第三章 蛋白质(Protein) 蛋白质蛋白质 ((protein)protein) 是由氨基酸为单位

以酰胺键 ( 肽键 ) 连接起来的一类含氮的生物大分子。蛋白质存在于所有的生物细胞中，是蛋白质存在于所有的生物细胞中，是生活细胞中数量、种类最丰富的生物生活细胞中数量、种类最丰富的生物大分子，构成生物体最基本的结构物大分子，构成生物体最基本的结构物质和功能物质。质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程与了几乎所有的生命活动过程。元 素 组 成 ： 所 有 蛋 白 质 都 含 有 C、 H、 O、 N 四种元素，大多数蛋白质还含有少量的 S ，有些蛋白质还 含 有 一 些 其 它 元 素 ， 如 P、 Fe、 Cu、Mo、 I 等。各种蛋白质的含氮量都很接近，都在16% 左右，因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量， 1 克氮就相当于 6.25 克蛋白质。

10-5

主要内容：

氨基酸的化学

肽

蛋白质的结构与功能

蛋白质的理化性质及其分离纯化

第一节 氨基酸化学

蛋白质用 H+，OH- 或酶彻底水解，可以得到许多种氨基酸的混合物，氨基酸是构成蛋白质的基本单位。

组成蛋白质的基本 ( 标准 ) 氨基酸（ amino acid， Aa ）有 20 种。

这些氨基酸中，大部分属于 L-- 氨基酸。其中，脯氨酸属于 L-- 亚氨基酸，而甘氨酸则属于 -氨基酸。

一、蛋白质的基本单位—— L-L--- 氨基氨基酸酸

1. L-1. L--- 氨基氨基酸的结构通式及分子构型酸的结构通式及分子构型

H3N C H

COO

R

-

+ ¦Á H2N C H

COOH

R

¦Á或

结构通式 ( 投影式 )

与羧基相邻的 α- 碳原子上都有一个氨基，因而称为 α- 氨基酸

构型：分子中各原子或基团之间的连接方式称为分子的构型。组成蛋白质的氨基酸除 Gly 以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为 D- 型和L- 型。

L-- 氨基酸的分子构型(configurition)

2. 基本氨基酸的分类、结构及代号

(1) 按侧链 R 基的结构

氨基酸的分类

(2) 按侧链 R 基的极性

极性和非极性分类与后面相矛盾？？

氨基酸的结构及代号 :

(non-polar, hydrophobic)

色氨酸 tryptophan Trp(Try) W 5.89

丝氨酸 serine Ser S 5.68

酪氨酸 tyrosine Tyr Y 5.66

半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07

蛋氨酸 methionine Met M 5.74

天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41

谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65

苏氨酸 threonine Thr T 5.60

(polar, uncharged)

(acidic)

(basic)

特殊氨基酸 (Special amino acids) – Gly

• 无光学活性 (optically inactive)

C H

H

-OOC

+H3N 蛋 白 质 多 肽 中Gly 残基的存在将增加其结构区域 的 柔 性 ， 而Pro 残基的存在则相反，将会增加其结构区域的刚性，

＊

具 环 式 结 构 的亚氨基酸 (ring structure and imino acid)

特殊氨基酸 (Special amino acids) – Pro

蛋 白 质 多 肽 中Pro 残 基 的 存 在将 会 增 加 其 结 构区 域 的 刚 性 ， 而Gly 残 基 的 存 在则 相 反 ， 将 增 加其 结 构 区 域 的 柔性

＊

＊

• 具有活性的巯基 (active thiol) 易氧化形成二硫键(disulfide bond), 可用作还原剂 ( reducing reagent)

特殊氨基酸 (Special amino acids) – Cys

特殊氨基酸 (Special amino acids) –His

组 氨 酸 侧 链为一个 咪 唑 基 ，在酸碱 催 化 中 起重要作用

＊

特殊氨基酸 (Special amino acids) –Phe, Tyr 和 Trp

蛋白质分子中 Phe, Tyr和 Trp 残基的存在使得蛋白质在近紫外区 (220-300nm) 有特征性吸收

＊

3. 蛋白质分子中不常见不常见 (( 非标准非标准 )) 的的 LL---- 氨基氨基酸酸

在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为非标准 (non-standard) 氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本 ( 标准 ) 氨基酸衍生而来的。其中重要的有 4- 羟基脯氨酸、 5- 羟基赖氨酸、 N- 甲基赖氨酸、 3,5- 二碘酪氨酸和硒代半胱氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下：

硒代半胱氨酸 (Selenocysteine)

NH

HO

COOH

4-ôÇ»ù¸¬°±Ëá

H2NCH2CHCH2CH2CHCOOH

OH NH2

5-ôÇ»ùÀµ°±Ëá

NH2

CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH

6-N-¼×»ùÀµ°±Ëá

HO

I

I

CH2CHCOOH

NH2

3,5-¶þµâÀÒ°±Ëá

(4-hydroxyproline (Hpro))(5-hydroxylysine)

(6-N-methyllysine)

(Diiodinotyrosine)

二、天然的非蛋白质氨基酸

在细胞内已发现的非蛋白组成成分的氨基酸有300 多种，尽管它们不是蛋白质的构成成分，但具有广泛的生物学功能。

如在尿素循环中的关键代谢中间产物：

L- 瓜氨酸：H2N-C-NH-CH2-CH2-CH2-CH-COO －

O NH3＋(Citrulline)

L- 鸟氨酸： H3N-CH2-CH2-CH2-CH-COO －

NH3＋

+

(Ornithine)

1. 氨基酸的一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶 , 其形状因构型而异(1) 溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解

