ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

เทคนคการตรวจสอบ Passion Fruit Woodiness Virus ในตนพนธเสาวรส Techniques for the Detection of Passion Fruit Woodiness Virus in

Passion Fruit (Passiflora edulis)

โดย

นางสาวศรนนท มณวรรณ

ควบคมและอนมตโดย ............................................................. วนท...........เดอน.......................พ.ศ. ............ (ผศ.ดร.พสสวรรณ เจยมสมบต)

ค านยม

ขอขอบคณ ผศ.ดร.พสสวรรณ เจยมสมบต ภาควชาโรคพช คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทใหขาพเจาไดท าปญหาพเศษดานไวรสสาเหตโรคพช และคอยใหค าปรกษา ชแนะชวยเหลอ และตรวจทานแกไขปญหาพเศษของขาพเจาฉบบนใหส าเรจลลวงไปไดด

ขอขอบคณ คณสทธชย บญรอด คณอมสา หลาพรหม และพ ๆ นสตปรญญาโท หองปฏบตการ A410 อาคารปฏบตการวจยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทเสยสละเวลาใหความเอาใจใส คอยแนะน าเทคนคตาง ๆ และใหค าปรกษาในการปฏบตงานในหองปฏบตการ รวมทงขอมลทเปนประโยชนอน ๆ

ขอขอบคณ สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทใหการสนบสนนงบประมาณในการท าปญหาพเศษ สดทายนขอกราบขอบพระคณบดา มารดา ทใหการสนบสนนการศกษา และเพอน ๆ ทเปน

ก าลงใจ คอยชวยเหลอ และเปนแรงผลกดนใหขาพเจาท าปญหาพเศษส าเรจลลวงไปไดด

นางสาวศรนนท มณวรรณ มนาคม 2551

เทคนคการตรวจสอบ Passion Fruit Woodiness Virus ในตนพนธเสาวรส

นางสาวศรนนท มณวรรณ

บทคดยอ

ตนแมพนธเสาวรสสมวงเบอร 2 ทใชเปนแหลงขยายตนพนธเสาวรสใหแกเกษตรกรในโครงการหลวงประสบปญหาการตดเชอไวรส Passion fruit woodiness virus (PWV) ท าใหผลผลตจากตนพนธทเปนโรคตกต าและมคณภาพไมตรงตามความตองการของตลาด จงไดมการเพาะเลยงเนอเยอเสาวรสปลอดโรคจากตนแมพนธและน ามาขยายพนธใหเกษตรกร โครงการวจยนไดศกษาประสทธภาพของเทคนคการตรวจสอบเชอ PWV ในตนพนธเสาวรส เพอใชในการคดเลอกตนพนธปลอดโรคกอนสงใหเกษตรกร โดยน าตนเสาวรสพนธสมวงปราศจากเชอและตนพนธทเปนโรคมาท าการตรวจสอบเชอ PWV ดวยเทคนคทใชกนอยทวไป 3 วธ ไดแก Enzyme-link immunosorbent (ELISA) ,Tissue blot immunoassay (TBIA), และเทคนคกลองจลทรรศนอเลกตรอน ท าการทดสอบกบตนปกตทไดจากการเพาะเมลดและตนทเปนโรคอยางละ 10 ตน เทคนค ELISA และเทคนค TBIA เปนการตรวจสอบโปรตนหอหมเชอ PWV ดวยแอนตบอดตอเชอ PWV กรณทใชเทคนค ELISA อานผลการตรวจจากปฏกรยาของเอนไซมทตดฉลากบนแอนตบอดและสบสเตรท ท าใหทราบระดบปรมาณเชอ PWV ในตวอยางพช จากคา OD ทความยาวคลน 405 นาโนเมตร โดยตนปกตทง 10 ตน จะมคา OD อยในชวง 0.222-0.262 สวนตนทเปนโรคจ านวน 9 ตน จะมคา OD อยในชวง 0.558-1.395 และจ านวน 1 ตนมคา OD เทากบ 0.393 สวนเทคนค TBIA สามารถอานผลจากตะกอนสมวงของปฏกรยาไดดวยตาเปลา และคาดหมายระดบปรมาณเชอ PWV ในเสาวรสเปนโรค จากความเขมของสมวงของตะกอน ซงปรากฏวาผลการตรวจของตนเปนโรคไดผลบวกทง 10 ตน แบงได 3 ระดบ คอ ตะกอนสมวงเขมมากจ านวน 4 ตวอยาง สมวงเขมปานกลางจ านวน 4 ตวอยาง และสมวงออนจ านวน 2 ตวอยาง เมอใชเทคนคกลองจลทรรศนอเลกตรอนและเตรยมตวอยางดวยเทคนค Dip preparation สามารถตรวจพบเชอไวรสรปรางทอนยาวคด ขนาดประมาณ 750 นาโนเมตร พบเชอในตวอยางทเปนโรคทง 10 ตน โดยพบเชอเฉลยประมาณ 5 อนภาค ตอพนทภาพภายใตกลองจลทรรศน ผลการทดลองสรปวาเทคนคการตรวจสอบเชอ PWV ทมประสทธภาพในการตรวจสอบเชอ ไวรส ในตนพนธเสาวรสได 100% ไดแก เทคนค TBIA และเทคนคกลองจลทรรศนอเลกตรอน ซงใหผลการทดลองทสอดคลองกน และสามารถตรวจสอบตนปกตแยกจากตนทเปนโรคไดอยางถกตอง สวนเทคนค ELISA ไดผล 90%

ค าส าคญ : Passion fruit woodiness virus, ELISA, TBIA, เทคนคกลองจลทรรศนอเลกตรอน, การตรวจสอบไวรส ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : ผศ.ดร. พสสวรรณ เจยมสมบต ปทพมพ : 2551 จ านวนหนา : 22

Techniques for the Detection of Passion fruit Woodiness Virus in Passion Fruit (Passiflora edulis)

