《生物化学实验》《生物化学实验》

课程简介课程简介 生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课，本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学的基本知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术。

目 录目 录 实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 ( 操作性 ) 4 学时 实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 ( 操作性 ) 3 学

时 实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 ( 验证性 ) 5 学时 实验四 动物肝肝脏 DNA 的分离与鉴定 ( 操作性 ) 3 学时 实验五 血液中葡萄糖的测定 ( 操作性 ) 3 学时 实验六 血清中总胆固醇的测定 ( 操作性 ) 4 学时 实验七 唾液淀粉酶活性的观察 ( 综合性 ) 4 学时 实验八 维生素 C 的定量测定 ( 操作性 ) 4 学时 实验九 脂肪酸的 β- 氧化 ( 操作性 ) 4 学时

实验十 琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 ( 操作性 ) 4 学时

实验十一 酪蛋白的制备 ( 操作性 ) 4 学时 实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定 ( 综合性 ) 3 学时

实验一实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法氨基酸的分离鉴定——纸层析法 【实验目的】 1.1. 掌握纸上层析的一般原理和操作方法。掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.2. 了解氨基酸的特征性颜色反应。了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.3. 学会分析未知样品的氨基酸成分。学会分析未知样品的氨基酸成分。【实验原理】 纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近

代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。研和生产分析工作中。 纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的 RfRf

值。值。 RfRf值的定义为：值的定义为：Rf =(Rf =( 原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离 )/)/ （原点到溶剂前沿的（原点到溶剂前沿的距离）距离） 用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献文献 RfRf值进行鉴定值进行鉴定。。

【实验试剂与器材】 1 、溶剂系统 （ 1 ）碱相溶剂：正丁醇正丁醇 :12%:12% 氨水氨水 :95%:95%乙醇＝乙醇＝ 13:13:

3:33:3 （体积比）（体积比）

（ 2 ）酸相溶剂：正丁醇正丁醇 :80%:80%甲酸甲酸 :: 水＝水＝ 15:3:215:3:2 （体积（体积比）比） 2 、显色贮备液： 0.1%0.1% 水合茚三酮丙酮溶液水合茚三酮丙酮溶液 3 、 V （ 0.1%硫酸铜） :V （ 75%乙醇） =2:38 溶液。 4 、混合氨基酸溶液 6mg/ml 。 5 、滤纸。 6 、烧杯 10ml （ ×1 ）。 7 、剪刀。 8 、层析缸（ ×2 ）。 9 、微量注射器 10μl （ ×1 ）或毛细管。 10 、电吹风（ ×1 ）。 11 、 722 型（或 7220 型）分光光度计。

【实验步骤】 11．纸的处理．纸的处理 取取 18 cm18 cm长、长、 18 cm18 cm宽的滤纸一张，离底边宽的滤纸一张，离底边 2 cm2 cm

处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点上定点样点 (( 原点原点 ))划圈，使圈的直径小于划圈，使圈的直径小于 0.5 cm0.5 cm 。。22．点样．点样 在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写可写MM ），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点 11次。每个样次。每个样品共点品共点 22次。次。 33．层析．层析 将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点

位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触 ((见图见图1)1) 。。 将培养皿中放入将培养皿中放入 22／／ 33 量的展层剂，放入层析缸中，量的展层剂，放入层析缸中，然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。 当溶剂前沿到达离上端当溶剂前沿到达离上端 2 cm2 cm处，取出滤纸，用铅笔处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。描出溶剂前沿，晾干。

图 1 滤纸的缝合

44．显色．显色 用喷雾器向滤纸上均匀喷洒用喷雾器向滤纸上均匀喷洒 0.1%0.1%茚三酮，晾干后，茚三酮，晾干后，将滤纸放入烘箱中将滤纸放入烘箱中 (80-100 )℃(80-100 )℃ ，烘烤，烘烤 55 分钟后，滤纸上分钟后，滤纸上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓 ((见见图图 2)2) 。。