于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。

(2) 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在 200℃以上。(3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的味甜、

有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。(4) 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光

平面向左或向右旋转，左旋者通常用（ - ）表示，右旋者用（ +) 表示。

(5) 光吸收：构成蛋白质的 20 种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区 (<220nm) 均有光吸收。在近紫外区 (220-300nm) 只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。

三 . 氨基酸的主要理化性质

• 酪氨酸的 max＝275nm， 275=1.4x103;

• 苯丙氨酸的 max＝257nm， 257=2.0x102;

• 色氨酸的 max＝280nm， 280=5.6x103;

2. 氨基酸的主要化学性质

(1) 氨基酸的离解性质及等电点

BrÖnsted 的酸碱理论，即广义酸碱理论。

HA A- + H

+

酸 碱 质子

氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。

H2N C H

COO

R

H3N C H

COO

R

-

+

-

+ H+

As an acid（ proton donor）：

As a base（ proton acceptor）：

H3N C H

COOH

R

H3N C H

COO

R

-

++ H+ +

不同 pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：

H3N C H

COOH

R

H3N C H

COO

R

-

++

+ H+

+ OH-

+ H+

+ OH-

H2N C H

COO

R

-

正离子 两性离子 负离子

氨基酸所带静电荷为“零”时，溶液的 pH值称为该氨基酸的等电点（ isoelectric point），以 pI表示。

实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。

当溶液的 pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。 pH<pI时，氨基酸主要以正离子形式存在。 pH>pI时，氨基酸主要以负离子形式存在。

H3N C H

COOH

R

H3N C H

COO

R

-

++H2N C H

COO

R

-

H2N C H

COOH

R

(a) 氨基酸的酸碱滴定曲线 Henderson-Hasselbalch 方程

pH=pKa + lg[质子受体 ][质子供体 ]

酸碱滴定曲线

等电点的计算

(b) 等电点的计算

中性氨基酸：以 Gly 为例

[H+]2=K1K2

pH=（ pK1+pK2） /2

pI=（ pK1+pK2） /2

pI =（ 2.34+9.60） /2=5.97Gly

K1= [Gly±] [H+][Gly+]

K2= [Gly- ] [H+][Gly±]

pI时，[Gly+ ] = [Gly- ]

[Gly±] [H+]K1

= [Gly±] K2

[H+]

H3N CH2

COOH

H3N CH2

COO-

++H2N CH2

COO-

Gly+Gly

+- Gly-

H+

K1

H+

K2

酸性氨基酸，以 Asp 为例：

Asp+Asp- Asp=Asp+

碱性氨基酸，以 Lys 为例：

Lys++

（ 2 ）氨基酸的化学反应

α- 氨基参加的反应

（ a ）成盐作用

R CH COOH

NH2

+ HCl R CH COOH

NH2 HCl¡¤

（ b ）与HNO2 的反应

R CH COOH

NH2

+ HNO2 R CH COOH

OH

+ H2O + N2 ¡ü

（ c ）与甲醛的反应

（ d ）酰基化反应及常用的酰基化试剂

酰氯：

R CH COOH

NH2

+ R'X R CH COOH

NHR'

+ HX

苄氧酰氯（ Cbz-Cl） :

对甲苯磺酰氯 (Tos-Cl)or5 一二甲氨基萘 -1-磺酰氯(dansyl chloride, DNS):

叔丁氧酰氯 (Boc-Cl):

CH2 O C

O

Cl

S Cl

O

O

H3C

O C Cl

O

C

CH3

H3C

CH3酸酐：

邻苯二甲酸酐：C

O

C

O

O

（ R’＝酰基）

or

+CH2 O C

O

Cl H2N CH

COONa

R

在弱碱中（后酸化）

Cbz-Cl

CH2 O C

O

N CH

COOH

RH

+ Na+ + Cl-

Cbz- 氨基酸

举例 1 ：

氨基酸与苄氧酰氯（ Cbz-Cl ）的反应

氨基酸与 5 一二甲氨基萘 -1-磺酰氯（ dansyl chloride, DNS ）的反应

H2NHC COOH

R

NH3C CH3

S OO

Cl

+

NH3C CH3

S OO

HNHC COOH

R

+ HCl

DNS-Cl

DNS-氨基酸

举例 2 ：

（ e ）烃基化反应

(f) 与 2 、 4 一二硝基氟苯的反应

2 ， 4 一二硝基氟苯

R CH COOH

NH2

+ R'X R CH COOH

NHR'