Miss Sirinan Maneewan The purple passion fruit (Passiflora edulis) No.2, which had been used for years as mother

plants for passion fruit stocks propagation in The Royal Project, were found to be infected with Passion fruit woodiness virus (PWV). The virus caused severe damage of stock plant and yield. Virus-free mother stocks were therefore produced by using meristem-tip culture technique and those regenerated shoots obtained were grafted to new passion fruit seedlings. This study aims to verify three applicable techniques for the detection of PWV in grafted passion fruit stocks. They were enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), tissue immuniblot assay (TBIA), and transmission electron microscopy (TEM) techniques. Each of ten healthy and grafted diseased passion fruit plants were used as test materials. For ELISA and TBIA, antiserum against PWV was used as probe to detect viral coat protein in infected plant. The ELISA value was evaluated by enzymatic reaction with substrate and virus titer was relatively determined by the optical density at 405 nm (O.D.405). ELISA value for ten healthy plants ranged 0.222-0.262 (negative) while those of nine diseased plants ranged 0.558-1.395 (positive), except one that showed the value of 0.393 (negative). TBIA technique showed positive result by visual observation of purple precipitate on ten spot of diseased samples but not on healthy ones. The density of purple color were roughly estimated for virus titer indicating high, medium and low densities for 4, 4 and 2 diseased plants, respectively. By using TEM and dip preparation technique flexuous rod virus particles size of about 750 nm were observed from all ten diseased plants with average 5 particles per microscopic field. The results obtained suggested that Both TBIA and TEM were 100% accurate for PWV detection in passion fruit stocks while ELISA was about 90%. Keyword : Passion fruit woodiness virus, DAC-ELISA, TBIA, Tranmission electron microscope technique, Detection technique for virus Degree : B.S. Program in Agricultural Biotechnology, Kasetsart University Adviser : Assist. Prof. Dr. Pissawan Chiemsombat Year : 2008 Page : 22

สารบญ

หนา

สารบญ (1) สารบญตาราง (2) สารบญรปภาพ (3) ค าน า 1 ตรวจเอกสาร 2 วตถประสงค 6 อปกรณและวธการ 7 ผลการทดลอง 9 วจารณผลการทดลอง 18 สรปผลการทดลอง 19 เอกสารอางอง 20

(1)

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสปกตดวยการใชเทคนค DAC-ELISA 11

และใช แอนตซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus

2 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสเปนโรคดวยการใชเทคนค DAC-ELISA 12 และใชแอนตซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus

3 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสปกตดวยการใชเทคนค TBIA 13 และใชแอนตซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus

4 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสเปนโรคดวยการใชเทคนค TBIA 14 และใชแอนตซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus

5 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสเปนโรคดวยการใชเทคนค 15 กลองจลทรรศนอเลกตรอน

6 เปรยบเทยบขอด-ขอดอยบางประการของเทคนคการตรวจไวรส ทง 3 วธ 18

(2)

สารบญรปภาพ

ภาพท หนา 1 ลกษณะอาการของโรคไวรส 3 แบบ ทพบในตวอยางทน ามาตรวจหา 10

เชอ Passion woodiness virus

2 ผลลกษณะของตะกอนสมวงทเกดขนบนเมมเบรนทตรวจเชอ Passion fruit 16 woodiness virus ดวยเทคนค TBIA A 3 ผลการทดลองตรวจสอบเชอ Passion fruit woodiness virus ในตนเสาวรสดวย 16

เทคนค Tissue blot immunoassay (TBIA)

4 ลกษณะอนภาคไวรส Passion fruit woodiness virus ทอนยาวคด ขนาด 750 17 นาโนเมตร ในตวอยางเสาวรสเปนโรคตนท 1-10 ทตรวจพบภายใตกลอง จลทรรศนอเลกตรอน ทไดจากการเตรยมตวอยางสดจากใบเสาวรส แบบ Dip preparation ยอมสแบบ Negative staining ดวย 2% uranyl acetate

(3)

เทคนคการตรวจสอบ Passion fruit Woodiness Virus ในตนพนธเสาวรส

Techniques for the Detection of Passion fruit Woodiness Virus in Passion Fruit (Passiflora edulis)

ค าน า เสาวรสเปนผลไมทสามารถรบประทานผลสดได โดยเฉพาะบางพนธทผลมรสชาตคอนขางหวาน และยงเปนผลไมอตสาหกรรมคอ ปลกเพอน าผลผลตไปแปรรปเปนน าผลไม เนองจากในผลมน ามาก รสเปรยวและมกลนหอม ส าหรบในประเทศไทยนนมผน าเสาวรสเขามาปลกครงแรกในป พ.ศ.2498 เปนพนธสมวง (ลพ, 2532) ตอมาไดมผน าเขามาปลกอกในอกหลายพนท ทงพนธผลสมวงและผลสเหลอง จนกระทงไดมการปลกเปนการคากนทวไป โดยมแหลงปลกทส าคญไดแก เชยงใหม เชยงราย นาน

ปจจบนการผลตเสาวรสเพอการคาประสบปญหาผลผลตตกต า และคณภาพไมตรงความตองการของตลาด เนองจากเกดปญหาโรคไวรสเขาท าลายตนแมพนธของโครงการหลวง ซงเปนแหลงผลตตนพนธเสาวรสส าหรบการขยายพนธของเกษตรกร จงท าใหเกดสะสมของโรคและการแพรกระจายไปอยางกวางขวาง

โรคไวรสทส าคญคอโรค woodiness มเชอสาเหตคอ Passion fruit woodiness virus (PWV) ในประเทศไทยพบครงแรกเมอป พ.ศ.2527 ทภาคกลาง, ตะวนออกและภาคเหนอของประเทศไทย ลกษณะตนทเปนโรคจะแสดงอาการใบดาง เสนใบใส ผลดางทวผล ผวเปลอกไมเรยบ เปลอกหนากวาปกต ผลจะมลกษณะบดเบยวและขนาดเลกลง หากพบการเขาท าลายรวมกบ Cucumber mosaic virus (CMV) แลวจะท าใหอาการของโรครนแรงยงขน แมลงทเปนพาหะของเชอคอ เพลยออน แตไมสามารถถายทอดโรคผานเมลด

เนองจากการแพรกระจายของโรคไวรสทเปนไปอยางกวางขวาง ทางมลนธโครงการหลวงไดมโครงการวจยทท าการศกษาทดลองผลตตนแมพนธเสาวรสปลอดโรค ดวยวธการเพาะเลยงเนอเยอ และใชเปนตนพนธปลอดโรคเผยแพรสเกษตรกร เพอลดปญหาการตดโรคไวรส และมการพฒนาแอนตบอดและวธการตรวจสอบไวรสทมประสทธภาพ ถกตอง แมนย า และมความสม าเสมอในการตรวจสอบตนแมพนธกอนทจะน าไปขยายพนธ (พสสวรรณ และคณะ, 2549) ส าหรบการทดลองน ไดท าการศกษาความถกตองและความเหมาะสมวธการตรวจสอบไวรสPWV ในตนพนธเสาวรสทเปนโรคและตนพนธปกต โดยท าการตรวจหาอนภาคไวรสดวยเทคนคจลทรรศนอเลกตรอน และการตรวจหาโปรตนหอหมอนภาคไวรส (Coat protein gene, CP gene) ดวยการใชเทคนคทางดานเซรมวทยา โดยใชแอนตซรมของ PWV

