15 listopad, 2011

Agnieszka Kaminska , Sylwester Gawinkowski, Tomasz Rolinski, Jacek Waluk, Robert Hołyst

Zadanie 19. Opracowanie podstaw budowy sensora przeciwciał na bazie powierzchni GaN i

ZnO modyfikowanych peptydami.

SEMINARIUM W RAMACH PROJEKTU „Kwantowe nanostruktury półprzewodnikowe do zastosowań w biologii i medycynie - Rozwój

i komercjalizacja nowej generacji urządzeń diagnostyki molekularnej opartych o nowe

polskie przyrządy półprzewodnikowe

InstytutChemii

Fizycznej PAN

Antigen-Antibody interactions

epitope

antibody

Sers platform

SERS spectrum – detects specific antibody-antigen binding event

Laser excitation

*The epitope is small (~6 amino acids or ~6 sugars) or a small part of a larger antigen

I. Zadania wykonane

1. Opracowanie aktywnej platformy do badań powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana ( ang. Surface enhanced

Raman Spectroscopy, SERS) bazującej na GaN

(1) Opracowanie procedur trawienia GaN ( we współpracy z IWC, Janusz Weyher, Igor Dzięcielewski)- sprawdzenie wpływu takich parametrów jak skład i proporcje roztworów używanych do trawienia, czas trawienia, wpływ właściwości warstw GaN tj. gęstości dyslokacji w celu otrzymania optymalnych podłoży do badań ramanowskich

SEM images of sample 185-4 after (a) photo-etching and (b) additional etching in hot KOH solution

SEM images of samples N1516-3.1 and -IV.1 after (a) 5 minutes and (b) 10 minutes photo-etching

(a) (b)

(a) (b)

I. Zadania wykonane

1. Opracowanie aktywnej platformy do badań powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana ( ang. Surface enhanced

Raman Spectroscopy, SERS) bazującej na GaN

(2) Optymalizacja procedur pokrywania trawionych podłoży GaN warstwami Au i stopem Au-Ag (60%/ 40%)

SEM images of samples (a) after photo-etchingand (b) subsequent evaporation of ~ 70 nm of Au.Photo-etching of GaN was done in the K2S2O8-KOH water solution under UV illumination

400 nm

Au-Ag (60%/ 40%)

Au

I. Zadania wykonane

2. Fabrykacja nowych podlozy do pomiarów SERS bazujących na nanodrutach ZnO pokrytych zlotem. z wykorzystaniem techniki CVD(Chemical Vapour Deposition)

na podłożu.

1.Aktywacja podłoża ITO przy zastosowaniu KMnO4

2.Reaktywny wzrost nanostruktur ZnO z roztworu zawierającego Zn(NO3)2 oraz KOH3. Pokrycie warstwą złota  

Rys.1. Widma SEM podlozy do pomiarow SERS otrzymanych technika CVD. Zdjęcia dla próbek otrzymanych w warunkach T=800oC, t=15 min, VNH3=1o dm3*h-1, VN2=140 dm3*h-1. EF=104

I. Zadania wykonane

Opracowanie metody do analizy powtarzalności widm Ramana bazującej na korelacji liniowej Pearsona

Tabela1. Wartości współczynników korelacji liniowej między drugimi pochodnymi spektrogramów Rys. Porównanie serii danych przed filtracją (górny

panel) i jej drugiej pochodnej uzyskanej za pomocą filtra ( dolny panel).

I. Zadania wykonane

1. Opracowanie procedur kontrolowanej immobilizacji peptydów na platformach sersowskich.

Immobilizacja aminokwasów na powierzchni sersowskiej pokrytej monowarstwą kwasu 11-merkaptoundekanowego (-), struktury nieuporządkowane, liczne wiązania

wodorowe

Immobilizacja aminokwasów na powierzchni sersowskiej pokrytej monowarstwą cysteaminy – „ tworzenie wiązań peptydowych w wyniku reakcji EDC/NHS” - (+)

Zbadanie wpływu warunków otrzymywania monowarstw cysteaminy na strukturę otrzymywanych warstw

wpływ pHczasu adsorpcji

stężenia roztworu adsorpcyjnegoelektrolitów

adsorpcja z rozpuszczalników polarnych

z roztworów o stężeniu powyżej 15mM

czas adsorpcji 1.5h

pH od 1.5 do 3

Monowarstwy cysteaminy- podsumowanie

Optymalne parametry procesu samoorganizacji prowadzące do monowarstw cysteaminy zbudowanych głównie z konformerów

Trans !!!

