第六节 药物的抗病毒实验

一、目的和要求1. 掌握药物体外抗病毒的实验方法和操作步

骤。2. 熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价。

二、内容（一）原理 病毒是一类结构简单、非细胞形态的专性细

胞内寄生的微生物，必须在易感的活的动物、鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用动物、鸡胚或细胞来进行病毒培养和药物的抗病毒试验。可通过观察细胞培养液酸碱度的变化、病毒致细胞病变效应（ CPE ）、病毒滴度（ PFU ）改变、病毒基因组 mRNA水平变化、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标的改变，来判断药物的抗病毒试验效果。

（二）材料1. 9~10 d 日龄鸡胚，壳白净且厚薄均匀的鸡

卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育过程中便于检查，为首选）

2. Hep-2 细胞或 MDCK 细胞3. 病毒：如 IFV （ FM1 株）、 RSV （ Long

株）4. 药物：试验药物，阳性对照药5. 动物：小鼠等（三）操作方法

鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，目前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。

1. 接种方法病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径，即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不同的病毒应选择各自适宜的接种途径，并根据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见表）。下面将以流感病毒为例进行说明。

一）鸡胚法

•

表 6-1     鸡胚孵育日龄及接种途径选择接种病毒名称 接种部位 鸡胚日龄 收获材料

痘类病毒、单纯疱疹病毒

绒毛尿囊膜 9-10 绒毛尿囊膜

流感病毒、腮腺炎病毒

尿囊腔 9-11 尿囊液

流感病毒初次分离 羊膜腔 12-14 羊水

某些嗜神经性病毒 卵黄囊 5-6 卵黄液

2. IFV-FM1 的 50% 鸡胚感染量（ EID50 ）测定

用生理盐水将病毒作 10 倍系列稀释，分别接种鸡胚， 0.1ml / 胚，同时设正常对照，共 6 组，每组 5 胚。 35℃ 孵育 72 h ，置 4

℃ 冰箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按Reed-Muench 法计算 FM1 的 EID50 。

3. 药物对鸡胚的毒性作用 选用健康的 9~11 日龄鸡胚，消毒备用。将

受试药和对照药作 10 倍系列稀释 5~6 个浓度，如 100mg/ml 、 10mg/ml 、 1mg/ml 、100μg/ml 、 10μg/ml ，每个浓度接种 5 胚，0.25ml / 胚。 35℃ 培养 5 d 后观察结果（死亡 / 存活）。确定两种药物对鸡胚的最大无毒剂量（ TC0 ），用于正式实验。

4. 药物对 FM1 的抑制作用 鸡胚随机分为 14 组，每组 5 胚，即试验

药的六个剂量组（从 TC0 开始作 10 倍系列稀释）、阳性对照药六个剂量组（同前）、生理盐水和病毒对照组。将不同浓度的药液注入鸡胚中， 0.25ml / 胚， 30 min 后经相同途径注入 100 EID50 病毒 0.1ml ，对照组以生理盐水代替。 35℃温箱孵育 5 d 。收获尿囊液，测其血凝效价，以能抑制 32倍以上所注射的最小药物量，即为其最小抑制剂量（ MIC ）。

4.1 鸡胚接种（ 1 ）孵育 9~10 d左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔

标出气室和胎位。（ 2 ）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规

以碘酒，酒精消毒。（ 3 ）用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。

（ 4 ）用 lml注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔刺入，沿胚胎的长轴刺入 0.5~1.0cm深度；此时针头已在尿囊腔中，注入 0.2ml 病毒悬液。

（ 5 ）拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔封闭，置于 35~36℃温箱内培养二天，每天翻动两次，用照蛋灯检视一次。培养二天后。置 -20℃ 冰箱 2 h 后，无菌操作收获尿囊液。

4.2 尿囊液的收获（ 1 ）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消

毒气室部位。（ 2 ）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分

的卵壳。（ 3 ）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取尿囊液（避免血管破裂），置于无菌试管中。

