植物基因组 DNA 的提取及纯度与含量的测定

实验八

第一部分

植物基因组 DNA 的提取

一、实验目的和要求1、学习并掌握植物基因组 DNA 的提取原理和方法；2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；3、学习并掌握对电泳检测基因组 DNA 结果的初步分析。

二、实验基本原理 植物基因组 DNA 的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（ CTAB) 法、十二烷基硫酸钠 (SDS) 法。十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使 DNA 得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸 (DNA 、 RNA) 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使 DNA 沉淀，沉淀 DNA溶于 TE 溶液中，即得植物基因组 DNA 溶液。 由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导 DNA 降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA 聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的 CTAB-DNA 提取法步骤多，较烦琐， DNA 产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。 SDS 法操作简单，温和 ,也可提取到较高分子量 DNA ，但所得产物含糖类杂质较多 ,这将直接影响 DNA 的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类 (尤其是氧化酶类 )对 DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂 (如巯基乙醇 )以降低这些酶类的活性。

DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 : DNA 分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。 DNA 分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的 DNA 片段泳动速度不同。 DNA 片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（ EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定 DNA 片断在凝胶中的位置。

影响 DNA 泳动速率（迁移率）的因素有：⑴ DNA 分子质量的影响：双链 DNA 分子迁移的速率与 DNA 分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。 ⑵ DNA 构型的影响：超螺旋 DNA＞线状 DNA＞开环 DNA⑶ 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度 为 1％～ 2％；⑷ 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般 5V/cm） （电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用 0.5 ～ 1.0V/cm电泳过夜。进行 高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。⑸ EB 的影响：溴化乙锭（ EB）插入双链 DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增 加。⑹ 电泳缓冲液的影响 :核酸电泳常采用 TAE 、 TBE 、 TPE 三种缓冲系统，但它们 各有利弊。 TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。 TPE 在进行 DNA回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE 缓冲液。在缓冲液中加入 EDTA ，可以鳌合二价离子，抑制 DNase，保护 DNA 。缓冲液 pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。⑺ 碱基组成与电泳温度的影响 : 一般影响不大

在 DNA 提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：（ 1） DNA 的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。（ 2）抑制内外源 DNase的活力。 DNase就象一把刀，它能把大分子的 DNA 切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点： a、低温操作；b、调节 pH，使偏碱（ pH8.0）； c、抽提液中加表面活性剂； d、加螯合剂（ EDTA ）除去酶的铺助因子（ Mg2+），使酶活性丧失。（ 3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使 DNA 降解，一般综合考虑，取 pH8.0 左右为宜。（ 4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等， DNA 分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使 DNA 断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。（ 5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取 DNA 的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少， DNA 含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。

三、实验材料与试剂1、实验材料：植物幼嫩叶子2、实验试剂（ 1）基因组 DNA 提取缓冲液（ 2）氯仿 : 异戊醇 :乙醇抽提液（ 3） TE缓冲液（ 4）平衡酚：（ 5） RNA 酶 A（ 6）酚 /氯仿（ 7）氯仿 / 异戊醇（ 8）异丙醇、无水乙醇、 70%乙醇。（ 9） 3mol/L NaAc（ 10） 5×TBE 缓冲液（ 11） 6×电泳上样缓冲液（ 12） 1.0%琼脂糖凝胶（ 13） EB（ 14） DNA 分子量 Markers： 125， 564， 2027， 2322， 4361， 6557， 9416， 23130bp.

四、实验器材与仪器1、研体2、离心机、离心管（ 7ml）及离心管架；3、微量移液器 10ul、 1000ul及枪头；4、恒温水浴箱 65 ℃5、制冰机；6、冰箱； 7、恒温水浴箱 37℃；8、微波炉； 9、电泳仪及电泳槽；10、紫外检测仪。

五、实验操作方法和步骤

置于预热到 65℃的研体中，加少许石英砂；加入预热到 65℃的基因组 DNA 提取缓冲液 3ml

称取植物幼嫩叶子 0.5g 迅速研成匀浆 转移到 7ml带盖离心管中

65℃水浴保温 1hr，其间经常轻柔摇动 加入 3ml氯仿 - 异戊醇 -乙醇溶液 轻柔颠倒混匀后，

室温静置分层 5min

离心 5,000g×5min 上清液转移到干净 7ml离心管中，记录体积，弃沉淀， *①

加入等体积的平衡酚，轻柔颠倒混匀，室静置 10min 4℃离心 12,000g×10min 转移上清于新 7ml离心管中，记录体积 *②

加入等体积酚 /氯仿，轻柔颠倒混匀，室温放置 15min 4℃离心（ 12,000g， 5min） 吸取上清转移到一新 7ml离心管中，记录体积 *

③

加入等体积的氯仿，颠倒混匀，室温放置 5min

4℃离心（ 12,000g， 10min） 吸取上清转移到一新 7ml离心管中，记录体积*④

加入 5μl RNase（ 5μg/μl），37℃ 保温 10min

加入 1/10 体积 3mol/L NaAC和 2×体积– 20℃预冷的无水乙醇– 20℃放置 20min *⑤

4℃离心（ 5,000g， 3min）收集沉淀 *⑥ 用 70%乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶液，干燥，让酒精完全挥发

