סוגי תרביות – עפ"י שלב התפתחות התרבית

לשטח הפנים של הכלי/ הנשאוספיחתם התאים בתרחיף שקיעת1.

במשטח הגידולנאחזיםבעזרת חלבונים גליקופרוטאינים ) בנסיוב( הם 2.

על פני המשטח שאליו נצמדומשתטחיםהתאים 3.

והתרבותלהתחלקהתא סיים את הסתגלותו ומתחיל 4.

) תרבית ראשונית (תאים חד-שכבתי על פני המשטח רובד נוצר 5.

את ההתרבות ומגביל אותה העוצר הפעלת מנגנון " עיכוב ע"י מגע " 6. לגודל לשטח הפנים של המשטח בלבד. התאים נוגעים זה בזה אך

לא עולים אחד על השני .

קבלת תרבית ראשונית

תרבית חד-שכבתיתהטרוגנית מבחינת סוג

התאים

שבועות2תוך

קבלת תרבית שניונית

תרבית חד-שכבתיתהומוגנית יותר מבחינת סוג התאים

בגלל תהליך הברירה שהתרחשבהעברות החוזרות

2אחרי השבוע ה

טיפול מכאני / אנזימי ) טריפסין (לפירוק רובד התאים1.

סרכוז והרחפה של התאים במצע הגידול , דילול2. וזריעה חוזרת בכלים חדשים ) העברה (.

מתקבל רובד חד-שכבתי של תאים בצלחות החדשות3.

(העברות חוזרותחוזרים על ההעברה ) 4.

טבעית ברירהבהעברות החוזרות מתרחש תהליך 5. ) חלק מהתאים מת וחלק מזערי שורד (

תרבית שניוניתמתקבלת 3.

רקמת בע"ח / רקמה עובריתשעברה פירוק מכאני ואנזימי עם טריפסין

רקמת עובריתשל בע"ח / אדם

3נושא 21 - 5שקופיות

5

קו תאיםאוכלוסיה דומיננטית

הומוגנית יותר של תאים השולטת בתרבית במשך

העברות חוזרות50

הברירה באופן הדרגתיבתרבית השניונית ממשיך להתרחש תהליך המתאימה ביותרואוכלוסיות תאים שונות נעלמות מהתרבית . האוכלוסייה

לתנאי הגידול תתרבה ) יש לה עדיפות ( ותשתלט על התרבית ויתקבל הומוגני יותר מבחינת סוג התאים) עדיין לא שבט ( למשלקו תאים

במצע הגידול (.בגורם הבוררתאים פיברובלסטים או תאי אפיתל ) תלוי . התאים ימותו או שחלקם יעברו התמרה מוגבלאורך חייו של קו תאים

סרטנית ויתקבל קו תאים רציף .

קו תאים רציףאוכלוסיה הומוגנית

של תאים המתחלקת ומתרבה ללא הגבלהבתרבית . מתקבלת

העברות חוזרות70 - 50לאחר

התאים בתרבית מתים . חלק מזערי של התאים בקו התאים לא מת , אלא עובר התמרה סרטנית ורוכש יכולת התרבות

נצחית קו תאים רציףבתרבית ) מחוץ לגוף החי ( ויצר

המוחק בתרבית לנצח ע"י המשך העברות חוזרות .ניתן להקפיא את התאים מקו תאים רציף ליצירת מאגר

לשעת הצורך. סיבות ההתמרה:

ספונטאנית בתנאי הגידול• מושרית ע"י הדבקה בווירוס • מכוונת ע"י איחוי התאים עם תא סרטני • מכוונת ע"י שינוי גנטי בהנדסה גנטית •

תרבית תאים

6

תאי בע"ח או אדם הניתנים לגידול בתרבית בקלות יחסית , לרוב הם :פיברובלסטים ) תאי העור ( , תאי אנדותל )רקמת ציפוי פנימית תאי רקמת החיבור : •) תאי אפיתל )רקמת ציפוי עילית (תאי רקמת ציפוי : • תאי היברידומה המייצרים נוגדנים תאי כלאיים ) תאים שעברו איחוי ( : •