1

ตรวจเอกสาร

ทมาและความส าคญของปญหา ในปจจบนการผลตเสาวรสเพอการคา ประสบปญหาผลผลตตกต าและคณภาพไมตรงตาม ความตองการของตลาด เนองจากเกดปญหาโรคไวรสเขาท าลายตนแมพนธเสาวรส ไดมรายงานวาพบเชอสาเหตคอ Passion fruit woodiness virus (PWV) ในแหลงปลกส าคญของประเทศไทย โดยการขยายพนธโดยใชกงพนธทตดเชอไวรส ซงผปลกเขาใจวากงพนธทมาจากตนทเปนโรคแตไมแสดงอาการสามารถน าไปขยายพนธตอได จงท าใหมการสะสมของโรคและการแพรกระจายของโรคเปนไปอยางกวางขวาง แนวทางการแกไขปญหาดงกลาวไดแก การใชตนพนธปลอดโรคแทนตนแมพนธเดม จงจ าเปนตองมวธการตรวจไวรสทมความแมนย าและรวดเรว เพอน ามาใชในการคดเลอกตนแมพนธปลอดโรค (พสสวรรณ และคณะ, 2549)

ลกษณะทวไปของเชอ Passion fruit woodiness virus (PWV)

Passion fruit woodiness virus หรอ PWV เปนเชอสาเหตทท าใหเกดโรค woodiness จดอยในวงศ Potyviridae และจดอยในจนส Potyvirus มอนภาคเปนทอนยาวคด มความยาว 670- 750 นาโนเมตร เสนผานศนยกลาง 12-15 นาโนเมตร มจโนมเปนอารเอนเอสายเดยว ชนดสายบวก (ssRNA positive-strand virus) ( Novaes and Rezende, 2003) มน าหนกโปรตนประมาณ 37 กโลดาลตน (Koizumi, 1995) ภายในเซลลพชจะพบผลกโปรตนลกษณะแบบ pinwheel, tubular และ scroll inclusion bodies อยในไซโทพลาสซม (พสสวรรณ และ คณะ, 2549)

ลกษณะอาการและการแพรกระจายของโรค woodiness

โรค woodiness เปนทรจกมาตงแตป ค.ศ. 1901 และมรายงานการพบครงแรกทประเทศออสเตรเลย ในปค.ศ. 1953 นอกจากนมรายงานการพบเชอ PWV ทเปนเชอสาเหตของโรคดงกลาวครงแรก ในประเทศบราซล เมอปค.ศ.1970 และพบวามการระบาดอยางรนแรงในป ค.ศ.1980 ในประเทศไตหวน (Koizumi, 1995) เสาวรสทเปนโรค woodiness จะแสดงอาการใบดางแบบ mosaic, ใบยน, ใบมอาการดางแบบจดวงแหวน (ring spot), เสนใบใส, รปรางใบบดเบยว, ผลดางทวผลหรอมอาการดางแบบวงแหวน, ผวเปลอกไมเรยบ, เปลอกหนากวาปกต, ผลจะมลกษณะบดเบยวและขนาดเลกลง, ล าตนมอาการดาง, การเจรญเตบโตลดลง, หากพบการเขาท าลายรวมกบ Cucumber mosaic virus (CMV) จะท าใหอาการของโรครนแรงยงขน (Taylor and Kimble, 1964)

2

การแพรกระจายของเชอ PWV และถายทอดเชอ PWV

เชอ PWV สามารถแพรกระจายโดยอาศยทอนพนธ และวธการขยายพนธดวยวธการทาบกง เชอไวรสไมสามารถถายทอดทางเมลด แตสามารถถายทอดไดโดยแมลงทเปนพาหะของเชอคอ เพลยออน ไดแก aphids, Myzus persicae และ Aphis gossypii (Novaes and Rezende,2004)

นอกจากเสาวรสแลวเชอ PWV ยงมพชอาศยอนอก ไดแก Centrosema pubescens., Crotalaria usaramoensis, Glycine max และ Phaseolus atropupureus (Koizumi, 1995) การตรวจสอบเชอ PWV

การทดลองปลกเชอไวรสดวยวธกลลงบนพชทดสอบ เพอตรวจวนจฉยโรค พบวา สามารถท าไดกบพชอาศยหลายชนด ไดแก

- Passiflora edulis (Passion fruit) แสดงอาการใบดางแบบ mosaic เสนใบนน ใบบดเบยวพบมจดสเหลองบนใบแก ผลมลกษณะแขง เชนเดยวกบทเกดจากการเขาท าลายของเชอ CMV หรอทเกดจากแมลง

- Passiflora edulis f. flavicarpa (golden passionfruit) และลกผสมระหวาง P. edulis กบ P. edulis f. flavicarpa (hybrid passionfruit) แสดงอาการใบดางซด รวมกบวงแหวนสเหลอง(Taylor and Kimble, 1973)

- Phaseolus lathyroides ใบทถกปลกเชอแสดงอาการจดสเหลอง หรอสน าตาล จากนนอาการ ไหม แพรไปตามเสนใบ เสนใบนน หงกยน ใบสเหลอง รวง

- Phaseolus vulgaris (French bean) อาการขนอยกบพนธถว มทงแบบจดสซด ไปจนถงเสนใบไหมทวใบ (Taylor and Kimble, 1973; พสสวรรณ และคณะ 2549)

การใชเทคนค Direct antigen coating ELISA (DAC-ELISA) ในการตรวจสอบไวรส พสสวรรณ และคณะ (2550) ตรวจหา PWV ในเสาวรสตนแมพนธรบประทานสดของโครงการหลวง กอนน ากงพนธไปใช ดวยการใชชดตรวจเชอ PWV ทใชเทคนค gold labeled IgG flow technique (GLIFT) โดยแยกสกดอมโมโนโกลบลน จ (PWV-IgG) ออกจากแอนตซรมตอเชอ PWV (PWV-As) ซงไดจากการผลตโพลโคลนอลจากอนภาคไวรสบรสทธ มาตดฉลากดวย colloidal gold ขนาด 40 นาโนเมตร ส าหรบใชเปนตวตรวจจบไวรส และใชแอนตบอดชนด goat anti rabbit-IgG (GAR) แสดงปฏกรยาควบคม(control) พบวา เมอตรวจสอบกบน าคนใบเสาวรสเปนโรคเกดแถบสมวงทเปนผลบวกและอานไดใน 1 นาท และไมเกดปฏกรยากบน าคนเสาวรสปกต