图图 2.2. 层析谱层析谱11．原点；．原点； 22．层析点；．层析点； 33．溶剂前沿．溶剂前沿

5 5 ．计算．计算 用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的 RfRf值。值。【注意事项】(1)(1) 在整个操作过程中，手只能接触滤纸在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘边缘，否则手指，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 (2)(2) 在在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。。 (3)(3) 展层结束后，切展层结束后，切勿忘记勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。用铅笔描出溶剂前沿。 (4) (4) 点样斑点不能太大（其直径应小于点样斑点不能太大（其直径应小于 0.5cm0.5cm ），防止），防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 (5)(5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。根据目的、要求，选择合适溶剂系统。

实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 【实验目的】 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。【实验原理】 考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质 --染料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝 G-250存在着两种不同样色形式，红色 -

棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色 -棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由 465nm变成 595nm ，测定 595 nm

吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。

蛋白质与染料结合速度很快， 2min就可以反应完全，并可以稳定 1h ，蛋白质 -染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为 10-100μg

蛋白质，微量测定时达到 1-10μg 蛋白质。此反应反复性好精度高，线性关系好。【实验试剂与器材】 1 、标准蛋白液（ 0.1mg/ml ） 0.2g 结晶牛血清白蛋白用 0.9%NaCl 稀释到 2000ml 。 2 、 0.9%NaCl

3 、考马斯亮蓝试剂： 100mg 考马斯亮蓝 G250 溶于 5

0ml

5%乙醇中，加 100ml85%磷酸，蒸馏水稀释 1000ml ，滤纸过滤。 4 、待测蛋白：人血清，用前用 0.9%NaCl稀释 200倍。

5 、漩涡混合器 6 、移液管 0.5ml （ ×2 ）， 1.0ml （ ×2 ）， 5ml （ ×

1 ） 7 、分光光度计 8 、试管 1.5cm×15cm (×8)

9 、量筒 100ml(×1)

10 、电子分析天平 11 、试管架 (×1)

【实验步骤】一、标准曲线线的绘制 取 7 支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以A595 为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准曲线。

试管号试剂

1 2 3 4 5 6

1mg/ml标准蛋白液 /

ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0.15mol/L NaCl/ml

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4

考马斯亮蓝染液 /ml

4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0

摇匀， 1 小时内以 1号管为空白对照，在 595nm处比色 A595nm

二、未知样液的测定 另取一干净试管，加入样品 1.0ml 及考马斯亮蓝染液4.0ml ，混匀，室温静置 3min ，于波长 595nm处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。

【注意事项】1 、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入 5-20min 内测 定吸光度，在这段时间内样色很稳定。2 、测定中，蛋白质 -染料复合物会吸附在比色皿上，实验 证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。

【思考题】1 、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白 质浓度。（ 1 ）样品不容易溶解，但要求结果很准确。（ 2 ）要求在半天内测定 60 个样品。（ 3 ）要求很迅速的测定一系列试管（ 30只）中溶液的蛋 白质浓度2 、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。

实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

【实验目的】 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。【实验原理】 血清中各种蛋白质的等电点不同，在 pH8.6 的巴比妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等，例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在 pH8.6时带的负电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析蛋白质。

【实验试剂与器材】（一）仪器1 、电泳仪； 2 、电泳槽；3 、恒温水浴箱；4 、 721 型分光光度计（二）材料1 、人血清或鸡血清2 、醋酸纤维素薄膜（三）试剂1 、 0.05 mol/L巴比妥钠 -HCL缓冲液（ pH8.6 ）：取巴比妥钠 10.3 g ，加蒸馏水约 800 ml 溶解后，加入 lmo

l/L

HCL 9.55 ml ，补加蒸馏水至 1000 ml ，测试其 pH

应 为 8.6 。 2 、染色液：取氨基黑 10B 1.0 g ，磺基水杨酸 10 g ，加冰 醋酸 20ml ，蒸馏水 400ml ，摇匀溶解。3 、漂洗液： 2.5％醋酸4 、洗脱液： 0.02 mol/L NaOH 溶液5 、透明液：无水乙醇 7份，冰醋酸 3份混合即成。

【实验步骤】1．薄膜准备2．点样

3．电泳

4．染色和漂洗

5．薄膜和透明 6．定量 （ 1 ）洗脱法

注意！白蛋白因加入 NaOH 的量比其他管多，其光密度值应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。

