كاريوتايپينگ انسان
TRANSCRIPT
بسم هللا الرحمن الرحيم
هرچه گفتي اي دم هستي از آن
پرده اي ديگر بر آن بستي بدان
نمونه •
كشت•
هاروست•
تهيه اساليد•
رنگ آميزي •
مرحله نهايي•
.
تعريف
مراحل كار
هدف
تعريف
.مطالعه ماده ژنتيكي، عملكرد و نحوه انتقال آن در سطح سلولي: يتوژنتيكسا
الق مي سيتوژنتيك انساني اغلب به مطالعه ي كروموزومي با استفاده از ميكروسكوپ نوري اط.گردد
ل نزولي و مرتب كردن كروموزوم هاي متافازي يك جاندار به ترتيب اندازه و به شك: كاريوتايپينگ.جفت جفت
.كاريوتايپنگ سلول انساني اساس سيتوژنتيك امروزي است
هدف
تشخيص ناهنجاري ها قبل از تولد•
بررس ي علل سقط يا مرده زايي•
ابهامات جنس ي•
تشخيص برخي بدخيمي ها•
بررس ي علل نازايي•
اطمينان از وجود بيماري هاي با علل نقايص كروموزومي•
6
The "Philadelphia chromosome"
مراحل انجام
تهيه ي اساليد كروموزومي•فيكساتيو-1
تميز بودن الم-2
روش هاي تمييز كردن الم ها
رطوبت نسبي و دماي الم ها-3
رنگ آميزي انواع روش ها
مرحله نهایی
نمونه گيري •
كشت •سلول هاي قابل استفاده•محيط هاي مورد استفاده•ميتوژن ها•نحوه كشت•
هاروست•تعريف•مواد ووسايل•روش انجام•
نمونه
خون •
مغز استخوان•
تومور •
مايع آمنيوتيك•
پرز هاي كوريونيك•
(كوردوسنتز)رگ ها ي خوني بند ناف•
پوست•
كشت
شرايط سلول هاقابليت تكثير داشتن
در دسترس بودن ميتوژن آن ها
سهولت كشت
:سلول هاي رايج مورد استفاده ليمفوسايت هاي خون محيطي
سلول هاي جنيني
محيط مورد استفاده
(RPMI 1640/100 ml) + (F.B.S 20-30%) + L – Glutamin +
(Penicilin – Streptomycin 10000 units/ml) + NaCO3 7.5%
PH باشد( 7حدود )اين محيط بايد خنثي.
RPMI : Roswell Park Memorial Institute
ميتوژن ها
:توژن هاازجمله مي.را ميتوژن گويند( القا كننده ميتوز )محرك هاي خارجي تكثير سلول •
T -Cells:براي •
(PHA)فيتوهماگلوتينين •
:B-Cellsبراي •
(Pakeweed)پاكويد •
Cancanavalin)كانكاناوالين آ • A)
•EBV
روش انجام كشت
قطره خون 15-20درجه سانتيگراد را در لوله استريل ريخته و37س ي س ي از محيط كشت 45•
.به آن مي افزاييمPHAس ي س ي 0.1كامل، به همراه
.درجه اينكوبه مي نماييم37ساعت در 72-70•
هاروست
برداشت محصول : معني لغوي •
:مواد مورد نياز•فالسك حاوي نمونه و محيط كشت•
(عامل توقف كروموزوم ها)كولسميد يا كولش ي سين •
(KCL)كلريد پتاسيم •
تازه و سرد( قسمت متانول 3+قسمت استيك اسيد1)فيكساتيو•
كولسميد
• Colcemid is a microtubule-depolymerizing drug.
• At very low concentration it binds to microtubule plus end to suppress microtubule dynamics
• at higher concentration can promote microtubule detachment from microtubule organizing center
كولش ي سين
آلکالوئید است که مانع ازينوع •د انجام مراحل پس از متافاز در فراین
. میتوز میگردد
کلش ی سين با از بين بردن •یل میکروتوبول و جلوگيری از تشک
.دوک عمل میکند
روش انجام هاروست
0.2 CC Colcemid + 10 CC Culture medium
45-120 minut in 37c
Centrifugation (800-500rpm and 8-10 minut)
5-7 cc KCL (0.075 M) 37c
15-20 minute in 37c
Centrifugation
Fixative(5-7 cc)
Centrifugation
تهيه ي اساليد
:فاكتور هاي مهم جهت حصول پخش كروموزومي ايده آل•
فيكساتيو-1
به آهستگي اضافه شود•
تسهيل فيكساسيون در صورت استفاده از يخچال و فريزر •
تمييزبودن الم ها-2
نوع الم ها•
تمييز كردن الم ها•روش اسيد الكل
روش اسيد كروميك
روش تهيه ي اساليد
ز سانتي متري با استفاده از پيپ پاستور روي الم تميي30قطره از سوسپانسيون سلولي از فاصله 2-3پرتاب •.سرد
.ي بررس ي الم ها زير ميكروسكوپ فازكنتراست ازنظر دانسيته سلولي و پخش كروموزوم هاي متافاز •
اگر تراكم سلولي كم بود
اگر تراكم سلولي زياد بود
سانتريفيوژ و مقدار كمتري فيكساتيو
افزودن فيكساتيو
وجود سيتوپالسم در اطراف كروموزومها افزايش زمان تيمار با هايپوتونيك
پخش زياد كروموزوم هاي متافازي كاهش زمان تيمار با هايپوتونيك
انواع روش هاي رنگ آميزي كروموزوم
رنگ آميزي يكنواخت -1
(Acetoorcein)استو اورسئين
(Acetocarming)استئوكارمينگ
(Hematoxilin)هماتوكسيلين
(Lishman)ليشمن
(Wright)رايت
(Fulgen)فولگن
رنگ آميزي باندي-2
N,G,Q,C,R,Tباندينگ هاي
كاربرد هاي روش هاي رنگ آميزي يكنواخت كروموزوم
شمارش كروموزوم•
تعيين محل سنترومر•
نسبت بازوهاي كروموزومي•
شكست ها و حذف ها •
بررس ي ماهواره•
وجود كروموزوم هاي دي سانتريك•
وجود كروموزوم هاي حلقوي •
•...