3

Catacutan et al. (1996) ท าการตรวจหา Banana bunchy top virus (BBTV) ในตวอยางจากประเทศออสเตรเลยดวยวธ ELISA, triple-antibody sandwich-enzyme-linked immunosorbent assay (TAS-ELISA), และ DAC-ELISA พบวา TAS-ELISA ใหความไวสงกวา DAC-ELISA และคาดดกลนแสงของ TAS-ELISA และ DAC-ELISA จะลดลงเมอ ความเขมขนของ monoclonal antibody เพมขน

Hema et al. (2004) ท าการตรวจหา Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) สายพนธในอนเดยใต สาเหตโรคดางในออย ดวยเทคนค immunocapture reverse transcription-polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) เมอเปรยบเทยบกบเทคนค DAC-ELISA พบวาการใชเทคนค IC-RT-PCR มความไวกวาตรวจดวย DAC-ELISA Kiranmai et al. (2005) ไดท าการตรวจทดสอบกลวยทมอาการ chorosis บนล าตนเทยมและเสนใบในโกดาวารตะวนตก ดวยวธ DAC-ELISA ซงไวรสจะใหผลเปนบวกกบแอนตซรมของ Bean yellow mosaic virus, Blackeye cowpea mosaic virus, Lettuce mosaic virus, Pepper mild mottle virus, Pepper mottle virus, Peanut stripe virus, Sugarcane mosaic virus, Pea seedborne mosaic virus, Potato virus Y and Datura leaf distortion virus (DLDV) สามารถบอกไดวา ไวรสทท าใหเกดอาการดงกลาว เปนไวรสใน Genus Potyvirus คอ Banana bract mosaic virus ทมรายงานอยในประเทศฟลปปนส

Mahmo et al. (1995) ตรวจหา Maize yellow stripe tenui-like virus (MYSV) โดยการใชแอนตซรม จาก nucleoprotein ของ MYSV ในการส ารวจพชอาศยและตวพาหะ คอ เพลยกระโดด (leafhoppers) ในอยปตดวยวธ DAC-ELISA ในแปลงทดลองและในหองปฏบตการ ในขาวสาล, ขาวบารเลย, ขาวโพด, และขาวโอต และในพวกวชพช Bromus wildenowii, Cenchrus biflorus, Dichanthium annulatum, Digitaria sanguinalis, Echinochloa colonum, Setaria verticillata and S. viridis. พบวาสามารถใช DAC-ELISA ในการตรวจหาเชอ MYSV ในพชอาศยและเพลยกระโดดได

4

การใชเทคนค Tissue blot immunoassay (TBIA) ในการตรวจสอบไวรส ปยาภรณ เพชรสงเนน และคณะ (2548) ตรวจสอบทอสโพไวรสซโรกรป 4 ในพรก มะเขอเทศ

แตงโม และถวลสง ดวยเทคนค DAC-ELISA และเทคนค TBIA พบวาการตรวจสอบดวยเทคนค TBIA ใหผลสอดคลองกบการตรวจดวย DAC-ELISA และพบวาตวอยางถวลสง ทตรวจดวยเทคนค DAC-ELISA ไดไมชดเจนสามารถตรวจพบไวรสไดชดเจนดวยเทคนค TBIA

Abou-Jawdah, (2005) ท าการตรวจหา Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) ทสามารถถายทอดโดยแมลงหวขาว (Bemisia tabaci) ในมะเขอเทศสายพนธทตานทาน ซงพบระบาดในแอฟรกา, เอเชยตะวนออกกลาง, เอเชยตะวนออกเฉยงใต โดยใชเทคนค TBIA ทใช heterologous monoclonal antibody ของ African cassava mosaic virus พบวา วธดงกลาว มความรวดเรวและมความไวสง และสามารถบอกปรมาณของเชอไวรส ตรวจไดแมท าการปลกเชอแลวนาน 6-8 วน และใชเวลาในการตรวจอยางนอย 4 ชวโมง ดงนนจงแนะน าใหใชวธการนในการตรวจหาเชอ TYLCV ในการคดเลอกมะเขอเทศพนธตานทาน

Chatenet et al . (2001) ตรวจหา Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) ในออยทปลกในศนย Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD) เปนออยถกกกกนโรค ทมาจาก Brazil, Florida, Mauritius, และ Réunion ในระหวางป ค.ศ.1997 ถง ค.ศ. 2000 โดยใชวธ TBIA และ Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) ทงสองวธใหผลทสอดคลองกน

Makkouk and Comeau (1994) ใช TBIA ในการตรวจหา Barley yellow dwarf virus (BYDV, luteovirus) พบวา TBIA มความไวทจะสามารถใชตรวจหา BYDV ในเนอเยอทแกและแหงของขาวบารเลย นอกจากนยงตรวจพบ BYDV ในขาวสาล, ขาวโอต, และขาวบารเลย หลงจากตดเชอ ทงในยอด, ดอก และหลงจากนนจะตรวจพบไวรสไดดจากการตรวจในล าตน

5

วตถประสงค เพอท าการศกษาความถกตองและความเหมาะสมของวธการตรวจสอบเชอ Passion fruit

woodiness virus ในตนพนธเสาวรส 3 วธการ ไดแก เทคนค Direct antigen coating ELISA (DAC-ELISA), เทคนค Tissue blot immunoassay (TBIA) และ เทคนคจลทรรศนอเลกตรอน

สถานทท าการทดลอง

หองปฏบตการ A410 อาคารปฏบตการวจยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน

โรงเรอนปลกพช ภาควชาโรคพช คณะเกษตร ก าแพงแสน หองปฏบตการกลองจลทรรศนอเลกตรอน งานชวเคม ฝายวจยและปฏบตการ

