临床免疫学检验 (clinical immunological test)

范畴 (category) ：1 、感染性疾病 (infection disease)2 、自身免疫性疾病 (autoimmune ～ )3 、超敏反应性疾病 (hypersensitivity ～

)4 、免疫缺陷 / 增殖性疾病(immunoabnormal ～ deficiency/proliferatio

n)5 、肿瘤 (tumour)6 、移植 (transplantation)

手段 (measure) 与目的 (objective) ：

应用免疫学的理论 (theory) 与技术(technique) ，研究疾病的病因 ( 致病 )(pathogenesis) 、发生 (occur) 、发展(develop) 和转归 (turn) ，并对疾病进行诊断 (diagnosis) 、疗效监测 (curative effect monitor) 和预防 (prevent) 。

内容 (content) ： 1 、体液免疫检测 (humoral ～ ) 2 、细胞免疫检测 (cellular ～ ) 3 、相关临床疾病的免疫检测 感染性疾病 自身免疫性疾病 超敏反应性疾病 免疫缺陷 / 增殖、肿瘤与移植

一、体液免疫检测 ( ～ test)（一）血清免疫球蛋白检测 (human serum immunoglobulin

～ )（二）血清补体检测 (human serum complement ～ )（三）体液免疫相关其他检测 (others ～ )

（一）血清免疫球蛋白检测

免疫球蛋白（ Immunoglobulins, Ig ）是具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。 可分为分泌型和膜型两种，前者主要存在于血清等体液中，如 Ab ；后者称膜型免疫球蛋白（ membrane Ig ， mIg ），是 B 细胞膜上的抗原受体 (receptor) 。

抗体（ antibodies, Ab ）是 B 细胞识别

抗原后增殖分化为浆细胞所产生的，能与相应抗原特异性 (specific) 结合(recognize antigen and binding) 并发挥免疫功能 (antigen and antibody reaction) 的球蛋白。

所有抗体都是免疫球蛋白， 但免疫球蛋白不都是抗体。

临床检测的血清免疫球蛋白 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 IgD IgE

重链 1 2 3 4 1 2 主要存在形式 单体 单体 单体 单体 五聚体 单体、双体 单体 单体

经典途径活化补体 ++ + +++ +++ 穿过胎盘 +++ + ++ 结合吞噬细胞 +++ +++ + + +

结合肥大细胞和嗜碱粒细胞

+++

与 SPA结合 + + + NK 细胞介导的ADCC

++ ++

免疫作用 抗感染、自身抗体 早期防御作用

粘膜局部 免疫

B细胞成熟标志

I型超敏反应

健康人血清主要 Ig 含量 (content) （ g/L ）

年 龄 IgG IgM IgA新生儿 6.6 ～ 17.5 0.01 ～ 0.06 0.06 ～ 0.216 个月 2.6 ～ 6.9 0.08 ～ 0.57 0.26 ～ 1.001 岁 3.0 ～ 9.5 0.14 ～ 0.91 0.37 ～ 1.502 岁 4.7 ～ 12.3 0.21 ～ 1.45 0.41 ～ 1.758 岁 6.3 ～ 15.0 0.46 ～ 2.51 0.47 ～ 2.2012 岁 7.0 ～ 15.5 0.58 ～ 2.91 0.49 ～ 2.4018 岁 7.3 ～ 15.5 0.70 ～ 3.21 0.51 ～ 2.61成人 7.0 ～ 16.0 0.70 ～ 3.00 0.40 ～ 2.80

检测手段 (method) ：

(PrecipitationReaction)

(In fluid phase)

(In agar)

（ ring 、 immune-turbidity 、 et al ）

（ diffusion ）

（ electrophoresis ）

(In fluid phase )絮状沉淀试验：

Ag

Ab

环状沉淀试验

透射免疫比浊： （ turbidimetry ）

在直射角度上测定光的透射强度，以吸收光单位（ A ）表示， A 值与复合物量呈正比。

散射免疫比浊（终点散射 / 速率散射）： （ nephelometry ） 在光路的 5°-95° 角的方向上测量散射光强度和被测溶液中微粒浓度关系的一种方法。 散射光：一定波长的光线沿水平轴通过复合物的混合液时导致光散射，散射光的强度与复合物量呈正比。 测定抗原抗体反应达平衡时～ ，终点（ end ） 测定单位时间内抗原抗体形成最大量时～，速 率（ rate ）