I. Zadania wykonane

1. Immobilizacja aminokwasów i peptydów na monowarstwach łącznikowych

Optymalizacja warunków prowadzenia reakcji EDC/NHS ( wpływ pH, czasu, stężeń i proporcji reagentów)

Immobilizowany peptyd musi mieć odpowiednią orientację i zachowywać swoją aktywność biologiczną

2. Immobilizacja przeciwciał na zmodyfikowanych polipeptydami platformach.

Optymalizacja warunków tworzenia kompleksu kompleksu peptyd blokujący-przeciwciało (pI przeciwciała, stosunek ilościowy reagentów, pH buforu z przeciwciałem - pomiędzy pIAg a pIAb, czas)

Immobilizacja aminokwasów

Widmo SERS (a) monowarstwy cysteaminy zaadsorbowanej na podlozu GaN pokrytym zlotem; widma SERS widmo SERS monowartwy cysteaminy z przylaczonym kwasem glutaminowym po 10min i ( b; (c) 30 min. i (d) 2 godzinach modyfikacji aminokwasem. Insert przedstawia normalne widmo Ramana kwasu glutaminowego.

Antigen- Blocking peptide interaction

blocking peptide (Akt(pan)) + mAb

blocking peptide (Akt(pan))

I. Zadania wykonane

1. Rejestracja i opracowanie widm Rama 20 aminokwasów

2. Rejestracja i opracowanie widm SERS aminokwasów

3. Rejestracja i opracowanie widm hetero i homo-peptydów

Baza widm

Identyfikacja położenia pików aminokwasów względem pików danego aminokwasu na przykładzie tyrozyny

I - intensywności pików tyrozynyE - położenia pików tyrozynyn - liczba pików pozostałych aminokwasów mająca to samo położenieArg – położenie pików argininy zgodnych z położeniem pików tyrozyny. Liczba oznacza intensywność, zaś puste miejsce – brak pikuPro – Trp – jak wyżej dla odpowiedniego aminokwasu

Identyfikacja aminokwasów w mieszaninie na podstawie spektrogramu

Rysunek. Uproszczony spektrogram mieszaniny tyrozyny i asparaginy do badania korelacji ze spektrogramami pojedynczych aminokwasów. Piki

czerwone (zielone) są skorelowane z pikami w spektrogramie asparaginy (tyrozyny).

Tabela. Ilość par skorelowanych dla poszczególnych aminokwasów. Piki na spektrogramie są sumą mnogościową wszystkich par skorelowanych dla danego aminokwasu.

II. PLANY.

Modyfikacja platform sersowskich wybranymi peptydami blokującymi i analiza zmian w widmach ramanowskich indukowanych tworzeniem się kompleksów peptyd blokujacy (epitop) – przeciwciało - kompletowanie bazy widm ramanowskich

Zintegrowanie chipu polipeptydowego z układem mikroprzepływowym

Testowanie chipu polipeptydowego do wykrywania ważnych immunologicznie przeciwciał jak: IgM, IgA, IgG, albuminy, transferyny, ceruloplazminy z materiałów biologicznych ( surowica krwi, mocz) i kolejno optymalizacja chipu na jedno wybrane przeciwciało

Opracowanie platform sersowskich bazujących na ZnO

Figure Schematic representation of an integrated SERS-CD platform for biomolecule detection.(a) A SERS spectroscopy and a SERS-CD platform. (reservoirs for activating chemicals (A), cells (B),media (C), and vent (D)) (b) Cell trapping schematics comparing cells before trapping (left) after trapping(right). (C) Sample concentrating cycle: secreted molecules are delivered (left), absorbed (center) andthen accumulated on a SERS probe (right), which results in molecule concentrating.

SERS microfluidic sensor