เรอนปลกพชทดลอง

ระยะเวลาท าการทดลอง เมษายน 2550 ถง ตลาคม 2550

6

อปกรณและวธการ ตวอยางเสาวรส และแอนตซรมทใชทดสอบ ตวอยางพชปกต คอ ตนเสาวรสพนธสมวงเบอร 2 ทไดจากการเพาะเมลดจ านวน 10 ตน ตวอยางควบคมทปราศจากเชอไวรส (Negative control) คอ ตนเสาวรสพนธสเหลองทไดจากการเพาะเมลด ตวอยางพชทเปนโรค คอ ตนพนธเสาวรสทไดจากการเสยบยอดตนเปนโรคลงบนตนตอพนธสมวง จ านวน 10 ตน ประกอบดวย ตนเสาวรสทไดจาก จ.สพรรณบร จ านวน 2 ตน โดยใหเปนตนท 1-2, ตนเสาวรสทไดจาก บานแมสาบ อ.สะเมง จ.เชยงใหม จ านวน 6 ตน เปนตนท 3-8 และตนเสาวรสทไดจาก สถานวจยปางดะ ต.แมทา อ.สะเมง จ.เชยงใหม จ านวน 2 ตน เปนตนท 9 -10 ตามล าดบ ตวอยางควบคมเปนตนพนธเสาวรสสมวงทตดเชอไวรส PWV (Positive control) จาก สถานวจยปางดะ แอนตซรมทใชในการทดลอง ไดจากการผลตโพลโคลนอลแอนตบอด (PAb-PWV) ทเตรยมจากเชอไวรส PWV ทแยกใหบรสทธฉดเขากระตาย ซงไดรบความอนเคราะหจากภาควชาโรคพช คณะเกษตร ก าแพงแสน เทคนค Direct antigen coating ELISA (DAC-ELISA)

ชงตวอยางใบเสาวรส 0.1 กรม น ามาบดใน carbonate coating buffer ทเตม diethyldithiocarbamic acid (NaDIECA) ความเขมขน 2 มลลกรมตอมลลลตร 1 มลลลตร ในสดสวนเนอเยอพชตอบฟเฟอรเปน 1:10 (w/v) ดดเอาเฉพาะสวนใสของน าคนพชใสลงในหลมของ ELISA plate หลมละ 100 ไมโครลตร บมในกลองชนอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เมอครบเวลาเทน าคนตวอยางออก และลางดวย 1X PBST หลมละ 200 ไมโครลตร 1-2 นาท 3 ครง เตรยมแอนตซรมตอเชอ PWV (PAb-PWV) เจอจางในอตราสวน 1:1,000 (v/v) และเตมน าคนใบเสาวรสปกตทบดใน 1X PBST ทผสม 1% Skim milk (อตราสวน 1:1 v/w) ใหความเขมสดทายเปน 1:100 (v/v) ตงทงไว 30 นาท ท 4 องศาเซลเซยส แยกเอาสวนใสของแอนตซรมใสลงในหลมตวอยาง หลมละ 100 ไมโครลตร บมในกลองชน อณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เมอครบเวลา ลางดวย 1X PBST หลมละ 200 ไมโครลตร 1-2 นาท 3 ครง เตรยม Goat anti rabbit (IgG) alkaline phosphatase เจอจางในอตราสวน 1:30000 ใน 1X PBST ทผสม 1% Skim milk (อตราสวน 1:1 v/w) น าไปใสในหลมตวอยางหลมละ 100 ไมโครลตร บมในกลองชน อณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เมอครบเวลา ลางดวย 1X PBST หลมละ 200 ไมโครลตร 1-2 นาท 3 ครง เตรยม p-nitrophenyl phosphate (PNPP) อตราสวน 1 มลลกรมตอมลลลตร ใน diethandomine buffer บมในกลองชนในทมด อณหภม 37 องศาเซลเซยส น าไปอานคา ELISA เมอบมซบสเตรทไปแลว 30 และ 60 นาท ดวยเครอง ELISA reader ทความยาวคลนแสง 405 นาโนเมตร และหยดปฏกรยาดวย 3M NaOH หลมละ 25 ไมโครลตร (โสภณ, 2536)

7

เทคนค Tissue blot immunoassay (TBIA) มวนใบเสาวรสเปนทอนกลมใหแนน ใชใบมดโกนตดตามแนวขวาง แลวกดผวหนาตดของพชลง

บนแผน nitrocellulose membrane 1 ครง ปลอยใหแหง (ประมาณ 10 นาท) น าแผนเมมเบรนใสถงพลาสตกแลวเตม 5% NFDM (non fat dry milk ในสารละลาย PBS buffer) ปดถงใหสนท น าไปเขยาเปนเวลา 1 ชวโมง ครบเวลาแลวลางดวย PBST buffer 1 ครง เตรยมแอนตซรมตอเชอ PWV เจอจางในอตราสวน 1:1,000 (v/v) และเตมน าคนใบเสาวรสปกตทบดใน 1X PBS (อตราสวน 1:1 v/w) ใหความเขมสดทายเปน 1:100(v/v) ตงทงไว 30 นาท น าไปเขยาเปนเวลา 1 ชวโมง ลางเมมเบรน 3 ครง ๆ ละ 10 นาท ดวย 0.5% NFDM ใน PBS แลวเตม goat anti rabbit alkaline phosphatase conjugate ทเจอจาง 1:30,000 เทา ใน PBST buffer ลงในถง น าไปเขยาอก 1 ชวโมง ลางเมมเบรนดวย PBST แลวลางเมมเบรน 3 ครง ๆ ละ 10 นาท ดวย 0.5% NFDM ใน PBS ใชกระดาษกรองซบบฟเฟอรใหเมมเบรนแหงหมาด ๆ ใสลงในถงพลาสตกแลวเตม BCIP/NBT (1 มลลกรมตอมลลตร) เมอปรากฏสมวงบนตวอยางควบคมทมไวรส น าเมมเบรนมาแชในน ากลนเพอหยดปฏกรยา และอานผลโดยดจากสมวงทเกดขนซงเปนผลบวก แสดงวามไวรสในตวอยางทน ามาตรวจสอบ (ปยาภรณ และคณะ, 2548) การตรวจดลกษณะสณฐานจากกลองจลทรรศอเลกตรอน เตรยมตวอยางดวยวธ Dip preparation และยอมสแบบ Negative staining โดยตดตวอยางใบเสาวรสทแสดงอาการของโรคอยางชดเจนเปนสามเหลยม จมปลายแหลมของตวอยางขนลงหลาย ๆ ครงในฟอสเฟตบฟเฟอร ทอยบนกรด ทงในอนภาค ไวรสตกลงสแผนเคลอบ โดยใชเวลาประมาณ 1-3 นาท ซบบฟเฟอรออกดวยกระดาษกรอง ยอมกรดดวย 2% uranyl acetate 1 หยด นาน 3-5 นาท ซบใหแหงดวยกระดาษกรอง แลวน ากรดไปสองดดวยกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองผาน เพอตรวจดอนภาคไวรส (พสสวรรณ และคณะ, 2549)

