g BOD/L]

: 성장율이 최대성장율의 1/2 일때의 기질의 농도

• 기질 제한시 미생물 성장률 ,

      

(2-3)

반포화 속도상수와 기질의 관계

• 반포화속도상수 : 기질의 생분해도 및 미생물에 의한 가용성 정도를 나타냄 .

⇒ 반포화속도상수가 크다 = 동일한 비성장율을 유지하는데 더 높은 기질농도가 필요하다 → 그 기질은 생분해도가 낮거나 미생물이 이용하기 어려운 물질이라고 해석할 수 있음 .

활성슬러지 공정 포기조에서 생활하수의 Ks 값 ;

60mg BOD5/L.

( 연습문제 ) μm=3day-1, Ks=60mgBOD5/L, X=3000 mgVSS/L 인 조건에서 유입 BOD5 가 5mg/L, 60mg/L, 500mg/L 인 각각의 경우에 대해 성장률 (r

g) 을 계산하시오 .

ⓐ 5mg/L: rg = 3 3000 = 690mVSS/L day : ․ 기준

  ⓑ 60mg/L: rg = 3 3000 = 4500mgVSS/L day ․

BOD5 농도 12 배 , 성장률 6.5 배 증가

  ⓒ 500mg/L: rg = 3 3000 = 6900 mgVSS/L day ․

BOD5 농도 100 배 , 성장률 10 배 증가

미생물 성장과 기질 소비의 관계

• 미생물에 의해 소비된 기질의 이용 ① 새로운 세포의 합성에 사용 ② 에너지 생성을 위해 분해

따라서 ( 미생물 성장율 ) (∝ 기질 소비율 )

 rc = 기질 소비율 , [M/L3-T]  Y = 수율 계수 (yield coefficient), [M/M]

(2-4)

미생물 성장과 기질 소비의 관계식

(2-3) 식의 rg 를 (2-4) 식에 대입 ,

(2-5) (2-6)

여기서 , :  최대 비기질 소비율 , [M/M T] ․

생활하수 처리용 활성슬러지 공정 ; k = 5 day-1

기질소비율

기질소비율에 대한 다른 제안들 ,

내생호흡대사의 영향

• 실제 폐수처리공정의 미생물 성장상태가 항상 대수기인 것은 아님 .

• 내생호흡 (endogeneous respiration), 사멸(death), 포식 (predation), 용균 (lysis) 에 의한 세포질량 감소를 모두 합하여 내생감소 (edogeneous decay) 라고 함 . 이는 미생물 농도에 대한 1 차 반응으로 알려져 있음 .

효소반응에 의한 기질소비 해석

• 위의 동역학식들은 Monod 가 실험적으로 관찰한 결과에 기초하고 있음 .

• 미생물에 의한 기질의 소비 , 즉 분해는 본질적으로 세포내에서 일어나는 생화학반응이며 대부분은 효소반응임 .

• Michaelius-Menton 은 기질분해를 다음과 같은 효소반응 동력학 으로 해석하였으며 결과적으로는 Monod 관계식과 유사함 .

S : 기질 E : 효소 ES : 기질․효소 복합물 P : 생성물

효소반응식에서 (2-13) 식이 평형 (equilibrium) 이라고

가정

(2-15)

                                   : = i 물질의 농도

(2-16)

(2-17)

• 한편 , 효소에 대한 물질수지식은 다음과 같다 .

(2-18)

여기에서 ,  CE  : 자유 효소농도

CES : 효소 - 기질복합물질농도

CEo : 초기 효소농도

• 최종적인 효소반응율 (V) 은 다음과 같이 정의할 수 있음 . (2-19)

(2-19) 식의 CES 를 쉽게 측정 가능한 CS, CEo 로 변환함 .

우선 , 측정이 어려운 CE 도 배제하기 위하여 ,

(2-18) 식에서 CE = CEo - CES 로 하여 (2-17) 식에 대입

CES 로 정리하면 ,

(2-20)

(2-20) 을 (2-19) 식에 대입하면 ,

이라고 놓으면 , (Vm 은 최대효소 반응률 )

(2-21)

(2-22)

 : (2-22) 식이 Monod 식과 유사함 .

연속흐름완전혼합반응기에서 물질수지

(Mass Balance in CSTR)

물질수지식의 기초

• 반응기 내에서 각 수질오염물질에 대하여 • 동역학 고찰에서 확인된 반응률 ( 미생물

성장률 , 기질소모율 등 ) 을 포함한 물질수지식을 설정함으로서 반응기의 부피를 설계할 수 있음 .

완전혼합반응기에서 물질수지 완전혼합 반응기 (CSTR : completely stirred tank reactor) 미생물 질량 , 용존 기질의 물질수지식 유도 .

미생물 질량 물질수지

축적율 = 유입율 - 유출율 + 순 성장율

가정 :① 정상상태 ( )

② 

상기식을 정리하면 ,

(2-26)

(2-27)

일정한 부피의 반응기에서 유입유량 (Q) 를 조절하여 미생물 비성장율 조절이 가능 ( 예 , Chemostat).