+

白蛋白 (A) α2 β γ

α1

%100% 各管光密度读数之和该种蛋白管光密度读数

）百分数（每种蛋白占总蛋白量的

（ 2 ）光密度计法（ 3 ）用本法定量，正常人数值为：白蛋白 54.0 % ~ 73.0 % 540 ~ 730 g/L

α1球蛋白 2.8 % ~ 5.1 % 28 ~ 51 g/L

α2球蛋白 6.3% ~ 10.6 % 63 ~ 106 g/L

β球蛋白 5.2 % ~11.0 % 52 ~ 110 g/L

γ球蛋白 12.5 % ~ 20.0 % 125 ~ 200 g/L

【注意事项】1．醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。2．血清或其他电泳样品应新鲜。3．点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。4．盐桥要放置平整，保证电场均匀。5．电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。6．较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不宜过高。7．选择合适的缓冲液离子强度。

8．两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。9．要控制好电流，电压和电泳时间。10．电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、 pH 及离子强度的改变，并应防止霉菌的滋长。11．染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性良好的定量结果。

【思考题】1. 电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析原因。2. 点样时，置于电场的正极还是负极，为什么？

实验四 动物肝肝脏 DNA 的分离与鉴定

【实验目的】 学习常用的 DNA 分离方法 。【实验原理】 在浓氯化钠 (1-2mol/L) 溶液中，脱氧核糖蛋白的溶解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠 (0.14mol/

L) 溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白 从样品中分别抽提出来。 将抽提的核蛋白用 SDS( 十二烷基硫酸钠 )处理，

DNA(或 RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿 - 异戊醇将蛋白质沉淀除去，而 DNA则溶解于溶液中。向溶液 中加入适量乙醇， DNA即析出。 为了防止 DNA(或 RNA) 酶解，提取时加入 EDTA

(乙二胺四乙酸）。

【实验试剂与器材】 1． 5mol/LNaCl 溶液：将 292.3g NaCl 溶于水，稀释至 1000ml 。 2． 0.14mol／Ｌ NaCl-0.15mol／Ｌ EDTA-Na 溶液： 溶 8.18gNaCl 及 37.2gEDTA－ Na 于蒸馏水，稀释至 1000ml 。

  

3． 25％ SDS 溶液：溶 25g 十二烷基硫酸钠于 100ml

45％乙醇。 ４． 0.015mol/LNaCl-0.0015mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液 ,氯化 钠 0.828g 及柠檬酸三钠 0.341g 溶于蒸馏水 ,稀释至 1,000ml 。 5 ．氯仿 - 异戊醇混合液 :氯仿 : 异戊醇 =24:1(V/V) 。 6 ． 1.5mol/LNaCl-0． 15mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液 :  

氯化 钠 82.8g 及柠檬酸三钠 34.1g 溶于蒸馏水 ,稀释至 1,000ml 。 7 ． 3mol/L乙酸钠 -0.001mol／Ｌ EDTA-Na 溶液：称取 乙 酸钠 408g 、 EDTA-Na0.372g 溶于蒸馏水 ,稀释至 1,000ml 。 8 ． 70%乙醇、 80%乙醇、 95%乙醇、无水乙醇。

   

9 ． 二苯胺试剂。 10 ． 1mol／Ｌ过氯酸溶液，将 10ml 过氯酸 (70%) 用蒸馏 水稀释至 11ml 。11 ．实验材料与仪器 大白鼠肝脏、匀浆器、离心机 5000r/min 、量筒 50ml(×1) 、 25ml(×1) 、 10ml(×1) 、吸管 5ml(×2) 、水浴锅、真空干燥器。

【实验步骤】1． DNA 的分离纯化： （ 1 ）将新鲜猪肝用 0.14 mol/LNaCl-0.15mol／Ｌ ED

TA 溶液洗去血液，剪碎，加入 50 ml0.14 mol/LNaCl-0.1

5mol／Ｌ EDTA 溶液 ,置匀浆器中研磨 .待研磨成糊状后，将糊状物离心 10min(4000r/min) ，弃去上清液，沉 淀用 0.14 mol/LNaCl-0.15mol／Ｌ EDTA 溶液洗二、三次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白制品。 （ 2 ）向上述沉淀物加入 0.14 mol/LNaCl-0.15mol／Ｌ EDTA 溶液，使总体积为 44ml ，然后滴加 25%SDS