8

ผลการทดลองและวจารณผล อาการของโรค woodiness ทเกดจากเชอ PWV อาการของเสาวรสทตรวจพบจากตวอยางตนเสาวรสเปนโรคทน ามาศกษาจ านวน 10 ตน แบงออกไดเปน 3 แบบ ดงน

1. อาการใบดางแบบ mosaic สเขยวสลบเหลอง ใบหนา เสยรปทรง (ภาพท 1 ก., ข.) 2. อาการใบดางแบบ mottle mosaic สเขยวซดสลบเขยวเขม ใบยนเลกนอย (ภาพท 1 ค., ง.) 3. อาการใบหงกเหลอง เนอใบแขง กรอบ (ภาพท 1 จ., ฉ.)

การตรวจสอบเชอ PWV ในตวอยางตนแมพนธเสาวรส การอานผลการตรวจสอบเชอ PWV ดวยเทคนค ELISA อานผล โดยการเปรยบเทยบกบ คา

O.D.405 ของ Negative control (0.233) โดยคาทสงกวาสองเทาของคา O.D.405 ของ Negative Control (0.466) ใหถอวาเปนโรคหรอพบเชอ

ผลการตรวจสอบเชอ PWV ดวยเทคนค DAC-ELISA ในตวอยางตนเสาวรสปกต และเสาวรสทแสดงอาการของโรค พบวา ตนปกต (ตวอยางทไมแสดงอาการของโรค) ซงปราศจากเชอมคาELISA (O.D.405) อยในชวง 0.22-0.262 ซงแสดงวาไมพบเชอ PWV ในตวอยาง แตในตวอยางทแสดงอาการของโรค พบเชอ PWV ในตวอยางทมคา ELISA (O.D.405) อยในชวง 0.558-1.395 จ านวน 9 ตวอยาง และไมพบเชอ PWV ในตวอยางทมคา ELISA เทากบ 0.393 จ านวน 1 ตวอยาง

ในการตรวจสอบดวยเทคนค TBIA พบวา ตวอยางเสาวรสปกต ไมปรากฎตะกอนสมวง (ภาพท 2. ก) ทเกดจากการท าปฏกรยาระหวางเอนไซมและสบสเตรท แตในตวอยางทแสดงอาการของโรคทงหมดเกดตะกอนสมวง และสามารถคาดหมายระดบปรมาณเชอ PWV จากความเขมของสมวงของตะกอน แบงได 3 ระดบ คอตะกอนสมวงเขมมาก (ภาพท 2. ข) จ านวน 4 ตวอยาง สมวงเขมปานกลาง (ภาพท 2. ค) จ านวน 4 ตวอยาง และสมวงเขมนอย (ภาพท 2. ง) จ านวน 2 ตวอยาง

การตรวจหาอนภาคของไวรส PWV ดวยเทคนคกลองจลทรรศนอเลกตรอนพบวา พบอนภาคไวรสทอนยาวคด ขนาด 750 นาโนเมตร เฉลยประมาณ 5 อนภาค ตอพนทภาพภายใตกลองจลทรรศน เฉพาะในตวอยางทแสดงอาการของโรค

จากผลการทดลองดงกลาวสามารถน าไปใชเปนแนวทางในการพฒนาชดตรวจสอบตนแมพนธเสาวรส เพอใหสามารถตรวจสอบเชอ PWV ในตนพนธเสาวรสไดอยางรวดเรวและแมนย า

9

ภาพท 1 ลกษณะอาการของโรคไวรส 3 แบบ ทพบในตวอยางทน ามาตรวจ ก., ข. อาการดางแบบ mosaic ค., ง. อาการดางแบบ mottle mosaic และใบบดเบยว เสยรป (leaf distortion) จ., ฉ. อาการใบหงกเหลอง เนอใบแขง กรอบ

ก ข

ฉ จ

ง ค

10

ตารางท 1 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสปกตดวยการใชเทคนค DAC-ELISA และใช แอนตซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus

ตวอยางเสาวรสปกต ตนท

คา ELISA (A405) ผลการตรวจ ทเวลา 30 นาท ทเวลา 60 นาท

1 0.1575 0.228 ไมพบเชอ 2 0.1525 0.227 ไมพบเชอ 3 0.1565 0.232 ไมพบเชอ 4 0.151 0.222 ไมพบเชอ 5 0.1515 0.224 ไมพบเชอ 6 0.151 0.224 ไมพบเชอ 7 0.157 0.235 ไมพบเชอ 8 0.17 0.262 ไมพบเชอ 9 0.163 0.245 ไมพบเชอ 10 0.154 0.23 ไมพบเชอ

Negative control 0.1575 0.233 ไมพบเชอ หมายเหต - หมายถง ตรวจไมพบเชอ อานจากคา ELISA ทไมเกน 2 เทาของตนปกตทเปน negative control (0.466) v

11

ตารางท 2 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสเปนโรคดวยการใชเทคนค DAC-ELISA และ ใชแอนตซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus (PWV)

ตวอยางเสาวรสเปนโรค ตนท

คา ELISA (A405) ผลการตรวจ ทเวลา 30 นาท ทเวลา 60 นาท

1 0.7725 1.395 + พบเชอ 2 0.6975 1.261 + พบเชอ 3 0.4435 0.801 + พบเชอ 4 0.3695 0.662 + พบเชอ 5 0.5345 0.955 + พบเชอ 6 0.2395 0.393 - ไมพบเชอ 7 0.317 0.558 + พบเชอ 8 0.5335 0.947 + พบเชอ 9 0.4285 0.775 + พบเชอ 10 0.556 0.999 + พบเชอ

Positive control 0.333 0.594 + พบเชอ หมายเหต + หมายถง ตรวจพบเชอ PWV อานจากคา ELISA ทมากกวา 2 เทาของตนปกตทเปน negative control (0.466) - หมายถง ตรวจไมพบเชอ อานจากคา ELISA ทไมเกน 2 เทาของตนปกตทเปน negative control (0.466)