즉 , 유입유량 (Q) 을 높이면 비성장률 (μ) 이 커짐 .

그러나유량을 너무 높이면 미생물의 고유한 최대비성장율보다 희석율 (Q/V) 이 더 커져서 반응기내의 미생물이 유실됨 .

= 수리체류시간 (Hydraulic Retention Time, HRT),

기질 ( 용존 유기물 ) 물질수지

축적율 = 유입율 - 유출율 - 기질 소모율

양변을 Q 로 나누면 ,

정상상태 , 에서 ,

(2-28)

(2-29)

반응기내 미생물 농도 계산식 유도

반응기내 미생물 농도 계산식 ;

(2-27) 을 으로 재정리하면 ,

(2-30)

(2-30) 식을 (2-29) 에 대입하면 ,

이 식을 X 에 대하여 정리하면 ,

여기에서 , 이므로

최종적으로 (2-32)

 Y, kd : 동력학계수 ,        Si : 유입농도 ( 주어지는 값 ),        S : 유출농도 ( 목표값 ),      θ = V/Q( 조절변수 )

위 식에서 , 유입수 기질농도 Si 를 처리 ( 분해 ) 하여 목표하는 유출수 ( 혹은 CSTR 반응기 내 ) 기질농도 S를 얻기 위해 ,

수리체류시간을 θ 로 유지할 때 , 동력학계수 Y 및 kd 를 알면 정상상태에서 유지되는 반응기내의 미생물농도 X를 계산 .

여기에서 운전인자 ( 조절변수 ) 는 수리체류시간이며 , 이에 따라 μ 값도 같이 변한다는 사실에 유의 .

반응기내 기질 농도 계산식 유도

반응기 내 기질 농도 계산식 ;

(2-27) 식에서 kd 를 좌변으로 넘겨 재정리하면 ,

(2-33)

양변에 을 곱하면 ,

(2-34)

S항을 우변으로 넘겨 정리하면 ,

(2-35)

S에 대하여 정리하면 ,

(2-36)

위 식에서 , 유입수 기질의 농도와 관계없이 수리체류시간이 θ 로 유지되는 반응기에서 ,

동력학계수 Y, kd, k (= μm/Y), Ks 를 알면 유출수 ( 혹은 CSTR

반응기내 ) 기질의 농도 S 를 계산 .

수리체류시간에 따른 S, X 의 변화

• 반송이 없는 CSTR, Si= 1,000 mg/L• 동력학계수 , 알고 있음• 수리적 체류시간 ( 즉 , 미생물평균체류시간 ) 의 변화에

따라 기질농도를 먼저 계산하고 그 결과로 미생물농도를 계산 . 다음 그림 .

• 반송이 없는 완전혼합반응기에서는 미생물평균체류시간과 수리체류시간이 동일함 .

반송 없는 완전혼합 반응기에서 수리 ( 미생물 평균 ) 체류시간에 따른 반응기내 기질 및 미생물농도

미생물 평균체류시간과 기질 , 미생물의 관계

• 미생물평균체류시간이 증가→ 반응기내 기질의 농도는 낮아짐 ( 동시에 순비성장율 , μ = 1/θc 도 낮아짐 )

→ 미생물의 농도는 증가 .

미생물평균체류시간이 아주 짧아지면 ( 그림에서 θc < θcm)

“ 미생물이 가지고 있는 고유의 최대 순비성장율을 유지하기 위하여 요구되는 체류시간 (θcm)” 보다 실제 체류시간이

짧아서 미생물들이 성장할 시간이 없어 유실됨 .

→ 유입된 기질도 사용되지 못하고 유출됨 .

따라서 실제 생물폐수처리공정에서는 폭기조의 미생물 평균체류시간이 반드시 θcm 보다 길게 유지되어야만 함 .

• 상기식들은 반송되는 미생물이 없는 완전혼합 반응기에서 , 생물학적으로 분해 가능한 용존 유기물에만 적용되는 제한점을 인식해야 함 .

• 대부분의 실제 활성슬러지 공정과 같이 , 반송 미생물이 있는 경우나 플러그흐름 반응기와 같이 반응기 형태가 달라지거나 ,

• 난분해성 유기물 및 입자상 고형 유기물이 포함되는 등 유입수 기질의 성상이 달라지는 경우에는 상기식이 변형되어야 함 .

• 처리수 기질의 농도를 낮게 , 반응기내 미생물 농도를 높게 유지하기 위해 → 미생물 평균 체류시간이 길어야 함 .

• 완전혼합 반응기에서 미생물평균체류시간을 길게 하기 위해서는 수리적 체류시간을 길게 해야 하고 이는 반응기의 부피가 늘어나서 비경제적임

• 따라서 수리적체류시간을 증가시키지 아니하면서 미생물평균체류시간을 증가시키기 위한 방법이 필요함 ;

2 차침전조에서 분리된 활성슬러지를 포기조로 반송 .

