LMO가 토양미생물 생태계에 미치는

영향 평가기법 개발(III)

(최종보고서)

2011. 11.

강원대학교 생명과학연구소

국립환경과학원

i

제 출 문

국립환경과학원장 귀하

본 보고서를 “LMO가 토양미생물 생태계에 미치는 영향

평가기법 개발(III)”사업의 최종보고서로 제출합니다.

2011년 11월 30일

연 구 기 관 : 강원대학교

연구수행기간: 2011.03.04∼2011.11.30

총괄연구책임자 : 송 홍 규

협동연구책임자 : 가 종 억

연 구 원 : 이 화 영

박 남 미

장 원 섭

권 혁 도

김 동 욱

김 이 정

김 민 선

임 효 선

백 혜 진

ii

요 약 문

1. 제 목

LMO가 토양미생물 생태계에 미치는 영향 평가기법 개발(III)

2. 연구 배경 및 목적

현재 국내에는 여러 LM식물이 개발 및 수입․유통되고 있으나 이들이 토양미생

물생태계에 어떠한 영향을 미칠 것인지 또한 이를 확인할 수 있는 방법이 체계적으

로 개발되어 있지 못한 실정이다. 본 연구에서는 분자미생물생태학적 방법과 전통

적인 미생물학적 배양방법을 병행하여 LM식물이 토양미생물군집에 미칠 수 있는

영향을 효과적으로 분석 평가할 수 있는 기술과 방법을 개발하여 확립하고자 한다.

특히 제1, 2차년도 연구에서 유의성이나 차이를 보였던 항목을 반복 조사하며 경향

성을 나타내지 않았던 조사항목 대신 다른 항목들을 조사하여 LM작물 (해충저항성

옥수수)이 토양미생물생태계에 미치는 영향을 파악하는 기법을 찾고자 한다.

3. 연구내용 및 방법

(1) 격리온실 설치, GM옥수수 재배, 토양특성 분석

강원대학교 구내에 격리 비닐온실 설치 (폭 7 m, 길이 10 m, 최대 높이 4 m)

제1차년도 연구에서 수확한 Bt toxin 유전자(cry1F) 도입 옥수수의 격리온실

에서 파종 및 재배

근권토양 채취 및 각종 물리화학적 특성 분석

(2) 배양법 및 활성 측정에 의한 토양미생물 군집 조사

일반세균이라 하는 호기성 종속영양세균의 개체수 King'B 배지에 희석된 토

양 시료를 접종하여 배양 후 집락을 계수하여 측정. 진균은 균사길이를 측정.

Sodium casein을 첨가한 선택배지를 이용하여 방선균 계수.

iii

기능성 세균종류로 섬유소분해세균과 단백질분해세균을 각 기질을 첨가한 선

택배지를 이용하여 계수.

리그닌 첨가 후 Biolog EcoplateTM를 이용하여 기능적 세균 다양성 조사

옥수수 재배 종료 후 옥수수 뿌리에 형성된 내생균근을 형광염색하고 형광현

미경으로 관찰하여 균근 형성률을 조사.

토양미생물활성으로 리그닌분해효소 활성을 측정.

(3) 기존 배양법을 보완하기 위한 신규 분자생물학적 기법 최적화 방안 확립

Real-time PCR-DGGE 기법을 사용하여 LM 옥수수의 재배와 환경조건의 변

화에 따른 토양미생물 군집구조변화 분석

토양미생물상 분석을 위한 real-time PCR-DGGE 기법과 배양법의 비교분석

DGGE profile의 유의성 판단기준 조사

(4) LMO가 토양미생물상에 미치는 영향평가 기법의 프로토콜 확립

배양방법 및 Real-time PCR-DGGE 기법의 최적 조건을 확립하고 일반화된

프로토콜 작성, 제출

(5) 확립된 프로토콜의 과학적 타당성 확보 방안 추진

LMO 심사위원회와 학회 발표 및 의견 수렴

(6) 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가

도입유전자의 토양내 수평적 전이 검출기법 조사

도입유전자의 토양잔류 수준 분석법 조사

4. 연구결과

(1) 배양법 및 활성 측정에 의한 토양미생물 군집분석

옥수수 재배 시 근권토양에서 배양방법에 의한 미생물군집을 분석한 결과 상

iv

당히 많은 항목에서 실험 결과의 재현성이 높은 편이었음. 또한 일부 결과를

제외하면 대체로 실험오차는 적은 편이었기 때문에 개체군과 활성의 변화 경

향을 비교하기가 용이하였음.

일반세균은 nonLM 옥수수토양이 중후반에 높은 수치를 나타내다 낮아지는 등

LM 옥수수토양과 차이 있는 변화의 일관성이나 유의성이 없었음.

방선균과 진균 균사길이는 상당기간 LM옥수수 근권토양이 나머지 두 토양시

료보다 약간 더 높은 결과를 보이는데 방선균은 초기에 유의성이 있으며 진균

균사길이는 유의성의 경계 수준을 나타내었음.

섬유소분해세균과 단백질분해세균은 오차범위를 넘어서는 정도로 nonLM옥수

수 근권토양보다 높은 결과를 보였으며 특히 섬유소분해세균은 통계적으로 유

의성 있는 차이가 있었으나, 이 차이가 실질적 영향을 미치는지 여부에 대해

서는 추가적인 연구가 필요함.

Biolog assay를 이용한 기능적 다양성의 경우 여러 기질 종류에서 nonLM옥수

수 근권토양이 나머지 두 토양시료보다 높았으며 평균 흡광도와 반응수가 특

히 후반에 높은 결과를 나타내었음.

LM옥수수에서 nonLM옥수수보다 높은 비율로 균근이 형성되었는데 이는 제

제1,2차년도의 결과와 유사하게 큰 변화가 없었음.

리그닌 분해효소 활성은 일관된 경향을 나타내지 않았으며 LM옥수수와

nonLM옥수수 근권토양이 유사하거나 큰 차이를 나타내지 않았음.

토양에 리그닌 첨가 후 Ecoplate의 average well color development (AWCD)

만으로는 군집간의 유의성 있고 일관성 있는 상관관계 및 변화 양상을 찾기

어려웠으며, 유의성 있는 개체수 항목과 탄소기질 이용도를 주성분분석

(principal component analysis; PCA) 한 결과 유의성이 없음.

(2) 기존 배양법을 보완하기 위한 신규 분자생물학적 기법 최적화 방안 확립

Real-time PCR-DGGE 기법에 의한 LM옥수수 재배에 따른 토양 미생물 군집

구조 변화를 분석한 결과 LM옥수수와 non-LM옥수수 토양 사이에는 유의한 변

화가 없으나, dry condition에서 재배된 non-LM옥수수 토양과는 유의한 차이를

v

보였고, 계절적으로도 유의한 차이를 보이는 것으로 관찰됨.

Real-time PCR-DGGE 기법은 재현성과 신뢰성이 높고, 환경변화와 계절변화에

따른 토양미생물상의 변화를 검출할 수 있을 정도로 민감성이 높은 수준으로

확인됨.

Real-time PCR-DGGE 기법에서 얻어진 DGGE band pattern의 변화는

BioNumerics 프로그램을 사용하여 통계적 유의성 여부를 판단할 수 있었음.

배양방법에서는 LM옥수수와 non-LM옥수수 토양 사이에 섬유소분해세균의 밀

도에 유의한 차이가 있는 것으로 관찰되었는데, Real-time PCR-DGGE 기법에

서도 LM옥수수와 non-LM옥수수 토양 사이에 2-3개의 DGGE bands가 차이가

있는 것으로 나타났음. 이 차이가 실질적 영향을 미치는지 여부에 대해서는 추

가적인 연구가 필요함.

배양방법에서는 환경조건을 변화시켜도 LM옥수수와 non-LM옥수수 토양 사이

에 세균의 밀도 유의한 차이가 없는 것으로 관찰되었으나, Real-time

PCR-DGGE 기법에서는 환경조건을 변화시켰을 때 DGGE profile에 차이가 있

는 것으로 관찰됨. 이 차이가 실질적 영향을 미치는지 여부에 대해서는 추가적

인 연구가 필요함.

배양방법은 세균의 전체 밀도 변화를 분석할 수 있으나, 세균군집 구조의 변화

를 분석할 수 없는 것으로 나타나 LM작물에 의한 토양미생물상의 변화를 정확

하게 평가하기 위해서는 배양방법과 분자생물학적 방법 (Real-time

PCR-DGGE)을 함께 사용하여 분석, 평가할 필요가 있음.

(3) 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가

LM옥수수 토양에서의 도입된 유전자 (cry1F)와 카나마이신 저항성 유전자의

background 는 각각 102, 103 copies/g soil 수준으로 관찰됨.

LM옥수수에 도입된 해충저항성 유전자(cry1F)의 토양에서의 잔류수준은 LM옥

수수의 생육이 왕성한 6월과 7월에는 상당히 증가하여 파종시점인 4월보다 약

100배 정도 높았으나, 옥수수를 수확한 후인 8월에는 그 잔류수준이 감소되어

LM옥수수를 파종한 4월의 원래의 수준으로 회복되는 것으로 관찰됨.

vi

카나마이신 저항성 유전자를 방출한 LM옥수수 토양에서의 총세균과 카나마

이신 저항성 세균의 밀도 변화는 실험기간 동안에 대조군과 큰 차이가 없는

것으로 관찰됨.

LM옥수수 토양에 방출된 카나마이신 저항성 유전자는 방출 23일 후 그 잔류수

준이 약 143배 정도 감소하였고 163일 후에는 접종된 카나마이신 저항성 유전

자의 약 99.8%가 분해되어 없어진 것으로 관찰됨.

카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되지 않은 토양에서 카나마이

신에 저항성을 갖는 미생물을 agar 배지에 배양한 후 균체의 genomic DNA를

추출하여 PCR 분석한 결과, 카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되

지 않은 토양에서 동일하게 10-2 plate에서 positive DNA band가 검출되어 카나

마이신 저항성 유전자의 토양미생물로의 전이, 확산은 관찰되지 않았음.

Pyrosequencing에 의해 전체 카나마이신 저항성 유전자의 염기서열을 분석한

결과, 카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되지 않은 토양에서 검출

된 카나마이신 저항성 유전자의 발생빈도가 서로 비슷한 것으로 나타나 카나마

이신 저항성 유전자의 토양미생물로의 광범위한 전이, 확산은 관찰되지 않았음.

(4) LMO가 토양미생물상에 미치는 영향평가 기법의 프로토콜 확립

배양방법 및 Real-time PCR-DGGE 기법의 최적 조건을 확립하고 일반화된

프로토콜 작성, 제출

(5) 확립된 프로토콜의 과학적 타당성 확보 방안 추진

LMO 심사위원회와 학회 발표 및 의견 수렴

5. 결 론

토양미생물의 개체수와 활성도를 측정한 결과 일반세균과 진균 균사길이는 상당

기간 LM옥수수 근권토양이 나머지 두 토양시료보다 약간 더 높은 결과를 보이며

방선균은 초기에 유의성을 나타내며 진균 균사길이는 유의성의 경계수준을 나타내

vii

었다. 반면에 Biolog assay를 이용한 기능적 다양성의 경우 nonLM옥수수 근권토양

이 나머지 두 토양시료보다 높았으며 평균 흡광도와 반응수가 특히 후반에 높은 결

과를 나타내었다. 기능적 미생물군은 LM옥수수 근권토양이 상당 기간 높은 개체수

를 나타내었으며 특히 섬유소분해세균과 단백질분해세균은 오차범위를 넘어서는 정

도로 nonLM옥수수 근권토양보다 높은 결과를 보였으며 이는 제1,2차년도 결과와도

상당히 유사하였다. 반면에 리그닌 분해효소 활성은 일관된 경향이 없었으며 LM옥

수수와 nonLM옥수수 근권토양이 유사하거나 큰 차이를 나타내지 않았다. 균근 형

성은 전년도와 유사하게 LM옥수수에서 더 높은 형성률을 나타내었다.

개체수 및 활성 측정 결과를 통계분석한 결과 섬유소분해세균의 개체수에서 유

의성 있는 결과를 얻었으며, 일부 항목에서 기간별로 유의성이 나타나거나 유의성

의 경계수준을 나타내는 결과들이 있었다 Ecoplate의 반응의 경우 제2차년도에는

일부 기질에 대해 nonLM옥수수와 LM옥수수 근권토양 간의 유의성 있는 차이가

있는 것으로 나타났으나 제3차년도에는 유의성 있는 차이가 나타나지 않았는데 이

는 리그닌 기질 첨가가 원인 중의 하나인 것으로 추정된다.

Real-time PCR-DGGE 기법에 의해 LM옥수수 토양, nonLM옥수수 토양, dry

condition에서 재배된 nonLM옥수수 토양의 세균군집 구조의 변화를 비교 분석한

결과, 주어진 한 시점에서는 LM옥수수 토양과 nonLM옥수수 토양의 세균군집의

DGGE profile에 별 차이가 없었으나, dry condition에서 재배된 nonLM 옥수수 토

양의 세균군집 구조와는 큰 차이를 보였다. BioNumerics 방법에 의해 DNA band의

존재유무와 강도 (intensity)를 대상으로 하여 DGGE pattern을 통계적으로 분석한

결과, 각 주어진 시점에서는 LM옥수수와 nonLM옥수수 재배 토양 사이에 유의한

차이가 없었으나, dry condition의 nonLM옥수수 재배 토양과는 유의한 차이를 보이

는 것으로 나타났다 (p>0.05). 또한, 계절적 흐름에 따른 토양세균군집의 DGGE

pattern은 상당한 변화가 있는 것으로 관찰되었는데, 이를 BioNumerics 방법에 의

해 분석하였을 때 봄과 여름의 옥수수 경작 토양의 DGGE profile 사이에 Pearson

correlation이 낮게 나타나 계절적으로 토양세균군집의 구조가 유의한 수준으로 변

화되었음을 알 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 1, 2, 3차 년도에서 개발, 검증된

Real-time PCR-DGGE 기법이 토양미생물군집 구조를 분석하는데 있어서 신뢰성과

재현성이 높을 뿐만 아니라, 환경변화와 계절적 변화에 따른 토양미생물군집 구조

의 변화를 검출할 수 있을 정도로 그 민감도가 높음을 확인하였다.

viii

한편, 배양방법의 결과와 Real-time PCR-DGGE 방법의 결과를 비교하였을 때, 배

양방법에서는 환경조건을 변화시켜도 LM옥수수와 non-LM옥수수 토양 사이에 전체

세균의 밀도에 유의한 차이가 없는 것으로 관찰되었으나, Real-time PCR-DGGE 기

법에서는 환경조건을 변화시켰을 때 DGGE profile에 큰 차이가 있는 것으로 관찰되

었다. 이와 같이 배양방법은 세균의 전체 밀도 변화를 분석할 수 있으나, 세균군집 구

조의 변화를 분석할 수 없는 것으로 나타나 LM작물에 의한 토양미생물상의 변화를

정확하게 평가하기 위해서는 배양방법과 분자생물학적 방법 (Real-time PCR-DGGE)

을 함께 사용하여 분석, 평가할 필요가 있다고 판단된다.