12

ตารางท 3 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสปกตดวยการใชเทคนค TBIA และ ใชแอนตซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus (PWV)

ตวอยางเสาวรสปกต ตนท

ความเขมของตะกอนสมวง ผลการตรวจ

1 - ไมพบเชอ 2 - ไมพบเชอ 3 - ไมพบเชอ 4 - ไมพบเชอ 5 - ไมพบเชอ 6 - ไมพบเชอ 7 - ไมพบเชอ 8 - ไมพบเชอ 9 - ไมพบเชอ 10 - ไมพบเชอ

Negative control - ไมพบเชอ หมายเหต - ไมเกดตะกอนสมวงเกดขน แสดงวาไมพบเชอ PWV

13

ตารางท 4 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสเปนโรคดวยการใชเทคนค TBIA และใชแอนต ซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus (PWV)

ตวอยางเสาวรสเปนโรค ตนท

ผลการตรวจ

1 + พบเชอ 2 ++ พบเชอ 3 + พบเชอ 4 ++ พบเชอ 5 + พบเชอ 6 +++ พบเชอ 7 + พบเชอ 8 +++ พบเชอ 9 ++ พบเชอ 10 +++ พบเชอ

Positive control +++ พบเชอ หมายเหต + หมายถง ตรวจพบเชอ PWV : ความเขมของสมวงของตะกอน +++ หมายถง สมวงเขมมาก, ++ หมายถง สมวงเขมปานกลาง, + หมายถง สมวงเขมนอย

14

ตารางท 5 ผลการตรวจหาไวรสในตวอยางเสาวรสเปนโรคดวยการใชเทคนคกลองจลทรรศน อเลกตรอน

ตวอยางเสาวรสเปนโรค ตนท

จ านวนอนภาคไวรส โดยเฉลยตอพนทใตกลอง(อนภาค)

ผลการทดลอง

1 5 พบเชอ 2 4 พบเชอ 3 5 พบเชอ 4 4 พบเชอ 5 7 พบเชอ 6 9 พบเชอ 7 3 พบเชอ 8 4 พบเชอ 9 6 พบเชอ 10 5 พบเชอ

15

ภาพท 2 ลกษณะของตะกอนสมวงทเกดขนบนเมมเบรนทตรวจเชอ Passion fruit woodiness virus ดวยเทคนค TBIA ก.ไมมตะกอนสมวง หมายถง ไมพบเชอ PWV ข.สมวงเขมมาก หมายถง พบเชอ PWV มาก ค.สมวงเขมปานกลาง หมายถง พบเชอ PWV ปานกลาง ง.สมวงเขมนอย หมายถง พบเชอ PWV นอย

ก. ข.

ภาพท 3 ผลการทดลองตรวจสอบเชอ Passion fruit woodiness virus ในตนเสาวรสดวย เทคนค Tissue blot immunoassay (TBIA) ก.ตนเสาวรสปกตทน ามาทดสอบ ตนท 1-10 ข.ตนเสาวรสเปนโรค ทน ามาทดสอบ ตนท 1-10

1 2 3 4 5 6

7 8 9

1 2

7

Negative control

8

100

3

9 10

4 5 6

Positive control

ง ค ข ก

16

ภาพท 4 ลกษณะอนภาคไวรส Passion fruit woodiness virus ทอนยาวคด ขนาด 750 นาโนเมตร ในตวอยางเสาวรสเปนโรคตนท 1-10 ทตรวจพบภายใตกลอง จลทรรศนอเลกตรอน ทไดจากการเตรยมตวอยางสดจากใบเสาวรส แบบ Dip preparation ยอมสแบบ Negative staining ดวย 2% uranyl acetate

7

8

9

5 6

3

4

2

10

1 3

8

17

วจารณผลการทดลอง การตรวจหาเชอ PWV ดวยเทคนค DAC-ELISA จะสามารถตรวจพบไวรสไดจะตองมไวรสในปรมาณมากจงสามารถตรวจหาไวรสได ใชเวลานาน คาใชจายอยในระดบปานกลาง มวธการท าทไมยงยากและการอานผลโดยใชเครองวดคา O.D. ท าใหทราบปรมาณของเชอ แตในการทดลองนสามารถตรวจพบเชอ PWV เพยง 90% เทคนค TBIA ใชปรมาณไวรส, เวลาใกลเคยงกบ DAC-ELISA แตคาใชจายถกกวามากวธการท าคลายกบ DAC-ELISA มวาการอานผลทเขาใจงาย แตไมทราบปรมาณเชอ และสามารถตรวจพบเชอ PWV ทกตน เทคนคกลองจลทรรศนอเลกตรอน (TEM) สามารถตรวจพบอนภาคไวรสไดตงแต 1 อนภาคขนไป เปรยบเทยบกบสองวธแรก แตคาใชจายในการใชเครองมอตรวจสงทสด การอานผลขนกบความช านาญและประสบการณในระดบปานกลาง และตรวจพบเชอ PWV ในทกตน จากการทดลองจะเหนไดวา เทคนคการตรวจหาเชอ PWV ทง 3 วธใหผลทคอนขางสอดคลองกน แตคณสมบตบางประการของแตละวธ ท าใหมผลตอความเหมาะสมในการเลอกใชวธทดสอบตามลกษณะของงาน เงนทน หรอ ผ วจย (ตารางท 6) ตารางท 6 เปรยบเทยบขอด-ขอดอยบางประการของเทคนคการตรวจไวรส ทง 3 วธ

วธการ ปรมาณไวรสท

ตรวจได การอานผล

การตรวจไวรสเชงปรมาณ

ระยะเวลา คาใชจาย

DAC ELISA ระดบนาโน

กรม ถกตอง-แมนย า

ท าได ประมาณ 6 ชม./10ตวอยาง

100-200บาท/ตวอยาง

TBIA ระดบนาโน

กรม ขนกบสายตา ท าไมได

ประมาณ 6 ชม./10ตวอยาง

50 บาท/ตวอยาง

TEM นอยกวาระดบนาโนกรม

ขนกบประสบการณและความช านาญ

ท าไมได 10 ชม./1ตวอยาง

920บาท/ตวอยาง

18

สรปผลการทดลอง การตรวจสอบไวรส PWV ดวยเทคนค DAC-ELISA โดยใชแอนตซรมตอเชอ Passion fruit

woodiness virus (PWV-As) อานผลโดยการเปรยบเทยบกบ คา O.D.405 ของ Negative control (0.233) โดยคาทสงกวาสองเทาของคา O.D.405 ของ Negative Control(0.466) ใหถอวาเปนโรคหรอพบเชอ ผลการตรวจสอบเชอ PWV ในตวอยางตนเสาวรสปกตพบวา มคา ELISA (O.D.405) อยในชวง 0.22-0.262 ซงแสดงวาไมพบเชอ PWV ในตวอยาง แตในตวอยางทแสดงอาการ พบเชอในตวอยางทม ELISA (O.D.405) อยในชวง 0.558-1.395 จ านวน 9 ตวอยาง และไมพบเชอ PWV ในตวอยางทมคา ELISA เทากบ 0.393 จ านวน 1 ตวอยาง ดงนนจงกลาวไดวา เทคนค DAC-ELISA สามารถตรวจหาเชอ PWV ได 9 ใน 10 ตวอยาง หรอ 90%