+ HX

（ R’＝烃基）

FO2N

NO2

2

4

H2NHC COOH

R

+FO2N

NO2

在弱碱中

DNFB

HN

HC COOH

R

+ F-

O2N

NO2

DNP- 氨基酸（黄色）

(g) 与苯异硫氰酸（酯）的反应

H2N C COOH

R

+ 在弱碱中N C S

H

PITC

PTC- 氨基酸 PTH- 氨基酸

N

CN

C

C

H HO

O

H

RH

S

H+

N

CN

C

CO

H

R

H

S

α- 羧基参加的反应

（ a ）成盐和成酯反应

H2N C COOH

R

H+ NaOH

+ C2H5OH

¸ÉÔï

H2N C COONa + H2O

R

H

H2N C COOC2H5 + H2O

R

H

HCl¡¤HCl

YHN CH

R

COOH + NO2HO

酰化氨基酸 对硝基苯酚

YHN CH

R

C NO2O

O

+ H2O

酰化氨基酸对 -硝基苯酯（活化酯）

（式中 Y＝酰基）

（ b ）成酰氯反应

YHN CH

R

COOH + PCl5

YHN CH

R

C Cl

O

+ POCl3 + HCl

（ c ）成酰胺反应

体外：

R CH

NH2

COOC2H5 + HNH2 R CH

NH2

C NH2

O

+ C2H5OH

体内：

Asp + NH4ATP

酶 Asn+

（ d ）脱羧基反应

R CH

NH2

COOH脱羧酶

CO2 + RCH2NH2¡ü

COOH

(CH2)2

CHNH2

COOH

大肠杆菌脱羧酶

COOH

(CH2)2

CH2NH2

+ CO2 ¡ü

（ e ）叠氮反应

R

CHH2N COOH

R

CHYHN COOH

R

CHYHN COOCH3

NH2NH2

£¨£ CH 3OH£©

R

CHYHN CO NH NH2

HNO2

R

CHYHN CON3 + 2H2O

α- 氨基和 α- 羧基共同参加的反应

(a) 茚三酮反应

（ b ）成肽键

R

CHH3N C+

O

1

+

R

CHN COO

2

H

H-OH

H2O

R

CHH3N C+

O

1R

CHN COO

2

H-

侧链 R 基参加的主要反应

(a) -S-S- 和 -SH 的氧化还原反应

R-SH： HS-CH2CH2OH 巯基乙醇（ mercaptoethanol ）

HS-CH2COOH 巯基乙酸（ mercaptoacetic acid ）

HS-CH2(CHOH)2-CH2SH 二硫苏糖醇（ dithiothreitol, DTT ）

H2N CH COOH

CH2

S

S

CH2

CH COOHH2N

6HCOOOHH2N CH COOH

CH2

SO3H

2 + 6HCOOH

2R£ SHCH COOHH2N

CH2 SH

+ R£ S£ S£ R2

（ b ）苯环的黄色反应

phe+ 少量浓H2SO4+ 浓HNO3

黄色

Tyror

Trp+ 浓 HNO3 黄色

（ c ）酚基的 Millon 反应（米伦氏反应）

HgNO3

Tyr+ Hg(NO3)2 红色

HNO3

or

（ d） pauly

反应 His + 重氮苯磺酸 红色（棕红色）

Tyr + 重氮苯磺酸 橘黄色

（ e） Folin 一酚反应

+磷钼酸 Tyr

磷钨酸 Trp蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）

四　氨基酸分析分离

1．分配层析法的一般原理：

分配系数 Kd=CA

CB

CA ：一种物质在 A 相（流动相）中的浓度

CB ：一种物质在 B 相（固定相）中的浓度

　　主要根据被分析的样品（如 aa 混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的，

逆流分溶（逆流分配）

2　纸层析 单向纸层析图

Rf值

双向纸层析图

3　薄层层析

4　离子交换层析

原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子

交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种

离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程

中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。 这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与

极性，非极性有关。

　　阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基 -SO3H 强酸型），羧基 -COOH （弱酸型）

阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基 -N+

(CH3)3OH-

5　高效液相层析（ high performance (pressure) liguid

chromatography, HPLC）

HPLC 的特点 :

HPLC 分离氨基酸的灵敏度高，可达到 10-12mol 水平

固相支持物颗粒小，比表面积大溶剂系统采用高压，流速快

适于各种类型的支持物的柱层析

（ 1 ）反相柱

（ 2 ）正向柱

HPLC 常用的层析柱：

第二节　肽 (peptides)

一、肽键 (peptide bond)

一个 Aa 的氨基与另一个 Aa 的羧基脱去一分子 H2O 形成的共价酰胺键。

1. 定义：

2. 肽键的特点

＊ 肽 键 的 特 点 是 氮原 子 上 的 孤 对 电 子与 羰 基 具 有 明 显 的共轭作用。＊ 组 成 肽 键 的 原 子处于同一平面。＊肽键中的 C-N 键具有部分双键性质，不能自由旋转。＊在大多数情况下，以反式结构存在。＊ 在 细 胞 内 环境条件下 ， 肽 键 相对稳定

二、肽（ peptides ）

1. 几个相关的概念

肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。组成肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。　　

肽与氨基酸残基：

由两个氨基酸残基组成的肽称为二肽 (dipeptide)；由三个以上十个以下氨基酸残基组成的肽称为寡肽 (oligopeptide)；由多个氨基酸组成的肽则称为多肽 (polypeptide), 亦称多肽链。

二肽，寡肽与多肽：

通常在多肽链的一端含有一个游离的 - 氨基，称为氨基端或 N-端；在另一端含有一个游离的 - 羧基，称为羧基端或 C-端。

H2N CH C

R1 O

HN CH C

R2 O

HN CH C

R3 O

HN CH COH

Rn O

N 端 氨基酸残基 氨基酸残基 C 端

肽链书写方式： N端→ C端

注：肽链可以是链状、环状或分支状。

肽链的 N-端与 C-端：

氨基酸顺序：在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序，氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以 C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。

C C N C C N C C N C C N C

CH2 CH CH2 CH2 CH2

COO-

OH CO2H CH2

CONH2OH

CH3

H3N+

O O O OH H H H H

H H H H

Ser Val Tyr Asp Gln

CH3

N-¶Ë C-¶Ë

ëļü

上述五肽可简写表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

肽链的表示法 ( 简写 )

多肽与蛋白质

蛋白质是由一条或多条多肽 (polypeptide) 链以特殊方式结合而成的生物大分子。

蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在 6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。