（ 4 ）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验（定性），判断病毒的增殖情况并对病毒进行鉴定；同时做无菌实验。

4.3 血凝和血凝抑制实验（ 1 ）血凝实验

血凝实验的具体操作方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。

[ 结果判断 ] 以“ +”号多少表示血凝程度： ++++ 100％的 RBC发生血凝，形成花边拉网状，红细

胞呈薄层均匀铺于板孔底，呈细沙状或薄膜状； +++ 75％的 RBC发生血凝，红细胞虽铺于孔底，呈细沙状，但边缘不整有下沉趋势；

++ 50％的 RBC发生血凝，红细胞在孔底呈一环状，四周有小凝集块；

+ 25％的 RBC发生血凝，红细胞在孔底沉聚呈小圆点，边缘不光滑，周围有小凝集块；

- 100％的 RBC沉积，红细胞于孔底呈一小圆点，边缘光滑整齐，无凝集现象。以使 50％的 RBC发生凝集的最高稀释倍数，为病毒的血凝效价。计算药物的 MIC 。

（ 2 ）病毒血凝抑制实验 根据血凝试验滴定的病毒血凝效价，以“ 2＋”的凝集者含有 1 个病毒血凝单位。如流感病毒的血凝效价为 1:160 ，即病毒液稀释至 1:160 时，每 0.25ml 中含 1 个血凝单位，若要将 0.25ml 病毒液配制成含 4 个血凝单位时，应稀释成 1: （ 160÷4 ），即 1:40 稀释。在做血凝抑制试验时用 4 个血凝单位。

将病毒液配成 4 个血凝单位。血凝抑制实验的方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。

主要根据细胞对病毒的敏感性选择适宜细胞株。人类病毒用人或猴的组织较敏感，因此，研究人的病毒性疾病常用人胚肾、人胚肺或人羊膜细胞。组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。本实验仅介绍对传代细胞的操作方法。

二）细胞培养法

1. 病毒 TCID50 滴定（ 1 ）原理 多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞

形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（ cytopathic effect ，CPE ），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断。 CPE 的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量，定义为病毒的 50％组织细胞感染指数（ 50％ tissue culture infectious dose ， TCID50 ）。在从事药物的抗病毒试验中，常用 100 TCID50 的病毒感染量进行。

测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做连续 10 倍系列稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的 CPE 不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般 48 h 即可； RSV 、 VSV 增殖也较快，因此 48~72 h也可以观察、染色、计算。

（ 2 ）实验材料细胞： MDCK 细胞或 Hep-2 细胞，或其它敏感细胞。病毒：流感病毒（ IFV ）或呼吸道合胞病毒（ RSV ）。试剂： DMEM 细胞培养基，新生小牛血清，胰蛋白酶或 VTP 消化液， PBS ，青霉素 100U/ml 、链霉素 100 U/ml ， MTT (4,5-二甲基噻唑 -2,5-二苯基四唑溴化物 ) ，结晶紫染液等。材料：细胞培养板（ 1块 / 组）， tip头（ 2盒 /排），微量移液器， 5ml 或 10ml吸管（ 2支/ 组），青霉素瓶带塞（ 10 个 / 组），酒精缸，镊子（ 2 个 / 组）， 1ml注射器，毛细吸管等。

（ 3 ）操作步骤1 ）制备细胞①将细胞生长面朝上，轻轻倒掉瓶中培养液，

用 PBS 小心洗涤 2 次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。②用上述吸管吸取 1ml VTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约 3～ 5min 。当细胞胞质回缩、细胞间隙增大呈拉网状后，即可停止消化，尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止。

③加入适量营养液到细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞充分使细胞均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。吸一滴细胞悬液于 Ep管中。④计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与

等量 0.04％台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。当细胞密度为 106/ml 时即可。