การตรวจสอบไวรส PWV ดวยเทคนค TBIA โดยใชแอนตซรมตอเชอ Passion fruit woodiness virus (PWV-As) ซงตวอยางตนเสาวรสเปนโรคสามารถท าปฏกรยาใหผลบวกกบแอนตซรมตอเชอ PWV คอ เกดตะกอนสมวงบนแผนเมมเบรนทกตวอยาง แสดงวาตรวจพบเชอ PWV ในตนเสาวรสเปนโรค และในตวอยางเสาวรสปกต ไมเกดตะกอนสมวงบนแผนเมมเบรนทกตวอยาง ไมพบเชอ PWV ในตวอยางตนเสาวรสปกต

การตรวจหาอนภาคของไวรส PWV ดวยเทคนคกลองจลทรรศนอเลกตรอนพบวา พบอนภาคไวรสทอนยาวคด ขนาด 750 นาโนเมตร ในตวอยางตนเสาวรสทเปนโรค แตไมพบอนภาคไวรส ในตวอยางตนเสาวรสปกต

ทง 3 วธใหผลการตรวจทสอดคลองกนคอ สามารถตรวจพบเชอ PWV ในตวอยางตนเสาวรสเปนโรคและไมพบเชอ PWV ในตวอยางตนเสาวรสปกต แตในเทคนค DAC-ELISA สามารถตรวจและใหผลการตรวจ 90% สวนเทคนค TBIA และเทคนคกลองจลทรรศนอเลกตรอน สามารถตรวจหาเชอ PWV ได 100%

19

เอกสารอางอง

ปยาภรณ เพชรสงเนน, พสสวรรณ เจยมสมบต, วมล สเทา และ อนรกษ สนปาเปา.2548. การตรวจสอบทอสโพไวรสซโรกรป 4 ในสวนของพชและผลผลตดวยเทคนคทางเซรมวทยา การประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร,มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 762 น.

พสสวรรณ เจยมสมบต, สรภทร พราหมณย, ณรงคชย พพฒธนวงศ, สวรรณา กลดพนธ, นชนาถ วารนทร และ อจฉรา ภาวศทธ. 2549. การทดสอบตนแมพนธเสาวรสรบประทานสดปราศจากไวรส รายงานการวจยประจ าป 2549 โครงการวจยท 3025-3560, มลนธโครงการหลวง, เชยงใหม. 32 น.

ลพ ภวภตานนท. 2532. การปลกกะทกรกฝรง. เอกสารเผยแพร อนดบท 2 มหาวทยาลย 30 ป,

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 21 น. โสภณ วงศแกว. 2536. โรคของถวลสงในประเทศไทย. กลมพชน ามน กองสงเสรมพชไรนา

กรมสงเสรมการเกษตร, กรงเทพฯ. 44 น.

Abou-Jawdah Y. 2005. Tissue-blot immunoassay, rapid method for virus detection in screening tomato line for TYLCV resistance. Acta Hort .,695,

Catacutan G.C., Eusebio A.A. and Bajet, N.B. (1996). Serological detection of banana

bunchy top virus (BBTV) in Musa spp. [Online], Avilable: http://www.agnet.org/library/eb/417b/ [2007,December 16]

Chatenet M., Delage C. and M. Ripolles. 2001. Detection of Sugarcane yellow leaf virus in Quarantine and production of virus-free Sugarcane by apical meristem culture. Plant Dis., 85(11), 1177-1180

20

Hema M., Kirthi N., Sreenivasulu P., Savithri H. S. 2004. Development of recombinant coat protein antibody based IC-RT-PCR for detection and discrimination of sugarcane streak mosaic virus isolates from Southern India. Arch of Virol. 14(6), 1185-1193

Kumar G., Hema L., Venkatramana M., Prasadji M., Rao J. K., Sreenivasulu D. M. 2005. Partial characterization of a Potyvirus causing bract mosaic of banana in Andhra Pradesh. Ind J Virol,16(1/2), 7-11

Koizumi Meisaku (1995). Problems of Insect-Borne Virus Diseases of Fruit Trees in Asia.

[Online], Avaible: http://www.agnet.org/library/eb/417b/ [2008,March 8]

Mahmoujd A., Hotjvenel C., Abol-Ela S.E., Sewify G.H., Ammar E.D. 1996. Detection of maize yellow stripe tenui-like virus by ELISA and dot-blot tests in host plants and leafhopper vector in Egypt. Phytopath Medit , 35, 19-23.

Makkouk K. M. and Comeau A. 1994. Evaluation of various methods for the detection

of barley yellow dwarf virus by the tissue-blot immunoassay and its use for virus detection in cereals inoculated at different growth stages. J. Plant Pathol,100(1), 71-80

Novaes Quelmo S. and Rezende Jorge A. M. 2003. Selected mildstrains Passion fruit

woodiness virus (PWV) fail to protect pre-immunized vines in Brazil. Scientia Agricola, 60(4), 699-708

Novaes Quelmo S. and Rezende Jorge A. M. (2004). Protection between strains of

Passion fruit woodiness virus in sunnhemp. [Online] Avaible: http://www.scielo.br/pdf/fb/v30n3/a17v30n3.pdf [2008,March 1]

21

Taylor R.H. and Kimble K.A. 1964. Two unrelated viruses which cause woodiness of passion fruit (Passiflora edulis Sims). Aus J. Agric Science, 15(4), 560–70.

Taylor R.H. and Kimble K.A. (1973). Passionfruit woodiness virus. Description of Plant Virus,

No.122

22