Microscopes กลองจลทรรศน

วตถประสงค ทราบชนดของกลองจลทรรศน

ทราบสวนประกอบและหนาทการท างานของกลองจลทรรศนธรรมดาและกลองสเตอรโอ

สามารถเปรยบเทยบความแตกตางระหวางกลองจลทรรศนธรรมดาและกลองสเตอรโอ

ทราบวธการใช การดแล และเกบรกษากลองจลทรรศน

สามารถหาขนาดของวตถจากกลองจลทรรศน

สามารถเตรยมสไลดสด และยอมสตวอยางเพอดดวยกลองจลทรรศน

Microscopes Simple microscope Compound microscope

ประกอบดวยเลนสเดยว เชน แวนขยาย (ก าลงขยาย 2-30 เทา) ใชศกษาลกษณะภายนอกของสงมชวตทมขนาดใหญ เชน ใบไม แมลง

กลองจลทรรศนเชงประกอบประกอบดวยเลนสตงแต 2 อนขนไป

Compound microscopes

1. Light microscope (bright-field microscope)

◦ เปนกลองจลทรรศนธรรมดาหรอใชแสงสองผานวตถทตองการด

◦ ก าลงขยาย 1000-2000 เทา

◦ ภาพทไดจะเปนภาพเสมอนหวกลบกบวตถ และเปน 2 มต

Compound microscopes

2. Stereomicroscope (dissecting microscope)

◦ แสงสองกระทบวตถสะทอนเขาตา

◦ ใชสองดสงมชวตขนาดเลกททบแสง ไมเหนรายละเอยดภายในเซลล

◦ ก าลงขยาย 80-200 เทา

◦ ภาพทไดจะเปนภาพเสมอนหวตง และเปน 3 มต

Compound microscopes

3. Phase contrast microscope

◦ มอปกรณพเศษท าใหวตถและพนหลงมความแตกตางกน

◦ ใชดเซลลหรอสงมชวตทมลกษณะใสโดยไมยอมส

Compound microscopes

4. Polarizing microscope

◦ ใชศกษาผลกและเสนใย เซลลกลามเนอลาย

◦ โครงสรางทเหนจะสวางตดกบพนทมด

Compound microscopes 5. Dark field microscope

◦ ใชศกษาสงมชวตขนาดเลก ทอยในของเหลว จะเหนเปนจดสวางบนพนหลงทมด (dark field condenser)

Compound microscopes 6. Fluorescence microscope

◦ ใชหาสารเรองแสง ทเรองแสงไดเองเชน วตามน A ไรโบเฟลวน คลอโรฟลล หรอเปนสารเรองแสงจากการยอมดวยสเรองแสง

Compound microscopes 7. Ultraviolet microscope

◦ ใชตรวจหากรดนวคลอก โดยเฉพาะ พวรน (purine) และ ไพรมดน (pyrimidine) ของนวคลโอไทด รวมทง กรดอะมโนและโปรตนบางตว เชน tyrosine, phenylalanine

protein crystal

UV image of cell

Compound microscopes

8. Electron microscope (EM)

◦ Transmission EM (TEM) (กลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองผาน)

ใชศกษารายละเอยดสวนประกอบโครงสรางเซลลทไมสามารถเหนไดดวยกลองจลทรรศนธรรมดา โดยจะเหนเปนภาพ 2 มต

ก าลงขยาย 1,000,000 เทา

◦ Scanning EM (SEM) (กลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด)

ใชศกษาพนผวของเซลล โดยจะเหนเปนภาพ 3 มต

ก าลงขยาย 800,000 เทา

Electron microscopes

TEM v. SEM

gills of a fish

Myelinated axon

การถอกลองจลทรรศน

สวนประกอบของกลองจลทรรศน

1. สวนทเปนตวกลอง 2. สวนทท าหนาทรบแสง 3. สวนทท าหนาทปรบภาพ 4. สวนทท าหนาทขยายภาพ

สวนประกอบของกลองจลทรรศน

1. สวนทเปนตวกลอง 1) Body tube บงคบแสงจากเลนสใกลวตถ

เขาสเลนสใกลตา

2) Stage แทนวางวตถ วางสไลดทตองการศกษา

3) Spring clip ทหนบสไลด ปจจบนม mechanical stage ซงม scale ในแนวตงและนอน ชวยใหหาต าแหนงของวตถทตองการดไดงาย

