ΕSKAPE

Πολυανθεκτικά μικρόβια του 2014

Ε. ΠετεινάκηΕργαστήριο Μικροβιολογίας

Ιατρικού Τμήματος Πανεπιστημίου Θεσσαλίας

7έτος Φθινοπωρινές Ημέρες Παθολογίας‘’Λοιμώξεις’’, 26&27 /9/2014, Λουτρά Αριδαίας

Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΣΥΓΧΡΟΝΟΥ ΚΛΙΝΙΚΟΥ

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ

γρήγορη και αξιόπιστη ανίχνευση του αιτιολογικού παράγοντα της λοίμωξης

με στόχο

α. εστιασμένη θεραπεία

β. πρόληψη της διασποράς πολύ-ανθεκτικών βακτηρίων και περιορισμό των ενδο-νοσοκομειακών λοιμώξεων

Ταξινόμηση Μεθόδων

• ανίχνευση-ταυτοποίηση-έλεγχος ευαισθησίας του μικροοργανισμού

• χαρακτηρισμός μηχανισμών αντοχής (φαινοτυπικές δοκιμασίες, μοριακές μέθοδοι)

• χαρακτηρισμός-τυποποίηση κλώνων (επιδημιολογική διερεύνηση)

• ανάλυση των δεδομένων-προτάσεις για λήψη μέτρων πρόληψης διασποράς

Τι είναι ο κλώνος;

Τα θυγατρικά κύτταρα είναι πιστά αντίγραφα (?) των μητρικών!

Ο γονότυπος πρέπει να συμβάλλει και στην κατανόηση της εξέλιξης των βακτηρίων και στην ταξινόμησή τους

CID 2009:48:1

ESKAPE pathogens

Enterococcus faecium vancomycin-resistant (VRE)

Staphylococcus aureus methicillin-resistant (ΜRSA)

Klebsiella pneumoniae carbapenemaseproducerAcinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa carbapenemase-producerEnterobacter ESBLs producer Rice LB, Infect Control Hosp Epidemiol 2010;31 Suppl 1:S7-10.

Αντοχή σε καρβαπενέμες

Ενζυμικοί μηχανισμοί• Παραγωγή καρβαπενεμάσης (vim, KPC, NDM)• Yπερπαραγωγή AmpC

Μη ενζυμικοί μηχανισμοί• Απώλεια ή μειωμένη έκφραση πορίνης: OprD• Υπερέκφραση αντλίας: MexAB-OprM

ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ Α, Β, D Oι κλάσεις A και D είναι ένζυμα που

στην ενεργό θέση τους έχουν σερίνη ενώ

η κλάση B περιλαμβάνει ένζυμα τα οποία στην ενεργό θέση περιέχουν δισθενή κατιόντα ψευδαργύρου (μεταλλο-β-λακταμάσες)

Καρβαπενεμάσες στην Ελλάδα

• Κλάση Α (ΚPC)(αναστολή από βορονικό)

• Κλάση B (VIM,NDM)(αναστολή από EDTA)

• Κλάση D (OXA-23, OXA-51, OXA-58, OXA-48)

Εξέλιξη Καρμπαπενεμασών στην Ελλάδα

PseudomοnasVIM KlebsiellaVIM KlebsiellaKPC

1996 2003 2007

Tsakris A et al. Outbreak of infections caused by Pseudomonas aeruginosa producing VIM-1 carbapenemase in Greece. J Clin Microbiol. 2000; 38: 1290Miriagou V et al. Escherichia coli with a self-transferable, multiresistant plasmid coding for metallo-beta-lactamase VIM-1. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47:395Maltezou H et al. Outbreak of infection due to KPC-2-producing Klebsilla pneumoniae in a hospital in Crete (Greece).Journal of Infection 2009; 58: 213

Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae in Greece, 2013

Vatopoulos et al, DMID 1013,

• εισαγωγή στην Ελλάδα νέας καρβαπενεμάσης

• προσπάθεια μη διασποράς στα νοσηλευτικά ιδρύματα της χώρας

• κλώνος ST11 (Poirel 2011),

• αντοχή κινολόνες, αμινογλυκοσίδες

Συνεχής εξέλιξη

Petinaki et al, BMC Infect Dis 2013 Oct 29;13:505. Carbapenemase-producing Pseudomonas aeruginosa from Central Greece: molecular epidemiology and genetic analysis of class I integrons.

5’CS aacA4 blaVIM-1 *170bp 3’CS Accession no. AY152821 duplication

5’CS blaVIM-1 aacA27 3’CS Accession no. AY648125

5’CS blaVIM-1 aacA7 dfrA1 aadA1 3’CS Accession no. FR748152

5’CS blaVIM-1 aacA7 dfrA1 aadA15 3’CS Accession no. KF85016

5’CS aacA4 blaVIM-4 *170bp 3’CS Accession nos. AY702100, KF850517 duplication

a)

e)

b)

c)

d)

Identification and characterization of genetic structures coding for carbapenemases in enterobacteria

from Central Greece.

Petinaki et al, Diagn Microbiol Infect Dis, in press

Διασπορά KPC σε άλλα εντεροβακτηριακά:

εμπειρία στο ΠΝΛ

• Emergence of Escherichia coli sequence type 410 (ST410) with KPC-2 β-lactamase. Mavroidi A, Miriagou V, Malli E, Stefos A, Dalekos GN,

Tzouvelekis LS, Petinaki E. Int J Antimicrob Agents. 2012 Mar;39(3):247- 50

• Detection of Citrobacter koseri carrying beta-lactamase KPC-2 in a hospitalised patient, Greece, July 2011.

