亲和层析 法
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亲和层析 法. 1 原理: 要有一对具有高 亲和 性的分子 2 亲和吸附剂 : 有 很多 亲和 性 吸附剂 可利用 3 金属螯合层析法 : 利用分子 与金属 的吸引力. 亲和色谱 原理:酶与载体之间的特异性作用。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上,然后用适当的底物特异地洗提。. ■ 亲 和 层 析法的四 项 要素:. 配 体 Ligand (A). (1) Solid Matrix. 耦合反 应 (3) Coupling Reaction. 洗脱 Elution (4). B. (2). B. B. Specific - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
亲和层析法
● 1 原理: 要有一对具有高亲和性的分子
● 2 亲和吸附剂: 有很多亲和性吸附剂可利用
● 3 金属螯合层析法: 利用分子与金属的吸引力
亲和色谱
原理:酶与载体之间的特异性作用。
亲和洗提
酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上,然后用适当的底物特异地洗提。
■ 亲和层析法的四项要素:
(2)
SpecificBindingSubstance (B)
洗脱Elution
(4)
配 体Ligand (A)
耦合反应 (3)Coupling Reaction
杂质B
B
B
B
(1)
Solid Matrix
B
■ 亲和层析法的作用机理:
固相载体
(1) (2) (3)
A
B
Sample
Washing Elution
X B
亲和基团配体
XB
A A
■ 典型的亲和层析操作:
Activity
Elution volume
Protein
pH 2.05
*
II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction
■ 专一性作用力的种类:
I. Conformational Match: Van der waals interaction
+Kd
两分子间因构象互补所造成的吸引力是由范德华力所贡献
+ -
=O…H-N-
B
A
■构型互补所产生的吸引力:
Van der Waal interactions
between non-polar surfaces
vdw vdw范德华键数目够多就足以产生亲和
力
■ 生化分子的反应基团:
-NH2胺 基-COOH羧 基-HC=O醛 基
-O-醚
氰 基 -C N
-OH醇 基 -SH硫醇基
-CH3烷 基
●●●●●
●●●
X
●●
●
●
■ 可与各种配体基团反应的载体:
配体基团 親 和 性 载体 反应基团 反应方式 直接反应加 EDC*
直接反应直接反应加 EDC*
直接反应直接反应DTT 活化 直接反应
-C≡N
-COOH
N-OH-succinimide
Oxirane 环氧己烷-NH2
oxirane
oxirane
-S-S-R
-G-S-S-R
CH-Sepharose 4B 或活化型
CNBr-activated Sepharose 4B
Epoxy-activated Sepharose 4B
AH Sepharose 4B
Epoxy-activated Sepharose 4B
Epoxy-activated Sepharose 4B
Thiopropyl-Sepharose 4B
Activated thio-Sepharose 4B
-NH2
-COOH-OH
-SH
* EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl
Pharmacia
■ 亲和性载体的反应基团:
spacer arm
- O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C - COOH
- OH
- O - C N
NH2 - Protein
- NH -C-C-C-C-C-C- NH2
- NH -C-C-C-C-C-C- COOH
- O - C - NH - Protein
NH
Epoxy
N-Succinimide琥珀酰亚胺
Carboxylic
Amino
CNBr activated
- NH -C-C-C-C-C-C- C - O-N
O
O
O
- O - C NCNBr
■ 各种亲和性载体及其专一性基团:
免疫吸附剂,大多自行合成
单株抗体纯化对 -D- 葡萄糖、甘露糖基有专一性 Heparin Sepharose CL-6B
Blue Sepharose CL-6B
5'AMP-, 2', 5'ADP-Sepharose 4B
用来纯化 lectin
酶的专一性结合
Oligo (dT)-cellulose
配 体 親和性分子 说 明
( 还有更多其它 亲和配体和载体 )
Oligo (dT)
抗体 底物或抑制剂Protein A
Con A 刀豆素Heparin
Cibacron-BlueAMP, ADP
单糖及衍生物
对应的酶对应的抗原
Lectin
NAD(P)+ 结合酶NAD(P)+ 结合酶
mRNA
部分 IgG
糖蛋白凝血蛋白等
Pharmacia
■ 金属螯合层析法:
Ni 固相载体His HisHis
Protein
Metal Chelate Affinity Chromatography
imidazole
elution-O-C-C-C-O-C-C-C-NOH
C-COOH
C-COOHOH
Juang RH (2004) ECX
■ 亲和层析法实例的原始材料:
CHOM鸡蛋粘多糖蛋白
OO
CH2OH
OH
NH2
OO
CH2OH
OH
NH
O=CH3
Chitin Trypsin
SDS-PAGE
■ 以亲和层析法纯化 Trypsin :
CHOM
Trypsin
A B C&D
Disc-PAGE
A B C = D以凝胶电泳检验亲和层析操作过程各步骤样品→
Chitin
■ Hydroxyapatite 吸附剂:
Bio-Rad CHT
(Ca5(PO4)3OH)2羟基磷灰石
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
●疏水性层析法: 利用分子间的疏水性引力
●液相分配: 分子在两液相间的分配比例不同
■ 蛋白质表面的极性或非极性分布:
Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig. 21-36
Superxoidedismutase(SOD)
Activie site
Hydrophobic area
Reverse Phase Chromatography (liquid-liquid)
Using ion-exchanger
Polarsolvent
■ 疏水性及反相层析法原理:
HIC (liquid-solid)
Using non-polar groups as a stationary phase
Polarsolvent
Non-polararea
Hydrophobic groupPolar area
Non-polararea
Non-polarsolvent
++
+++++++ ++
Polar phase
C18 = -C18H37
C6 = -C6H13
Phenyl = -C6H6Juang RH (2004) ECX
■ Hydrophobic interaction 色析法:
Elution volume (mL)
0
10
20
30
40
50
5
10
15
20
25
100 200 300 400
Eth
yle
ne g
lyco
l (%
)
Ammonium sulfate (% sat.)
Pro
tein
con
centr
ati
on
BA
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