LM옥수수가 재배된 시험구 토양에서의 해충저항성 유전자 (cry1F)와 카나마이

신 저항성 유전자의 background 수준은 각각 102, 103 copies/g soil 수준으로 관찰

되었다. LM옥수수에 도입된 해충저항성 유전자는 LM옥수수의 생육이 활발한 시기

인 6월과 7월에 토양잔류수준이 크게 증가하였으나, 옥수수를 수확한 후인 8월에는

그 잔류수준이 감소되어 LM옥수수를 파종한 4월의 원래의 수준으로 회복되는 것으

로 관찰되었다. 카나마이신 저항성 유전자를 방출한 토양에서 총세균과 카나마이신

저항성 세균의 밀도 변화는 실험기간 동안에 대조군과 큰 차이가 없는 것으로 관

찰되었고, 카나마이신 저항성 유전자는 방출 23일 후 그 잔류수준이 약 143배 정도

감소하였고, 실험 기간 동안에 접종된 카나마이신 저항성 유전자의 약 99.8%가 분해

되어 없어지는 것으로 관찰되었다.

카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되지 않은 토양에서 카나마이신에

저항성을 갖는 미생물을 agar 배지에 배양한 후 균체의 genomic DNA를 추출하여

PCR 분석한 결과, 카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되지 않은 토양에

서 동일하게 10-2 plate에서 positive DNA band가 검출되었다. 또한, 균체에서 추출된

genomic DNA를 대상으로 하여 pyrosequencing에 의해 전체 카나마이신 저항성 유

전자의 염기서열을 분석한 결과, 카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되

지 않은 토양에서 검출된 카나마이신 저항성 유전자의 발생빈도가 서로 비슷한 것으

로 나타났다. 이러한 결과로 볼 때, 카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양에서 카

나마이신 저항성 유전자의 다른 토양미생물로의 광범위한 전이, 확산은 발생하지 않

은 것으로 분석되었다.

3년 동안의 연구기간을 통해서 LM작물이 토양미생물상에 미치는 영향에 대한

평가방법을 확립하는 연구를 수행하였다. 이를 통해 LM작물과 non-LM작물 간에

ix

일부 특정 토양미생물 군집에 차이가 있는 것이 파악되었으나 이것이 실질적인 영

향을 미치는지 여부에 대해서는 추가적인 장기연구가 필요할 것이다.

한편, LM작물은 토양에 근거를 두고 생장하고 있어 LM작물의 환경위해성 평가

에는 토양미생물상에 미치는 영향에 관한 평가도 반드시 포함되어야 한다. 그러나

국내외적으로 아직까지 토양미생물상 변화에 대한 확실한 평가기법은 구축되지 않

았는데, 본 연구를 통해 3년간의 결과를 바탕으로 제안하는 것은 배양법만으로는

토양미생물상의 변화를 평가하기 어려우므로, 분자생물학적으로 이를 보완할 수 있

는 평가기법과 함께 수행되어야 한다는 점이다. 본 연구에서는 분자생물학적 기법

중에서도 현재까지는 비용이나 실질적인 평가 면에서 Real-time PCR DGGE 방법

이 가장 효율적일 것으로 판단된다.

또한, 토양미생물상을 조사하는 시기는 최소 5회 정도가 되어야 할 것이며, 이중

LM작물을 재배하기 전에 한번, 재배시기 중 식물생육이 가장 활발할 때를 고려하

여 3회 이상 그리고 식물재배가 마무리 되었을 때 1회 정도가 적당할 것으로 제안

한다. 조사를 위한 토양채취 방법과 분석방법은 첨부자료로 제출하였다.

6. 활용방안

LMO가 토양미생물상에 미치는 영향 심사 시 세부평가를 위한 항목(안) 마련

배양법만으로는 토양미생물상의 변화를 평가하기 어려우므로, 분자생물학적으

로 이를 보완할 수 있는 평가기법과 함께 사용하여 평가수행

토양미생물상을 조사하는 시기는 최소 5회 정도가 되어야 할 것이며, 이중

LM작물을 재배하기 전에 한번, 재배시기 중 식물생육이 가장 활발할 때를 고

려하여 3회 이상 그리고 식물재배가 마무리 되었을 때 1회 정도가 적당할 것

으로 제안

LMO가 토양미생물군집에 미치는 영향 평가를 위한 배양 및 활성측정법 개발

LMO가 토양미생물군집에 미치는 영향을 파악하기 위한 조사에 적합한 배양

계수 및 측정방법의 선발을 통해 LMO의 환경방출의 기초자료로 활용

LM식물에 의한 토양미생물상의 변화를 검출, 평가할 수 있는 표준화된 배양

및 활성측정 방법을 위한 토대를 확립

x

LMO가 토양미생물군집에 미치는 영향 평가를 위한 분자생물학적 기법 개발

LMO가 배양가능한 미생물은 물론이고 배양되지 않는 미생물을 포함하여 전

체 토양미생물군집 구조에 미치는 영향을 분석하는데 활용

LMO가 특정한 기능성미생물 군집에 미치는 영향을 분석하는데 분자생물학적

방법으로 활용

LMO가 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가

LMO에 도입된 유전물질이 토양미생물 군집에 미치는 장기적 영향을 분석하

고 도입 유전자의 토양잔류와 토양미생물로의 이동성을 분석하는데 활용

LMO가 토양미생물군집에 미치는 영향 평가를 위한 종합적 표준방법 개발

LM식물에 의한 기능성 미생물군의 변화를 모니터링할 수 있는 표준화된 배양

방법과 분자생물학적 방법을 제안

미생물 배양법과 분자생물학적 방법을 종합적으로 적용하는 기법을 개발하여

LM식물에 의한 전체 토양미생물군집의 변화를 모니터링할 수 있는 표준화된

검출기법(안)을 제안함으로써 환경부의 자연생태계 위해성 평가․심사에 활용

가능한 과학적 근거를 제시

의도적 또는 비의도적으로 환경에 방출된 LM 식물의 도입유전물질을 모니터링

하는 기술과 방법을 확립하여 LMO에 의한 환경위해성 평가․심사에 필요한

평가기법을 제안

LMO가 자연생태계 미치는 영향에 대한 심사협의 시 토양미생물군집에 미치는

영향을 평가하는 방법론적 프로토콜 개발

LMO 사례별 환경위해성 평가기술개발과 환경위해성 평가 표준화방법 구축을

위한 비교자료 제시

xi

Abstract

According to the development and cultivation of various LM (living modified)

crops there is a possibility of release into natural environments and spread to

other plants of modified genes. Since some modified genes released may affect

the indigenous soil microbial communities which have enormous roles for the

maintenance of soil environments, the risk assessment of cultivation of LM

crops must be carried out before the large scale cultivation on agricultural fields.

In this study, we established an isolated greenhouse in the campus of Kangwon

National University at Chuncheon, and the effects of LM corn plants on the soil

microbial community were examined by various culture-based methods and

molecular biological methods. From the experimental results we tried to draw or

improve the appropriate methods for the assessment of the effects of cultivation

of LM corn plants on soil microbes.

In the many culture-based analytical tests, the results showed the high

reproducibility, and most standard deviations of results were small except some

cases. Therefore, it was somewhat easy to compare the changing patterns of

microbial populations and activities in the soil. The populations of most different

microbial groups did not show a statistically significant difference between LM

corn planted soil and wild corn planted soil, but the numbers of aerobic

heterotrophs and fungal mycelium length were higher in the LM corn

rhizosphere soil. The hyphal lengths of fungi showed the close value of

significant difference, and the population of actinomycete showed the significant

difference during the initial period. The number of cellulolytic bacteria and

proteolytic bacteria were also higher in LM corn rhizosphere soil than those in

nonLM corn rhizosphere soil, which is similar to the results in the previous

year. Functional diversity measured by Biolog assay was also higher in LM

corn rhizosphere soil. On the contrary, other microbial groups show inconsistent

patterns of change of population and activities and did not exhibit the statistical

significance. In contrast to the results of the previous year, the statistical

analysis of the results of number of reaction well and utilization of several

kinds of substrate in Biolog assay did not show a significant difference between

xii

nonLM and LM corn rhizosphere soils, which might be due to the addition of

lignin substrate. Principal components analysis of population number and

substrate utilization pattern of soil microbial community also did not exhibit the

clustering of LM and nonLM corn rhizosphere. The microbial populations which

showed the typical change pattern and statistical significance should be

examined again, and statistically analyzed. Then the quantitative standard to

determine the effects of LM plant might be suggested.

The impacts of planted transgenic corn on bacterial communities in field soils

were also monitored using molecular methods. Analysis with real-time

PCR-DGGE of 16S rRNA genes revealed that the bacterial community were

quite similar to each other in a given month between LM and nonLM corn

soils. However, the DGGE profiles obtained from soil bacterial communities of

nonLM corn cultivated under a dry condition were quite different from those of

LM and nonLM corns cultivated under normal conditions. Statistical analyses of

those DGGE profiles with BioNumerics Program revealed that there were no

significant differences between LM corn and nonLM corn in a given month, but

the bacterial DGGE profiles of nonLM corn soils received dry stress were

significantly different from those of corns cultivated under normal conditions.

The bacterial community structures of corn soils also appeared to change with

the seasons, as shown by significant variation of DGGE banding patterns.

Statistical analyses showed that their DGGE profiles were significantly changed

with seasons. The results suggested that, in spite of dryness-induced and

seasonal variations of bacterial communities, the bacterial communities of the

experimental field were not significantly affected by cultivation of LM corn. The

results of this study also demonstrated that the new 16S rDNA DGGE

procedure using real-time PCR much improved the quantitative and qualitative

analyses of soil bacterial community, producing quite diverse and discernible

DNA bands with high reproducibility, reliability, and sensitivity.

The results from cultivation method showed that the microbial densities were

not significantly different between rhizosphere soils of LM corn and nonLM corn

under dry condition. However, the microbial community structures obtained with

xiii

real-time PCR DGGE method were quite different in soils between LM corn and

drought-stressed nonLM corn. The results demonstrated that the cultivation

method could analyze the changes of soil microbial densities, but it could not

analyze the changes of soil microbial community structures of LM corn-cultivated

fields. Therefore, the cultivation and molecular methods should be used together to

evaluate the potential of LM crops for unwanted adverse effects on soil microbial

community.

A real-time PCR procedure was used for quantitative analysis of genes

which have been introduced into LM plants. The real-time PCR method was

applied to estimate the background levels of cry1F gene introduced into LM

corn and of the kanamycin-resistant gene in corn-cultivated soils. Initially, the

background level of the cry1F gene was about 102 copies/g soil in the

experimental field soil cultivated with LM corn. Its level was greatly increased

to 104 copies/g soil on June when the LM corn was actively growing in the

experimental field, but thereafter its level was gradually decreased to the initial

level of April when was the time for sowing the LM corn. The background

level of kanamycin resistant gene was about 103 copies/g soil in the

experimental field soil used for cultivation of LM corn. When the soil was

inoculated with the kanamycin resistant gene at the level of 107 copies/g soil, its

level was continuously decreased to about 104 copies/g soil in 79 days after

inoculation, and then its level was more or less maintained at that level during

the rest of the experimental period. The horizontal transfer of the

kanamycin-resistant gene to indigenous soil microorganisms was not observed

during the experiments.

Based on the results of this research, we propose that, in addition to some

cultivation methods for aerobic heterotrophic bacteria, actinomycetes, fungi and

cellulolytic bacteria, a molecular analytical method such as real-time PCR DGGE

should be used for proper evaluation of the impact of LM plants on soil

microbial community. It is also recommended that soil samples are taken at

least five times, one at the seedtime, three times during the actively-growing

season, and one at the harvesting season.

xiv

<차 례>

제출문 ............................................................................................................................................ⅰ

요약문 ............................................................................................................................................ⅱ

Abstract........................................................................................................................................ xi

차례..............................................................................................................................................xiv

그림차례....................................................................................................................................... xv

I. 서론 .......................................................................................................................................1

Ⅱ. 연구 내용 및 방법 .............................................................................................................. 3

1. 과업의 범위 ............................................................................................................................ 3

1) 국내 유통 중인 LMO가 토양미생물생태계에 미치는 영향 확인기법 개발......... 3

2) 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가.......................................................... 5

2. 조사 및 분석방법 .................................................................................................................. 6

1) 국내 유통 중인 LMO가 토양미생물 생태계에 미치는 영향 확인기법 개발....... 6

(1) 격리온실 설치, LM옥수수 재배 및 토양시료 채취................................................. 6

(2) 토양미생물 군집변화 분석을 위한 배양방법 조사 ................................................ 9

(3) 기존 배양법을 보완하기 위한 신규 분자생물학적 기법 최적화 방안 확립... 12

(4) 미생물상 변화 정도에 대한 판단기준 조사 ............................................................15

2) 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가........................................................ 16

(1) 도입유전자의 토양내 수평적 전이 검출기법 조사................................................ 16

(2) 도입유전자의 토양잔류 수준 분석 ............................................................................. 23

Ⅲ. 연구 결과 및 고찰 ............................................................................................................ 27

1) 국내 유통 중인 LMO가 토양미생물생태계에 미치는 영향 확인기법 개발..... 27

(1) 토양미생물의 군집 변화를 분석하는 배양방법및 활성측정방법..................... 27

(2) 기존 배양법을 보완하기 위한 신규 분자생물학적 기법 조사......................... 49

2) 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가...................................................... 59

(1) 토양에서의 도입유전자의 background 분석 방법 조사..................................... 59

(2) 도입유전자의 토양내 수평적 전이 검출기법 조사.............................................. 61

(3) 도입유전자의 토양 잔류수준 분석기법 조사........................................................ 68

Ⅳ. 결론 ...................................................................................................................................... 75

V. 활용방안 및 향후계획 ....................................................................................................... 77

Ⅵ. 연차별 주요 내용 및 결과 요약..................................................................................... 79

Ⅶ. 참고문헌................................................................................................................................ 81

Ⅷ. 부록......................................................................................................................................... 86

xv

<그림 차례>

Fig. 1. 본 연구가 수행되고 있는 강원대 구내에 설치된 격리 온실 전경 ...................6

Fig. 2. Maize genotyping with PCR amplification ...........................................................7

Fig. 3. 옥수수 파종 및 생장 상태 ..........................................................................................8

Fig. 4. pF1K T7 벡터 (Promega)..........................................................................................16

Fig. 5. 옥수수 근권 토양내 수분함량....................................................................................28

Fig. 6. 옥수수 근권토양 내 일반세균의 개체수 ................................................................29

Fig. 7. 옥수수 근권 토양내 방선균의 개체수 ....................................................................30

Fig. 8. 옥수수 근권토양 내 진균 균사 길이 ......................................................................31

Fig. 9. 옥수수 근권토양 내 섬유소분해세균의 개체수 .................................................32

Fig. 10. 옥수수 근권토양 내 단백질분해세균의 개체수 .................................................33

Fig. 11. Ecoplate 기질 이용에 따른 옥수수 근권토양 내 Shannon 지수 ..................34

Fig. 12. Ecoplate 기질 이용에 따른 옥수수 근권토양 내 Simpson 지수 ..................35

Fig. 13. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 AWCD .......................36

Fig. 14. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 이용된

탄소기질의 수 .............................................................................................................36

Fig. 15. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 carbohydrate

기질에 따른 AWCD ..................................................................................................37