蛋白质分子量变化范围很大 , 从大约 6000 到 1000000道尔顿甚至更大。

2. 肽的理化性质

(1)．两性解离与等电点

肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末

端氨基、末端羧基和侧链 R 基。

由于肽中 N 端自由氨基和 C 端自由羧基之间的距离比氨基酸中

的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中 C 端 -COOH的 pK

略大于氨基酸中的 pK值， pK1↑。 N 端 -NH+3 的 pK略小于氨

基酸中的 pK值， pK2↓。 R 基的 pK变化不大。 肽的等电点：肽所带净电荷为“零”时，溶液的 pH值。

例：已知末端 α-COOH， pK3.6 ，末端 α-NH3+pK8.0 ε-

NH+3pK10.6 。

计算 Ala-Ala-Lys-Ala 的等电点。

pK 10.6P COO

NH2

NH2(¦Å)

-

P-

pI=(8.0＋ 10.6) /2

=9.3

P COOH

NH3

NH3(¦Å)

pK 3.6P COO

NH3

NH3(¦Å)

+

+

+

+

pK 8.0P COO

NH2

NH3(¦Å)+

- -

P++ P

++- P

+-

(2) 肽的化学性质

肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离、等电点等，但肽有与氨基酸不同的特殊反应

（ a ）双缩脲反应

（ b ）肽键的紫外吸收 210～ 230nm

C O

NH2

NH2

C O

NH2

NH2

加热

C O

NH2

NH

C O

NH2

+ NH3¡ü

双缩脲 ＋ 碱性 CuSO4溶液 紫色

3. 天然存在的某些活性肽

(1) 肌肽和鹅肌肽

肌肽（ carnosine） :β-Ala-His

鹅肌肽（ anserine）： β-Ala-1-Me-His

(2) 谷胱甘肽 (glutathione,GSH)

GSH 过氧化物酶

H2O2 2GSH

2H2O

GSSG

GSH 还原酶

NADPH+H+

NADP+

As a reductant to protect nucleic acids and proteins from toxin by discharging free radical or H2O2

(3) 多肽抗菌素

(4) 多肽激素

• 种类较多，生理功能各异。

• 多肽类激素主要见于垂体及下丘脑分泌的激素，如催产素（ 9 肽）、加压素（ 9 肽）、促肾上腺皮质激素（ 39 肽）、促甲状腺素释放激素（ 3

肽）。

• 神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（ 5 肽）、 - 内啡肽（ 31 肽）、强啡肽（ 17

肽）等。

垂体后叶激素如催产素和加压素

促甲状腺素释放激素 (thyrotropin-release hormone， TRH )

如由下丘脑分泌的激素之一 促甲状腺素释放激素

(5) 神经肽

甲硫氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Met 亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu

功能：镇痛

例如脑啡肽 (enkephalin) ：

Responsible for signal transduction (信号转导 ) in neurotransmission

　脑啡肽 (enkephalin)；内啡肽 (Endorphin)；强啡肽 (dynorphin)； P 物质 (Substance P)；神经肽 Y (neuropeptide Y)

4 肽的人工合成

(1) 概况

20世纪初 E. Fischer ：以氨基酸为原料合成了一个十八肽。

1932年 M.Bergman: Cbz

1953年美国 Du.Vigneaud ：生物活性的催产素

1965年中国：生物活性的牛胰岛素

1962年美国Merrifield ：固相合成法

(2) 合成方法

（ a ）液相合成法

① 用缩合剂的方法

氨基保护基 Y： Cbz、 Boc、 Tosyl

C

O

CO

S

O

O

H3C

苄氧甲酰基(CGZ)：

叔丁氧甲酰基(BOC)：

对甲苯磺酰基(Tosyl)：

甲酯（ OMe ）：CH3O-

乙酯（ OEt ）：C2H5O-

苄酯（ OBzl）：

叔丁酯（ OBut ）：

羧基保护基 Z：

缩合剂： N， N′ 一二环己基碳二亚胺（ N， N′-dicyclohexyl

carbodiimide ，缩写 DCCI或 DCC ）

脱去氨基保护基的方法：

Boc 用酸，如 50% 三氟醋酸脱去

Tosyl 用钠氨还原法

脱去羧基保护基的方法：

苄酯（ OBzl ）用催化加氢法

叔丁酯（ OBut ）用酸，如 50% 三氟醋酸脱去

Cbz 用催化加氢法

甲酯或乙酯用皂化法

② 将参与肽键合成的羧基和氨基活化

羧基的活化 :

氨基的活化：

接肽时加入有机碱如三乙胺或 KHCO3 等，保证氨基处

于自由状态，氨基即活化。

早期用酰氯，但反应太激烈，后来采用叠氮法，而现在用了最多的是活化酯法和混合酸酐法。

BOC

BOC

BOC

BOC

BOCAmino acid protected by t-butyloxycarboxyl

(BOC)

(b) 固相合成法

一、蛋白质的分类

（一）根据蛋白质分子的形状

1 ． 球 状 蛋 白 质 （ globular protein）

2．纤维状蛋白质（ fibrous protein）

第三节 蛋白质的结构与功能

（二）根据组成和溶解度1．单纯蛋白质（ simple protein） : 也称简单蛋白质，完全由氨基酸组 成的蛋白质。单纯蛋白质的分类（根据溶解度的不同） (1) 清蛋白 (albumin) ：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。如血清清蛋白。

(2) 球蛋白 (globulin) ：不溶于水而溶于稀盐溶液，如血清球蛋白。 (3) 谷蛋白 (glutelin) ：不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱，　 如米谷蛋白。 (4) 谷醇溶蛋白 (prolamine) ：不溶于水，但溶于 70%~80%乙醇，如玉米 醇溶蛋白。 (5) 组蛋白 (histone) ：溶于水及稀酸溶液，分子中含 Arg、 Lys 较多 ,呈 （弱）碱性，如小牛胸腺组蛋白。 (6) 鱼精蛋白 (protamine) ：溶于水及稀酸溶液，分子中含碱性氨基酸特 别多，呈（强）碱性，如鲑精蛋白。 (7) 硬蛋白 (scleroprotein) ：不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液。如胶原 蛋白、角蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白等。

