题目：姜辛夏冲剂对哮喘大鼠题目：姜辛夏冲剂对哮喘大鼠 免疫功能调节的研究 免疫功能调节的研究

课题负责人：张玉英

汇报内容：汇报内容：

• 研究目的、内容• 课题完成时间• 具体执行情况• 经费使用情况

一、研究目的、意义及内容一、研究目的、意义及内容目的 :该课题是在临床观察有效基础上，在进行实

验研究已证实该方具有减轻气道炎症，降低气道高反应性，松弛支气管平滑肌痉挛的作用的前提下，通过观察姜辛夏冲剂对哮喘大鼠免疫功能调节作用的影响，进一步探明其作用机理，为研究治疗哮喘的中药新药提供理论和实验依据。

研究内容：主要研究姜辛夏冲剂对卵蛋白致敏哮喘SD 大鼠血清及肺泡灌洗液（ BALF ）中白介素（ IL ） -4 、 IL-5 、 IL-12 、 γ- 干扰素（ IFN-γ ）含量及总 IgE 含量的影响，从免疫调节角度探讨其作用机理，为该方的临床应用提供理论和实验依据。

二、课题时间： 二、课题时间： • 1. 完成周期： 2006.01 ～ 2007.12

• 2. 计划完成时间： 2006.01 ～ 2006.07• 2006.01 ～ 2006.03 预定实验动物，相关试

剂及药物等，检验试剂等是否合格。• 2006.04 ～ 2006.06 做必要的技术及预实验

准备，检验是否到位。• 2006.07 ～ 2006.09 做预实验，考查造模方

法、给药途径等是否合理。预实验提前到五月至六月份进行 ) ，现已结束

三、执行情况：三、执行情况：• 第一阶段：• 调研：（主要是试剂：百日咳杆菌、试剂

盒。造模方法、具体操作及标本采集等均做了反复调研。调研方式主要采用：网络、电话、近处直接到现场了解。）

第二阶段：第二阶段：

• 分析调研材料，确定有关实验方法、模型制作、试剂、对照药物等做必要的预实验准备：

• 在近阶段（ 2006.04-2006.6.30 ），通过对本实验的造模方法、造模试剂、检测指标等进行调研结果如下：

• 造模、试剂：通过查阅文献及研究总结以前造模方法发现采用四肢、双侧腹股沟各皮下注射 0.1ml 抗原液及腹腔注射0.2ml 抗原液进行模型制备效果优于其他方法。致敏试剂用百白破杆菌疫苗

• 酶联免疫吸附法：经多方面调查进行研究采用双抗夹心酶联免疫吸附法测定细胞因子，方法易操作且结果准确，能更好的反映指标

• 试剂盒：决定订购武汉博士德生物科技有限公司 IL-4 的 ELISA 试剂盒，上海西唐生物科技有限公司的 IL-5 、 IL-12 、 IFN-γ 的 ELISA 试剂盒，大连泛邦化工技术开发有限公司 IgE 的 ELISA 试剂盒。（以上试剂盒质量较可靠，相比其他公司价廉）

• 标本采集：①血清②肺泡灌洗液

第三阶段：进行预实验：第三阶段：进行预实验：1. 实验动物及分组：清洁级健康雄性 SD 大

鼠 40只，体重 200±20g （由西安交通大学动物实验中心提供）适应性饲养 1 周，按体重随机分成 4组，每组 10只。

• （ 1 ）正常对照组（简称 A组）• （ 2 ）哮喘模型组（简称 B组）• （ 3 ）必可酮气雾剂治疗组（简称 C组）• （ 4 ）姜辛夏冲剂治疗组（简称 D组）

22．实验药物及主要试剂．实验药物及主要试剂

2.1 药物 • （ 1 ）姜辛夏冲剂（由陕中附院制剂室制

备，每包含生药 8g ）• （ 2 ）必可酮气雾剂（ Becotide ）每掀含丙酸倍氯米松 50μg （重庆葛兰素制药有限公司产品）

2.2 主要试剂• （ 1 ）卵蛋白（ OVA ）和氢氧化铝（均选购美国

Sigma公司产品）• （ 2 ）百白破杆菌疫苗（由咸阳市防疫站提供）2.3 试剂盒 • （ 1 ） IL-4 试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司提供）