Fig. 16. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 carbohydrate

기질에 따른 반응수 ...................................................................................................37

Fig. 17. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 carboxylic acid

기질에 따른 AWCD ..................................................................................................38

Fig. 18. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 carboxylic acid

기질에 따른 반응수 ...................................................................................................38

Fig. 19. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 amino acid

기질에 따른 AWCD ..................................................................................................39

Fig. 20. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 amino acid

기질에 따른 반응수 ...................................................................................................39

Fig. 21. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 polymer 기질에

따른 AWCD ................................................................................................................40

Fig. 22. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 polymer 기질에

따른 반응수 .................................................................................................................40

xvi

Fig. 23. 옥수수 근권토양의 laccase 활성.............................................................................41

Fig. 24. 옥수수 근권토양의 lignin peroxidase 활성..........................................................42

Fig. 25. 옥수수 근권토양의 manganese peroxidase 활성................................................42

Fig. 26. 옥수수 근권토양의 general peroxidase 활성.......................................................43

Fig. 27. 현미경으로 관찰된 균근 ..........................................................................................44

Fig. 28. 옥수수 근권토양의 탄소기질 이용도에 대한 PCA .........................................45

Fig. 29. 옥수수 근권토양의 토양미생물 개체수와 탄소기질 이용도에 대한 PCA ..46

Fig. 30. 강원대 실험 포장의 토양에서 추출된 전체 soil DNA에 대한 16S

rDNA-Real time PCR의 변곡점 분석...................................................................50

Fig. 31. Real-time PCR-DGGE 기법을 이용한 LM옥수수 토양세균군집 분석........53

Fig. 32. Real-time PCR-DGGE 기법을 이용한 LM옥수수 토양세균군집 분석........54

Fig. 33. Real-time PCR-DGGE 기법을 이용한 LM옥수수 토양세균군집 분석........54

Fig. 34. LM 옥수수 경작 토양에서의 계절적 변화에 따른 토양세균군집

구조의 변화...................................................................................................................55

Fig. 35. BioNumerics 프로그램에 의한 7월 12일과 7월 26일 토양의 16S rDNA

PCR-DGGE pattern의 Cluster 분석......................................................................56

Fig. 36. BioNumerics 프로그램에 의한 계절별 16S rDNA PCR-DGGE pattern의

Cluster 분석.................................................................................................................57

Fig. 37. LM옥수수 토양에서의 cry1F 유전자 농도와 Ct값의 상관관계 ..................60

Fig. 38. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자 농도와 Ct값의

상관관계 ......................................................................................................................61

Fig. 39. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자와 카나마이신 처리에

따른 총 세균수의 변화.............................................................................................62

Fig. 40. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자와 카나마이신 처리에

따른 카나마이신 저항성 세균 개체수의 변화....................................................63

Fig. 41. Time 0 (왼쪽), 52일 (가운데), 163일 (오른쪽)후에 10-2, 10-3 의 배양 plate

에서 회수된 균체에서의 카나마이신 저항성 유전자의 PCR 검출...............64

Fig. 42. 카나마이신 저항성 유전자를 접종한 LM옥수수 토양 (K0-K163)과

접종하지 않은 대조군 토양 (C0-C163)의 Nested PCR product의

Agilent Bioassay 결과.............................................................................................67

Fig. 43. 카나마이신 저항성 유전자를 접종한 LM옥수수 토양과 접종하지 않은

대조군 토양의 target 카나마이신 저항성 유전자의 read수..........................68

xvii

Fig. 44. LM옥수수에 도입된 해충 저항성 유전자 (cry1F) 의 standard

curve...............................................................................................................................69

Fig. 45. LM옥수수 포장 토양에서의 해충 저항성 도입유전자 cry1F 의

Ct값 변화.......................................................................................................................70

Fig. 46. LM옥수수 토양에서의 해충 저항성 도입유전자 (cry1F) 의 잔류수준

변화. ..............................................................................................................................71

Fig. 47. 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 standard curve...............................72

Fig. 48. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 Ct값 변화....................73

Fig. 49. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 잔류수준 변화............74

1

I. 서 론

ㅇ 최근에 생물공학기술의 발달로 인하여 여러 가지의 유전자 변형미생물과 형질전

환식물체가 개발됨에 따라 이들 유전자 변형 생물체 (living modified organism;

LMO)가 사고로 인해 자연 환경에 유입되거나 또는 특정한 목적으로 현장 활용을

추구하는 과정에서 다양한 유전자 변형 생물체가 자연 생태계에 노출될 수 있는 상

황에 직면해 있다.

ㅇ 선진국에서는 유전자 변형 생물체가 실제 환경에서 어느 정도 정상적으로 생존

할 수 있는지, 또 이들 유전자 변형 생물체에서 유출된 변형 유전자의 수평적 전이

와 다른 토착생물의 생존과 활성에 미치는 영향에 대해 많은 관심을 갖고 오래 전

부터 활발한 연구를 수행해 왔으나, 국내에서는 아직까지 유전자 변형 생물체의 개

발에만 관심이 집중되어 환경위해성 연구에 대한 투자가 미비하고, 이들 유전자 변

형 생물체에 의한 자연 생태계 교란에 대한 우려를 검증하는 노력이 크게 부족한

실정이다.

ㅇ 토양미생물은 자연 생태계에서 분해자의 역할을 담당하고 있어서 토양에 유입되

는 다양한 물질들을 분해하여 식물의 무기질 양분을 공급할 뿐만 아니라, 농약과

같은 환경오염물질을 분해, 제거하고 토양구조를 물리화학적으로 개선함으로써 토

양생태계를 건강하게 유지시켜 주는 중요한 기능을 수행하고 있다.

ㅇ 근래에는 여러 종류의 유전자 변형 생물체가 개발되어 산업화를 추구하는 과정

에서 그 변형된 유전자에서 만들어진 새로운 화학물질이 토양에 유출될 수 있고,

변형된 생물체에 도입된 새로운 유전물질이 토양에 유입될 수 있다. 이에 따라 토

양미생물의 군집구조와 활성에 영향을 줄 수 있고, 토양미생물로의 유전자 이입현

상이 발생하면서 실험실에서 인위적으로 변형된 유전물질이 자연 생태계에 널리 유

포되는 결과를 초래할 수 있다.

ㅇ 결국 이들 유전자 변형 생물체의 도입에 의해 토양미생물의 군집 구조와 활성이

영향을 받게 되면 자연 생태계가 교란되어 정상적인 생태계의 모습을 유지하기 어

렵고, 이러한 효과는 다른 생태계로 급속히 전파되어 전체 생태계에 큰 영향을 줄

수 있기 때문에, 유전자 변형 생물체를 실제 현장에 적용하기 전에 토양에서 중

요한 기능을 수행하고 있는 토양미생물에 미치는 환경위해성을 분석 평가하여

야 한다.

ㅇ 유전자 변형 생물체가 토양의 토착미생물에 미치는 영향을 조사하기 위해서는

우선 자연 환경에서의 토착미생물 군집의 변화를 정확하게 분석, 평가하고, 도입된

유전자의 검출 방법, 토착미생물로의 전이 등을 분석할 수 있는 방법 등이 확립되

2

어야 한다.

ㅇ 그러나 종래의 미생물 plate 배양법 또는 PCR을 이용한 방법만으로는 유전자 변

형 생물체가 토양의 토착미생물의 활성이나 군집 변화에 미치는 영향을 분석할 수

없고 검출수준도 매우 제한되어 있어서 유전자 변형 생물체의 영향을 정확하게 평

가하기 어렵다.

ㅇ 이런 한계점을 극복하기 위해서 종래의 미생물 plate 배양법을 개선하고 토양에

서 미생물군집 DNA를 추출하여 분석하는 분자미생물생태학적 방법의 확립이 요구

된다. 이 방법을 이용해 토착미생물 군집구조의 변화를 미생물 plate 배양법보다 쉽

게 파악할 수 있고 연구대상이 되는 도입유전자의 전이와 운명에 대해서도 비교적

정확하게 분석할 수 있게 된다.

ㅇ 현재 국내에는 7개 종류의 83개 이벤트의 LM식물이 식용․사료용․가공용으로

수입․유통되고 있으며 또한 국내에서 여러 종류의 LM식물이 개발되고 있다. 그러

나 아직까지 이렇게 수입 유통되거나 개발되고 있는 LM식물이 토양미생물생태계에

어떠한 영향을 미칠 것인지 또한 이를 확인할 수 있는 방법이 체계적으로 개발되어

있지 못한 실정이다.

ㅇ 따라서 본 제안에서는 LM식물이 생장하는 토양을 대상으로 하여 분자미생물생

태학적 방법과 전통적인 미생물학적 배양방법을 병행하여 사용함으로써 의도 또는

비의도적으로 자연 환경에 방출된 유전자 변형 생물체가 그 환경에 토착하는 토양

미생물군집에 미치는 영향을 효과적으로 분석 평가할 수 있는 기술과 방법을 개발

하여 확립하고자 한다.

3

Ⅱ. 연구 내용 및 방법

1. 과업의 범위

1) 국내 유통 중인 LMO가 토양미생물생태계에 미치는 영향 확인기법 개발

(1) 토양미생물의 군집 변화를 분석하는 배양방법 조사

- 격리된 온실에서 유전자변형 작물 재배 후 근권토양 시료 채취

LMO의 토양미생물에 대한 영향을 평가하기 위해 LM작물의 재배가 필요한데

꽃가루가 자연환경으로 퍼지는 것을 막기 위해 격리된 온실에서의 재배가

필요하다. 본 연구의 1차년도에서 확보된 crystal Bt toxin 유전자인 cry 도입

LM옥수수를 강원대에 설치한 격리온실에서 재배하고 근권토양을 채취.

옥수수의 성장이 가장 활발한 시기인 파종 후 40일에서 80일 사이 기간 중에

집중조사를 수행한다.

- 일반 세균과 방선균 개체수, 진균 균사체 길이와 균근 형성 측정

LMO가 전체 토양미생물군집에 미치는 영향을 보기 위해 먼저 큰 분류군의

미생물의 배양가능 개체수를 측정한다. 1,2차년도 조사항목 중 특정기간에

개체군 변화양상이나 LM옥수수와 nonLM옥수수 근권토양에서 차이를 보였던

일반 세균의 배양가능 개체수와 진균 균사체 길이를 측정하는데 옥수수의

성장이 가장 활발한 기간 중에 집중조사를 수행한다. 한편 옥수수 뿌리에 균근

형성 정도를 옥수수 재배 종료 후 조사한다.

- 미생물의 기능성 종류별 배양

토양세균의 기능으로 가장 중요한 물질 순환에 중요한 세균 종류를 구분하여

배양가능 개체수를 조사한다. 역시 1차년도 조사항목 중 특정기간에 개체군

변화양상이나 LM옥수수와 nonLM옥수수 근권토양에서 차이를 보였던 기능성

세균종류인 섬유소분해세균, 단백질분해세균의 배양가능 개체수를 조사한다.

옥수수의 성장이 가장 활발한 기간 중에 집중조사를 수행한다.

- 세균군집의 활성조사

미생물의 개체수와 생체량만으로 실제 미생물의 기능 발휘여부는 알 수

없으므로 총미생물 활성과 특정 미생물활성의 측정이 필요하다. Biolog

assay를 이용하여 탄수화물 등의 탄소기질 이용능에 따른 토양미생물군집의

4

functional diversity를 조사하였는데 전년과 달리 리그닌 증가에 따른 영향을

조사하였다 또한 리그닌 분해효소 활성도 조사하였다.

(2) 기존 배양법을 보완하기 위한 신규 분자생물학적 기법 조사

- 1차년도에 확립된 개선된 DGGE법을 이용하여 질소고정세균의 군집 구조

분석: 특정 기능성 세균 군집을 검출하는 1차년도 문헌 조사에서

질소고정유전자 (nifH)를 대상으로 하여 질소고정세균을 특이적으로 검출할 수

있는 PCR primer (PolF/ PolR)를 선정한 바, 2차년도 연구에서는 이 primer를

사용하여 Real-time PCR-DGGE 기법에 의해 LM옥수수 토양의 질소고정세균

군집의 변화를 대조구와 비교분석한다.

- 토양미생물상의 변화를 분석하는 pyro-sequencing 기법 분석: 1차년도 문헌

연구에서 pyro-sequencing에 사용되는 GS_FLX Amplicon sequencing의

원리를 조사하였고, 16S rDNA에서 약 400b를 읽을 수 있는 VI-VIII 영역이

바람직한 것으로 밝혀졌으며, 얻어진 염기서열을 분석할 수 있는 Megan

프로그램의 유용성을 조사한 바, 2차년도 연구에서는 이 pyro-sequencing

방법에 의해 LM옥수수 토양의 토착미생물상의 변화를 대조구와 비교분석한다.

(3) 토양미생물상의 변화 검출기법 및 최적화 방안 마련

- Real-time PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)를 이용한

미생물군집 평가: 기존의 DGGE 분석법은 여러 가지 bias와 error를 가지고

있어서 토양미생물군집 구조를 정확하게 평가하지 못하였다. 1차년도에서는

이러한 다양한 오류들을 분석하여 Real-time PCR를 이용한 새로운 DGGE

기법을 확립하였는데, 이 기법은 재현성과 신뢰성이 높고 background smear가

개선되었으며, 다양한 토양미생물 군집을 정성적 정량적으로 분석할 수 있는

것으로 관찰되었다. 따라서, 2차년도 연구에서는 이 기법을 활용하여

LM옥수수가 재배되는 토양의 토착미생물군집 구조의 변화를 분석함으로써

새로 개발된 DGGE 기법의 적용성과 활용성을 평가한다.

- 또한 새로 확립된 토양미생물 검출기법의 최적화 방안을 마련하고 이에 대한

프로토콜을 작성한다.

5

(4) 미생물상 변화 정도에 대한 판단기준 조사

- 실험결과의 통계분석 및 영향평가: 배양계수와 활성측정 결과를 ANOVA

analysys를 이용한 통계분석을 통해 미생물상과 활성의 차이와 변화 정도에

대한 유의성을 검정하고, 문헌조사를 통해 비교하여 LMO의 토양미생물군집에

미치는 영향에 대한 판단기준을 조사한다.

- DGGE DNA band patterns의 유의성 판단 기준 조사 : DGGE band profiles에

나타난 실험군과 대조군사이의 통계적 유의성 검증을 위해 문헌조사와 기존의

분석프로그램을 조사하여 최적의 통계적 분석방법을 제안한다.

2) 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가

(1) 토양에서의 도입유전자의 background 분석 방법 조사

- 토양에서의 인위적인 유전물질의 검출 기법 조사: LM작물 도입유전자 cry1F의

토양에서의 검출 기법을 조사하고 cry1F의 토양에서의 정량분석 기법을

조사한다.

(2) 도입유전자의 토양내 수평적 전이 검출기법 조사

- 토양에서의 항생제 저항성 유전자의 미생물군집으로의 이동성 조사:

카나마이신 저항성 유전자를 토양에 유출시킨 후 카나마이신 선택압 (selection

pressure)이 가해지는 조건에서 이 유전물질이 다른 토양미생물로 어느 정도

전이, 이동되는지를 조사한다.