溶液 3ml ，边加边搅拌。加毕，置 60℃水浴保温 10min

( 不停搅拌 ) 溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作

系使核酸与蛋白质分离。 （ 3 ）加入 5mol／Ｌ NaCl 溶液 10ml ，使 NaCl最终浓度达到 1mol/L ，搅拌 10min ，加入约一倍体积的氯仿 - 异戊醇混合液，振摇 20min ，离心 10min(4000r/mi

n ) 。去掉沉淀，上层清夜徐徐加入 1． 5—2倍 95%乙醇， DNA沉淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则 DNA丝状物即缠在玻棒上。 （ 4 ）将 DNA粗品置于 27ml0.15mol/LNaCl-0.0015m

ol/柠檬酸三钠溶液中，再加入 3ml1.5mol/L NaCl-0.0015

mol/柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿 - 异戊醇混合液，振摇 10min ，离心 (4000r /min ， 10min) ，倾出上层液 (沉淀弃去 ) ，加入 1.5倍体积 95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀

(粗 DNA ）。操作步骤 重复处理一次。 （ 5 ）将上步得沉淀溶于 27ml0.015mol/LNaCl-0.0015

mol/L柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入 2倍 95

%乙醇，边加边搅， 取出丝状 DNA ，依次用 70% 、 8

0% 、 95% 及无水乙醇各洗一次，真空干燥。

2 、鉴定：用二苯胺法测定 DNA

实验五 血液中葡萄糖的测定

【实验目的】（ 1 ）理解血糖在生物体内的重要意义。（ 2 ）掌握 Folin-Wu 法测定血糖含量的原理和方法。

【实验原理】 葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。 血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。

【实验试剂与器材】1 、标准葡萄糖溶液（ 1 ） 1% （ m/V ）葡萄糖母液 称取葡萄糖 1.0g ，溶于蒸馏水中，然后用 100ml 容量瓶定容至刻度。（ 2 ）标准葡萄糖溶液 用移液管吸取 1% 葡萄糖母液 1.

0ml ，放入 100ml 容量瓶内，然后定容至刻度。2 、碱性硫酸铜溶液（ A 、 B 液）（ 1 ） A 液：称取无水碳酸钠 35.0g ，酒石酸钠 13.0g

及碳酸氢钠 11.0g ，用蒸馏水溶解，然后用 1000ml 容量瓶定容至刻度。（ 2 ） B 液：称取硫酸铜 5.0g ，用蒸馏水溶解，然后用 100ml 容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。

碱性硫酸铜（现配现用）。 取 A 液 25ml ， B 液 5ml ，混合后，再用 A 液定容至 50ml ，摇匀。该混合液在 4℃冰箱里可保存数日，如果暴露于阳光下，数小时即失效。3 、酸性钼酸盐溶液 称取钼酸钠 104.6g ，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入 500ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一较大的试剂瓶中，加溴水 0.5ml ，摇匀，静置数小时。置于 1000ml 容量瓶中，缓慢加入 85% （ V/V ）H3PO4225ml ，边加边摇匀。再加入 25% （ V/V ）硫酸 150ml ，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入冰乙酸 75ml ，摇匀，加蒸馏水稀释至 1000ml ，贮存于

棕色瓶中。4 、 10％（ m/V ）钨酸钠溶液5 、 0.33mol/L硫酸溶液6 、动物血（家兔心脏取血）7 、分光光度计8 、血糖管9 、奥氏吸管10 、水浴锅11 、表面皿

【实验步骤】 1.无蛋白血滤液的制备 先在烧杯中加 0.8g左右的抗凝剂（草酸钾或草酸钠），从家兔心脏取血 10ml放入烧杯，振荡摇匀。用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血 1ml ，缓缓放入 20

ml锥形瓶中，加水 7ml ，摇匀，血液变成红色透明时加 10％钨酸钠 1ml ，摇匀，再加 0.33mol/L 硫酸，随加随摇，加完放置 5～ 15min ，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于 0.1ml

全血。2. 血糖的测定 取具 25ml刻度的血糖管 3只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液 2ml ，放入第一只血糖管中，于第二只