• （ 2 ） IFN-γ 、 IL-5 、 IL-12 试剂盒（上海西唐生物科技有限公司提供）

• （ 3 ） IgE 试剂盒（由大连泛邦化工技术开发有限公司提供）

3 .3 . 主要仪器主要仪器 • （ 1 ） JWC-2医用超声雾化器（辽宁省鞍山无线电一厂出品）

• （ 2 ） TDL-16c台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）

• （ 3 ） 3550 型酶联免疫检测仪（美国 BIO-RAD产品）

4 .4 . 大鼠模型制作及给药方法大鼠模型制作及给药方法4.1 模型复制 : （参考迟磊等报道的造模方法）模

型组与各治疗组分别于第 1天、第 8天，每鼠两腹股沟、前足跖共 4点分别皮下注射抗原液（含OVA100mg 、百白破杆菌疫苗约 0.5ml 和氢氧化铝干粉 100mg 制成的混悬液） 0.2ml同时腹腔注射 0.2ml 抗原液致敏；正常对照组以等量生理盐水代替致敏。第 15天，每晚 8-9 时给予超声雾化吸入 2%OVA 20min激发哮喘；正常对照组用等量生理盐水以同样方法雾化。观察大鼠反应，若出现呼吸急促、喘息、双肺闻及哮鸣音、躁动、甚则出现口唇、双眼、耳紫绀等改变即为造模成功。

4.2 4.2 给药给药 实验第 15天开始激发后给药， 1次 / 日，全

过程共历时 28天。（剂量依据文献折算） • （ 1 ） A组：每鼠以蒸馏水 3ml 灌胃；• （ 2 ） B组：每鼠以蒸馏水 3ml 灌胃。• （ 3 ） C组：每鼠雾化吸入必可酮气雾剂 1掀；

• （ 4 ） D组：每鼠以姜辛夏冲剂 4.6g/200g用蒸馏水溶化为 3ml 灌胃；

5 .5 . 标本采集与检测标本采集与检测• 5.1 标本采集 :• （ 1 ）于末次激发后 24h将大鼠行摘眼球取血凝固后分离，

在 4℃条件下， 3000r/min离心 10min,取上清液 -20℃保存备用。

• （ 2 ）取血后，将大鼠脱颈处死，剪开颈部皮肤，顿性分离，暴露气管，在右主支气管上剪一小口，将圆头 7号针头进针 0.5 ～ 1.0cm, 以“ 0”号手术线结扎固定，缓慢注入生理盐水（ 37℃） 3ml,按摩肺脏 30s后抽出，重复 3次，每例收集肺泡灌洗液 6 ～ 7ml （回收率＞ 85% ），将肺泡灌洗液（ BALF ）注入离心管中， 3000r/min离心15min ，取上清液 4ml 分装， -30℃保存备用。

• （ 3 ）随后取肺组织植于甲醛中固定制成石蜡切片，以观察肺组织病理变化。

• 5.2 指标检测 • （ 1 ）一般情况：观察实验过程中各组大

鼠的呼吸频率、精神、饮食、活动、排便、毛发等变化情况。

• （ 2 ）血清及 BALF 中 IFN-γ 、 IL-4 、 IL-5 、 IL-12 、总 IgE 含量的测定：采用双抗夹心酶联免疫吸附法测定。（具体步骤严格按照试剂盒说明进行操作）

四、经费使用情况：四、经费使用情况：支出内容 金额（万元）

调研有关实验方法、试剂及试剂盒等

0.05

联系合作单位指标检测仪器设备（酶标仪、离心机等）

0.05

购买预实验所用试剂及对照药 0.05

购买预实验动物 40只及造模试剂 0.20

购买试剂盒 0.90

购买雾化器 0.04

进行预实验 0.00

合计 1.29

谢 谢