2．结合蛋白质（ conjugated protein）：亦称复合蛋白质， 由蛋白质和非蛋白质两部分组成。

结合蛋白质的分类（根据非蛋白质即辅基的不同）

(1) 糖蛋白（ glycoprotein）：含糖类，如胶原蛋白。

(2) 脂蛋白（ lipoprotein）：含脂类，如血浆脂蛋白。

(3) 核蛋白（ nucleoprotein）：含核酸，如核糖体。

(4) 磷蛋白（ phosphoprotein）：含磷酸，如酪蛋白。

(5) 金属蛋白（ metalloprotein）：含金属，如铁蛋白含 Fe 。

(6) 血红素蛋白（ hemoprotein）：辅基为血红素，如血红蛋白。

(7) 黄素蛋白（ flavoprotein）：辅基为黄素（ FAD或 FMN ）， 如琥珀酸脱氢酶（含 FAD ）。

（三）根据功能

1.　非结构蛋白质

包括酶、激素蛋白、运输蛋白（转运蛋白）、贮存蛋白、运动蛋白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等。

2.　结构蛋白质

对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。

为了对蛋白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。

蛋白质的一级结构又称初级结构，二级结构、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结构或构象。

二、蛋白质的结构

随着蛋白质化学研究的进展，认为在二级结构和三级结构之间还可划分超二级结构和结构域两个层次，所以蛋白质的结构层次为：

一级结构 二级结构 超二级结构

结构域 三级结构 四级结构

（一）蛋白质的一级结构（ primary structure）

1．定义：

蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的线性排列顺序（ sequence ）。

氨基酸顺序书写时，从 N- 末端 (N-terminus) 至 C- 末端 (C-terminus).

肽键 (peptide bond) 和二硫键 (disulfide bond) 均属于蛋白质一级结构 .

2．蛋白质一级结构的测定

序列测定前的准备工作：

样品的纯度

相对分子质量

肽链的数目

氨基酸组成

一级结构的测定主要用小片段重叠法原理：

Analysis of aa sequence in the polypeptide (protein sequencing)

• Sanger.1953, insulin Nobel prize

Major step: purification, disulfide bond break(single chain)1. HCl degradation(6N, 110,180C,36h), aa composition, aa

seperation by ion exchange chromatography.2. N-terminal(DNP, Dansyl-Cl), C-terminal (carboxylase) chemical method, enzymetic method3. Peptide chain peptide fragment Enzyme. Trypsin (Lys. Arg), Chymotrypsin(Phe, Tyr, Trp), BrCN(Met) Seperation4. Sequencing aa of peptide fragment Edman reation (degradation, phenlythisoctanate, 异硫氰酸苯

脂）

Aa sequencing

苯乙内酰硫脲氨基酸

（ 1 ）肽链的拆开和分离与纯化

共价键： 主要是二硫键折分

分离纯化：

采用还原法或氧化法

序列测定步骤与方法

• Dialysis (透析 )

• Acetone precipitation and salt

precipitation (沉淀 )

• Electrophoresis (电泳 )

• Chromatography (层析 )

• Ultracentrifugation (超离心 )

（ 2 ）末端分析：包括 N端分析， C端分析

N端分析方法

① 二硝基氟苯法（ DNP法、 DNFB法或 FDNB法）

② 丹磺酰氯法（ DNS法）

③ 苯异硫氰酸 (酯 )法（ PITC法、 PTC法、 PTH法、 Edman降解法 ）

④ 氨肽酶（ aminopeptidase, Apase ）法

Ala Val

Gly

亮氨酸氨肽酶（ Leucine amino peptidase, LAP）

专一性 :

A= 非极性氨基酸时 快

A= 其它氨基酸时 慢

A B

N端

A=Leu时 最快

C端分析

① 硼氢化锂还原法

HN CH COOH

R

LiBH4

HN CH CH2OH

R

水解

混合氨基酸 H2N CH CH2OH

R

+

C端

② 肼解法：也称联氨法

③ 羧肽酶（ carboxypeptidase, Cpase ）法

4 种羧肽酶的来源和专一性

羧肽酶 来源 专一性

CpA 胰脏 能释放除 pro 、 Arg 和 Lys 以外的所有 C端氨基酸

CpB 胰脏 主要水解 C 端为 Arg 或 Lys 的肽键

CpC 植物或微生物 相当广泛，几乎能释放 C端的所有氨基酸

CpY 面包酵母 可释放 C端所有氨基酸

（ 3 ）肽链的氨基酸组成分析

酸水解：通常用 6Mol/L HCl

HPLC 分析 Aa 组成

（ 4 ）肽链的部分水解

化学方法：

溴化氰（ CNBr ）裂解法 :

酶解方法

Cleavage reagent ( 裂解剂 )

Cleavage site ( 裂解位点 )

Trypsin ( 胰蛋白酶 ) Lys, Arg (C)

Chymotrypsin ( 胰凝乳蛋白酶 ) Phe, Tyr, Trp (C)

弹性蛋白酶 Ala, Gly, Ser, Val (C)

胃蛋白酶 Phe, Trp, Tyr (N)

Staphylococcus aureus Glu (C)

Cyanogen bromide ( 溴化氰 ) Met (C)

Hydroxylamine ( 羟胺 ) Asn—Gly

（ 5 ）肽段的分离和氨基酸序列测定 • Edman降解（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也