(3) 도입유전자의 토양 잔류수준 분석기법 조사

- Real-time PCR 방법에 의한 도입유전물질의 정량적 분석기법 조사:

real-time PCR을 이용하여 토양으로 유출된 LMO 마커 유전자 (카나마이신

저항성 유전자)의 토양 잔류 수준을 조사하고, LM작물 도입유전자 cry1F의 토양

잔류 수준을 시간별로 조사한다.

6

2. 조사 및 분석방법

1) 국내 유통 중인 LMO가 토양미생물 생태계에 미치는 영향 확인기법 개발

(1) 격리온실 설치, LM옥수수 재배 및 토양시료 채취

본 과제의 1차년도 연구 초기 (2009년 4월 16일)에 설치한 강원대학교 부지 내

격리 비닐 온실을 3차년도에도 그대로 이용하였다 (Fig. 1). 온실의 크기는 폭 7 m,

길이 10 m, 최대 높이 4 m이며 전후 양쪽에 출입문이 있으며 환기를 위해 양 옆면

을 올릴 수 있게 하였다. 2011년 4월 1일에 부산물퇴비 200 kg과 복합비료를 10 kg

을 고루 살포한 후 표층 토양과 잘 혼합하였다.

Fig. 1. 본 연구가 수행되고 있는 강원대 구내에 설치된 격리 온실 전경

2011년 4월 12일 wild type의 nonLM옥수수로 재래종 찰옥수수 그리고 LM옥수

수로 crystal Bt toxin 유전자가 도입된 Bt옥수수를 별도의 구역에 파종하고 그 사

이에 미파종 대조구 지역을 두었다. 재래종 찰옥수수 파종 구역은 다시 두 구역으

로 나누어 정상적인 수분 공급지역과 절반의 수분을 공급하여 건조스트레스를 가한

지역으로 나누었다. Bt옥수수는 1차년도 연구에서 수확한 종자에서 crystal Bt

toxin 유전자인 cry1F 도입 여부를 조사하여 선발하였다. Qiagen DNeasy mini kit

를 이용하여 DNA를 추출하고, reference gene으로 옥수수 유전자내의 알코올탈수

소효소 유전자 (adh, alcohol dehydrogenase)를 이용하였으며, target gene으로

TC1507 옥수수품종의 Cry1F 도입유전자를 대상으로 특이적인 프라이머를 이용하

7

여 adh와 cry1F fraLMent를 증폭하였다. PCR 수행 결과 cry1F gene의 증폭 분석

은 각각의 옥수수 DNA의 주형에서부터 131base pair의 PCR product 생성의 유무

로 확인하였다. 그 결과 TC1507과 DAS59122의 두 가지 event의 형질전환 작물로

추정되는 옥수수에서만 양성반응을 나타냈으며, 비형질전환 옥수수에서는 cry1F

gene이 검출되지 않았다 (Fig. 2).

(A) (B)

Fig. 2. Maize genotyping with PCR amplification. Template DNA were extracted

from 6days of growth Maize leaves and roots. (A): Detection of the adh1

gene(231bp), Lanes: 1 and 2, non-transgenic maize; 3 and 4, LM maize supposed

to be double mutant of TC1507 and DAS59122; 5 and 6, LM maize Roundup

Ready; 7, 100 bp marker. (B): Detection of the cry1F gene TC1507(131bp),

Lanes: 1, 100bp marker; 2 and 3, non-transgenic maize; 4 and 5, LM maize

supposed to be double mutant of TC1507 and DAS59122; 6 and 7, LM maize

Roundup Ready.

위의 방법으로 판별된 LM옥수수를 별도로 구분하여 재배하였다. 재배 시 농약

은 살포하지 않았으며 출사기 때 웃거름으로 요소를 시비하였다. 파종 후 5, 8., 10,

11, 12, 13, 15, 18주 20주 후 nonLM옥수수와 Bt옥수수 두 종류 옥수수의 근권토양

을 채취하였다 (Fig. 3). 각각 다른 구역에서 자라는 3개의 옥수수 개체로부터 표층

토양을 약 2∼3cm 걷어낸 후 뿌리 자체가 포함되지 않게 뿌리 근처 약 1∼3cm의

근권토양을 총 약 1 kg 정도 채취하고 잘 혼합하여 1개의 혼합시료를 만들어 총 3

반복의 혼합시료를 준비하였다. 토양은 2 mm 체로 거른 후 일부는 drying

oven(105)에서 12시간 건조시켜 건조중량을 측정하여 토양의 수분함량을 조사하

였으며 나머지 토양에서 미생물 군집을 분석하였다.

8

Fig. 3. 옥수수 파종 및 생장 상태

9

(2) 토양미생물 군집변화 분석을 위한 배양방법 조사

가. 토양미생물 밀도 조사

재배된 LM옥수수의 근권토양에서 토양미생물의 개체수의 변화를 배양을 통해

조사하여 그 타당성 여부를 알아본다. 토양미생물의 종류는 크게 세균과 진균을 조

사한다.

a) 일반세균 군집밀도 분석

토양세균 밀도는 소위 일반세균이라 하는 호기성 종속영양세균의 개체수를 측정

한다 (종속영양 평판계수, heterotrophic plate count). 1차년도에 가장 많은 개체수

를 나타내었던 King's B medium 3g을 증류수 980ml (최종은 1000ml)에 넣는다.

pH 7.0으로 맞춘 후, 여기에 agar 15g을 넣고 고압멸균 한다. 멸균이 끝난 후, 배지

의 온도가 50 정도 되면 Cycloheximide (200mg/ml EtOH) 10ml을 넣고 잘 섞은

후 Petri dish에 분주한다. 배지는 agar가 충분히 굳은 후 사용하였고 남은 것은

polyethylene bag에 넣어 냉장 보관한다. 채취한 옥수수 근권토양을 잘 섞어서 1g을

취한 후, 멸균된 0.85% 생리식염수로 토양 희석액 10ml로 조제한 다음, 그 중 1ml

을 취하여 차례로 10-1~10-7까지 희석하고 이를 King's B medium에 100씩 3반복

으로 도말한다. 희석액이 도말된 배지를 incubator에서 28, 48시간 배양 후, 배지

에 나타난 집락을 계수한다.

b) 진균군집 밀도 분석

진균군집 밀도는 배양계수 대신 1차년도 조사 시 뚜렷한 개체군 변화양상이나

LM옥수수와 nonLM옥수수 근권토양에서 차이를 보였던 균사체 길이를 측정한다.

토양 현탁액을 적절히 희석한 후 acridine orange(0.01%)로 염색하여 여과한

polycarbonate membrane filer를 형광현미경 하에서 micrometer를 이용하여 균사의

길이를 측정하여 진균의 밀도를 측정한다.

c) 방선균 군집 밀도 분석

증류수 990ml (최종은 1000ml)을 준비하고 여기에 Sodium Caseinate 0.2g,

KH2PO4 0.5g, MgSO4․7H2O 0.2g, FeCl3․6H2O 0.5g을 가하여 용해시킨 후 pH를

6.5～6.7으로 조정하고 pH 조절 후 Agar 15g을 넣고 고압멸균 한다. 채취한 옥수수

근권토양을 잘 섞어서 10g을 취한 후, 멸균된 0.85% 생리식염수로 토양 희석액

100ml로 조제한 다음, 그 중 1ml을 취하여 차례로 10-1~10-7까지 희석하고 45

10

water bath에서 16시간 열을 가한 후 이를 준비한 Sodium Caseinate agar 배지에

100씩 3반복으로 도말한다. 희석액이 도말된 배지를 28에서 6일간 배양한 후,

배지에 나타난 콜로니를 계수한다.

나. 미생물의 기능성 종류별 배양

a) cellulolytic과 proteolytic bacteria의 개체수 조사

근권토양에 존재하는 종속영양세균이 잘 이용할 수 있는 중요한 미생물 생장기

질인 cellulose, starch, protein과 lipid를 분해할 수 있는 미생물의 밀도 조사를 위해

각 성분을 영양소로 포함시킨 선택배지 위에 적당하게 희석된 토양 현탁액을 도말

하여 일정 시간 배양 후 자라나는 미생물의 집락을 계수하여 그 밀도를 측정한다.

섬유소분해세균은 배지 (CMC 5g, TSB 3g, 한천 18g, 증류수 1 리터)에 희석된

토양 현탁액을 도말 배양한 후 0.1% Congo red 용액을 뿌려 30분간 둔 후 1M

NaCl 용액으로 세척한다. 섬유소 분해세균은 집락 주위의 붉은 색이 탈색되어 둥근

원이 생기며 이를 계수한다. 단백질 분해세균은 배지 (skim milk 10g, TSB 3g, 한

천 18g, 증류수 1 리터)에 희석된 토양 현탁액을 도말 배양한다. 배기 전체가 반투

명한 우유빛이며 단백질 분해세균은 집락 주위가 투명해지며 이를 계수한다.

다. 세균군집의 활성 조사

Biolog plate를 이용하여 탄수화물, 아미노산, 중합체 등의 탄소기질 이용능에 따

른 토양미생물군집의 functional diversity를 조사하는데 특히 리그닌 이용도를 집중

적으로 조사한다. 토양 10g에 lignin (alkali, Aldrich Chemical Co., Inc.) 20 mg을

기질로 넣어주어 3일간 배양 후 0.145M NaCl 용액 95ml에 현탁하고 10-3까지 연속

희석한 후 100를 Ecoplate (Biolog Inc., USA)의 각 well에 접종한다. Plate를 2

5에서 배양하면서 매 24시간마다 96시간까지 595nm에서의 흡광도를 plate reader

로 측정한다. 각각의 Biolog 기질에 대해 평균 well-color 측정을 위해 72시간 흡광

도를 이용한다. Average well color development (AWCD)를 다음 식으로 계산하였

다.

AWCD =∑(C-R)/n

C: 각 well의 OD560nm

R: Control well의 OD590nm

n: 기질의 수(31)

11

또한 현탁액을 원심분리 후 리그닌 분해효소의 활성도 측정하는데 lignin

peroxidase (LP), manganese-dependent peroxidase (MnP), laccase, general

peroxidase 등 네 가지의 효소를 측정한다. LiP의 활성측정은 2mM veratryl

alcohol, 0.4 mM H2O2, 50mM tartaric acid가 되도록 첨가하여 310nm에서

veratryl alcohol 이 veratryl aldehyde로 변하는 것을 측정하고 MnP의 활성은

470nm에서 2,6-DMP의 산화로 측정한다. Reaction mixture는 1mM DMP, 50mM

MnSO4, 2mM H2O2를 첨가한다. Laccase는 0.002M의 o-tolidine 100와 10분간

반응시켜 590nm에서 흡광도를 측정한다. General peroxidase는 50mM phosphate

buffer (pH 7)에 0.3mM guaiacol, 0.12mM H2O2를 반응시켜 436nm의 흡광도를

측정한다. 효소의 활성은 0.1의 흡광도 변화를 1unit으로 나타낸다.

라. 식물 뿌리의 균근 형성

옥수수 재배 종료 시 자라난 뿌리를 수거하여 흙을 제거한 후 약 1 정도 길이

로 잘라 시험관에 담아 염색에 사용하였다. 10% KOH 용액을 뿌리가 잠길 정도로

넣고 water bath에서 60로 20분간 가온하여 세포내용물을 모두 분해시켰다.

Filter paper에 옮겨 건조한 다음 0.05% trypan blue를 넣고 121, 1.5기압에서 15

분간 멸균하였다. 멸균 후 염색된 뿌리들은 50% glycerol 용액에 넣고 다시 고압멸

균기에서 121, 1.5기압으로 5분간 살균하여 탈색한 후 광학현미경하에서 100배로

관찰하였다 (Koske and Gemma, 1989).

바. 통계분석

모든 실험 결과는 SPSS ver. 18 프로그램을 이용하여 Analysis of Variance

(ANOVA)와 principal components analysis (PCA)를 시행하였다. ANOVA는 신뢰

수준 95%로 유의성을 평가하였고 Scheffe test을 이용하여 사후 분석하였다. PCA

는 요인분석 하여 Kaiser-Meyer-Olkin(KMO) 와 Bartlett 검정법으로 검정한 후

고유값이 높은 성분을 추출하였다. 추출된 성분으로 산점도를 그려 토양미생물의

군집변화를 분석하였다.

12

(3) 기존 배양법을 보완하기 위한 신규 분자생물학적 기법 최적화 방안

확립

가. Real-time PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)를 이용한 미

생물군집 평가

a) Soil DNA extraction

각 microcosm 토양시료의 soil DNA는 BIO 101® Systems의 FastDNA®

SPIN®Kit를 사용하여 추출하였다.

① Lysing Matrix E Tube에 sample soil 500을 담는다.

② soil sample을 넣은 tube에 978의 Sodium Phosphate Buffer와 122의 MT

Buffer를 첨가한다.

③ 미리 차게 해 둔 bead-beater의 speed를 5000rpm으로 맞추고 90초간 작동시킨

다.

④ bead beating이 끝나면 soli sample이 들어 있는 Lysing Matrix E Tube을 얼음

에 넣어 온도를 식힌 후 다시 위의 과정을 1회 더 반복한다.

⑤ 위 과정이 끝나면 4, 14000rpm, 5min간 centrifuge한다.

⑥ centrifuge가 끝난 뒤 supernatant를 깨끗한 새 1.5 test tube에 옮기고 여기

에 250 PPS reagent를 넣어준다. 그리고 이들이 잘 섞일 수 있도록 1분 간 충

분히 Inverting한다.

⑦ 이것을 다시 4, 14000rpm, 5min. centrifuge한 뒤 아래 pellet이 딸려오지 않게

supernatant만 다시 깨끗한 1.5 test tube에 옮긴다.

⑧ Binding Matrix Suspension을 충분히 섞어준 후 supernatant가 들어있는 1.5

test tube에 1 넣고 3분 동안 흔들어준다. 3분 동안 흔들어 준 다음에는 room

temp.에서 5～10분 동안 놓아두어 DNA가 binding된 silica matrix가 가라앉도록

한다.

⑨ binding matrix가 섞여오지 않게 위쪽의 supernatant 700를 pipet을 이용해

조심스럽게 제거한 뒤, 남은 supernatant와 silica matrix를 다시 섞어준다. 이 중

에서 700를 catch tube에 끼워둔 SPIN™ Filter에 넣고 4, 14000rpm, 1min.

centrifuge한다. 아래 catch tube에 모인 flow-through를 버리고 남은 supernatant

에 suspension한 silica matrix를 이용하여 같은 과정을 계속 반복해준다.

⑩ 미리 잘 흔들어 섞어 둔 SEWS-M을 500 SPIN™ Filter에 넣고 room

temp., 14000rpm, 1min. centrifuge한다. flow-through를 버리고 SEWS-M

13

Wash solution을 filter에서 완전히 제거하고 말리기 위해서 room temp.,

14000rpm, 2min. 다시 centrifuge한다.

⑪ SPIN™ Filter를 새로운 1.5 Catch Tube에 옮긴 뒤 tube 뚜껑을 열어 둔 상

태에서 5분 간 공기 중에서 말린다. 여기에 50 DES(DNase/Pyrogen Free

Water)를 넣고 손가락으로 tube를 가볍게 튕겨주거나 낮은 속도로 vortex하여

DES가 matrix 속으로 충분히 스며들어 섞일 수 있도록 해준다.