חד-שבטיים

העברות חוזרות של תרבית שניונית שבועות12במשך

14 – 13בשבוע

בע"ח

שבועות 2

תרבית ראשונית

שבועות 12חוזרות 70 העברות

מינימום) (

תרבית שניונית

הזדקנותודעיכה

התמרה סרטנית

קו תאים

קו תאים רציף

ה 16בשבוע

תרבית נצחית

שעות20-48זמן הדור

העברה

סיכום סוגי תרביות

7ציר הזמן)שבועות(

סוג התרבית

תרבית ראשונית

תרבית שניונית

קו תאים

קו תאים רציף

0

2

4

מות התרבית16

ה 14בשבוע

Primary culture

secondary culture

Cell line

continuous Cell line

ה 16בשבוע

השלבים בהתפתחות רובד תאים חד-שכבתי בתרבית על משטח תאחיזה

של חלבוני הקישור )חלבוני תאחיזה במצע ( למשטח גידול הידרופיליספיחה

התאים עם המשטח המצופה בחלבוני קישורמגע

התאים למשטח באמצעות חלבוני הקישורהתקשרות

התאים והצמדתם למשטח הגידולהשתטחות והתפרשות

התאים על-פני משטח הגידולהתחלקות והתרבות

רובד תאים חד-שכבתי נוצר על משטח הגידול

1

2

3

4

5

6

המעבר לתרבית תאים זהו מעבר הדרגתי ובררני

המתפתח בשלבים

8 http://biomed.wustl.edu/faculty/elbert/Elbert%20Lab/endothelial_cell_biology.htm

תרביתתאי אנדותל

http://www.bme.gatech.edu/vcl/Tissue_Engineering/Background/5_cell_seeding.htm

אנימציה על התפתחות תרבית

9

סרט וידיאו על תרבית תאים כולל שלבי תמותה )אפופטוזיס(Controlling cell proliferation and cell death (apoptosis)

Click here to watch a video clip of apoptosis in action

http://www.bham.ac.uk/chemeng/actg/actghome.htm

סרטון על מותה של תרבית

10

מנגנון היצמדות התאים בתרבית ויצירת תאחיזה למשטח הגידול

גורמי קשירה. הוספת 1בעלי מטען חשמלי חיובי +

כמו חלבונים גליקופרוטאיניםאו יונים דו-ערכיים )יוני סידן(

. הוספת התאים 3)קרום התאים טעון שלילי

) ---- -- -

++++++

+++

+ ++

. טעינת המשטח ב +2גורמי ספיחת ע"י

הקשירה החיוביים+++ + ++

טעונים +גורמי קשירהבאמצעות

מגע. יצירת 4 בין התאים

למשטחהתאים למשטח התקשרות . 5

באמצעות הגליקופרוטאינים

התאיםהשתטחות. 6+ והתחלת ההתרבות + + ++ +

------

+ + + + ++- - - - - -

-

העשרה

11

http://www.hansei.com/products/products02.htm

תאי אדם מרקמות שונות שהצליחו לגדל בתרבית העשרה

12

צורות גידול של תאים בתרבית – לפי סוג התאים

13

גידול רב-שכבתי גידול חד-שכבתי גידול בתרחיף

תאי בע"ח נורמאליים שמקורם ברקמות חיבור או רקמות ציפוי )תאי עור או

אפיתל ( נצמדים למשטח תומך ,משטחים ומתרבים עליו. הם יוצרים

רובד תאים חד-שכבתי מסודר . גידולם נעצר.

דורשים תאחיזה למשטח מוצק • יש עיכוב ע"י מגע•

תאי דם ולימפה נורמאליים של בע"ח מתרבים בצורה חופשית במצע נוזלי כתאים בודדים או

בצברים קטנים. הם יוצרים תרחיף תאים .

לא דורשים תאחיזה למשטח •מוצק

תאי בע"ח סרטניים יכולים לגדול בצורת תרחיף במצע נוזליאו יוצרים גושי תאים לא

מסודרים ורב- שכבתיים על מצע מוצק

לא דורשים תאחיזה למשטח • אין עיכוב ע"י מגע•

תאים נורמאלייםתאים סרטניים

14

תנאי הגידול של תאים בתרבית

כלי הגידולבקרת הגידולמצע הגידול

המצע מורכב עשיר ויקר ומכיל :

מקור סוכר )גלוקוז(• מלחים אנאורגנים• חומצות אמיניות • ויטמינים• אנטיביוטיקה )נגד זיהום •

חיידקי( נסיוב מן החי ) מכיל גורמי •

תאחיזה וגורמי גידול והתרבות )

התנאים מבוקרים ודומים לתנאים בגוף :