Mavroidi A, Neonakis I, Liakopoulos A, Papaioannou A, Ntala M, Tryposkiadis F, Miriagou V, Petinaki E. Euro Surveill. 2011 Oct 13;16(41)

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΥΤΟΜΑΤΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ

• Αξιόπιστη ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους

• Προσδιορισμό MIC (CLSI, EUCAST)

Φαινοτυπικές και μοριακές δοκιμασίες: επιδημιολογική διερεύνηση

Καρβαπενέμες (CLSI)

CLSI 2009/2011

mg/L

S≤ I ≥R

ERTAPENEM 2 /0.5 4/1 8/4

IMIPENEM 4/1 8/2 16/4

MEROPENEM 4/1 8/2 16/4

Μελέτη της επιδημιολογίας της αντοχής

• ασχολείται με την ταυτοποίηση των γονιδίων αντοχής

και τον τρόπο μεταφοράς τους από είδος σε είδος

• μελέτη της κλωνικής συγγένειας πολυανθεκτικών μικροβίων

MHT

Στέλεχος που παράγει καρβαπενεμάση τύπου A Με PCR ταυτοποιήθηκε το υπεύθυνο γονίδιο που κωδικοποιεί

ένζυμο KPC

Στέλεχος που παράγει καρβαπενεμάση Α+Β Με PCR ταυτοποήθηκαν τα υπεύθυνα γονίδια που

κωδικοποιούν ένζυμα VIM+KPC(+)

Τι καθορίζουν οι επιδημιολογικές μελέτες ;Τι καθορίζουν οι επιδημιολογικές μελέτες ;

• Αριθμό κλώνων που διασπείρονται στο νοσοκομείο

• Αριθμό κλώνων που ενέχονται σε λοιμώξεις• Πηγή διασποράς του κλώνου• Τρόπους διασποράς

• Αριθμό κλώνων που διασπείρονται στο νοσοκομείο

• Αριθμό κλώνων που ενέχονται σε λοιμώξεις• Πηγή διασποράς του κλώνου• Τρόπους διασποράς

MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 MWM

A A A A B B B B C C C C E E E E F F F F G G G G

145.5

194.0

242.5

291.0

388.0

485.0

97.0

Kb

Μοριακή τυποποίηση μετά από ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο

Ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας– MLST: multi locus sequence typing (7 house keeping

γονίδια) (mlst.net)

– Επιτήρηση της διασποράς των διαφόρων μικροργανισμών παγκόσμια

Έλεγχο για Αποικισμό

• ΜΕΘ Όλοι οι ασθενείς που εισάγονται στη ΜΕΘ• Κλινικό Τμήμα1. Ασθενείς με γνωστό αποικισμό ή λοίμωξη από

πολυανθεκτικό στέλεχος2. Ασθενείς με ιστορικό νοσηλείας κατά την οποία έλαβε

θεραπεία με καρβαπενέμες το τελευταίο 3μηνο3. Ασθενείς με ιστορικό νοσηλείας σε ΜΕΘ το τελευταίο 6μηνο4. Ασθενείς με ιστορικό νοσηλείας στην Ινδία ή το Πακιστάν

το τελευταίο 6μηνο

Νέες γρήγορες μέθοδοι για πολυανθεκτικόυς μικροοργανισμούς

• Eφαρμογή της MALDI TOF MS στον έλεγχο αποικισμού από πολυανθεκτικά μικρόβια

(ταυτοποίηση του μικροοργανισμού σε 1 λεπτό/ ανίχνευση αντοχής σε 2 ώρες)

• Εφαρμογή του blue-carba (ανίχνευση σε 2 ώρες αν το μικρόβιο παράγει καρβαπενεμάση,

πολύ οικονομική μέθοδος)

Η χρήση της MALDI TOF MS στον έλεγχο αποικισμού από πολυανθεκτικά μικρόβια

• Ταυτοποίηση μικροοργανισμού σε 1 λεπτό• Ανίχνευση καρβαπενεμάσης σε 2 ώρες

Πολύ οικονομική μέθοδος (ελάχιστο κόστος αντιδραστηρίων)Απαραίτητη η αγορά του μηχανήματος

Mass Spec αρχή λειτουργίας

Ionizer

Sample

+_

Mass Analyzer Detector

Πρωτείνες επιφανείας και ριβοσωμικές πρωτείνες

3000 5000 7000 9000 11000 13000

Mass (m/z)

1648.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Inten

sity

< < C :\D o k u m e n te u n d E in s te llu n g e n \m .e rh a rd \E ig e n e D a te ie n \A n a g n o s T e c -d c \Z w is c h e n a b la g e \D o k u m e n t B a n n e r.tx t> > S p e c [B P = 3

3775

7075

8074

8744

10939

9453

9994

7980

10347

5015

7863

11572

7092

5931

9654

3581

6837

9330

7367

10226

8450

10608

11906

Το Εργαστήριο του μέλλοντος…

Σε 1h.30’: 96 δείγματα

Blue-Carba

Απλή βιοχημική δοκιμασία για την ανίχνευση διαφόρων καρβαμενεμασών απευθείας από αποικίες

Παρακολούθηση υδρόλυσης ιμιπενέμης μέσω απελευθέρωσης Η⁺

Ως δείκτης αλλαγής PH χρησιμοποιείται το μπλέ της βρωμοθυμόλης

Ερμηνεία των αποτελεσμάτων σε 30΄ εως 2 ώρες

Βασισμένη στο Carba NP ( Nordmann- Poirel)

Αξιολόγηση αποτελεσμάτων

Στελέχη Blue-Carba (+)

Στέλεχος Blue-Carba(-)