是一种 N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。

（ 6 ）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列

（ 7）二硫键位置的确定 对角线电泳

（ 8）酰胺基位置的确定

Aa composition analysis

Result:

A 5, C 2, D 3, E 0, F 1, G 3, H 2, I 3,K 2, L 2, M 2, N 2, P 3, Q 1, R 1, S 2, T1, V 1, W 2, Y 0

Conclusion:

Polypeptide has 38 Aa; Trypsin will cleave at one R(Arg) and two K(Lys), to give four fragments. Cyannogen bromide will cleave at two M(Met) to give three fragments

Treat with FDNB, hydrolyze, separate Aa

2,4-dinitrophenyl-Asn detected

N (Asn) is amino-terminal residues

S S

Cleave with cyanogen bromide, separate fragments

C-1: NGAAWHDFNPIDPRGASM

C-2: TKQCVHSD

C-3: ALIKWLIACGPM

C-3 overlap with T-1 and T-4, allowing them to be orderedSequence on

sequencer

Sequence established

NGAAWHDFNPFDPRGASMALIKWLIACGPMTKQCVHSD

T-2 T-1 T-4 T-3

C-1 C-3 C-2

(C) -S-S-

(b)

HS SH

T-1: GASMALIK

T-2: NGAAWHDFNPIDPR

T-3: QCVHSDT-4: WLIACGPMTK

T-2 placed at amino-terminus because it begins with N(Asn); T-3 place at carbooxyl terminus because it does not end with R(Arg) or K(Lys).

Cleave with trypsin,separate fragments

Sequence on sequencer

3. 根据 DNA序列推测蛋白质氨基酸序列（ Deduction from DNA sequence）

Isolate the genes encoding the protein

DNA sequencing

mRNA sequencing

Dedermine the AA sequence according to the 3-letter codons

4．蛋白质序列数据库

(1) PIR（ Protein Information Resource ）数据库

(2) SWISS-PROT 数据库

（二）蛋白质的三维结构

1. 蛋白质的二级结构 一条多肽链中相邻氨基酸残基在空间上的有规则的、重复的排列－－蛋白质的二级结构。(refers to regular, recurring arrangements in space of adjacent amino acid residues in a peptide chain)

• Repeated connection of N(-H), C, and C(=O)

• H-bond formation

• Without including side chains -helix (-螺旋 )

-pleated sheet (-折叠 ) -turn (-bend) (-转角 )Random coil (无规则卷曲 )

定义：

肽单元 ( 酰胺平面或肽键平面 )在肽链中每 6 个原了 C-C(=O)-N(-H)-C 构成一个肽单元

Peptide unit plane can rotate freely around C-C and C-N bonds, namely, the torsion angles (平面转角 ) and

Peptide unit is planar and rigid

C=O and N-H groups are in trans conformation

Peptide unit plane can rotate freely around C-C and C-N bonds, namely, the torsion angles ( 平面转角 ) and

酰胺平面的特性

Both and are defined as 0o, in the conformation in which the two peptide bonds connected to a single C are in the same plane( 连 接 在 同一个 C 原子上的两个肽键平面处在同一平面时定义 和 均为零度 )

多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以碳原子相隔。ψ和φ这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置，也就决定了肽链的构象。

(1) -helix ( -螺旋 ) 1950年美国 Pauling 等人在研究纤维状蛋白质时，提出了 α-螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在 α-螺旋。

① 蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每 3.6 个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为 0.54nm ，每个氨基酸残基沿轴上升 0.15nm ，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转 100º。 ② 在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。

③ - 螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。

-螺旋结构的要点如下：

左手和右手螺旋

-螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。

The -CO group of peptide unit n is H-bonded to the -NH group of peptide unit (n+3).

一些侧链基团虽然不参与螺旋，但他们可影响 -螺旋的稳定性

在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸， -螺旋就不稳定 ●

在多肽链中只要出现 pro ， -螺旋就被中断，产生一个弯曲

（ bend ）或结节（ kink ）

●

Gly的 R 基太小，难以形成 -螺旋所需的两面角，所以和 Pro 一

样也是螺旋的最大破坏者

●

肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如 Ile ，由于空间位阻，也难以

形成 -螺旋

●

● 在蛋白质的 α-螺旋中若 N端为带负电荷的氨基酸有利于中和 N端 δ+ ，因而使其 α-螺旋稳定。

(2) β- Sheet (β-折叠 )

也是 pauling 等人提出来的，它

是与 - 螺旋完全不同的一种结构。

HO

① β-折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。

② 在两条相邻的肽链之间形成氢链。

③ β-折叠有平行 (parallel) 和反平行 (antiparallel) 的两种形式 :

④ 每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是 0.325nm ，反平 行的是 0.35nm 。

(3) β-turn (β-转角 )

β-转角是指蛋白质分子的多肽链经常出现 180º的回折，在回折角上的结构就称 β-转角，也称发夹结构，或称 U 形转折。由第一个氨基酸残基的 C=O 与第四个氨基酸残基的 N—H 之间形成氢键。

Gly and Pro residues often occur in -turn

　　没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象．不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同．分两类：　　

（４）自由回转

② 连接条带

① 紧密环如 Ω 环

Ω 环

Side chains and secondary structure

• Shape: Pro having a rigid ring (–helix disrupter)

• Size: -sheet need small side chain; Leu, Ile, Trp, and Asn having bulky sides (hard to form –helix)

• Charge: too many charged AAs in a short region of one peptide repel each other (hard to form –helix)

在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构： αα；ββ ； βαβ ；βββ ．

α α ββ

βαβ

２． Supersecondary Strructure and Domain(超二级结构和结构域 )