临床意义（ significance ）：1. 血清多克隆 Ig 水平增高 患者血清中各型 Ig均升高，常见于各种感染特别是慢性 (chronic) 细菌感染，如肺

结核、慢性支气管炎、慢性肝病自身免疫性(autoimmune) 疾病。 SLE患者以 IgG 、 I

gA升高较多见，类风湿性关节炎—— IgM 增高为主。

多克隆抗体 (polyclonal antibody): 由不同的 B 细胞克隆产生的抗体 .

单克隆抗体 (monoclonal antibody): 由一个细胞克隆所产生的只识别单一 抗原决定簇的纯的抗体 .

2. 血清单克隆 Ig 水平增高 患者血清中出现异常增多的单克隆蛋白（ monoclonal protein ， MP（即M 蛋白））

达30g/L 以上，而正常 Ig包括与 MP同类 Ig 的含

量则显著降低。此类异常增多 Ig多无免疫活性 ,主要见于免疫增殖性 (immunoproliferative)疾病，如多发性骨髓瘤 (multiple myeloma,MM), 原发性巨球蛋白血症 (primary macro-globulinemia) 、重链 (heavy chain) 病、轻链 (light chain) 病等。

新生儿、婴幼儿由于体液免疫功能尚不成 熟，免疫球蛋白的含量较成人低，需按年 龄组进行分析与判断。关于血清 IgE和 IgD的测定： 血清总 IgE为 0.13 ～ 0.92mg/L; 血清总 IgD为 0.6 ～ 2.0mg/L; IgE值升高多见于超敏反应性疾病 ,骨髓瘤 IgD值升高多见于骨髓瘤等。

异常免疫球蛋白检测：M 蛋白 / （ Monoclonal immunoglobulin

s ） 由一种单克隆 B淋巴细胞异常增殖时产生的 具有相同结构和电场移动率的 Ig 分子或分子片段，一般不具有抗体活性 ,又称副蛋白（ paraprotein ）。

冷球蛋白（ cryoglobulin ） 指血清中一种蛋白， 4℃不溶解， 30℃易于 凝聚， 37℃便溶解。存在于多种疾病，参 与炎症或免疫复合物引起的疾病。

M 蛋白的检测（免疫固定电泳） (immunofixation electrophoresis)

操作：待检血清 + 抗血清 IgG IgA IgM Κ链 λ链 I抗原抗体对应沉淀并被固定，染色等

结果 (result) ：

与 M 蛋白检测相关 (related) 疾病：1 、多发性骨髓瘤（ multiple myeloma ）2 、巨球蛋白血症（ macroglobulinemia ）3 、重链病（ heavy chain disease ）4 、轻链病（ light chain disease ）5 、半分子病（ half-molecule immunoglobulin disease ）6 、恶性淋巴瘤 (malignant ～ )7 、良性 M 蛋白血症 (benign ～ )

例 :

多发性骨髓瘤（ multiple myeloma,MM ） 是浆细胞异常增殖的恶性肿瘤，也称浆细

胞瘤（ plasmocytoma ）。是 IPD 中最常见的一种类型。 1873 年由 Butzky首先并命名。

MM 的主要临床特征：①进行性的骨质破坏，如骨质疏松和溶骨性病变，常有骨痛、易骨折，为 MM最典型特征；②大量的 M 蛋白导致血液粘度增高 , 呈高粘血症或沉积

于肾小管中，肾小管上皮细胞淀粉样变性，发生肾病综合征。损害中枢神经系统，可出现神经功能障碍；③骨髓损伤可引起贫血、粒细胞和血小板减少；④浆细胞浸润其他组织，如脊髓和神经根受压时引起运动功能障碍等；⑤男性多发，平均发病年龄 46 岁左右；⑥恶性程度高，预后不良；⑦易感染。