⑫ 충분히 섞이면 room temp., 14000rpm, 1min. centrifuge하여 DES에 녹은 DNA

가 Catch Tube에 모이게 한다.(-20 stored)

b) 변곡점 결정 PCR (Total vol. 50 µl)

PCR buffer 1×(1.5 mM MgCl2포함)

Template (20～50ng/) 1 µl

F352TA 0.5 µM

515r 0.5 µM

each dNTP 0.325 mM (총 1.3 mM)

Bovine serum albumin 1 mg/ml

SYBR Green I 0.5×

Taq DNA polymerase 2.5 U

F352TA :

5'-CGCCCGCCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGA

GGC-3‘

515r :

5'-ACCGCGGCTGCTGGCAC-3'

real-time PCR system 이용

step 1. 94 °C 5 min

step 2. 94 °C 1 min

step 3. 51 °C 1 min

step 4. 72 °C 1 min

go to step2 40 more times

step 6. 72 °C 30 min

14

c) 16S rRNA PCR

위에서 결정된 변곡점까지 동일한 PCR components를 Real-time PCR system을

이용하여 16S rDNA를 증폭시킨다.

d) PCR 산물 혼합 및 농축

변곡점까지의 PCR증폭은 반응의 포화점에서 끝나는 기존의 PCR에 비하여 증폭

산물이 매우 낮은 농도로 존재하므로 PCR산물 50를 모두 취하여 MinElute

PCR purification kit(Quiagen)를 이용해 정제․농축한다 (total vol 12). 1.5%

agarose gel에 농축된 PCR products 1ul씩 loading하여 gel상에서 밴드밝기를

Bionumerics software version 4.00 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium)을 이용하

여 측정하여 동일하게 조절된 각 시료의 농축된 PCR산물을 DGGE gel에 loading

하여 분석한다.

e) DGGE 분석

① Acrylamide 38.93g과 Bis-acrylamide 1.07g를 넣고 3°D.W를 이용하여 total

volume 100.0이 되도록 하여 40% Acrylamide/Bis(37.5:1)를 만든 후 0.45μ

filter로 filteration한 뒤 4에 보관한다.

② Ammonium persulfate 0.1g을 1.0 3°D.W에 녹여 10% Ammonium Persulfate

를 만들어 둔다. 이것은 반드시 실험 전 조제하여 사용한다.

③ Tris-base 242.0g에 Acetic acid, glacial 17.1과 0.5M EDTA(pH 8.0) 100.0

을 넣고 3°DW로 총 부피를 1000.0로 맞춰 50×TAE buffer를 만든다. 증폭한

fragment의 길이가 대략 400bp 정도이므로 gel은 8% gel을 이용하며,

denaturing gradient를 만들 solution의 농도는 low가 40%, high가 70%가 되도

록 만든다.

④ denaturing solution은 40% Acrylamide/Bis 17.5, 50×TAE 1에 deionized

formamide와 urea를 넣은 후 총 부피가 50.0이 되도록 하여 만든다. 43%

denaturing solution은 deionized formamide 8.6, urea 9.03g이 되도록 넣고,

63%에는 deionized formamide 12.6에 urea가 13.23g이 되도록 넣는다. 만들어

진 용액을 5분간 degas한 뒤 0.2μ 멸균 filter에 여과한 후에 갈색병에 넣어 4

에서 보관한다. 보관 최장기간은 한 달이며 이것을 넘길 경우에는 반드시 폐기

한다.

⑤ gel을 만들기 전에 gradient 생성 확인을 위해 Dcode Dye solution을 만든다.

15

Dcode Dye solution은 Bromophenol blue 0.05g에 Xylene cyanol 0.05g을

1×TAE buffer 10.0에 녹여서 만든다.

⑥ 2% Bromophenol blue 0.25, 2% Xylene cyanol 0.25, 100% Glycerol 7.0,

3°D.W 2.5을 섞어 2×Gel Loading Dye를 만든 뒤 amplify 해 둔 16S rDNA

sample과 1:1 volume으로 섞어준다.

⑦ 50×TAE를 희석하여 0.5×TAE 8ℓ를 만들어둔다. 이 중 7ℓ를 electrophoresis

tank에 붓고 ceramic heater가 손상되지 않도록 control module을 끼운 뒤

temperature ramp rate를 200/hr로 맞춘 뒤 buffer가 60까지 데워지게 한다.

⑧ denaturing gel 이 완성되고 모든 준비가 끝나면 다시 control module을 닫고,

온도를 60로 맞춘 뒤 running 속도를 맞추기 위해 20V로 20분간 pre-run 시

킨 뒤, 60V로 28시간 loading해준다.

⑨ loading이 끝나면 gel이 찢어지지 않게 glass plate에서 분리 후 3차 증류수

150과 15 SYBR green I(10,000X conc. in DMSO, Cambrex)을 섞어 부어놓

고 여기에 15분 정도 담가두어 염색한 후 3차 증류수에서 20분간 destaining한

다음 DNA image analyzer를 이용하여 DNA band pattern을 분석한다.

(4) 미생물상 변화 정도에 대한 판단기준 조사

가. DGGE DNA band patterns의 유의성 판단 기준 문헌조사

① DGGE profiles에 나타난 band의 수, 위치, 밝기 등을 통해 군집구조와 다양성

의 유사도 및 유의성을 판단할 수 있는 통계적 분석 방법 및 소프트웨어를 조

사한다.

② Band pattern profiles간의 유사도분석에 이용되는 기존의 상용프로그램을 통해

실험군과 대조군간의 통계적 유의성 판단의 가능성과 적합성을 조사한다.

③ 문헌조사를 통해 최적방법을 선택하고, 이를 전체 미생물군집 또는 특정 미생

물군집의 DGGE 분석결과에 적용하여 통계적 유의성을 검증한다.

나. 확립된 프로토콜의 과학적 타당성 확보 방안 추진

국립환경과학원 LMO 심사위원회와 농촌진흥청 LMO 심사위원회에 위에서

확립된 표준화된 프로토콜을 발표하여 심사위원들의 의견을 수렴하고, 한국미생

물학회, 한국미생물생명공학회 등 미생물 및 농학관련 학회에 발표를 통해 프로

토콜의 타당성과 활용성에 대해 관련 연구자들의 의견을 수렴한다. 수렴된 의견

을 반영하여 프로토콜을 표준화 시키며 유의성 판단기준을 수정 보완한다.

16

2) 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가

(1) 도입유전자의 토양내 수평적 전이 검출기법 조사

LM옥수수 밭에서 채취한 토양에 카나마이신 저항성 유전자를 대장균에 형질전

환하여 LB배지에 107까지 배양 후 이것을 열처리하여 150g의 LM옥수수 토양에

접종한 실험군과 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있지 않은 대장균을 실험군

과 똑같은 조건으로 접종한 대조군으로 나누어 real-time PCR을 이용하여 카나마

이신 저항성 유전자의 copy수를 확인하고 다른 토양미생물로의 전이, 이동 가능

성을 조사한다.

a) 카나마이신 저항성 유전자 형질전환.

카나마이신 저항성 유전자를 갖고 있는 pF1K T7 벡터 (Fig. 6)를 이용하여 다

음과 같은 방법으로 대장균에 형질전환 하였다. 카나마이신 저항성 유전자의

coding 부분의 위치는 1001～1795bp이다.

Fig. 4. pF1K T7 벡터 (Promega)

실험재료

ⅰ) SOB(1L 기준): 20g Bacto-tryptone, 5g bacto-yeast extract, 0.5g NaCl를 950

DW에 녹인 후 10 250mM KCl(1.86g/100 DW)을 넣어 완전히 녹인다. 5N

NaOH를 이용 pH 7.0으로 맞춘 후(약 200) 1ℓ로 맞춘 후 고압 멸균한다.

ⅱ) 2M MgCl2:90 DW에 19g MgCl2을 녹인 후 최종 용량을 100로 맞추고 고압

멸균한다.

ⅲ) 1M glucose: 50ml DW에 9.0078g의 glucose를 녹인 후 고압 멸균한다.

17

ⅳ) Competent cell.

ⅴ) pF1K T7 vector(50p/mole).

ⅵ) Cuvette.

ⅶ) Electoporation.

실험방법

ⅰ) Com cell, cuvette, vector를 얼음에 둔다.

ⅱ) 새 E-tube에 SOB 1 넣고 5 2M MgCl2와 20 1M glucose을 넣고

vortexing한 후 spin down(SOC) 시킨다.

ⅲ) Vector(50p/mole) 2.5를 competent cell tube에 가하고 pipetting한다.

ⅳ) Mix 된 32.5 전부를 cuvette 틈 사이로 넣어 주고 바닥을 톡톡 쳐서 액이 모

두 가라앉게 한다

ⅴ) Cuvette 겉의 물기를 닦고 electroporation(200Ω, 1.7V, 4～4.5msec)한다.

ⅵ) 재빨리 clean bench로 가져와서 SOC를 cuvette에 넣어준 뒤 pipetting하고 모

두 회수하여 다시 SOC tube에 넣는다.

ⅶ) 37 진탕배양기 안에 테잎으로 고정하여 1시간 배양한다 (SOC tube).

ⅷ) LB+kanamycin(25/) agar에 배양한 SOC tube에서 200 spreading한 후,

7에서 1～2 일 동안 배양한다.

ⅸ) 100mL LB배지에 약 0.1mL 취하여 E-tube에 넣고 형질전환된 cell을 loop를 이

용하여 접종한다. 이것을 다시 100mL 배지에 넣고 37 shaking incubater에 하루

동안 배양한다.

ⅹ) 새로운 100mL LB배지에서 1mL씩 따서 분광광도계용 cuvette 2개에 넣어 둔다

(blank 측정용). 9번을 pipet으로 따서 넣는다. 37 shaking incubater에 배양한

다.

xi) 2시간부터 20분 간격으로 측정한 OD600이 0.5～0.6이 될 때까지 키운다.

xii) 50mL tube에 담고 양팔저울을 이용하여 balance를 맞춘 후 4, 4,500rpm에 15

분 동안 원심분리한다.

xiii) supernatant를 제거하고 나머지 50mL을 붓고 다시 반복한다.

xvi) supernatant를 제거하고 최종 부피가 5mL이 되도록 0.85% saline을 부은 후

pellet을 풀어준다.

b) 카나마이신 저항성 유전자의 정량적 분석

각 토양시료의 soil DNA는 BIO 101 Systems의 FastDNA SPINkit를 사용

18

하여 추출하여 real-time PCR system을 이용하여 분석한다.

실험재료

i) Real time PCR (Roche LightCycler 480)

ii) Sealing foils

iii) 96well plates

iii) Master mix

Water, PCR-grade 4.5

kanF primer(20pmol/) 0.25

kanR primer(20pmol/) 0.25

LightCycler480 SYBR Green 1 Master 2 5

Total 15

- kanF: 5'-TGAATGAACTGCAGGACGAG-3'

- kanR: 5'-ATACTTTCTCGGCAGGAGCA-3'

실험방법

i) 실험 전에 모든 tube를 spin down 시킨다.

ii) master mix를 plate에 15씩 분주한다.(one reaction component에 reaction수

를 곱해서 한꺼번에 reaction mix를 만든다).

iii) 샘플 template를 5씩 넣는다.

iv) Seal foil을 붙이는데 sealing foil에 지문이나 먼지 등이 묻지 않도록 주의한

다.

v) Centrifuge에서 spin down (약 1500g, 2분) 한다.

vi) Plate를 기기에 넣고 software를 실행한다.

vii) PCR protocol에서 primer 온도와 product 크기에 맞추어 setting 후 실행한

다.

viii) Real-time PCR수행 (cry1F 유전자 정량 프로그램과 동일함.)

c) 카나마이신저항성 유전자를 지닌 세균군집밀도 분석

Tryptic soy broth 3g을 증류수 980ml (최종은 1000ml)에 넣는다. pH 7.0으로

맞춘 후, 여기에 Agar 15g을 넣은 배지를 준비하여 고압 멸균한다. 배지의 온도

가 56정도 되면 배지에 Cycloheximide (200mg/ml EtOH) 1ml을 넣고,

19

kanamycin stock 25/을 1ml 넣어 잘 섞은 후 Petri dish에 분주한다. 2mm

체로 친 토양 1g을 멸균한 0.85% saline 9.5mL에 넣고 shaking incubator에서

150rpm, 28에서 20분간 교반한다 (10-1희석). 교반한 시료를 clean bench로 가져

온 후 flask를 바닥에 대고 회전시켜 다시 교반시킨다. 수면이 평면이 되었을 때

즉시 수면아래 0.5～1cm 사이에서 피펫으로 1mL 취한다. 취한 1mL을 0.85%

saline 9mL에 가한다 (10-2희석). 총 10mL이 된 test tube를 약 3～5초간

vortexing한 후 1mL 취하여 다른 0.85% saline 9mL에 가한다 (10-3희석). 이와

같이 10-7까지 희석하고 이를 준비한 Tryptic soy agar 배지에 100씩 각각 도말

한다. 희석액이 도말된 배지를 incubator에서 28, 48시간 배양 후, 배지에 나타

난 콜로니를 계수한다. control토양과 카나마이신 저항성 유전자가 방출된 토양에

서 자란 콜로니의 밀도와 양상의 변화를 비교 분석한다.

d) barcoded pyro-sequencing 방법에 의한 카나마이신 저항성 유전자의 전이성 분

석

각 microcosm 토양시료의 genomic DNA는 Wizard® Genomic DNA Purification

Kit(Promega)를 사용하여 추출하였다.

실험재료

i) 1.5ml microcentrifuge tubes

ii) water bath, 37°C, 80°C

iii) isopropanol, room temperature

iii) 70% ethanol, room temperature

iv) 50mM EDTA (pH 8.0)

v) 10mg/ml lysozyme

실험방법

i) 대조구 및 카나마이신 저항성 유전자가 방출된 토양에서 자란 전체 콜로니 균

체를 각각 회수한다.

ii) 회수 된 균체를 480ul 50mM EDTA에 혼탁시킨다.

iii) 혼탁 시킨 균체에 120ul lysozyme을 넣고 37°C water bath에서 60분간 둔다.

iv) 13,000 × g에서 2분간 원심분리하고 상등액을 제거한다.

v) 600ul의 Nuclei Lysis Solution을 넣고 pipet으로 부드럽게 섞어준다.

20

vi) 80°C water bath에서 5분간 배양 후 실온에서 식힌다.

vii) 3ul RNase Solution을 첨가하여 섞은 후 37°C water bath에서 60분간 배양

후 실온에서 식힌다.

viii) 200ul Protein Precipitation Solution을 넣고 vortexing 한다.

ⅸ) 5분간 얼음에 둔다.

ⅹ) 13,000 × g에서 3분간 원심분리한다.

ⅺ) 상등액을 새 tube에 옮기고 600ul isopropanol을 넣고 섞는다.

ⅻ) 13,000 × g에서 2분간 원심분리한다.

xiii) 600ul 70% ethanol을 넣고 섞은 후 13,000 × g에서 2분간 원심분리한다.

xiv) 상등액을 버리고 15분간 air-dry한다.

xv) 100ul Rehydration Solution을 첨가하고 4°C에서 overnight 한다.