نمونه هايي از رنگ آميزي يكنواخت
ليشمن
قسمت بافر فسفات4قسمت ليشمن در 1•
•PH 6/8برابر
دقيقه زير رنگ5-3•
شستشو با بافر فسفات •
خشك كردن•
سپس غوطه وري در گزيلن•
خشك كردن مجدد و المل گذاري •
گيمسا
:محلول كاري •
•cc4گيمسا
•cc96 بافر فسفات باPH 6/8برابر
دقيقه7-10: مدت رنگ آميزي •
شستشو و خشك كردن و المل گذاري •
انواع روش هاي باندينگ كروموزوم
• G-banding
• Q-banding
• C-banding
• R-banding
• T-banding
• N-banding
گيمسا
كويناكرين
سنترومر
معكوس
تلومر
هستك
پير كردن الم
.را پشت سر گذارند Agingجهت دستيابي به يك الگوي مناسب نواربندي بايد الم ها مرحله ي •
:الم ها را به چندين طريق پير مي كنند •
درجه سانتي گراد60ساعت در 24•
درجه سانتي گراد75ساعت در 2-1•
درجه سانتي گراد90-95دقيقه در 20•
روز در دماي آزمايشگاه14تا 10•
روز رنگ بري گردد2ابتدا با گيمسا يكنواخت رنگ شده وپس از G-bandingهمچنين بهتر است قبل از •
.
نواربندي گيمسا
مكانيسم نامشخص
:مواد مورد نيازنرمال سالين
(gr/60cc Normal salin 0.4)محلول تريپسين
ميلي ليتر آب1000گرم سيترات سديم در NaCL +8.82گرم17.63(:SSC)سيترات سالين
PBSقسمت 3+ قسمت گيمسا 1: محلول رنگ آميزي
روش نواربندي گيمسا
37در بن ماري SSCساعت در 2الم ها را
دقيقه2هر يك % 100و% 90و% 70و% 50آب گيري الم ها در الكل هاي
S 10-2درجه سانتيگراد به مدت 45-48فرو بردن الم ها در تريپسين
ورود فوري در سالين نرمال وآب مقطر
دقيقه رنگ آميزي، شستشو با آب مقطر و خشك كردن10خشك كردن،در هواي آزاد
مرحله نهايي
.روي الم ها المل چسبانده با عدس ي روغني بررس ي ميكنيم•
.يك متافاز مناسب را عكس برداري نموده و از آن فتوميكروگراف با رزولوشن باال تهيه ميكنيم•
ورت نزولي كروموزوم ها را به صورت دستي يا با نرم افزار كامپيوتري بر حسب انذازه و الگوي باندينگ به ص•
.وجفت جفت مرتب مي نماييم
.كاريوتايپ حاصله را از نظر وجود نا هنجاري هاي احتمالي ارزيابي ميكنيم•
Genetic Disorder
Down's Syndrome Turner's Syndrome Klinefelter Syndrome Cri du Chat Syndrome
karyotype change 3 copies of chromosome
21
one X only for chromosome
23
XXY for chromosome 23 deleted part of
chromosome 5
How often does it
occur? 1 in 800 1 in 2000 1 in 750 1 in 50,000
Physical
Symptoms
mental retardation, eyes
slant upwards,
prone to heart
defects and
respiratory
problems.
normal female in childhood,
normal intelligence,
fails to fully undergo
puberty and will
remain infertile
male, normal in appearance
and intelligence, sterile,
may show some female
characteristics (breast
development, feminine
body shape)
distinctive cat-like cry in
babies, respiratory
problems,
shortened life
span is possible
Genetic DisorderTriple X Syndrome Edward's Syndrome Patau Syndrome Trisomy 23
karyotype change XXX for chromosome 23 3 copies of chromosome 18 3 copies of chromosome 13 XYY for chromosome 23
How often does it
occur? 1 in 700 1 in 6,000 1 in 15,000 1 in 2,000
Physical
Symptoms
female with normal
intelligence and
appearance, may
be sterile
feeding and breathing
difficulties,
developmental delays,
deformation of head
and face, cardiac
defects, often results
in early death
mental retardation, cleft
palate, extra fingers and
toes, incomplete
development of internal
organs, often results in
early death
male with low mental
ability, normal in
appearance
منابع
نتشارات ا–دكتر احمد مجد و دكتر سيد محمدعلي شريعت زاده -راهنماي عملي زيست شناس ي سلولي و مولكولي-11388-دانشگاه اراك
1390-انتشارات دانشگاه اراك –دكتر احمد همتا –كاوش در ژنتيك تجربي -2
فرهنگ زیست شناس ی جلد اول دکتر بزرگمهر وزیری -3
4-www.geneticlab.ir
•...