MM 的主要免疫学特征：①血清中出现大量的 M 蛋白： IgG＞ 35g/L, IgA＞ 20g/L, IgM＞ 15g/L, IgD＞ 2.0g/L ， I

gE＞ 2.0g/L ；或尿中有本周蛋白（＞ 1.0g/24h尿）；②血清中正常 Ig 水平明显降低；③骨髓中有无限扩增的异常浆细胞（≥ 15% ）为主要病理特征，组织证实有浆细胞瘤；④有溶骨性损害。

不同类型的多发性骨髓瘤 :

类 型 发生率（ % ） 本周蛋白尿阳性（ % ） 临 床 特 点 IgG 50 ～ 60 50 ～ 70 典型症状 IgA 20 ～ 25 50 ～ 70 高粘综合征较多见 IgD 1 ～ 2 90 骨髓外病变、溶骨病 变多见， 44% 淀粉样变 IgE 0.01 少见 IgM ＜ 1 90 高粘综合征最常见非分泌型 1 ～ 5 无 溶骨病变较少，神 经系统损害较多见

MM 的发病机制发病机制不明，与下列因素有关。（ 1 ）是遗传与环境因素综合作用的结果。主要发生在 1号、 11号、 14号染色体，使浆细胞可发生永生化（ 2 ）造血干细胞的异常 。形成浆细胞瘤。（ 3 ）细胞因子的异常 。 MM患者可有 IL-6 异常增高，体外内实验证明 IL-6 可促使MM 细胞增殖、生长和存活，使MM 细胞增多。 IL-6 增高直接效应是抑制 IL-4 的产生，从而抑制了正常的体液免疫功能。（ 4 ）与粘附分子、 IL-6 等信号传递受体和 B 细胞 1 ～

2

等抑制凋亡的受体高表达有关。

本周蛋白（ bence-jones protein ） :

1847 年由 Bence-Jones 在病人的尿液中检出而命名。已知M 蛋白不具有免疫活性，无正常免疫球蛋白的功能，其轻链分子小可通过肾小球滤过从尿排除。

（本周蛋白是从尿中检出的 M 蛋白轻链）

冷球蛋白的检测 ( 定性 ) ：

冷球蛋白的定量分析鉴定沉淀中蛋白质类型，可将沉淀用冷缓冲液洗涤后，再溶于巴比妥缓冲液中，固定电泳或免疫电泳鉴定。冷球蛋白检测的注意事项采血过程要保温，用品用预温， 4℃下放置时间要一周，正常人血清也可含有冷球蛋白，多数在 80μg/L 以下。

（二）血清补体检测

补体（ complement ）是指血清中具有酶活性的一组不耐热球蛋白。

A. C1 ～ C9(C1q 、 r 、 s) ；B. B 因子、 D因子、 P因子、 H因子；C. C1抑制物、 C4 结合蛋白、促衰变因子

等。

溶血程度与补体含量的关系 :

补体相关的实验室检测：1 、总补体溶血活性测定（ CH50 ） 反映主要补体 C1 ～ C9 成分的综合水平。 试管法：正常参考值范围 50 ～ 100U/ml 脂质体免疫法：其范围 23 ～ 46U/ml 测得值高：急性炎症、损伤、恶性肿瘤 测得值低：补体消耗相关疾病 补体合成降低（肝病） 先天性缺陷

2 、补体单个成分检测（ C3 、 C4 、 C1q ）

方法 :免疫比浊法、单向免疫扩散法

补体单个成分检测的意义 :若血清 C3 含量增高，由于 C3 是急性时相反应蛋白，在急性炎症、传染病早期、急性组织损伤、恶性肿瘤、移植物排斥反应时增高。但是补体含量增高的临床意义不大。若血清 C3 含量降低，见于合成能力低下，如慢性肝病；合成原料不足，如营养不良；补体消耗或丢失增多，如系统性红斑狼疮活动期、白血病化疗后、大量失血、大面积烧伤。 血清 C4 含量降低，见于多发性骨髓瘤、遗传性血管性水肿、遗传性 C4 缺乏症等。

二、细胞免疫 (cellular ～ ) 检测参与机体细胞免疫反应的细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞（自然杀伤） 中性粒细胞针对细胞的数量 (amount) 、活性（功能 function ）、表面标志物 (membra

ne molecules ) 表达 (express)程度～。

T细胞表面标志物 ( 主要 ):