* barcoded pyro-sequencing을 위한 nested PCR

nested PCR에는 FastStart High Fidelity PCR System, dNTPack (Roche)이 사

용 되었다.

1st PCR (Total vol. 50 µl)

FastStart High Fidelity

Reaction buffer, 10× 5ul (1.8 mM MgCl2포함)

DMSO 5 µl

PCR Grade Nucleotide Mix 1 µl

Downstream primer 5 µl (최종 0.4 µM)

Upstream primer 5 µl (최종 0.4 µM)

Template DNA 1 µl (20 ng)

FastStart High Fidelity Enzyme

Blend(5U/µl) 0.5µl (2.5U/reaction)

Water, PCR-Grade up to 50µl

km450F :

5'-AGG CAG CGC GGC TAT CGT G-3‘

km450R :

5'-CCA GCC GGC CAC AGT CGA TG-3'

21

Thermal cycling

step 1. 95 °C 2 min

step 2. 95 °C 30 min

step 3. 60 °C 30 min

step 4. 72 °C 30 min

go to step2 31 more times

step 6. 72 °C 7 min

2nd PCR (Total vol. 50 µl)

FastStart High Fidelity

Reaction buffer, 10× 5ul (1.8 mM MgCl2포함)

DMSO 5 µl

PCR Grade Nucleotide Mix 1 µl

Downstream primer 5 µl (최종 0.4 µM)

Upstream primer 5 µl (최종 0.4 µM)

Template DNA 1 µl (20 ng)

FastStart High Fidelity Enzyme

Blend(5U/µl) 0.5µl (2.5U/reaction)

Water, PCR-Grade up to 50µl

22

List of barcoded primers

Primer1 :

5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-AGGCAGCGCGGCTATCGTG-3‘

Primer2-1 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCGTCAT-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-2 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGAGCTG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-3 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCAGATG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-4 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-CGATGAG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-5 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCTGCAG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-6 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGCGATG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-7 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-ATGCTGAG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-8 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TACAGCAG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

23

Thermal cycling

step 1. 95 °C 2 min

step 2. 95 °C 30 min

step 3. 60 °C 30 min

step 4. 72 °C 30 min

go to step2 31 more times

step 6. 72 °C 7 min

PCR 산물 정제 및 농축

PCR산물 50를 모두 취하여 QIAquick PCR purification kit(Quiagen)를 이용

해 정제․농축한다 (total vol 30).

실험방법

i) 250ul의 PB buffer를 50ul PCR sample에 넣고 섞는다.

ii) QIAquick spin column에 300ul의 혼탁액을 넣고 13,000 × g에서 1분간 원심분

리한다.

iii) 원심분리 후 column을 통과한 sample을 제거한다.

iv) 750ul의 PE buffer를 넣고 13,000 × g에서 1분간 원심분리한다.

v) 원심분리 후 column을 통과한 sample을 제거 후 다시 13,000 × g에서 1분간

원심분리한다.

vi) column을 새 1.5ml tube에 둔다.

vii) 30ul EB buffer를 넣고 13,000 × g에서 1분간 원심분리한다.

viii) column을 통과한 DNA 농축, 정제액을 Nanodrop 2000c 에서 확인한다.

위에서 nested PCR 방법에 의해 얻어진 증폭된 PCR 시료를 Agilent Bioanalyser

DNA 7500 Assay를 통하여 정량 분석 후 Roche GS FLX junior로 전체 염기서열

을 분석한다.

(2) 도입유전자의 토양 잔류 수준 분석

가. LM옥수수 도입유전자 cry1F의 정량분석

LM옥수수 토양에서 cry1F유전자의 background를 조사하기 위해 이 유전자를

형질전환한 대장균을 107까지 배양하고, 10-1-10-7까지 희석하여 각각을 20g의 LM

옥수수 토양에 접종한다. 그 후 각 표준시료 soil DNA를 추출하여 Real-time

PCR로 CP값을 측정하였고, 이 CP값과 세균의 농도를 바탕으로 하여 Standard

curve를 작성하고 검출한계를 조사한다.

24

a) cry1F유전자 도입 형질전환

LM 옥수수로 부터 cry1F 유전자를 분리하여 E.coli DH10B/pUC19를 이용하여

다음과 같은 방법으로 형질전환한다.

실험재료

ⅰ) SOB(1L 기준): 20g bacto-tryptone, 5g bacto-yeast extract, 0.5g NaCl를 950

DW에 녹인 후 10 250mM KCl(1.86g/100 DW)을 넣어 완전히 녹인다. 5N

NaOH를 이용 pH 7.0으로 맞춘 후(약 200) 1ℓ로 맞춘 후 고압멸균 한다.

ⅱ) 2M MgCl2:90 DW에 19g MgCl2을 녹인 후 최종 용량을 100로 맞추고 고압멸

균 한다.

ⅲ) 1M glucose: 50ml DW에 9.0078g의 glucose를 녹인 후 고압멸균 한다.

ⅳ) Competent cell.

ⅴ) cry1F 유전자와 pUC19 vector의 ligation(50p/mole).

ⅵ) Cuvette.

ⅶ) Electoporation.

실험방법

ⅰ) Com cell, cuvette, vector를 얼음에 둔다.

ⅱ) 새 E-tube에 SOB 1 넣고 5 2M MgCl2와 20 1M glucose을 넣고

vortexing한 후 spin down(SOC) 시킨다.

ⅲ) Vector(50p/mole) 2.5를 competent cell tube에 가하고 pipetting한다.

ⅳ) Mix 된 32.5 전부를 cuvette 틈 사이로 넣어 주고 바닥을 톡톡 쳐서 액이 모

두 가라앉게 한다

ⅴ) Cuvette 겉의 물기를 닦고 electroporation(200Ω, 1.7V, 4～4.5msec)한다.

ⅵ) 재빨리 clean bench로 가져와서 SOC를 cuvette에 넣어준 뒤 pipetting하고 모

두 회수하여 다시 SOC tube에 넣는다.

ⅶ) 37 진탕배양기 안에 테잎으로 고정하여 1시간 배양한다 (SOC tube).

ⅷ) LB+ampicillin(100/) agar(pH 7.5)를 30분간 건조 후 X-gal (50mg/ml) 20

를 spreading하여 30분간 건조한 뒤 배양한 SOC tube에서 100 spreading한 후,

37에서 1일 동안 배양한다.

ⅸ) 100mL LB배지에 약 0.1mL 취하여 E-tube에 넣고 형질전환된 white colony을

loop를 이용하여 접종한다. 이것을 다시 100mL 배지에 넣고 37 shaking incubater

에 하루 동안 배양한다.

ⅹ) 새로운 100mL LB배지에서 1mL씩 따서 분광광도계용 cuvette 2개에 넣어 둔다

25

(blank 측정용). 9번을 pipet으로 따서 넣는다. 37 shaking incubator에 배양한다.

xi) 2시간부터 20분 간격으로 측정한 OD600이 0.5～0.6이 될 때까지 키운다.

xii) 50mL tube에 담고 양팔저울을 이용하여 balance를 맞춘 후 4, 4,500rpm에 15

분 동안 원심분리한다.

xiii) supernatant를 제거하고 나머지 50mL을 붓고 다시 반복한다.

xvi) supernatant를 제거하고 최종 부피가 5mL이 되도록 0.85% saline을 부은 후

pellet을 풀어준다.

b) Soil DNA 추출

각 토양시료의 soil DNA는 BIO 101Systems의 FastDNA

SPIN

kit를 사용

하여 추출하였다.

c) Real-time PCR

실험재료

i) Real time PCR (Roche LightCycler 480)

ii) Sealing foils

iii) 96well plates

iii) Master mix

Water, PCR-grade 4.5

Cry1F primer(20pmol/) 0.25

Cry1R primer(20pmol/) 0.25

LightCycler480 SYBR Green 1 Master 2 5

Total 15

- Cry1F: 5'-CATTCGCGTACACCATTGTC-3'

- Cry1R: 5'-CACTTCGTTGCCTGAACTGA-3'

Realtime PCR protocol

i) Setup

Detection Format Block Type Reaction Volume

SYBR Green 96 10 – 100

26

ii) Programs

Program name Cycles Analysis Mode

Pre-incubation 1 None

Amplification 45 Quantification

Melting curve 1 Melting curves

Cooling 1 None

iii) Temperature targets

Target

()

Acquisition

mode

Hold

(hh:mm:ss)

Ramp rate

(/s)

Acquisition

(per )Pre-incubation

95 None 00:05:00 4.4 -

Amplification

95 None 00:00:10 4.4 -

55 None 00:00:20 2.2 -

72 Single 00:00:30 4.4 -

Melting curve

95 None 00:00:05 4.4 -

65 None 00:01:00 2.2 -

97 Continuous - - 10

Cooling

40 None 00:00:10 1.5 -

d) Real-time PCR 방법을 이용하여 cry1F 검량선을 참고하여 강원대 LM옥수수

도입유전자의 토양잔류수준을 일정한 시간 간격으로 분석한다.

나. 토양에 방출된 카나마이신 저항성 유전자의 정량분석

LM옥수수 토양에서 카나마이신 저항성 유전자의 background를 조사하기 위해

이 유전자를 형질전환한 대장균을 107까지 배양하고, 10-1-10-7까지 희석하여 각각

을 20g의 GM옥수수 토양에 접종한다. 그 후 각 표준시료 soil DNA를 추출하여

Real-time PCR로 CP값을 측정하였고, 이 CP값과 세균의 농도를 바탕으로 하여

Standard curve를 작성하고 검출한계를 조사한다. 토양으로 LMO(카나마이신 저

항성유전자 형질전환세균)를 유출시킨 실험군과 비형질전환 대장균을 접종한 대

조군을 대상으로 카나마이신 선택압(selection pressure)이 가해지는 조건에서 위

와 같이 real-time PCR을 이용하여 일정간격으로 카나마이신 저항성 유저자의

copy수를 조사하고 도입유전자의 토양잔류 수준을 조사한다.

27

Ⅲ. 연구결과 및 고찰

1) 국내 유통 중인 LMO가 토양미생물생태계에 미치는 영향 확인기법

개발

옥수수가 토양미생물생태계에 미치는 영향을 조사하기 위해 먼저 옥수수가 토양

에 활발하게 영향을 미칠 수 있는 시기를 알아보았다. 강원도 농업기술원 김석윤

연구원과 강원도 홍천 옥수수 시험장 박기진 박사에 의하면 옥수수는 천근성 작물

로 특히 유묘 시기에 뿌리가 크게 발달하지 않으며 대사활동도 활발하지 않다. 무

릎 높이 (4∼5엽 시기)로 자라난 신장기 때부터 뿌리와 줄기의 생장이 활발해지기

시작하고 7∼8엽 시기에 어린 이삭(유수)인 자수와 웅수가 분화되기 시작할 때 (6월

중순) 대사가 더욱 활발해지며 이 때 수분을 다량 요구한다. 생장이 활발한 시기는

우리나라의 중부지역에서 4월 중순 파종 시 파종 후 40일 이후부터 80일 정도까지

이며 수꽃이 나오는 출수기 때부터 생식생장을 준비하고 이후 생장률은 감소하며

수분을 많이 흡수하여 생식생장에 이용하는 것으로 알려졌다.

옥수수의 이런 생장 상황에 따라 본 연구에서는 4월 12일에 옥수수를 파종하였

으며 7일 후인 4월 20일에 대부분이 발아하여 파종 후 5, 8, 10, 11, 12, 13, 15, 18

주에 토양 시료를 채취하였다. 그 후 옥수수가 시들기 시작하여 20주에 마지막 시

료를 채취하였다.

(1) 토양미생물의 군집 변화를 분석하는 배양 및 활성 측정방법

가. 토양 미생물 밀도 조사

1) 수분함유량 분석

옥수수 근권토양의 수분함유량이 토양미생물군집에 어떤 영향을 미치는지 알아

보기 위해 sampling 시 각각의 수분함량을 조사하였는데 옥수수 근권토양은 7〜17

% 내외의 수분함량을 갖고 있었다 (Fig. 5). 조사 기간내 dry옥수수 토양의 수분함

량은 7〜12%로 예상대로 비교적 낮은 수분함량을 갖고 있었고 LM과 nonLM옥수

수 토양은 11〜17%로 약간 높아 ANOVA 결과 dry옥수수 토양과 LM 및 nonLM

옥수수 토양이 유의성 있는 차이를 보였다(p<0.05).

28

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

%

Fig. 5. 옥수수 근권토양내 수분함량 (, nonLM 옥수수; , LM 옥수수; , dry

옥수수)

2) 일반세균 군집밀도 분석

처음 옥수수 파종 시 time 0 라 하고 이후 일정 간격으로 옥수수 근권토양을

채취하여 일반세균의 개체수를 나타내었다 (Fig. 6). Time O 때 일반세균의 개체수

는 1.38×106±1.1×105 cells/g이었는데 5주 후 nonLM옥수수는 9.34×105± 6.0×104

cells/g으로 감소하였고 LM옥수수와 dry옥수수 근권토양에서는 6.14×105±2.39×104

cells/g와 7.11×105±5.11×104 cells/g로 감소하였다. 8주후 nonLM과 LM옥수수 토양

의 일반세균은 5.68〜5.02×105 cells/g로 유사한 수치를 나타내었고 dry옥수수 토양

의 일반세균은 2.52×105±1.5×104의 낮은 수치를 나타내었다. 10주에서 12주까지

nonLM옥수수와 LM옥수수가 비슷한 수치의 변화를 보인 반면 dry옥수수 토양의

일반세균은 일정하게 낮은 수치를 보였다. 13주, 15주에는 nonLM옥수수 토양의 일

반세균이 9.27×105〜1.04×106cells/g로 증가하였고 LM옥수수는 4.43×105〜5.43×105

cells/g으로 dry옥수수 토양과 거의 비슷한 수치를 나타내었다. 18주와 20주에는 모

두 감소하여 1.73×105〜3.93×105 cells/g로 비슷한 수치를 보였다.

Dry옥수수 토양을 포함한 세 시료에서 일반세균 개체수의 ANOVA의 유의확률

값은 0.022로 유의성 있는 결과를 나타내었는데 LM옥수수와 nonLM옥수수 토양만

의 통계적 유의확률 값은 p=0.415로 유의성 있는 차이가 없었다. 이 결과는 작물의

차이보다 환경요인의 영향이 더 클 수 있음을 알 수 있었으며 또한 LM옥수수의 모

본이 아닌 wild type 옥수수와 LM옥수수 간의 근권세균 군집 비교가 타당함을 가

리킨다. LM옥수수의 평균값을 76%로 하향조정한 결과 p=0.05이라는 유의성 있는

29

수치를 얻을 수 있었다.