一瓶细胞消化后加入适量营养液制成所需细胞悬液，浓度约为 1×106/ml 。用微量移液器将细胞悬液加入 40孔板微孔中，每孔 100μl ， 37℃ 、5%CO2 孵育箱培养 24 h ，形成单层后，做病毒滴定用。

2 ） 50% 组织细胞感染量（ TCID50 ）测定①稀释病毒液：取无菌青霉素瓶 9支，各管

分别加 3% 小牛血清的维持液 2.7ml ，然后向第一管加 IFV 病毒液 0.3ml ，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液 0.3ml加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液0.3ml加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续 10 倍稀释，使病毒稀释为 10-1 ， 10-2 ， 10-3 … 10-9 。

②病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的 IFV 病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加 2孔，每孔 100μl 。细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。置 37℃ 、 5%CO2 孵育箱中孵育。③结果观察：于孵育后 18 、 24 、 36 、 48 、 72h

在倒置显微镜下观察 CPE ，病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落等现象。“ -” 表示细胞正常；“ +” 表示有 25% 细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；“ 2+” 有 50% 细胞产生病变；“ 3+” 有 75%细胞产生病变；“ 4+” 有 75% 以上细胞产生病变（实验时，有的观察 24h~48 h 即可染色计算；或逐日观察 CPE ，直至病毒产生的 CPE 不再进展为止）。

3 ）按 Reed-Muench 法计算 TCID50 ，参见下表：

10-3 8/8 10 0 10/10 100

10-4 2/8 2 6 2/8 25

10-5 0/8 0 14 0/14 0

10-6 0/8 0 22 0/22 0

10-7 0/8 0 30 0/30 0

10-8 0/8 0 38 0/38 0

累积数（孔） 病变细胞孔病毒稀释度

病变孔数 / 接种孔

数 有病变↑ 无病变↓ 比例 百分比 %

按表中可见， 10-3 稀释的病变高于 50%； 10-4 稀释的病变低于 50%； 50% 病变分布于 10-3与 10-4 之间，计算公式如下：

高于 50% 病变率 - （ 50% ） 距离比例 = - 高于 50% 的病变率 -低于 50% 的病变率

× lg 稀释倍数 100-50 = - 100-25 × lg10= -0.67

lg TCID50 =高于 50% 病变的低稀释度对数 +距离比 = -3+(-0.67)=-3.67

即 1 个 TCID50=10-3.67 ，查 0.67 的反对数为 4.68 ，即病毒做 4.68×103 倍稀释时取 0.1ml 接种细胞，可使 50% 细胞产生病变。

附录：如何计算 200 个 TCID50？

4.68×103÷200=23.4 ，将病毒作 23.4 倍稀释时即得 200 个 TCID50 。

按计算结果，用 100 个 TCID50 病毒进行药物的体外抗病毒试验。

2. 病毒增殖及病毒感染单位量测定2.1 病毒增殖 将冻存的病毒株复苏后接种于敏感细

胞进行增殖， 2~3 d 后出现典型细胞病变，待病变达 80~90％时收获病毒。反复冻融3 次并低速离心取上清，分装后用空斑形成单位实验（ plaque forming unit, PFU ）测定病毒的感染量，保存于 -80℃ 备用。在进行药物的抗病毒试验中，亦可用该实验测定药物对病毒增殖的影响，而且结果可能更准确、可靠。

2.2 病毒感染单位量测定用 PFU 表示。

以 5.0×105 /ml 的密度接种敏感细胞于 6孔细胞板中。置 37℃ 、 5％ CO2 细胞培养箱中培养，使其 24 h 内长成单层；

在冰盘上操作，用维持液将病毒作 10 倍连续系列稀释（ 10-1～ 10-8 ）（操作如下图所示）；

注：即在一系列 2ml 的 Ep 管中先加入 1.8ml 维持液，取 0.2ml  病毒加入第一只 Ep 管中，充分混匀后病毒稀释度为 10-1 ，取混合后的 0.2ml  病毒悬液加入第二只 Ep 管中作为稀释度 10-2 ，依此类推作系列稀释，则得到连续 10 倍稀释的病毒悬液。