1 、羊 RBC 受体 (E花环 )

2 、 T 细胞抗原受体（ T cell receptor,TCR)

3 、 CD3,CD4/CD8 ； CD28,152,154 和 CD2 等

（ Cluster of differentiation ； CD ）4 、丝裂原受体（ PHA/ConA ～）5 、 MHC 分子（ MHV-Ⅰ类分子）6 、细胞因子受体～

临床常见的细胞免疫检测项目T细胞表面标志物检测(membrane molecules of T lymphocyte

s ～ )通过检测 T淋巴细胞表面特有的标志物识别，计数细胞总数；分析细胞亚群。方法： E玫瑰花环形成试验(Erythrocyte rosette forming cell test) T细胞分化抗原（ CD）测定(Cluster Differentiation of T cells ～ )

E玫瑰花环形成试验 :T 细胞表面有特异性绵羊红细胞 (SRBC)

受体，即 E 受体。将 T 细胞与 SRBC按一定比例混匀，置 4℃至少 2h 或过夜， T 细胞表面的 E 受体能与 SRBC 结合形成以 T细胞为中心，四周环绕 SRBC 的花环样结构（见图 )镜检计数可得总花环 (Et)形成率，亦即 T 细胞的百分率。

正常参考值范围 Et 64.4±6.7% Ea 20%～ 40%

流式细胞术 (flowcytometry,FCM) ： CD3+T细胞 61 ～ 85%； CD4+T细胞 28 ～ 58%； CD8

+T细胞 19 ～ 48%； CD4+/CD8+T细胞比值 1.66±0.33(＞ 1) 。

T淋巴细胞功能检测 (function ～ )

T淋巴细胞体外培养 , 在有丝分裂原作用下细胞内核酸与蛋白质合成增加 , 细胞发生母细胞化 (transformation ) ～ , 或经混合 (mixed) 淋巴细胞培养等来帮助细胞免疫功能评估。方法：形态学 (morphologic counting ) 3H-胸腺嘧啶核苷掺入法 (3H-thymidine incorporation) MTT法 (MTT colorimetry) Mixed lymphocyte culture (one-way/two-way)

Lymphocyte transformation (%) =(transferred lymphocyte)÷200×100% Reference value: ～ 70%

(3H-thymidine incorporation): T细胞经有丝分裂原刺激，向母细胞转化时胞内 DNA 合成活跃， 3H-胸腺嘧啶核苷作为原料摄入， 3H-胸腺嘧啶核苷的掺入量与细胞增殖相关（ SI＞ 2 ，正常）Stimulating index (SI)

= mean CPM of the stimulated cells/mean CPM of the corresponding control Cells (unstimulated=control )

MTT法 (colorimetry): 细胞增殖代谢活跃，细胞内线粒体脱 氢酶活性增高，通过线粒体能量代谢 使得MTT代谢形成紫色甲潜，经细胞

溶 解分析吸光度，估计细胞增殖程度 (SI＞ 2) 。

methyl thiazolyte trazolium;MTT 四甲基偶氮唑盐 , 为一种染料 .

混合淋巴细胞培养 (mixed culture) ： 将两个无关的淋巴细胞混合培养，由于不同个体 MHC的差异，彼此都以

对方为抗原发生反应，导致 T细胞转化。 T细胞转化能力可通过 3H-胸腺嘧啶核苷掺入法、 MTT法，检测分析。

B淋巴细胞表面标志物检测B淋巴细胞表面标志物： 1 、膜表面免疫球蛋白（ SmIg ） 2 、分化抗原（ CD19 ～ 22 和 CD29 ） 3 、 Fc 受体 (Fc receptor) 4 、补体受体 (complement receptor) 5 、 EB 病毒受体等 (EB virus recepto

r)

检测方法 (method) ： 1 、免疫荧光 (fluorescence immunoassay)法测 SmIg （用 5 种抗 Ig 抗体 +B 细胞——荧光显微镜下计数） .参考值 : SmIg+细胞总数 16 ～ 28%，其中 G+ 4 ～13%； M+7 ～ 13%； A+1 ～ 4%；D+5 ～ 8%; E+0 ～