4) Arm แขน ใชจบเวลายกกลอง

5) Base ฐาน เปนสวนทรองรบน าหนกกลอง

1

2 3

4

5

2. สวนทท าหนาทรบแสง 1) กระจกเงา ท าหนาทสะทอนแสงผานวตถ

ปจจบนเปนแหลงก าเนดแสง เชนหลอดไฟฟา

2) Condenser เลนสรวมแสง รวมแสงเขาสวตถ

3) Iris diaphragm อยใตเลนสรวมแสง ใชปรบแสงใหผานเขาเลนสรวมแสงไดมากหรอนอยตามตองการ

สวนประกอบของกลองจลทรรศน

2

3

1

3. สวนทท าหนาทปรบภาพ 1) Coarse adjustment knob ป ม

ปรบภาพหยาบ ใชหาระยะโฟกสโดยการปรบแทนวางวตถขนลง

2) Fine adjustment knob ป มปรบภาพละเอยด ใชปรบใหภาพคมชดยงขน

3) Coaxial stage control ป มเลอนต าแหนงของสไลด โดยภาพทเหนจากเลนสใกลตาจะสลบกน เชน เลอนสไลดไปทางซาย ภาพทเหนจะไปทางขวา

สวนประกอบของกลองจลทรรศน

1

2

3

4. สวนทท าหนาทขยายภาพ 1) Objective lens เลนสใกลวตถ ม 3 -4 อน

โดยจะตดอย กบแปนสวมเลนสใกลวตถ revolving nosepiece

เลนสใกลวตถก าลงขยายต า มก าลงขยาย 4 เทา เลนสใกลวตถก าลงขยายปานกลาง มก าลงขยาย 10

เทา เลนสใกลวตถก าลงขยายสง มก าลงขยาย 40 เทา เลนสใกลวตถหวน ามน มก าลงขยาย 100 เทา เวลาให

ตองหยดน ามนลงบนกระจกปดสไลดเพอใหแสงหกเหดขน

2) Ocular or eyepiece เลนสใกลตา ขยายภาพจากเลนสใกลวตถ มก าลงขยาย 10 เทา ท าใหเหนเปนภาพเสมอนหวกลบ

Eye lens ดานใกลตา Field lens ดานตรงขาม

สวนประกอบของกลองจลทรรศน

2

1

ความสามารภในการขยายภาพของกลองจลทรรศน

ขนอย กบสงส าคญ 2 สงคอ resolution & numerical

aperture (NA)

◦ Resolution (R) คอ ความสามารถของเลนสใกลวตถของกลองในการแยกจดสองจดทอยใกลกนทสดใหเหนแยกออกเปนสองจด

ความสามารภในการขยายภาพของกลองจลทรรศน

ขนอย กบสงส าคญ 2 สงคอ resolution & numerical

aperture

◦ Numerical aperture (NA) คอคาความสามารถของเลนสใกลวตถในการรวมแสงทหกเหจากวตถ

R = 0.6 x λ NA

λ คอ ความยาวคลนแสง (0.55 µm)

ความสามารภในการขยายภาพของกลองจลทรรศน

เลนสใกลวตถก าลงขยายเทากน ◦ ตวทมคา R ต ากวาจะมประสทธภาพดกวา

◦ ตวทมคา NA สงกวาจะมประสทธภาพดกวา

ก าลงขยาย

NA

ความหนาของกระจกปดสไลด

ความยาวของ mechanical tube

Working distance ระยะการท างานของเลนสใกลวตถ(ทท าใหเหนภาพชด) หรอ ระยะทางจากเลนสใกลวตถจนถงกระจกปดสไลด

การหาก าลงขยายของภาพทไดจากกลองจลทรรศน ก าลงขยายของภาพ = ก าลงขยายของเลนสใกลตา x ก าลงขยายของ