弃去细胞培养板中各孔中的营养液，每孔接种相应稀释度的病毒悬液 0.5ml ，每个稀释度重复 3孔。 37℃吸附 2 h ，每 15min摇动数下以保证病毒吸附分布均匀；

弃去各孔中的病毒液， PBS轻轻洗涤一次。每孔加入 2ml覆盖层（含 6％新生牛血清的 DMEM与 1.5％琼脂糖等体积混匀，配好后立即使用，以免凝固），水平放置 15min使其凝固；

33℃ ， 5％ CO2 细胞培养箱中培养 3 d 。剔除覆盖层，每孔加入 1ml 0.5％结晶紫染色 10min ，自来水冲洗后选择空斑数清晰且易于分辨的稀释度计数空斑，根据空斑数计算病毒的 PFU 。下图显示的是 RSV的空斑形成实验结果。

PFU 的计算方法： a·b PFU＝ v（ PFU ：空斑形成形成单位 /ml； a ：空斑

均数； b ：病毒稀释度的倒数； v ：病毒量 /ml ）

 1 ：正常对照； 2 ～ 6 ：病毒稀释度分别为  10 － 4 ， 10 － 5 ， 10 － 6 ， 10 － 7 ， 10 －

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   病毒的空斑形成实验结果示意图

 3             2            1

6 5 4

2. 药物对细胞的毒性测定 已长成单层的细胞（ 96孔板），倾去

培养液，用 PBS洗涤 2 次，加入用无血清1640 作连续 10 倍系列稀释的受试药物， 100µl/孔，每个浓度重复 4孔，并设正常细胞对照。整个实验重复 3 次。 37℃ 、 5%CO2 孵箱中培养 3 d ，观察细胞病变效应（ CPE ），按 Reed-Muench 法计算药物的半数中毒浓度（ TD50 ）和最大无毒浓度（ TD0 ）。阳性对照药的毒性测定，与受试药物同法同步在同一板中进行。

4. 药物的抗病毒实验4.1 微量细胞病变抑制法 已长成单层的细胞（ 96孔板），倾去培养液，用

PBS洗 2 次，加入 100 TCID50 病毒， 100µl/孔，37 5%CO℃ 2 下吸附 2h ，使病毒进入细胞内。弃病毒液，用 DMEM 液洗 2 次，洗去游离病毒。加入受试药的 TD0 浓度作连续 2 倍系列稀释的 6 个浓度，每个浓度均重复 3孔，并分别设立细胞对照、病毒对照和空白对照孔，阳性对照药同上。37℃ 、 5%CO2 下培养 3 d ，记录 CPE ，按 Reed-Muench 法计算能抑制 50%CPE 产生的药物有效浓度（ EC50 ）。整个实验重复 3 次。

4.2 中性红染色法 基本步骤同上，加入药物培养 3 d 后待 CPE 不再

进展时，弃维持液，用 PBS洗 2 次，每孔加入 0.2ml 中性红染液（ 0.04% ），避光， 37℃ 、 5%CO2 孵育 1.5 h 。弃染色液，用 PBS洗 2 次，控干，每孔加入 0.2ml 的 90%乙醇（无水乙醇： 0.2M ， pH4.2枸橼酸缓冲液 =9 ： 1 ），室温放置2~3 h ，摇匀，以空白对照孔调零，在酶标仪 546nm处比色，测定其吸光度 A值。根据各组的平均 A值，计算药物的抑制百分率，再按 Reed-Muench 法计算 50%抑制浓度（ IC50 ）等各项结果。整个实验重复 3 次。