1.5%。 2 、流式细胞术 (flowcytometry,FCM) 检测 B细胞分化抗原（ CD19 ） .参考值 : CD19+细胞 11.74%±3.73%

B淋巴细胞功能检测 (function):

1 、 B淋巴细胞增殖 (proliferation) 试验

2 、溶血空斑 (hemolytic plaque) 试验

3 、酶联免疫斑点法（ ELISPOT）4 、体内试验（皮试） (Ⅰ/Ⅳ)

ELISPOT:

用抗原包被固相，加入待检的抗体产生细胞，再诱导其抗体的分泌。

分泌的抗体与包被于固相的抗原结合，在抗体形成细胞周围形成抗原抗体复合物。

再加入酶标记二抗，通过底物的显色反应镜下计数着色斑点，并记录显色的深浅、范围，可评估 B 细胞功能～

斑点计数，数据分析

阳性 阴性

A and B ：检测标本（刺激后的待测细胞）

E and F ：检测抗体对照（相同数量刺激后的待测细胞，使用 PBS替代了检测抗体）

C and D ：阴性对照（相同数量的未刺激细胞）

G and H ：背景对照（只加入培养基，无细胞）

H1 and H12 ：阳性对照（重组的细胞因子）

检测模式和结果示意图

体内试验（皮试）正常机体对某种抗原建立了细胞免疫后，

如用相同的抗原做皮肤试验时，常出现阳性的迟发型超敏反应。本试验不仅可以检查受试者是否对某种抗原具有特异性细胞免疫应答能力，而且可以检查受试者总体细胞免疫状态。

体内试验（皮试） :B 细胞功能减低或缺陷，可表现为体内 Ig

和血型抗体量下降或缺如，患者对外源性抗原的应答能力减弱或缺如，仅产生极低或不能产生特异性抗体。故临床定量测定受检者血清中各种 Ig 量和相应血型抗体可判断 B 细胞功能，也是诊断体液免疫缺陷的重要指标。反之，如血清中一种或多种 Ig 或轻、重链片段异常增高，表明 B 细胞产生 Ig 的功能异常增高。

4 、自然杀伤细胞（ NK）免疫检测：NK为一类大颗粒淋巴细胞，其表面无专门的识别标志，具有细胞介导的细胞毒作用能直接杀伤靶细胞。

NK具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功效，还参与移植排斥、超敏反应等～

NK功能测定：包括乳酸脱氢酶释放率、51Cr释放等等 。

5 、吞噬细胞（ phagocytes ）功能检测： 吞噬细胞 — 中性粒细胞（ neutrophils ） 单核 -吞噬细胞 （ mononuclear ～ /macrophages ） 吞噬细胞的吞噬活力 — 趋化（ trend ） 吞噬（ phagocytosis ） 胞内消化（ elimination ）

细胞免疫相关的主要细胞因子检测：

细胞因子 (cytokines):由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的，介导和调节免疫、炎症反应的小分子多肽。细胞因子少入血，检测局部含量有意义；细胞因子具网络特性，联合检测多信息分析有意义。

细胞因子的种类：1 、白细胞介素（ IL-1 ～ 18 ）2 、集落刺激因子（ CSF）（粒、巨噬细胞和混合～）3 、干扰素（ IFN）（ α、 β、 γ ）4 、肿瘤坏死因子（ TNF）（ α、 β ） 5 、转化生长因子 β 家族 / （ SGF）6 、趋化因子家族7 、其他（表皮生长、血小板衍生～）

常见细胞因子检测方法：1 、生物学检测法（促细胞增殖和增殖抑制、细胞毒活性、抗病毒活性、趋化活性等）。2 、免疫学检测法（ ELISA 、 RIA 、免疫印迹、免疫斑点）。3 、分子生物学法（ RNA印迹、 PCR等）。4 、单个细胞产生细胞因子测定法（反向溶血空斑、反向 ELISA斑点）。

