第十三章

细 胞 凋 亡 检 测

细胞凋亡的几种检测方法

形态学观察：普通光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜

磷脂酰丝氨酸外翻分析（ Annexin V法）

线粒体膜势能的检测

DNA片断化检测：大分子染色体 DNA片段、 DNA Ladder

脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （ terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated

nick end labeling, TUNEL ）

半胱氨酸蛋白酶 Caspase家族活性的检测

细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体。

形态学观察

光学显微镜和倒置显微镜：体积缩小、核深染、核碎裂、

凋亡小体形成、无炎症反应

荧光显微镜和激光共聚焦显微镜： DNA特异性染料

（ Hoechest 33342/33258, DAPI）

透射电子显微镜：超微结构是诊断凋亡的最可靠指标

电镜下：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。

Annexin V 法 磷脂酰丝氨酸（ Phosphatidylserine ， PS ）：细胞凋亡早期从内侧翻转到细胞膜表面

Annexin V: 钙依赖性的磷脂结合蛋白，与 PS可高亲和力特异性结合 . 由于 PS外膜化比凋亡引起的核酸变化更早，所以该试剂盒比 DNA检测法能更早期检测细胞凋亡

Annexin V 与 PI 联合

碘化丙啶 (propidine iodide, PI) 是一种核酸

染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的

细胞， PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将

Annexin-V 与 PI 匹配使用，可检测早晚期的凋亡细胞。

已开发出多种荧光标记的试剂盒

流式细胞仪分析

荧光显微镜结果

DNA 片 断 化 检 测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩 , 染色质 DNA 在核小体单位之间的连接处断裂 , 形成 50~300kb长的 DNA 大片段 , 或 180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段 , 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱 (DNA ladder) 。

(1) 本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。(2) 不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。

TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记技术 (TUNEL)

细胞凋亡中 , 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大

量的粘性 3’-OH 末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶

（ TdT ）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化

物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA 的

3’- 末端，从而可进行凋亡细胞的检测

是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单

个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应

细胞凋亡典型的生物化学和形态特征

Caspase 活性的检测 在正常状态下， Caspase 家族都以无活性的酶原 (30 ～

50kD) 形式表达，当细胞发生凋亡时 Caspase 可以被蛋白酶

裂解，大亚基和小亚基形成活化的 Caspase 。一些Caspase

活化后可以次序激活其他 Caspase 形成 Caspase 级联反应，

促发细胞凋亡。在目前已知的 14 种 Caspase 中， Caspase-

3 、 Caspase-8 和 Caspase-9 与凋亡的关系最为密切，在细

胞凋亡中起执行凋亡的作用。

相关基因表达的检测

细胞凋亡时许多基因表达异常，检测这些凋亡相关调

控基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的常用方法

Fas ； c-myc ； Bcl-2 和 bcl-X 表达水平比例

方法： Northern杂交、 PCR 、 Western Blot、免疫组化

Amplifluor™ Apoptosis Gene Systems ：

检测 fas, bax-alpha 和 bcl-X ( 长的 ) 基因的 mRNA 表

达水平

流式细胞仪对细胞凋亡的分析

线粒体功能 Annexin V Assay

Caspases

DNA Fragmentation Assays

DNA Cycle

优缺点：速度快、定量、收集大量数据 、 多参

数测

量；分选；从细胞整体上测量，不能定位

凋亡检测方法的选择

每种检测方法均有其优缺点，应对其原理有所了解

根据自己的研究目的、样本种类选择合适的方法

一般选择两种以上不同检测方法

针对不同检测方法已开发出多种商业试剂盒，简

化

了实验步骤和操作程序