• 实验组平均 A 值 - 病毒对照组平均 A 值• 抑制百分率 = 细胞对照组平均 A 值 - 病毒对照组平均 A 值 ×100%

4.3 MTT 法 基本步骤同上，当病毒对照组细胞 CPE 在 (+ +

+)～ (+ + + +) 时弃培养液上清，每孔加入含 5g·L MTT 的培养液 50μl ，继续培养 2~3 h 后弃去MTT上清，每孔加 DMSO 100μl ，混匀 5min 后，用酶标仪测 570nm波长处的吸光度 A值。按下述公式计算药物对病毒的抑制率：

• 病毒抑制率 (%)=( 药物处理组 A 均值 - 病毒对照组 A 均值 )/( 细胞对照组 A 均值 - 病毒对照组 A 均值 ) × 100% ，结合细胞毒性实验的结果，用统计软件 SPSS13.0 的 Probit回归法，或按 Reed-Muench 法，计算受试药的半数中毒浓度 TD50 和半数有效浓度 EC50 ，并计算药物的治疗指数（ TI ）。

4.4 空斑抑制法 参照上述方法进行（略），与病毒对照组比较，计算药物

的 50%抑制浓度 IC50 。4.4 药物对 RSV侵入细胞的阻断作用 根据药物毒性实验的结果，从药物的最大无毒浓度开始，

将不同浓度受试药 100μl预先处理细胞 2 h, 以 PBS洗涤2 次后用 100 TCID50 的病毒每孔 100μl攻击 ,吸附 2 h ，每隔 15min摇晃 1 次，使病毒均匀吸附。弃病毒液 ,加 100μl 细胞维持液，置 37℃ 、 5%CO2 培养，每日观察并记录 CPE 。实验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药物组。当病毒对照组 CPE 在 75%~100% 时弃培养液上清，每孔加入含 5g·L MTT 的培养液 50μl ，继续培养2～ 3h 后弃去MTT上清，每孔加 100μl DMSO ，混匀 5min 后，用酶标仪测 490nm波长处的 A值。按 Reed-Muench 法计算药物的半数中毒浓度 TD50 和半数有效浓度 EC50 。

4.5 药物对 RSV 的直接杀伤作用 根据药物毒性实验的结果，从药物的最大无毒浓度

开始，将不同浓度的含药维持液与 100μl 的 100 TCID50 病毒等体积混合， 37℃ 、 5% CO2条件下作用 2 h 后，再将其感染 Hep-2 细胞， 100μl/孔，吸附 2 h 后用 PBS洗涤 2 次，每日观察并记录细胞病变效应（ CPE ）。实验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药物组。当病毒对照组细胞 CPE 在 75%~100% 时弃培养液上清，每孔加入含 5g·L MTT 的培养液 50μl ，继续培养 2~3h 后弃去MTT上清，每孔加 DMSO100μl ，混匀 5min 后，用酶标仪测 490 nm波长处的 A值。按 Reed-Muench 法计算药物的半数中毒浓度 TD50 和半数有效浓度 EC50 。

5. 治疗指数（ TI ） 按 TI= TD50/EC50 或 TD50/IC50 进行计算。药理学实验规定， TI 4﹥ 表示药物有效。

三）体内抗病毒试验1. 实验动物的选择 试验动物在病毒学研究中的用途主要有：分离与

鉴定病毒、制备疫苗及诊断抗原、制备免疫血清、研究病毒的致病性、免疫性、发病机理及有效药物疗法等。病毒接种于何种动物以及选择何种接种途径，主要取决于病毒的种类和实验研究的目的。应根据实验需要选择最敏感动物作为实验对象，常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接种时要根据病毒对动物及组织细胞的亲嗜性而选择特定的部位，常用接种途径有鼻腔、腹腔、脑内、皮下、肌肉、静脉及小鼠经口接种、家兔角膜注射等。给药方式亦可有腹腔、灌胃、静脉注射、肌肉注射、吸入等。