IL-2/ IL-2RIL-2 主要由活化的 CD4+细胞产生，通过

自分泌和旁分泌作用于分泌 IL-2 的细胞本身或近邻的 CD4+和 CD8+细胞，是机体免疫网络中最重要的调节因子。

为评价机体免疫功能的重要指标之一。体液中含量低难以直接检测。通常检测由刺激原（ PHA/ConA ）诱导单

个核细胞在体外产生其的能力来反映。

IL-4主要由Th 细胞经抗原或丝裂原刺激后产生

可调节 B 细胞及其他多种免疫细胞的功能。IL-4 能增加亚剂量 IgM 抗体对 B 细胞的刺激IL-4 与 LPS共刺激 B 细胞分泌 IgG1 和 IgEIL-4 能促进 B 细胞膜表面CD23 分子表达IL-4 能阻断 IFN对 L929 细胞的保护作用，

呈显拮抗 IFN的抗病毒活性。

IL-6IL-6由多种淋巴类和非淋巴类细胞

（单核 -巨噬细胞、血管内皮细胞、 T/B 细胞、某些肿瘤细胞）产生，具有多种生物学功能，在机体的免疫应答、骨髓造血、炎症反应中起重要作用。

IL-6 能刺激某些细胞分化（ CESS细胞、 SKW6-CL4 细胞、 B 细胞等）

IL-8IL-8由单核 /巨噬细胞、成纤维细胞、

上皮细胞和内皮细胞的多种细胞产生，其主要生物活性是激活中性粒细胞。

IL-8 是中性粒细胞的激活剂和趋化因子IL-8刺激多型核白细胞释放髓过氧化物酶

细胞黏附分子 Cel l adhension molecules(CAM)

由细胞合成分泌存在于白细胞与内皮细胞表面的蛋白质，以配

体-受体相对应的形式发挥作用。介导细胞-细胞，细胞-基质，细

胞-基质-细胞相互接触和结合，参于细胞的识别，导致细胞的活化

和信号转导，诱发细胞的增殖和分化，引起细胞伸展和移动，是免

疫应答，炎症发生，凝血，肿瘤转移，创伤愈合等生理和病理过程

的分子基础。黏附分子已被单独列为一组 CD抗原。

细胞黏附分子分类 (classified) 整合素家族 (integrin) 选择素家族 (selectin) 免疫球蛋白超家族 (immunoglobulin superfamily) 钙粘蛋白家族 (cadherin) 粘蛋白样家族、等等 （ mucin-like family ）

黏附分子的功能 (function)

1 、免疫细胞识别（ distinguish ）中的辅助受体和协同活化信号。

2 、炎症（ inflammatory ）过程中白细胞和血管内皮细胞黏附。

3 、淋巴细胞归巢 （ lymphocyte homing ）。

黏附分子与疾病 (and disease) 白细胞黏附不全症：白细胞表达整合素族分子缺陷，中性粒细

胞不能向炎症部位渗透而造成致命性感染。

肾小球炎症：整合素家族中的β 1β 2亚型能介导细胞向肾脏内

浸润。在肾脏发育、肾炎或发生癌变时，它们的表达有明显变

化。

黏附分子与肿瘤 (and tumour)

1. 对肿瘤浸润和转移的影响 （1） 第一步肿瘤细胞某些黏附分子表达减少，肿瘤细胞间附着减弱而脱落，且与邻近细胞附着

（2） 入血的肿瘤细胞表达黏附分子，与血管内皮细胞黏附，导致血行转移

如大肠癌和乳腺癌等 E钙粘素表达明显下降，且与肿瘤的恶性程度相关 2. 对肿瘤的诊断 不同肿瘤可表达正常相应组织不表达的黏附分子，作为鉴别的标志

可溶性黏附分子（ dissolved ～）

指从细胞表面脱落并直接进入血液的～已知某些黏附分子由其 mRNA翻译后可直接分泌进入血液～

临床发现在脑脊液、胸腹水、滑膜液和肺泡灌洗液中能检测到并且可反映局部黏附分子表达与代谢的情况。

黏附分子的检测（～ test ）1 、细胞表面黏附分子的检测 放射免疫测定 免疫荧光测定 酶免疫测定（ ELISA ） 化学发光免疫测定2 、可溶性黏附分子的检测 ELISA 法

谢 谢