血糖管中加 2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml蒸馏水。然后各加 2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮 6min ，取出，在流水中迅速冷却，各加入 4ml 酸性钼酸盐溶液， 1min 后以蒸馏水稀释至 25ml ，混匀，倒入比色杯，用 722 型风光光度计于 420～ 440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。3.计算 按下式计算 100ml全血中所含的血糖质量（ m

g ）。m＝ A1×C0÷A0÷0.1×100

式中： m ： 100ml 血中所含的糖质量

C0 ：标准葡萄糖溶液浓度 A1 ：样品溶液吸光度 A0 ：标准溶液吸光度【注意事项】 1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸 管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出 1ml 血液所用的时间不应少于 1min 。2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血混合液中加入 10％硫酸 1～ 2滴，待变为暗棕色后

再滤。3. 血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实验结果可能偏高 20%～ 30% 。

【思考题】

1．移液管使用时应注意哪些问题 ?

2．全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质 ?

实验六 血清中总胆固醇的测定

【实验目的】 学习血清胆固醇的检测方法 。【实验原理】 胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用，产生紫红色物质，此物质对 550nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。 100ml 样品中胆固醇含量在 400mg 之内与吸光度呈良好线性关系。

【实验试剂与器材】1 、邻苯二甲醛试剂2 、 90% 醋酸3 、混合酸4 、标准胆固醇贮液（ 1mg/ml ）5 、标准胆固醇应用液（ 0.1mg/ml ）6 、人血清7 、试管8 、吸管9 、容量瓶10 、烧杯11 、电子分析天平12 、 722 型（或 7220 型）分光光度计

【实验步骤】1 、标准曲线的绘制 取清洁干燥试管 5 支，编号，按表加入试剂。加毕，混匀，静置 10min ，以 550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。

管号试剂 0 1 2 3 4

标准胆固醇应用液 /ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4

醋酸 /ml 0.4 0.3 0.2 0.1 0

邻苯二甲醛试剂 /ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2蒸馏水 /ml 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01混合酸 /ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0

100ml 样品中总胆固醇含量 /mg 0 100 200 300 400

A550nm

2 、样品的测定 取 2 支清洁干燥试管，编号后，按表加入试剂。

显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在 4~32℃时，颜色能稳定 2h 。 加毕，混匀，静置 10min ，于 550nm波长比色，以对照管校正零点，对照标准曲线即知 100ml 样品中总胆固醇含量（ mg ）。

管号试剂 对照 样品

醋酸 /ml 0.4 0.4

血清 /ml 0.01 0.01

邻苯二甲醛试剂 /ml 0 0.2

无水乙醇 /ml 0.2 0

混合酸 /ml 4.0 4.0

实验七 唾液淀粉酶活性的观察实验七 唾液淀粉酶活性的观察 【实验目的】

酶是化学本质为蛋白质的生物催化剂。其活性受到很多因素的影响，如温度、 pH值以及抑制剂激活剂等。通过本次的实验观察，同学们应该更加深刻的理解理论课上所讲的酶促反应动力学的内容。

【实验原理】

在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色。 淀粉在唾液淀粉酶的作用下水解：淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦芽糖及少量葡萄糖 遇 I2 分别呈现：蓝色→紫色→红色→不显色

由于在不同温度，不同 pH ，或者在有激活剂或抑制剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。【实验试剂与器材】1 、试剂 0.5% 淀粉溶液 0.3% NaCl 溶液 0.3% CuSO4 溶液 碘液 2 、仪器：恒温水浴锅

【实验步骤】1.  唾液淀粉酶的制备(1)  提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约 5mL ）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。(2)  稀释：将酶提取液用水定容至 100mL 。作为唾液淀粉酶的样品液。（由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是 50～ 300倍，甚至超过此范围。）2. 温度对酶活性的影响 取 3 支试管，编号后各加入淀粉溶液 2毫升。将第 l 、2号试管放入 37℃恒温水浴中保温，第 3号试管放入冰水

中冷却， 5 分钟后，向第 l号试管中加人煮沸 5 一 15 分钟的稀释唾液 l毫升；向第 2 、 3号试管加稀释唾液各 l

毫升。摇匀， 20 分钟后取出 3 支试管，各加碘溶液 2

滴，混匀，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。3. 抑制剂和激活剂对酶活性的影响 取 3 支试管，编号。向第 l 支试管中加入 l%氯化钠溶液 l毫升，向第 2 支试管中加入 0.1% 的硫酸铜溶液 l毫升，向第 3 支试管中加入蒸馏水 l毫升作对照。再向每支试管各加入 0.l% 淀粉溶液 3毫升和稀释的唾液 l毫升。摇匀各管内容物，一齐放入 37℃恒温水浴中保温， 10~15 分钟后取出。冷后，各滴入 2 一 3滴碘溶液，混匀。观察比较 3 支试管颜色的深浅。