用 1mlTE 溶解沉淀，即为植物基因组 DNA 溶液 *⑦

凝胶电泳检测基因组 DNA （分子量大小、纯度）4℃保存备用

说明：如果蛋白质和 RNA未去除干净，重复酚，酚 /氯仿，氯仿抽提步骤，乙醇沉淀和洗涤，重溶于 TE中，继续用 RNase处理，直至基因组 DNA 纯度和质量符合要求。

（一） 植物基因组 DNA 的提取

①② 紫外吸收法测定基因组 DNA 纯度与含量

① ②

③ ④

* 植物基因组 DNA 的提取操作过程现象

⑤

⑥

⑦

* 植物基因组 DNA 的提取操作过程现象

1、制胶（ 1 ％琼脂糖凝胶） 在胶模上架好梳子。称取 01g琼脂糖，置于 250ml锥形瓶中，加 100ml 0.5×TBE 电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至 50～ 60℃后，加入 EB，使其终浓度为 0.5mg/L，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量 0.5×TBE （刚好淹过胶面），拔去梳子备用。（注： EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作）2 、加样 取 5ul纯化的 DNA 原溶液样品，与 1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。若 DNA 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3 、电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到 100V，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约 2cm 时，停止电泳（约需 30 ～ 60min）。4 、观察和拍照 取出胶块置于紫外灯下观察， DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。（注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。

（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA

第二部分

基因组 DNA 纯度与含量的测定

一、实验目的和要求1、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法；2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组 DNA 纯度与含量的方法。

二、实验基本原理 核酸——DNA 和 RNA 所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在 260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用 260nm 波长进行核酸含量的测定。 波长为 260nm 时， DNA 或 RNA 的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为 1μg / ml 时， DNA 钠盐的 OD260＝ 0.02。 当 OD260 ＝ 1时，双链 DNA 含量约为 50μg / ml 单链 DNA 含量约为 37μg / ml RNA 含量约为 40μg / ml 寡核苷酸含量约为 30μg / ml（由于底物不同有差异）1 、核酸样品 DNA 、 RNA 含量的测定： 如用 1cm 光径石英比色皿，用 H2O 稀释 DNA 或 RNA样品 n倍并以 H2O为空白对照，根据此时读出的 OD260值即可计算出样品稀释前 DNA 的含量： DNA （ μg/μl） =50×OD260读数× DNA样品稀释倍数 /1000 RNA （ μg/μl） =40×OD260读数× RNA样品稀释倍数 /1000 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。

当 DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响 DNA吸光度的准确测定。由于 DNA 在 260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在 280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在 230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的 OD260、 OD280和 OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。2 、核酸样品纯度判断的一般标准：⑴ DNA 纯度： OD260/OD280≈1.8，表示为纯的 DNA； OD260/OD280 ＞ 1.9，表示有 RNA 污染； OD260/OD280 ＜ 1.6，表示有蛋白质、酚等污染。⑵ RNA 纯度： 1.7 ＜ OD260/OD280＜ 2.0，表示为纯的 RNA； OD260/OD280 ＜ 1.7 时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 ＞ 2.0 时，表示可能有异硫氰酸残存。⑶ OD230/OD260的比值应在 0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和 PCR 的效果。

三、实验材料与试剂1、实验材料 植物基因组 DNA样品2、实验试剂⑴ ddH2O；

⑵ TE 缓冲液（ pH 8.0）。

四、实验器材与仪器1、离心机、离心管（ 5ml）及离心管架；2、微量移液器 10ul、 200ul、 1000ul及枪头；3、紫外分光光度计；4、石英比色皿（ 0.5cm光径）或 1cm光径的微量石英比色皿（ 50ul、 100ul）。

五、实验操作方法和步骤 方法 1： 将提取的植物基因组 DNA样品吸取 20ul，加到新的 5ml离心管中，再加一定量的 ddH2O 或 TE 缓冲液（ pH 8.0）稀释 100倍，用 0.5cm 光径石英比色皿（约需 1.6ml 样品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定 230nm、 260nm、 280nm处的吸光度。计算植物基因组 DNA样品溶液的 DNA 的含量以及 DNA样品的纯度。 方法 2： 直接取植物基因组 DNA样品微量原液，用分光度计进行自动测定出 230nm、260nm、 280nm处的吸光度值，计算植物基因组 DNA样品溶液的 DNA 的含量以及 DNA样品的纯度。

⑴ 用 TE调 0（空白）：

⑵ 取植物基因组 DNA样品原液 5ul，进行自动测定 230nm、 260nm、 280nm处的吸光度值：

六、计算1、植物基因组 DNA样品溶液的 DNA 的含量： DNA （ μg/μl ） = 50×OD260读数×2*×DNA样品稀释倍数 /1000 （ * 用 0.5cm 光径石英比色皿×2 ，用 1cm 光径石英比色皿×1 。）2、植物基因组 DNA样品溶液的 DNA 的纯度： OD260/OD280＝ OD230/OD260＝ 3、样品纯度判断： ⑴ OD260/OD280 ≈1.8，表示为纯的 DNA； ⑵ OD260/OD280 ＞ 1.9，表示有 RNA 污染； ⑶ OD260/OD280 ＜ 1.6，表示有蛋白质、酚等污染。

七、结果分析讨论

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氨基移换反应及其产物的鉴定

值 日