采集全血、血浆、血清、组织脏器或细胞等标本，进行相应指标的检测。为减少个体差异，一般试验选择成年动物，动物体重尽可能一致；如无特殊要求，实验动物的性别应先选雄性动物或雌雄各半，且动物要健康，雌性动物怀孕及授哺期不宜采用。此外，根据实验研究不同的精确程度要求，选择标准化试验动物。标准化试验动物是指按遗传控制方法和微生物控制标准培育而成的动物。按遗传学控制原理可分为近交系、远交系、突变系、杂交一代等，按微生物学控制原理可分为无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物、清洁动物等。病毒接种完成后，按一定级别的动物饲养标准饲养，对照组与实验组分笼饲养。

2. 病毒接种方法2.1 鼻腔接种法 实验组小鼠先用乙醚浅麻后，将小鼠头部仰起，向鼻腔内缓慢滴入一定感染量的病毒悬液 100μl左右，正常对照组鼻腔滴入等量不含病毒的 PBS 或生理盐水，要掌握麻醉的深浅度。麻醉太深，小鼠能将病毒悬液直接吸入肺中，引起肺水肿，往往于接种后 1d 内死亡；麻醉太浅，小鼠又试图将接种物咳出。

2.2 小白鼠腹腔接种（ 1 ）用无菌注射器以无菌操作法吸取病毒悬液，排除气泡（将注射器针头朝上，使气泡上升，在针头上裹以消毒棉球，然后轻轻将气泡推出）。

（ 2 ）右手轻拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙面上，迅速以左手拇指和食指抓紧小白鼠耳颈部皮肤，以无名指及小指将尾巴按在手掌上，使其腹部向上，用碘酒消毒腹部皮肤。

（ 3 ）使小白鼠头部略向下垂，右手持已吸好病毒液的注射器，由腹股沟皮下刺穿皮肤，再沿腹壁下部刺入，抽吸注射器，如无回血或尿液，即可进行注射。注入病毒液 0.5ml 后将针头退出，用酒精棉球消毒针刺部位。

（ 4 ）将小白鼠标记后放回鼠笼，观察结果。

2.3 皮内接种法 应选择白色动物或动物的白毛处（以背部皮肤为

宜）。去毛消毒后，将皮肤绷紧，用 1ml 的注射器附以最小号的针头，平刺入皮肤，针尖向上，缓缓注入接种物，此时皮肤应出现小圆丘形隆起，否则表示不在皮内。

2.4 皮下接种法 多选择腹股沟、腹壁中线或背部注射。局部去毛

消毒后，用手拇指和食指将局部皮肤提起，右手将注射针头刺入提起的皮肤下，将接种物缓缓注入，些时可见注射处皮肤有轻度隆起，迅速拔出针头，并以酒精棉球按压片刻，防止注射物外溢。

2.5 肌肉接种法 多选择腿部肌肉注射。一人抓住实验动物，局部去毛消毒后，另一人将针头刺入肌肉层内，缓缓将接种物注入。

2.6 静脉接种法 不同动物选择不同部位静脉注射。一般家兔选择耳静脉，大白鼠、小白鼠选择尾静脉。注射时先将动物固定，然后用手指轻弹或以酒精反复涂擦静脉所在部位，使静脉隆起，以小号针头刺入血管，缓缓推入注射物。在注入时，可见血管颜色变白，如果局部发现有隆起或注射物不易注入时，则表示针头未进入血管，应重新注射。

2.7 小白鼠脑内接种法 本法适用于一切脑炎病毒的分离培养之用。用 1

ml注射器抽取病毒悬液 0.1 ml ，去除注射器内的气泡。取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的体部。右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颞部皮毛（不碰到眼）。右手拿注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向进入颅腔，进针 2~3mm ，不要插得太深，注射量为 0.02~0.03 ml 。注射完毕，碘酒消毒注射局部，将小鼠放回笼中，室温隔离饲养。逐日观察动物发病情况，动物一般在 3~4 d 开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、痉挛，慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。