【注意事项】 沸水浴中的试管在加入碘液之前一定要在自来水下冷却。这是因为淀粉与碘液生产的蓝色物质加热会变成无色，如果不冷却而直接加入碘液会使生成的蓝色物质变为无色，导致得出错误的实验结果。【思考题】1.  什么是酶的最适温度？有何实践意义？2.  什么是酶的最适 pH？它是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么意义？3.  酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？它们各有什么特点？

实验八 维生素实验八 维生素 CC 的定量测定的定量测定 【实验目的】 1. 学习维生素 C 定量测定法的原理和方法。 2. 进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能。【实验原理】 维生素 C 是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。抗坏血酸能还原染料 2 ， 6— 二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏

血酸。在酸性溶液中， 2 ， 6— 二氯酚靛酚呈红色，被还

原后变为无色。

因此，可用 2 ， 6— 二氯酚滴定样品中还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍多加一些染料，使墒定液呈谈红色，即为终点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所合的还原型抗坏血酸量成正比。

【实验试剂与器材】1． 2％草酸溶液：草酸 2g ，溶于 100m1蒸馏水。2． 1％草酸溶液：溶 1g草酸于 100 ml蒸馏水。3．标准抗坏血酸溶液。4． 1％ HCl 溶液。5． 0.1％ 2,6— 二氯酚靛酚溶液。

6. 松针、新鲜蔬菜 (辣椒、青菜、西红柿等 ) 、新鲜水果 (桔子、柑子、橙、柚等 ) 。7. 容量瓶8.锥形瓶9.微量滴定管10. 研钵11.漏斗

【实验步骤】1．不同样品用不同方法提取(1)松针：水洗净，用滤纸吸去表面水分。称取 0． 5g ，放入研钵中，加 1%HCl 溶液 5m1 一起研磨。放置片刻，将提取液转入 50 m1 容量瓶中。如此反复 2—3次。最后用 1％ ECt 溶液稀释到刻度并混匀，静置 10 分钟，过滤，滤液备用。 (2)新鲜蔬菜和水果类：水洗净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取 20． 0g ，加 2％草酸 100m1置组织搅碎机中打成浆状。称取浆状物 5． 0g ，倒入 50 m1

容量瓶中以 2％草酸溶液稀释至刻废。静置 10 分钟，过滤 (最初数m L 滤液弃去 ) 。滤液备用。

2．滴定(1)标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液 1． 0ml

(含 0． 1mg 抗坏血酸 )置 100 ml锥形瓶中，加 9ml1

%草酸，微量摘定管以 0． 1％ 2 ， 6— 二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持 15秒钟即为终点。由所用染科的体积计算出 1m1染料相当于多少 mg 抗坏血酸。(2) 样液滴定： 准确吸取滤液两份，每份 10． 0 m1 分别放人二个 l00 m1锥形瓶内，滴定方法同前。3．计算

V＝滴定时所用去染料ml数。 T=1ml染料能氧化抗坏血酸 mg数。W＝ 10 ml 样液相当于含样品之 g数。

【思考题】试述本实验介绍的 2 ， 6- 二氯酚靛酚滴定法的优缺点。

实验九 脂肪酸的实验九 脂肪酸的 β-β- 氧化氧化

【实验目的】（ 1 ）了解脂肪酸的 β- 氧化。（ 2 ）通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的 量，掌握测定 β- 氧化的方法及原理。【实验原理】 根据 β- 氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶 A 。两分子乙酰辅酶 A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成 β- 羟丁酸。乙酰乙酸、 β- 羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患

糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O

CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH

剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。NaIO+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O  