Time 0 이후에 세 종류의 시료에서 모두 개체수가 감소하여 약간의 변동만을

보였는데 이는 제1,2차년도 결과와 유사하였다. 시험구역 준비 시 토양의 경작, 통

기와 시비 후 단기적으로, 또한 토양 시료 채취 후 handling 및 sieving 과정에서의

통기 및 혼합에 의해 일시적으로 배양가능 미생물의 수가 증가할 수 있는데 (Lund

and Goksoyr, 1980), 본 실험의 결과도 동일한 양상을 나타낸 것으로 추정되며 8주

부터 큰 변화가 없는 dry옥수수 토양을 제외한 두 시료는 변화가 심해 일관성 있는

결과를 얻기 힘들었다.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 17 18 19 20

Time(weeks)

x1

06 C

FU

/g s

oil

Fig. 6. 옥수수 근권토양 내 일반세균의 개체수 (, nonLM옥수수; , LM옥수수;

, dry옥수수)

3) 방선균군집 밀도 분석

방선균의 time 0 때의 개체수는 5.44×104±2.5×103 cells/g이었는데 5주 후

nonLM옥수수 근권토양은 6.2×104±4.8×103 cells/g인데 반해 LM옥수수 근권토양에

서 1.35×105±1.2×104 cells/g로 높은 수치를 나타내었다 (Fig. 7). 8주에도 LM옥수수

근권토양의 방선균의 개체수는 1.58×105±1.4×104 cells/g로 더 증가하였다. 10주 후

부터는 nonLM과 LM옥수수 토양의 개체수가 비슷한 수치를 보였으며 실험기간 내

dry옥수수 토양은 1.3〜3.88×104 cells/g로 낮은 개체수를 나타내었다. 전체 방선균

개체수의 유의확률 값은 0.007로 유의한 차이를 나타내었는데 LM과 nonLM옥수수

30

토양의 통계적 유의확률 값은 0.073이었다. 재배 초반 (1-5주)에는 p=0.04로 유의한

차이를 보였으며, LM옥수수토양의 개체수의 전 기간 평균값을 109% 상향조정한

결과 유의성 있는 수치를 얻을 수 있었다.

0

4

8

12

16

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 1314 1516 1718 1920

Time(weeks)

x10

4 C

FU

/g s

oil

Fig. 7. 옥수수 근권토양내 방선균의 개체수 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; ,

dry옥수수)

4) 진균군집 밀도 분석

균사길이의 time 0 때는 2.9±0.2 m/g이었는데 5주에서 8주까지는 nonLM옥수수와

LM옥수수 토양에서의 균사길이는 2.8〜3.7 m/g으로 오차범위 내 비슷한 수치를 보

였다 (Fig. 8). 이후 dry옥수수 토양의 균사길이는 2.6〜3.4 m/g로 낮은 반면

nonLM과 LM옥수수 토양은 10주 이후 증가하여 13주에는 LM옥수수 토양의 균사

길이가 6.1±0.4 m/g로 크게 증가하였다. 15주에 약간 감소하였으나 nonLM옥수수

토양의 균사길이와 차이를 보였다. 18주에는 dry옥수수 토양의 균사길이도 증가하

여 LM과 nonLM옥수수 근권토양의 균사길이와 비슷한 수치를 보였으며 20주에도

3.8〜4.1 m/g로 큰 차이가 없었다. LM옥수수 토양에서의 균사 밀도는 nonLM옥수

수보다 높은 수치를 나타내었는데 이러한 경향은 제1,2차년도와 유사하였고 평균

수치도 증가하였다. nonLM과 LM옥수수 토양은 유의확률 값이 0.051로 유의성의

경계수준이었는데 LM옥수수 토양의 전체 평균값을 100.2% 상향조정하면 유의성

있는 수치를 얻을 수 있었다.

세 토양 종류에서 모두 진균 균사길이가 제2차년도의 1.5∼2.5 m/g의 범위에 비

31

해 높고 제1차년도와 비슷한 수준이었다. 시간 경과에 따라 크게 변화하지 않고 대

조구나 nonLM옥수수 근권토양에 비해 LM옥수수 근권토양에서 약간 더 높은 수치

를 나타내는 경향은 제1,2차년도의 결과와 유사하였다. Bt 목화 뿌리에서 진균 집락

형성이 더 활발하다는 보고 (Gupta et al., 2004)가 있었는데 그 보다는 낮은 결과이

며 동일한 Bt 형질전환이라도 작물과 토양의 종류 등에 따라 다른 영향을 나타낼

수도 있을 것이다.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

m/g

Fig. 8. 옥수수 근권토양내 진균 균사 길이 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; ,

dry옥수수)

나. 미생물의 기능성 종류별 배양

1) cellulolytic와 preteolytic bacteria의 개체수

먼저 자연 환경에 가장 풍부한 유기물인 cellulose 분해세균을 선택배지를 사용

하여 계수하였다. Time 0 때의 개체수는 5.89×104±3.1×103 cells/g이었는데 5주 후

nonLM옥수수 근권토양은 6.17×104±2.8×103 cells/g인데 반해 LM옥수수 근권토양에

서 2.09×105±3.4×104 cells/g로 높은 수치를 나타내었다 (Fig. 9). 8주에도 LM옥수수

근권토양의 섬유소분해세균의 개체수는 1.68×105±2.8×104 cells/g로 약간 감소하였으

나 여전히 높은 개체수를 보였다. 10주 후 부터는 nonLM과 LM옥수수 토양의 개체

수가 비슷한 수치를 보였으며 실험기간 내 dry옥수수 토양은 2.42〜4.05×104 cells/g

로 낮은 개체수를 나타내었다. LM옥수수 토양의 섬유소분해세균 개체수는 nonLM

32

옥수수 토양과 유의성 있는 차이를 보였는데 (p=0.048<0.05) 이는 제1,2차년도와 비

슷한 결과이다. LM옥수수 토양의 평균값을 99.5% 하향조정하여 ANOVA를 수행했

을 때 유의확률 값이 0.051로 높아져 LM옥수수 토양과 nonLM옥수수 토양과의 유

의성 있는 차이를 줄일 수 있게 된다.

0

10

20

30

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

x1

04 C

FU

/g s

oil

Fig. 9. 옥수수 근권토양내 섬유소분해세균의 개체수 (, nonLM옥수수; , LM옥

수수; , dry옥수수)

단백질분해세균의 time 0 때의 개체수는 3.46×104±3.0×103 cells/g이었는데 5주

후에는 LM옥수수 근권토양의 개체수가 1.02×105±9.3×104 cells/g로 증가하였고

nonLM옥수수 토양도 5.82×104±5.8×103 cells/g로 약간 증가하였다. 8주에도 LM옥수

수 토양은 높은 개체수를 보였는데 섬유소분해세균과 비슷한 양상을 보였다 (Fig.

10). 10주에는 2.34〜2.43×104 cells/g 으로 LM옥수수 근권토양과 nonLM옥수수 근

권토양의 개체수가 비슷해졌고 이후 LM옥수수 근권토양의 개체수가 약간 높으나

nonLM옥수수 근권토양과 비슷한 개체수를 나타내었다. 15주에는 개체수가 약간 증

가하였으며 18주와 20주에는 2.26〜2.68×104 cells/g으로 LM옥수수 근권토양과

nonLM옥수수 근권토양의 개체수가 비슷해졌다. 단백질분해세균의 개체수 변화 양

상은 섬유소분해세균 개체수와 유사하지만 전년도와 달리 LM옥수수와 nonLM옥수

수 간의 유의성 있는 차이는 없었다 (p>0.05).

33

0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

Time(weeks)

x10

4 C

FU

/g s

oil

Fig. 10. 옥수수 근권토양내 단백질분해세균의 개체수 (, nonLM옥수수; , LM옥

수수; , dry옥수수)

다. 세균군집의 활성 조사

Biolog assay를 이용하여 탄수화물 등의 탄소기질 이용능에 따른 토양미생물군

집의 functional diversity를 조사하였으며 리그닌 분해효소 활성을 측정하여 리그닌

이용도를 집중적으로 조사하였다.

1) 종다양성 분석

종다양성 (species diversity)은 종풍부도 (species richness)와 각 종의 개체수

(또는 수도)가 얼마나 고르게 분포하는 가를 나타내는 균등도 (species evenness)를

동시에 나타내는 척도이다. 한 군집 내에서 다수의 종들이 비슷한 개체로 나타나면

종다양도는 높고 반대로 소수의 종이나 소수의 종이 상대적으로 많은 개체수를 차

지하면 다양도는 낮고 우점도가 높게 된다. 종다양도가 높은 군집은 군집내 먹이사

슬내의 포식, 경쟁과 생태적 지위를 달리함으로 상호관계 작용이 복잡하고 다양함

을 나타낸다.

종다양성 지수로 가장 흔히 사용되는 Shannon Index와 Simpson Index는 종수

(s)와 개체수(N)뿐만 아니라 종 개체수에 대한 각 종( n i)이 차지하는 비율을 고려

하고 있다. 한 군집으로부터 두 개체를 랜덤하게 추출하였을 때 두 개체가 같은 종

에 포함될 확률을 다음의 식으로 각각 나타낼 수 있다;

34

Shannon's Index H = -∑(P i * ln(P i)

Simpson Index D = 1-∑(P i)2

Pi is ration of activities on each substrate to the sum

of activities on all substrates

본 연구에서 Ecoplate의 기질 이용에 따른 Shannon Index (Fig. 11)와 Simpson

Index (Fig. 12)로 계산된 토양세균군집의 기능적 다양성은 time 0 때 가장 낮고 시

간 경과에 따라 약간씩 증가하는 경향을 나타내었다. 토양 미생물의 다양성 지수인

Simpson 지수와 Shannon 지수는 15주에 dry옥수수 토양의 Simpson 지수가 높아

진 것을 제외하고 대부분 비슷한 양상을 보였다. LM옥수수 근권토양의 종다양성

지수가 nonLM옥수수 근권토양보다 높았는데 이는 작년과 상반된 결과이기도 하다.

dry옥수수 토양은 초반에는 높다가 후반에는 비교적 낮은 수치를 나타내어 LM옥수

수와 nonLM옥수수 토양과 차이를 보였으나 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났

다(p>0.05)

0.5

1.0

1.5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Sampling No.

Ind

ex

Fig. 11. 옥수수 근권토양내 Shannon 지수 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; ,

dry옥수수)

35

0.85

0.90

0.95

1.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Sampling No.

Ind

ex

Fig. 12. 옥수수 근권토양내 Simpson 지수 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; ,

dry옥수수)

2) 기질이용도 측정

Ecoplate에 접종 시 96시간까지는 지속적으로 흡광도가 증가하다 그 이후 증가

율이 낮아졌는데 여러 연구자들이 72시간 배양 후 흡광도를 측정하고 있다

(Schutter and Dick, 2001; Shen et al., 2006). 각각의 토양미생물 군집의 기질 이용

도를 AWCD값으로 비교 분석하였다 (Fig. 13). Dry옥수수 토양의 경우 5주에는

LM옥수수 토양과 비슷한 기질이용도를 나타내었으나 8주 이후 낮아져 10주 이후에

는 nonLM옥수수 근권토양이나 LM옥수수 근권토양보다 기질 이용도가 낮았다.

Ecoplate에서 이용된 탄소기질 수의 시료 간 차이 및 시간 경과에 따른 변화 양상

도 평균 흡광도 결과와 유사하였다 (Fig. 14). Ecoplate에 대한 ANOVA 결과 유의

성 있는 차이는 없었다 (p>0.05).

Ecoplate의 기질 종류에 따른 평균 흡광도 (Figs. 15, 17, 19 and 21)와 반응수

(Figs. 16, 18, 20 and 22)의 결과를 보면 carbohydrate (7종류), carboxylic acid (9

종류)와 amino acid (6종류)는 전체 흡광도 및 반응수와 유사한 경향을 나타내어

nonLM옥수수와 LM옥수수가 유사하게 높은 수치를 나타내며 시간 경과에 따른 변

화양상도 유지되거나 약간씩 높아지는 경향이 비슷하였고 AWCD의 ANOVA 결과

와 마찬가지로 유의성 있는 차이는 없었다 (p>0.05). 재배 시간이 경과함에 따라 수

치가 높아지는 경향은 제2차년도와 비슷하나 제2차년도에는 몇몇 기질의 AWCD가

LM옥수수 근권토양과 nonLM옥수수 근권토양 간에 유의성 있는 차이가 있었던 것

36

에 반해 제3차년도에는 유의성이 없는 것으로 나타났다. Bt 형질전환작물에서

lignin 함량이 높아진다는 보고 (Flores et al., 2005)에 따라 lignin 기질을 첨가하여

3일간 배양한 것이 2차년도와 다른 결과를 보인 것 같다.

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

Time(weeks)

Ab

so

rba

nce

Fig. 13. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 AWCD (, nonLM옥

수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

Time(weeks)

Num

er

of

rea

cti

on

Fig. 14. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 이용된 탄소기질의 수

(, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

37

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213 1415 1617 1819 20

Time(weeks)

Ab

so

rba

nce

Fig. 15. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 carbohydrate 기질에

따른 AWCD (, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

Num

er

of

rea

cti

on

Fig. 16. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 carbohydrate 기질에

따른 반응수 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

38

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 121314 15161718 1920

Time(weeks)

Ab

so

rba

nce

Fig. 17. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 carboxylic acid 기질에

따른 AWCD (, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

Num

er

of

rea

cti

on

Fig. 18. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 carboxylic acid 기질에

따른 반응수 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

39

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

Time(weeks)

Ab

so

rba

nce

Fig. 19. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 amino acid 기질에 따

른 AWCD (, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 14151617 181920

Time(weeks)

Num

er

of

rea

cti

on

Fig. 20. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 amino acid 기질에 따

른 반응수 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

40

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

Ab

so

rba

nce

Fig. 21. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 polymer 기질에 따른

AWCD (, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

Num

er

of

rea

cti

on

Fig. 22. 옥수수 근권토양 접종 시 Ecoplate (72시간 배양)의 polymer 기질에 따른

반응수 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

41

3) 리그닌분해효소의 활성 측정

Laccase의 활성은 time 0때 0.33 U/ml 이었는데 점차 증가하여 8주에는 nonLM

옥수수 토양에서의 활성이 0.78 U/ml이고 dry옥수수 토양은 0.44 U/ml로 낮은 수준

이었다 (Fig. 23). 10주에는 크게 변화하여 dry옥수수 토양이 1.45 U/ml로 크게 증

가하였다가 감소하였으며 11주 이후에는 LM옥수수 토양에서의 활성도가 높아졌다.

Laccase 활성의 경우 시료간의 차이 변화가 심하고 오차 범위도 커서 일정한 경향

을 찾을 수 없었으며 유의성도 없었다 (p>0.05).

0.0

0.1

0.2

0.3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

lac a

cti

vit

y(U

/ml)

Fig. 23. 옥수수 근권토양의 laccase 활성 (, nonLM옥수수; , LM옥수수; ,

dry옥수수)

Lignin peroxidase의 활성은 5주와 8주에는 laccase 활성과 비슷한 듯하나 10주

이후 시간의 경과에 따라 각 시료 간에 많은 변화가 없지만 유의성 있는 차이는 없

는 것으로 보인다 (Fig. 24, p>0.05).

42

0.0

0.1

0.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

Lip

acti

vit

y(U

/ml)

Fig. 24. 옥수수 근권토양의 lignin peroxidase 활성 (, nonLM옥수수; , LM옥

수수; , dry옥수수)

Manganese peroxidase 활성은 time 0때 1.12 U/ml 이었는데 5주와 8주에는

nonLM옥수수와 LM옥수수 토양의 MnP 활성도는 감소하였고 8주에도 낮은 활성도

를 보이다가 10주에 LM옥수수 토양의 활성이 증가하여 15주와 18주에는 2.1∼2.5

U/ml로 크게 증가하였다 (Fig. 25). MnP 역시 다른 리그닌 분해 효소와 마찬가지

로 시료 간 오차범위가 커 유의성 있는 차이를 나타내지 못했다 (p>0.05).