Assignment #3

• 유입수 BOD 가 200 mg/l 인 CSTR 에서 수리적 체류시간의 증가에 따라 변화하는 반응기내의 BOD 및 VSS 의 농도를 계산하여 그림으로 나타내시오 .

( 필요한 동력학 계수는 문헌치를 사용할 것 )

중량하수처리장 http://jhasu.seoul.go.kr/

- 우리나라 최초의 하수처리장 - 하수처리 역사 부산광역시 시설관리공단 http://www.beic.go.kr/beic/

- 부산시 하수처리 현황 - 하수처리장 소개 동영상

• 삼성엔지니어링 - 환경산업사업 - 환경분야 연구개발

http://www.samsungengineering.co.kr/secl/kor/index.html 태영㈜ - 하수처리장 건설 - Clean zone ( 하수처리공정 )

http://www.taeyoung.com/

Environmental factors and growth

1. Solutes and water activity Aw – water activity or availability

pure water: Aw = 1.0 solute reduces Aw and affects osmotic pressure

“Aw and osmotic pressure inversely related” high osmotic pressure, low Aw (in text)

osmotic pressure – 1. force to prevent osmosis 2. force driving osmosis

low solute – cell gains water high solute (Aw) – cell loses water

cell must compensate to retain watercompatible solutes – compatible with growth

and metabolism at high concentration(choline, proline, glutamic acid, K+)

organisms which thrive in high solute – osmophiles organisms which tolerate high solute – osmotolerant

organisms which thrive in high salt – halophiles organisms which tolerate high salt – halotolerant

organisms which thrive in high pressure – barophilesorganisms which tolerate high pressure – barotolerant

2. pH – measure of [H+]

each organism has a pH range and a pH optimum

acidophiles – optimum in pH range 1-4alkalophiles – optimum in pH range 8.5-11 lactic acid bacteria – 4-7 Thiobacillus thiooxidans – 2.2-2.8 fungi – 4-6

internal pH regulated and near neutral adjusted with ion pumps

buffers

3. Temperature

for chemical reactions, van’t Hoff law appliesfor 10˚C rise, rate of reaction doubles

enzymes affected by temperature minimum and maximum temperatures set range

low – inactivehigh – denaturationoptimum – most effective

bacterial range – 0 to 100˚C, maybe higher individual – less broad

classification psychrophiles – 0-15˚C mesophiles – 20-45˚C theromophiles – 55˚C or above; extreme

E. coli – mesophile; 10-45˚C, opt. 37˚C

how do psychrophiles, mesophiles and thermophiles differ?

lipid variation amino acid composition of proteins

4. Oxygen

full spectrum; based in part on metabolic pathways obligate aerobes obligate anaerobes facultative anaerobes microaerophiles aerotolerant

Relationship related to oxidation/reduction potential Eo'

Eo' measure of tendency for a compound/solution to donate e- (be oxidized)accept e- (be reduced)

O2: strong e- acceptor; oxidizing agent; Eo‘ + H2: strong e- donor; reducing agent; Eo' –

Eo': larger +, stronger acceptor larger -, stronger donor

aerobes need high +, something to accept e-

O2 is a good acceptor ‘anaerobic respiration’ – NO3

- or SO4-2 used

anaerobes need high -, something to remove O2

O2 products are toxic to cells

O2 metabolism generates superoxide (O2-) or H2O2

O2 + e- → O2- & O2

- + e- + 2H+ → H2O2

aerobes eliminate O2 products with two enzymessuperoxide dismutase 2O2

- + 2H+ → O2 + H2O2

catalase 2 H2O2 → O2 + 2H2O

anaerobes lack superoxide dismutase and/or catalase anaerobes need high -, something to remove O2

chemical: thioglycollate; pyrogallol + NaOH H2 generator + catalystphysical: removal/replacement

5. Carbon dioxide (CO2) 0.03% in air 5% for some organisms:

Streptococcus sp.Neisseria gonorrhea

6. Radiationspectrum of electromagnetis energiesshorter λ, greater energy, thus more damage

Gamma rays & x-rays – ionizing radiation γ rays: 10-8 to 10-1 nm – radioactive decay x-rays: 10-3 to 102 nm – artificially generated

high energy, high penetrating powerinduce free radicals, break bonds

Ultraviolet light 100-400 nm short λ from sun absorbed by O2, forming O3

long λ absorbed by O3, returning to O2

protects against harmful UV most effective: 260 nm

thymine dimers325-400 nm, tryptophan breakdown

visible 400-750 nm photosynthesis strong dose excites pigments (cytochromes)

act as photosensitizersgenerate superoxide (singlet oxygen or O2

-) strong oxidizer carotenoids protect

infrared 103-105 nm (60% of sunlight) poor penetrating power

microwave radiation > 106 nm