I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI

根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。

【实验试剂与器材】 1 、 0.5% （ m/V ）淀粉溶液 2 、 0.9% （ m/V ） NaCl 溶液3 、 0.5mol/L丁酸溶液 4 、 15%三氯乙酸溶液 5 、 10% 氢氧化钠溶液 6 、 10%盐酸溶液 7 、 0.1mol/L碘溶液8 、标准 0.01mol/L硫代硫酸钠溶液9 、 1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲液10 、恒温水浴11 、微量滴定装置12 、解剖用具13 、玻璃器皿

【实验步骤】 1 、肝糜制备（ 1 ）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用 0.9%NaC

l 溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。（ 2 ）称取肝组织 5g置研钵中，加少量 0.9%NaCl 溶

液，研磨成细浆。再加 0.9%NaCl 溶液至总体积 10ml ，得肝组织糜。

2 、酮体生成和沉淀蛋白质 取 50ml锥形瓶 2只，编号，并按下表操作。

试 剂 锥 形 瓶 编 号

1号（样品） 2号（对照）

V(1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲液 )/ml

3 3

V(0.5mol/L丁酸溶液 )/ml 2 -

V( 肝组织糜 )/ml 2 2

混匀，置于 43℃恒温水浴内保温 1.5h

V(15%三氯乙酸溶液 )/ml 3 3

V(0.5mol/L丁酸溶液 )/ml - 2

混匀，静置 15min ，过滤，滤液分别收集于 2 支试管中

混匀后立即用 0.01mol/L标准的硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘，滴至浅黄色时，记录滴定 A瓶与 B瓶溶液所用硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品中的丙酮含量。 4 、计算 肝脏的丙酮含量（ mmol/g ） = （ V 对照 -V 样品） ×CNa2S2O3÷6

式中： V 对照为滴定对照所消耗的标准 Na2S2O3 溶液的体积，以 ml 为单位； V 样品为滴定对样品消耗的标准 Na2S2O3 溶液的体积，以 ml 为单位； CNa2S2O3 为标准 Na2S2O3 溶液的浓度（ mol/L ）。

【注意事项】1 、用新鲜肝糜进行实验，确保肝内酶活力。2 、注意滴定终点的控制，保证实验的准确度。

【思考题】1 、为什么说脂肪酸 β- 氧化实验的关键是制备新鲜的肝糜 ?

2 、什么叫酮体 ? 为什么正常代谢时产生的酮体量很少 ?

实验十 琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶实验十 琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶

【实验目的】 学习和掌握琼脂糖凝胶电泳法分离乳酸脱氢酶同工酶的原理和方法。【实验原理】 能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同工酶。同工酶的蛋白结构既有差别，它们的理化性质也就有所差异，因此可用电泳或其他方法将它们分离开来。 本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱

氢酶 5 个同工酶（ LDH1 、 LDH2 、 LDH3 、 LDH4

和 LDH5 ）。【实验试剂与器材】1 、巴比妥— HCl缓冲液（ pH8.4 ， 0.1mol/L ）2 、 0.5mol/L 乳酸钠溶液3 、 0.001mol/L EDTA·Na2 溶液4 、 0.5% 琼脂糖凝胶5 、 0.8%~0.9% 琼脂糖染色胶6 、显色液7 、 2% 醋酸缓冲液8 、电泳用缓冲液（ pH8.6 ， 0.075mol/L ）9 、人血清

10 、水平台，水平仪11 、烘箱12 、电泳槽13 、电泳仪14 、微量注射器【实验步骤】1 、琼脂糖凝胶板的制备和电泳 将 0.5% 琼脂糖凝胶水浴加热溶化，取 2ml 溶化的凝胶液平浇于一洁净的载玻片上。凝胶凝固后，于此凝胶板一端 1/3处，用小刀开一狭长小槽，用滤纸片仔细吸去小槽内液体。 用微量注射器向小槽内加入新鲜血清 10~15μl ，将

凝胶板放在电泳槽内，两端各以浸有电泳用缓冲液的纱布作盐桥，点样端靠近阴极。电泳 40~60min ，电压约 1

00伏。2 、显色 约于电泳终止前 10min ，将 0.8%~0.9% 琼脂糖染色胶在水浴中溶化。取此溶化的凝胶 0.67ml 与显色液 0.