เลนสใกลวตถ Objective lens Magnification Ocular lens Total

magnification

Low power 4x 10x 40x

Medium power 10x 10x 100x

High power 40x 10x 400x

ขอบเขตการมองเหนภาพ field view

•ก าลงขยายต า •ภาพขนาดเลก •ขอบเขตการมองเหนกวาง

•ก าลงขยายสง •ภาพขนาดใหญ •ขอบเขตการมองเหนแคบลง

การหาขนาดจรงของวตถจากกลองจลทรรศน Micrometer ◦ Stage micrometer

◦ Ocular micrometer

การหาขนาดจรงของวตถจากกลองจลทรรศน Stage micrometer

ม 10 ชองใหญ แตละชองหางกน 0.1 มลลเมตร หรอ 100 ชองเลก แตละชองหางกน 0.01 มลลเมตร

การหาขนาดจรงของวตถจากกลองจลทรรศน Ocular micrometer

แบงออกเปน 100 ชอง แตละชองมระยะหางเทาๆกน แตจะมขนาดเทาใดนนขนอยกบก าลงขยายของเลนสใกลวตถทใช

การเทยบ scale micrometer กอนน าไปใช

4X

stage

ocular

2 ชอง ocular = 1 ชอง stage

1 ชอง ocular = ½ ชอง stage

= 0.01/2

= 0.005 mm

=0.005 x 1000 µm

=5 µm

การเทยบ scale micrometer กอนน าไปใช

4 ชอง ocular = 1 ชอง stage

1 ชอง ocular = 1/4 ชอง stage

= 0.01/4

= 0.0025 mm

=0.0025 x 1000 µm

=2.5 µm

10X

stage

ocular

การเทยบ scale micrometer กอนน าไปใช

เลนสใกลวตถก าลงขยาย 10 เทา โดย 4 ocular = 1 stage

สงมชวตทเหนจะมขนาดเทาใด

4 ชอง ocular = 1 ชอง stage

1 ชอง ocular = 1/4 ชอง stage

= 0.01/4

= 0.0025 mm

=2.5 µm

2.5 x ?

การประมาณขนาดของวตถเมอไมม micrometer

ขดเสนบนกระดาษยาว 1 เซนตเมตร แลวแบงชองละ 1 มลลเมตร น าไปสองเทยบหาความยาวเสนผานศนยกลางของอาณาเขตทเหนในแตละก าลงขยายของเลนสใกลวตถ

4x

ม 8 ชอง = 8000 µm

10x

ม 4.5 ชอง = 4500 µm

4x Euglena มขนาดประมาณเทาใด

Stereomicroscope

Ocular lenses 10x

Objective

lenses

Stage

Zoom

Magnification adjustment

Reflected light source

Focus adjustment

Base Transmitted light source

การเตรยมสไลดส าหรบดดวยกลองจลทรรศนธรรมดา

สไลดถาวร (permanent slide)

สไลดสด (wet mount)

การเตรยมสไลดสดและการยอมส วางตวอยางลงบนสไลด หยดน า(หรอสยอม)ลงไปบนตวอยาง ปดดวยกระจกปดสไลด อาจใชปลายเขมหมดคอยๆวางกระจกปดสไลด

ซบน าทอยนอกกระจกปดสไลดและใตสไลดแลวน าไปสองดดวยกลองจลทรรศน

การยอมสหลงจากดตวอยางทยงไมไดยอมไปแลว

การใชกลองจลทรรศน

การใชกลองจลทรรศน

การใชกลองจลทรรศน

งานทตองปฏบต ศกษาสวนประกอบตางๆของกลองจลทรรศน และหนาทการท างานของ

สวนประกอบตางๆ ฝกหดการใชกลองจลทรรศนธรรมดาโดยใชสไลดถาวร และกลองสเตอรโอ

โดยใชตวอยางสงมชวต เปรยบเทยบความแตกตางของภาพทมองเหนจากกลองจลทรรศนธรรมดา

และกลองสเตอรโอ เขยนตวอกษร “ก” หรอ “ง” บนกระดาษแลวน าไปสองดดวยกลอง

จลทรรศนธรรมดาและกลองสเตอรโอ วดเสนผานศนยกลางของอาณาเขตทเหนในกลองจลทรรศนธรรมดา เมอ

ใชเลนสใกลวตถก าลงขยายต า ปานกลาง และสง ฝกหดหาขนาดจรงของวตถจากกลองจลทรรศนธรรมดา ฝกหดเตรยมสไลดสดและการยอมส เพอศกษาดวยกลองจลทรรศน ฝกหดวธการเกบกลองจลทรรศนธรรมดา และกลองสเตอรโอ