(1) Supersecondary Structure

超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．

两个 βαβ聚集体连在一起形成 βαβ αβ 结构，称 Rossmann折叠

Rossmann Sheet (折叠 )

βαβ Rossmann折叠

① 结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。

② 结构域一般由 100~200 个氨基酸残基组成，但大小范围可达 40~400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的．

③ 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上．

④ 结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。

⑤ 在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性．

（２） Domain ( 结构域 )

结构域是 1970年 Edelman提出的，它是指在较大的球状蛋白质分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就是结构域。

对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，大的蛋白质分子可以由 2 个或更多个结构域组成。

结构域有时也称功能域，功能域是指有功能的部分功能域可以是一个结构域，也可以是两个或两个以上的结构域组成。

从动力学的角度耒看，一条长的多肽链先折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构要比直接折叠成三级结构更合理。从功能的角度耒看，酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间，因为连接各个结构域的常常是一条松散的肽链，使结构域在空间上摆动比较自由，容易形成适合底物结合的空间。

Methyl-accepting chemotaxin

Protein structure － Domains, motifs and families

Domains: structurally independent units of many proteins, connected by sections with limited higher order structure within the same polypeptide. (Figure)

They can also have specific function such as substrate binding

Structural motifs: • Groupings of secondary structural elements that

frequently occur in globular proteins• Often have functional significance and represent the

essential parts of binding or catalytic sites conserved among a protein family

motif

Protein families: structurally and functionally related proteins from different sources

The primary structures of c-type cytochromes from different organisms

Motif Motif

The tertiary structures of the above c-type cytochromes

Cys, Met and His side chains covalently linked to the heme to the protein

Domain

3. Tertiary Structures ( 三级结构 )

• Factors affecting the 3D structurehydrophobic interaction (疏水作用 )ionic interaction ( 离子作用 )hydrogen bonds (氢键 )van der Waals force (范德华力 )

The relative spatial position of all residues of a protein, i.e., the three-dimensional (3D)arrangement of all atoms

(1)

(2)

a. Hydrophobic interaction

• Nonpolar molecules tend to cluster together in water, that is, aqueous environment tends to squeeze nonpolar molecules together.

• A charged group is able to attract an opposite charged group.

• The force is given by Coulomb’s law

b. Ionic interaction

c. Hydrogen bond

• A hydrogen atom is shared by two other atoms. • H-donor( 供体 ): the atom to which H atom is

more tightly attached, and the other is H-acceptor( 受体 ).

• An asymmetric electronic charge around an atom causes a similar asymmetry around its neighboring atoms.

• The attraction between a

pair of atoms increases as they come closer, until they are repelled by van der Waals contact distance.

d. van der Waals force

Interactions stabilizing proteins

1963年 Kendrew 等通过鲸肌红蛋白的 x-射线衍射分析，测得了它的空间结构。　

(3) 例子

Ribonuclease( 核酸酶 )

Rhodopsin( 视紫红质 )

从目前对球状蛋白质二、三级结构研究的资料来看，它们有一些共同的特点：

(1) 在球状蛋白质分子中 , 一条多肽链往往通过一部分 α-螺旋， 一部分 β-折叠，一部分 β-转角和无规卷曲等使肽链折叠 盘绕成近似球状的构象。

(2) 球状蛋白质的大多数极性侧链总是暴露在分子表面形成亲 水面，而大多数非极性侧链总是埋在分子内部形成疏水核。 (3) 球状蛋白质的表面往往有内陷的空穴，空穴周围有许多疏 水侧链，是疏水区，这空穴往往是酶的活性部位或蛋白质 的功能部位。

4.Quaternary structure ( 四级结构 )

四级结构是指蛋白质的亚基聚合成大分子蛋白质的方式（亚基是指一条多肽链或以共价链连接在一起的几条多肽链组成的蛋白质分子的最小共价结构单位）。

(1) 定义：

The spatial arrangement of multiple subunits of a protein is referred to as the quaternary structure.

• Proteins need to have two or more polypeptide chains to function properly.

• Each individual polypeptide of the complete tertiary structure is called subunit ( 亚基 ).

• These subunits are associated by H-bonds, ionic interactions, and hydrophobic interactions.

• Polypeptide chains can be in dimer ( 二聚物 ), trimer ( 三聚物 ).., as well as homo- ( 同性 ) or hetero- ( 异性 ) form.

Ionic forces among Hb subunits

HemoglobinHemoglobinMyoglobinMyoglobin

Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.214

Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.195

小结

三、蛋白质的理化性质

蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似，但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物，也就出现了一些新的性质。

（一）胶体性质

由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。

蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。

- - ---

------

-++

++

+

+

++ +

+

+

+

----

--

---

--

-

蛋白质胶体颗粒的沉淀

+ +++

+

++

- --

-

- --+

-

（沉淀）（疏水胶体） （疏水胶体）

（二）酸碱性质和等电点

1. 蛋白质分子的可解离基团

2. 等电点

在某一 pH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH值就是蛋白质的等电点。

每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。

蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系 :

等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。

3. 等离子点

等离子点是蛋白质在不含其它溶质的纯水中，蛋白质所带净电荷为零时的溶液的 pH值。等离子点是一个常数。

4．蛋白质等电点的测定

等电聚焦

（三）电泳 (Electrophoresis)

移动的速度 v =E · Z f

• The charges and the molecular weights will determine their moving velocity in the electric field, leading to the separation of different proteins.

• The gel polymer material for protein separation is composed of methylenebisacrylamide and acrylamide.

• The pore size can be controlled by changing the concentration of cross-linking reagent.

• The gel with different concentration of cross-linking reagent can be used for different size proteins.