53ml 及 0.5mol/L 乳酸钠溶液 0.2ml混匀，立即浇在电泳完毕的凝胶板上， 37℃避光保温 1h ，即显示出五条深浅不等的蓝紫色区带。最靠近阳极端区带是 LDH1 ，依次为 LDH2 、 LDH3 和 LDH4 ， LDH5则移向阴极端。3 、固定与干燥 将显色后的凝胶板浸于 2% 醋酸溶液中， 2h 后取出，

用一干净滤纸覆盖凝胶板上， 50℃烘 1.5~2h ，烘干后，取去滤纸，背景即透明。 如需定量，可用光密度计测定各区带。

实验十一 酪蛋白的制备实验十一 酪蛋白的制备 【实验目的】1 、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。2 、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。【实验原理】 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/

L 。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为 4.7 。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的 pH调至 4.

7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

【实验试剂与器材】1 、新鲜牛奶2 、 95%乙醇 3 、无水乙醚 4 、 0.2mol/L pH4.7 醋酸——醋酸钠缓冲液 5 、乙醇——乙醚混合液：乙醇∶乙醚 =1 1∶ （ V/

V ）6 、离心机7 、抽滤装置8 、精密 pH试纸或酸度计9 、电炉10 、温度计

【实验步骤】 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至 40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、 pH4.7 的醋酸缓冲液 100mL ，用精密 pH试纸或酸

度计调 pH至 4.7 。 将上述悬浮液冷却至室温。离心 15 分钟（ 3000 r

/min ）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化 1. 用水洗涤沉淀 3次，离心 10 分钟（ 3 000r/min ），弃去上清液。

2. 在沉淀中加入 30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀

2次。最后用乙醚洗沉淀 2次，抽干。3. 将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。（三）准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白 g/100 mL牛乳

式中理论含量为 3.5g/100mL牛乳。【思考题】 1. 制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 2.试设计另一种提取酪蛋白的方法。

100%测得含量:得率理论含量

实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定

【实验目的】 掌握谷丙转氨酶的测定方法。【实验原理】 谷丙转氨酶作用于丙氨酸及 α-酮戊二酸，生成谷氨酸与丙酮酸。丙酮酸与 2.4- 二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。

丙酮酸二硝基苯腙

红棕色

2,4-二硝基苯肼

COOHCH2CH2C OCOOHCOOHCH2CH2CHNH2COOH

CH3CHNH2COOH

GPT

CH3C OCOOH

CH3C N NH

NO2

NO2

H2O OHH2N HN

NO2

NO2

COOH

【实验试剂与器材】1 、标准丙酮酸（现配） 2 、谷丙转氨酶底物 4℃， 1周 3 、 0.1M pH7.4 PB

4 、 0.02% 2,4- 二硝基苯肼溶液 5 、 0.4M NaOH

6 、新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）7 、剪刀 或 组织捣碎机 8 、 37℃水浴9 、 分光光度计（ 520nm ）10 、比色皿11 、计算纸（ 9 cm×9 cm ）

【实验步骤】1. 肝匀浆 处理： 20g 肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，再用预冷的 0.1M pH7.4 PB捣碎，并定容至 200ml ，供全班用。2. 谷丙转氨酶活力的测定1 ）取 4 支试管，标注名称，按照下表操作2 ）计算酶活力 本法规定：酶在 37 ℃ 与底物作用 30 分钟，产生2.5μg 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。3.计算1 ）每 ml 肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（ U/ml ）

试管

试剂(ml)

测定管

（A）

标准管

（S）

对照管

（B）

空白管

谷丙转氨酶底物 0.5 0.5 —— ——

37℃ 水浴5 分钟

肝匀浆 0.1 0.1（标准丙酮酸） 0.1 0.1（H2O）

混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟

2.4-二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5

谷丙转氨酶底物 —— —— 0.5 0.5

混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟

0.4M NaOH 各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm

A 520nm 0.000

2 ）每 g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（ U/g ） D’ = D × 200 / 20

说明： A ：样品 A 520nm

B ：对照 A 520nm

S ：标准 A 520nm

500 ：标准丙酮酸浓度 2.5 ：谷丙转氨酶换算单位系数 200 ： 200ml 肝匀浆 20 ： 20g 肝

S

200BA

5.2S

500BAD

【附注】1 、 2,4- 二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性意 的， α-酮戌二酸也能与 2,4- 二硝基苯肼作用而显 色。2 、 2,4- 二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白管颜 色较深。