מעלות37 טמפרטורה •pH = 7.2 -7.4 סביבה ניטרלית • איזון אוסמוטי קפדני )התאים •

רגישים ללחץ אוסמוטי בהיותם מוקפים בקרום בלבד

5% אוורור )אספקת חמצן( בתוספת • המצע .pHלאיזון CO2גז

אינדיקטור פנול אדום במצע • חומצי ( pH) מצהיב ב

סביבה סטרילית ) עבודה במנדף •סטרילי , שימוש במצע מסונן המכיל

אנטיביוטיקה, אוויר מסונן (

כלי הגידול מסוגים שונים :

עשויים פלסטיק שקוף בעל •מכסה הסוגר בצורה חופשית לא

הרמטית כדי לאפשר נשימה וחילוף גזים(

צלחות פטרי • צלחות עם בארות ) מולטי(• בקבוקי מיוחדים לשימוש אופקי• מגירות / סלילים / חרוזים – •

להגדלת יחס שטח הפנים לנפחהכלל : שטח פנים מקסימאלי

ונפח מצע מינימאלי בגלל : . לאפשר מגע 2. יוקר המצע 1

של התאים עם האוויר

של מצע הגידול :pHויסות ושמירה על ה באוויר לוויסות חומציות המצע : הפחמן דו חמצני נמס בתמיסת CO2 גז 5%הזרמת

המצע ויוצר חומצה חלשה המקיימת מצב שיווי משקל עם האניון שלה . נוצרת מערכת בופר

הבולמת שינויים בריכוז הפרוטונים בתמיסה עקב חילוף החומרים בתאים הגדלים בתרבית .

בקבוקי תרבית לשימוש אופקי

בקרה של פרמטרים חיוניים לגידול תרבית אנימאלית ) של בע"ח ואדם ( :• PH טמפרטורה• חמצן ) אוורור (•

סטייה של ערכי המדדים האלה מהנדרש תגרום למותה של תרבית תאי בע"ח

ריכוז המזון במצע • ריכוז פסולת •

רעילה

http://www.bham.ac.uk/ChemEng/actg/actgres.htm

15

גידול תאים בבקבוק סובב

תיאור המערכת : ליטר כ"א, מסתובבים במצב אופקי על ציר 2 בקבוקי זכוכית בנפח

האורך שלהם, באופן רציף. .שטח פני הבקבוק הפנימי מותאם לספיחת תאים ולתאחיזה . הפאזה הגזית גדולה כי נפח המצע קטן ) רובד התאים פעם טבול במצע ופעם נחשף לאוויר ) לחמצן

: דוגמה לשימוש במערכת ייצור תרכיבי חיסון

העיקרון : שטח פנים מקסימאלי ונפח מצע עפ"י גידול תעשייתי של תרבית תאי בע"ח - מינימאלי

16

יתרונות :צמצום סכנת זיהום של כלל התרבית . אם יש זיהום אז הוא מוגבל 1.

לבקבוק בודד בלבד .שטח הפנים גדול יחסית לנפחו. הרובד מצפה את שטחו הפנימי.2.כמות המצע מינימאלית . חסכון כלכלי .3.הפאזה הגזית גדולה ) חלל הבקבוק גדול ( ומאפשרת חילוף גזים.4.זמינות המצע לתאים טובה .5.

התהליך מנתי. העבודה עם הרבה בקבוקים מסורבלת ולא חסרונות:נוחה.

http://www.eyela.co.jp/seihinEX/catalog/sogo_catalog/18Edobutsu.html

17

מערכת הבקבוק הסובב לגידול תאי בע"ח

העיקרון : שטח פנים מקסימאלי ונפח מצע עפ"י גידול תעשייתי של תרבית תאי בע"ח - מינימאלי

גידול תאים על מיקרו נשאים

גידול בתהליך גידול בתהליך מעורבל ) מנתי (רציף

מספקים מצע טרי + ערבול עדיןהתאים מתרבים במיכל הגידול

כשיש הצטברות פסולת עקב הגידול וירידה בכמות חומרי המזון

מסננים מצע ישן ומחליפים במצע טרי

חסרונות גידול מעורבל -מנתי : לא ניתן להגיע לביומסה גדולה כיצפיפות הגידול של התאים קטנה

יותר

יתרונות הרציף )פרפוזיה( :