• Sodium dodecyl sulfate (SDS) is added into the protein solution to denature the protein.

• Anions of SDS bind to protein in the ratio of 1 SDS per 2 AAs.

• The protein-SDS complex is roughly charged proportional to the mass.

• The smaller the protein, the faster the moving speed.

( 四 ) 变性作用（ denaturation）

1．变性的概念和理论

概念：变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失。

理论：吴宪提出

肽链从紧密有序结构→松散无序的结构

2．变性的因素

物理因素 : 加热、紫外线、 X-射线、超声波等。

化学因素 : 酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸 胍）、重金属盐等。

3．变性蛋白质的特性

（ 1 ）生物活性全部或部分丧失

（ 2 ）一些侧链基团暴露，可滴定基团增加

（ 3 ）一些物理化学性质的改变

（ 4 ）生化性质的改变

4．变性的可逆性

蛋白质的一级结构决定高级结构

（五）凝固作用

变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固。

（六）沉淀作用

1．加酸沉淀蛋白质

2．加中性盐沉淀蛋白质

3．加有机溶剂沉淀蛋白质

4．加重金属盐沉淀蛋白质

5．加生物碱试剂沉淀蛋白质

（七）沉降作用

什么是沉降？

沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。

t ：时间（ sec ）x ：下沉的距离（ cm ）v =

dx dt

沉降常数（沉降系数）：当沉降界面以恒速移动时，单 位离心场中的沉降速度。

xw

vs

2 s ：沉降常数

v ：沉降速度（ cm/sec） w ：离心机转头的角速度（弧度 /sec ）x ：蛋白质界面中点离旋转中心的距离，以 cm 计。

瑞典的蛋白质化学家 T.Svedberg 1S=10-13秒。

（一）蛋白质一级结构与功能的关系

1．镰刀状红细胞贫血病（ sickle-cell anemia ）

四、蛋白质结构与功能的关系

Observed Normal range

Red cell count 2.6×106/ml 4.6～ 6.2×106/ml

Hemoglobin content 8g/100ml 14～ 18g/100ml

White cell count 15,250/ml 4,000～ 10,000/

ml

HbA β- 链： Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…

HbS β- 链： Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…

HbA（ adult hemoglobin ）HbS（ sickle-cell hemoglobin）

2．激素和它的前体分子

胰岛素和它的前体

（二）蛋白质的空间结构与功能的关系

以血红蛋白的别构效应为例说明蛋白质的空间结构与功能的关系

1．血红蛋白中血红素辅基的结构

2．血红素中的 Fe2+ 与氧结合前后价数不变

3．血红蛋白与氧的结合

4．血红蛋白的别构效应 (变构效应 )（ allosteric effect ）

氧合作用显著改变 Hb 的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从 T态→ R

态）T态（ tense state ）紧张态

R态（ relaxed state ）松驰态。

血红蛋白是由两个 α- 亚基和两个 β- 亚基组成的四聚体（ α2β2），有稳定的四级结构，

与氧的亲和力很弱，但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后。即引起该亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，使血红蛋白与氧结合的速度大大加快。

别构效应是指含亚基的蛋白质分子由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子构象、性质和功能发生变化。

5．波耳（ Bohr ）效应

H+和 CO2促进 HbO2释放 O2

6. 2 ， 3 一二磷酸甘油酸对 Hb 氧合的影响

Or 2, 3 - Bisphosphoglycerate (BPG)

Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.573

substrate

product

蛋白质四级结构有利于细胞生理反应

螺旋可以组合成更复杂的的构造

Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.173

可自 动组合的病毒外 壳蛋白

Alb

ert

s e

t a

l (2

00

2)

Mo

lecu

lar

Bio

log

y o

f th

e C

ell

(4e

) p

.15

3

五、蛋白质的分离、纯化和鉴定

一般包括五步

（一）细胞破碎 有机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器、在研缽中或球磨机上磨等。还有超声法、反复冻融法、自溶等方法。

（二）抽提

根据蛋白质的溶解性用适当溶剂来抽提，总的原则是要制备的蛋白质溶在什么溶剂中就用什么溶剂来抽提。

（三）分离

1．盐析法

在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白

质沉淀下来，常用的中性盐为 (NH4)2SO4、 NH4Cl 等。

2．有机溶剂沉淀法

常用的是乙醇、丙酮。

3．等电点沉淀

利用蛋白质在等电点时溶解度最小这一特性，可以调溶液的 pH ，尽量接近它的等电 点，而使蛋白质沉淀。

4．吸附法

吸附法是利用各种吸附剂和蛋白质结合能力（吸附能力）的不同来分离蛋白质。

5．透析和超滤

超滤法是最近几年发展起来的一种新技术，利用分子大小不同，来分离蛋白质。

透析

（四）纯化

1．离子交换层析

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素（ CM-C），阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（ DEAE-C ）。

2．凝胶过滤

也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。

常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名 Sephadex ） 聚丙烯酰胺凝胶 (商品名 Bio-GelP)

琼脂糖凝胶 (商品名因生产厂家而 不

同 )

4．亲和层析

这是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的一种方法。

蛋白质 ＋ 配体 蛋白质配体复合物

3．高效液相层析（ HPLC ）

这种分离纯化方法由于专一性强，理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。

5. 疏水层析

6. 电泳

7. 结晶

（五）鉴定

1．纯度鉴定

常用的方法有电泳法、超离心法等。

还有恒溶度法

2．分子量确定

（ 1） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）

SDS （十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。

SDS 可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。

（ 2 ）凝胶过滤法

原理 ：

3．等电点的测定

4．生物活性的测定

不同的蛋白质有不同的生物功能，也就有不同的生物活性测定的方法。