חסכון במצע יקר. ריכוז המצע קבוע

ריכוז החמצן קבועצפיפות התאים גבוהה יותר

מזרימים מצע ברצף לתרבית , ומרחיקים בו

זמנית את המצע המשומש דרך מסנן לשימוש חוזר

) המצע ממוחזר (

תיאור המערכת : מיקרון150-200כדורים קטנים בקוטר

המורחפים במצע הגידול עם התאים.התאים נצמדים לשטח הפנים של הכדורים

נאחזים בו ועליו מתחילים להתחלק ולהתרבותעד שיוצרים על כל כדור מעטפת רקמתית

בצורתרובד תאים חד-שכבתי

הגידול על נשאים יכול להיות מנתי או רציף

18

http://www.microcarriers.com/cytodex.html

מיקרו נשאים ועליהם גדלים תאים

תכונות המיקרו נשאים המשמשים בגידול תרביות תאים :

מ"מ ( 0.1-0.25כדורים קטנים ) 1.

עשויים פולימר טבעי מצולב ומותמר במטען חיובי כמו צלולוז ,דקסטרן )פולימר טבעי של 2.גלוקוז( , קולגן או עשויים פולימר סינתטי לא רעיל .

בעלי מבנה גמיש ) הקטנת נזק התנגשויות העלול להיגרם לרובד התאים (3.

בעלי תכונות אופטיות )בליעת אור באורך גל מסוים מאפשרות מעקב מיקרוסקופי אחר גידול 4.התאים(

מאפשרים גידול בתרחיף עם ערבול עדין5.

ניתנים להפרדה מהמצע ) הפסקת הערבול תגרום לשקיעתם (6.

מאפשרים גידול רציף7.

המערכת קלה יותר לבקרה ולוויסות הפרמטרים המשתנים8.

יחס שטח פנים לנפח של הנשאים גדול9. מאפשרים קבלת צפיפות גבוהה של תאים המצפים ברובד חד-שכבתי את הנשאים10.חסכוני וכלכלי כי משתמשים בנפח מצע קטן יחסית 11.סיכויים לזיהום חיידקי קטנים יותר12.חוסך העברות חוזרות13. המעבר קל יחסית לנפחים גדולים יותר ולפיתוח ייצור מסחרי 14.

19

מיקרו נשא עטוף בשכבת תאים שגדלו על שטח פניו

http://www.percell.se/Kulastor.gif

מסנן תחתון

מסנן עליון

תרחיף נשאים +תאים

מצע גידול מוזרם כלפימעלה לערבול

מצעהגידולממוחזר

משאבה

אויר +CO2

ערבול התרבית ע"י הזרמת מצע ממוחזר כלפי מעלה מערכת גידול רציפה -

הרחקת המצע המשומש)ללא נשאי התאים(

דרך מסנן לשימוש חוזר

20

יתרונות המיקרו נשאים :

יחס שטח פנים לנפח גדול מרבי. נפח 1.המצע מינימאלי . חסכון כלכלי .

אפשרות הגדלה הדרגתית של נפח 2.העבודה

אפשרות השימוש בתרחיף הנשאים 3.בכלים קטנים ונוחים .

אפשרות לערבול מתון ולתנאי גידול 4.קבועים

מתקבלת צפיפות תאים )ביו מסה( 5.גבוהה

אפשרות להפרדה קלה של התאים 6.ממצע הגידול

חוסך העברות חוזרות ) מצמצם סכנת 7.זיהום (

אפשרות לתהליך גידול מנתי וגם רציף8.

העשרה

21

סוגי תאים הגדלים בתרבית , מצעים , סוגי תרביות ושיטותhttp://www.research.umbc.edu/~jwolf/method5.htm

סוג התאים שניתן לרכוש באופן מסחרי למטרות יישומיותhttp://www.hansei.com/products/products02.htm

http://www.bet-analyses.com/frame_right/culturee.html

הרכב המצע ותנאי הגידול http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/media.htm

תפקיד הנסיוב במצע http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/serum.htm

תרבית ראשונית http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/primary.htm

http://www.nhnscr.org/stem-cell-culture-course/course-description.htm

של תרבית תאי בע"ח0n-lineבקרה http://hugroup.cems.umn.edu/Research/hybridoma/on-line_control.html

מערכת מיקרו-נשאיםhttp://www.percell.se/history.htm

מערכת הבקבוקים הסובביםhttp://www.eyela.co.jp/seihinEX/catalog/sogo_catalog/18Edobutsu.html

רשימת אתרים להרחבה