0.0

0.1

0.2

0.3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

Mn

p a

cti

vit

y(U

/ml)

Fig. 25. 옥수수 근권토양의 manganese peroxidase 활성측정 (, nonLM옥수수;

, LM옥수수; , dry옥수수)

43

General peroxidase 활성의 time 0 값은 1.46 U/ml 이었으나 시간이 경과하면

서 활성도는 감소하였다 (Fig. 26). nonLM옥수수 토양에서의 효소 활성도가 비교적

낮은 수치를 보인 반면 dry옥수수 토양의 효소 활성도는 높아 nonLM옥수수 토양

과 차이를 보이나 유의성 있는 차이는 아니었다 (p>0.05).

0

0.1

0.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time(weeks)

Gua

acti

vit

y(U

/ml)

Fig. 26. 옥수수 근권토양의 general peroxidase 활성 (, nonLM옥수수; , LM

옥수수; , dry옥수수)

Bt 형질전환작물에서 lignin 함량이 높아진다는 보고 (Flores et al., 2005)와 달

리 LM옥수수 근권토양에서의 각종 리그닌 분해효소 활성은 nonLM옥수수 근권토

양에 비해 유의성 있는 증가를 나타내지 않았다.

라. 식물 뿌리에서 균근 형성 조사

옥수수 재배 시 자라난 뿌리를 수거하여 균근 형성 여부를 조사하였다. nonLM

옥수수와 LM옥수수 뿌리에서 각각 30개의 시료를 준비하여 균근을 관찰한 결과

nonLM옥수수는 22개 (86.6%), LM옥수수 24개 (93.3%)가 관찰되었다 (Fig. 27).

LM옥수수에서 nonLM옥수수보다 높은 비율로 균근이 형성되었는데 이는 제1,2차년

도의 결과와 같다.

44

Fig. 27. 현미경으로 관찰된 옥수수 뿌리의 균근 (x100 좌: LM옥수수, 우: nonLM옥

수수)

마. 통계분석

통계처리를 위하여 SPSS을 이용하였으며, 토양미생물의 개체수와 활성 결과를

종합적으로 비교하기위해 ANOVA를 이용하였고 Biolog Ecoplate의 탄소 기질 이용

도는 principal components analysis (PCA)를 수행하였다 (Fig. 28).

45

Fig. 28. 옥수수 근권토양의 탄소기질 이용도를 이용한 PCA (, nonLM옥수수; ,

LM옥수수; , dry옥수수)

그 결과 전체 변이의 65.8%, 9.8%, 4.8%를 PC1, PC2, PC3이 각각 설명하였다.

PC1에서 높은 loading factor 값을 가지는 탄소원은 phenyltehyl-amine,

L-phenylalanine, D-cellobiose, D-malic acid, D-galactonic acid, γ-lactone, Tween

80, α-ketobutyric acid, glucose-1-phosphate, D-galacturonic acid, L-arginine,

putrescine, Tween 40, α-cyclodextrin, L-threonine, 4-hydroxy benzoic acid, D,L-

α-glycerol phosphate, glycyl-L-glutamic acid 등이고, PC2는 glycogen, PC3는 α

-D-lactose이 높은 loading factor 값을 갖는 탄소원이다. 각 성분은 시료의

sampling 시기에 따라 구분될 뿐 control, nonLM옥수수 근권토양, LM옥수수 근권

토양을 구분하지 못했다.

토양미생물의 개체수와 활성 결과를 ANOVA analysis (p=0.05) 한 결과 nonLM

옥수수와 LM옥수수 근권토양 간에는 유의성 있는 차이가 없었다. 일반세균 개체수

의 ANOVA analysis 유의확률 값은 0.415이었는데 LM의 평균값을 76.2% 하향조정

한 결과 0.050이라는 유의성 있는 수치를 얻을 수 있었다. 균사길이의 경우 nonLM

옥수수와 LM옥수수 토양은 유의확률 값이 0.051로 유의성의 경계수준이었는데 LM

옥수수의 평균값을 100.2% 상향 조정하면 유의성 있는 수치를 얻을 수 있었다.

ANOVA analysis 후 유의성 있는 항목들로 principal components analysis

46

(PCA)를 수행한 결과 (Fig. 29) 전체 변이의 48.3%, 31.2%를 PC1, PC2가 각각 설

명하였다. PC1에서 높은 loading factor 값을 가지는 방선균, 단백질, 섬유소의 개체

수이고 PC2는 Ecoplate에 관련된 항목들이었다. Fig. 27에서 보는바와 같이 dry옥

수수 토양은 그림 좌측 아래쪽에 무리가 형성되어 nonLM과 LM옥수수 근권토양과

구분지어지는 것을 알 수 있다.

Fig. 29. 옥수수 근권토양의 토양미생물의 개체수와 탄소기질 이용도를 이용한 PCA

(, nonLM옥수수; , LM옥수수; , dry옥수수)

바. 토양미생물상 변화 정도에 대한 판단기준

본 연구에서는 nonLM과 LM옥수수 근권토양이 몇 가지 기능적 세균 개체수에

서 유의성 있는 차이를 나타내었다. 특히 섬유소분해세균과 단백질분해세균은 1,2차

년도와 3차년도에서 모두 LM옥수수에서 nonLM옥수수 근권토양보다 높은 개체수

를 나타내었다. 반면 Ferreira et al. (2003)은 Bt 대두의 근권토양에서 nonLM작물

보다 낮은 개체수와 건조중량을 갖는 것으로 보고하였으며 유의성 수준은 대체로

p<0.01 수준이었다. 일반세균 개체수는 재배기간 중 LM옥수수와 nonLM옥수수 근

권토양의 변화가 다양하여 일관성있는 결과를 얻을 수 없었다. 반면 방선균의 개체

47

수 분석 결과 재배 초기에 유의성 있는 차이가 있었는데 이는 재배 초기에 토양 수

분함량에 대한 유의성이 없으므로 건조 환경에 의한 영향은 아닌 것으로 보인다.

또한 식물뿌리에서 내생균근 집락화조사 결과 LM옥수수 근권토양에서 더 높은 비

율로 균근이 형성되었는데 이는 제1,2차년도와 같은 결과이다.

제1차년도와 2차년도 연구를 통해 특이적인 경향성을 나타내거나 LM옥수수와

nonLM옥수수 근권토양 간에 유의성 있는 차이를 보이는 조사항목 (섬유소분해세

균과 단백질분해세균의 개체수, Ecoplate 기질이용수 및 기질이용도) 및 매우 유

사한 결과를 나타내는 조사항목들 (일반세균, 균사길이, 방선균, 균근형성)은 차후

반복적인 실험 후 통계분석을 통해 유의성을 재확인하고 LM작물의 영향 여부를 판

단할 수 있는 정량적 기준을 도출할 예정이다. Bt corn에서 lignin 함량 증가로 인

한 낮은 생분해가 보고된 바 있어 (Flores et al., 2005) 토양미생물 활성으로 Biolog

assay를 이용한 lignin 기질 이용도를 조사하였으나 유의성 있는 결과를 얻지 못해

현재로서는 LM작물의 영향 여부를 판단할 수 없었으나 보다 장기적인 연구가 필요

한 것으로 판단된다.

정량적 기준 도출 시 기존에 보고된 결과를 비교할 필요가 있는데 토양미생물의

개체수는 토양 및 작물 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며 Brusetti et al.

(2004)은 Bt 옥수수 근권토양에서 106.3∼107.2 CFU/g soil의 일반세균 개체수를 보고

한 바 있다. Rui et al. (2005)은 Bt목화 근권에서 비교적 낮은 수준인 1∼3⨯105CFU/g soil의 일반세균과 5∼30⨯104 CFU/g soil의 무기인산염 용해세균 및 0.5∼3

⨯106 CFU/g soil의 질소고정세균의 개체수를 보고하였다. 한편 Bt 단백질을 처리

하여 토양미생물을 계수한 결과들도 있는데 Muchaonyerwa et al. (2004)은 세 가지

종류의 토양에서 일반세균은 3.4∼43⨯106 CFU/g soil, 진균은 1.8∼10.2⨯104CFU/g soil의 수준을 보고하였으며 Ferreira et al. (2003)은 Bt 단백질 생성균주 접

종 시 107.4∼109.2 CFU/g soil의 일반세균, 104.8∼106 CFU/g soil의 진균, 104.8∼106.2

CFU/g soil의 단백질분해세균, 104.8∼106.4 CFU/g soil의 섬유소분해세균 및 104.8∼

107.3 CFU/g soil의 전분분해세균의 개체수를 보고한 바 있다. 이런 결과들을 더 많

이 수집하여 일반적인 개체수 범위를 결정할 때 이용해야 하겠다.

LM작물의 영향 여부를 판단할 수 있는 정량적 기준은 유의성 있는 차이를 나타

내는 조사항목에서 통계학적으로 95% 신뢰수준 (p<0.05)을 나타낼 수 있는 개체수

와 활성의 차이를 기본으로 하고 기존의 연구결과와 비교하여 구체적인 판단기준을

결정할 예정이다. 또한 LM옥수수와 nonLM옥수수 근권토양 내의 측정치가 매우 유

사하여 통계적 유의성을 나타내지 않았던 조사항목에서 만일 어느 정도 차이가 나

타나면 통계학적으로 유의성 (p<0.05) 있는 차이인지를 계산하여 LM작물의 영향

48

여부에 대한 정량적 기준으로 삼을 수 있을 것이다.

작물의 종류에 따라 토양에 미치는 영향이 다르며 또한 LM작물이 토양에 미치

는 효과가 계절적 변화, 토양 종류와 농경 방법 같은 환경 요인에 의해 큰 영향을

받을 수 있다고 보고되었다 (Icoz and Stotzky, 2008). 따라서 비료 시비, 토양 pH

변화 등 농경지에서 흔히 일어날 수 있는 환경변화에 따른 LM작물의 영향을 조사

할 필요가 있다. 또한 배양법이건 비배양법이건 어느 한 가지 방법만으로 토양미생

물 군집 또는 구성원의 일부 동태를 정확히 파악하기 어려우며 여러 방법을 조합하

거나 추가적인 방법으로 확인하는 것이 권장되기도 하였다 (Icoz and Stotzky,

2008). 따라서 본 연구에서도 여러 가지 방법을 이용한 장기적이고 반복적인 조사를

통해 LM작물에 의한 영향에 대한 결론을 내려야 할 것이며 비배양법에 의한 결과

와도 비교하여 LM옥수수가 토양미생물군집에 미치는 영향을 평가할 수 있는 방법

을 종합적으로 평가해야할 것이다.

사. 배양계수와 활성측정법의 타당성과 판단기준에 대한 의견 수렴

지금까지 조사한 항목들과 그 결과에 대한 국내의 다른 과학자의 의견을 수렴하

기 위해 2011년도 한국미생물학회 춘계학술대회와 한국미생물생명공학회 춘계학술

대회에 연구결과를 포스터를 발표하였고 국립환경과학원의 LMO심사위원회에서 구

두발표한 후 수렴된 의견은 다음과 같다;

① GM작물 도입에 대응한 시의적절한 연구내용으로 특히 유의성 있는 차이를 나

타내는 일부 조사항목들이 있는 것에 주목해야 하며 이 현상이 단기적인지 또한 만

일 장기적으로 나타난다면 다른 미생물들에 어떤 영양을 미칠지 조사할 필요성이

있다. 특히 섬유소분해세균과 단백질분해세균 등이 지속적인 차이를 나타낸다면 토

양의carbon budget, 생태계의 resilience 등에 영향을 미칠 가능성이 있을 수 있다.

② 다른 작물, 예를 들면 GM콩 등의 영향이 상당히 클 수 있으므로 추가적인 연구

가 필요하며 후속연구에서 GM작물 영향의 구체적인 기작을 밝힐 필요성이 있다.

③ 섬유소분해세균의 유의성 있는 차이를 보면 토양 내 cellulase 활성과 cellulolytic

population을 비교할 필요가 있으며 cellulolytic bacteria의 종별 변화가 있는지도 조

사할 필요성이 있다. 이를 위해 cellulase 관련 primer로 DGGE 분석을 하여 연관성

을 조사하면 단서를 얻을 가능성이 있다. 마찬가지로 proteolytic bacteria와

protease 관계도 조사할 필요가 있다.

49

④ 유의성 있는 항목들을 LMO 영향 판단기준 항목으로 정하는 것이 바람직하며

일반적으로 조사하는 소위 일반세균이라 하는 호기성 종속영양세균, 진균과 방선균

도 포함해야 할 것이다. 이 조사항목들은 유의성 있는 차이가 나오면 영향이 있는

것으로 판단해야할 것이다. 유의성 정도를 어떤 기준으로 할지, 그리고 조사항목마

다 유사한 기준을 정할지도 더 많은 조사를 통해 결정해야 할 것이다.

⑤ 영향 조사를 위한 옥수수 재배방법의 표준화가 필요할 것이다.

⑥ 더 많은 품종 실험의 필요성이 있으며 조사 시점 특히 생장활발한 시기의 유의

성 있는 차이가 식물에 어떤 영향을 미칠지 조사해야 한다.

(2) 기존 배양법을 보완하기 위한 신규 분자생물학적 기법 조사

1) 토양세균군집의 Real-time PCR-DGGE 분석

1, 2 차년도 DGGE 분석 기법의 개선을 통해 F352TA/515r 프라이머를 이용하여

다양한 세균군의 16S rRNA gene을 증폭시키고, 14%의 polyacrylamide gel을 이용

한 DGGE 분석을 통해 높은 해상도의 band pattern을 얻을 수 있었다. 본 연구에서

는 개선된 DGGE 분석기법을 적용하여 LM옥수수 재배에 따른 토양 세균 군집의

변화를 조사하였다.

가. 옥수수 경작토양의 16S rDNA Real-time PCR의 변곡점 분석

16S rDNA-PCR의 bias를 최소화하기 위해 우선 옥수수 재배 시험구의 여러 토

양에서 추출된 DNA를 대상으로 하여 real-time PCR방법에 의해 각 토양 DNA의

PCR 포화상태를 조사하여 DNA 증폭곡선의 변곡점을 분석하였다 (Fig. 30). 이 변

곡점 실험 결과로 볼 때 옥수수 재배 시험구의 토양은 25 cycle 내외에서 변곡점이

형성되는 것으로 관찰되었고, 따라서 본 연구에서 진행된 옥수수 시험구 토양을 대

상으로 한 16S rDNA-real time PCR은 25 cycle까지 수행하였다.

50

Fig. 30. 강원대 실험 포장의 토양에서 추출된 전체 soil DNA에 대한 16S

rDNA-Real time PCR의 변곡점 분석.

나. 16S rDNA Real-time PCR-DGGE 분석

강원대 옥수수 재배 포장은 LMO 옥수수 경작지, 비형질전환 옥수수 경작지, 건

조 조건이 가해진 비형질전환 옥수수 경작지 등의 3가지 그룹으로 나눠져 있는데,

16S rDNA Real-time PCR-DGGE 분석을 위해 각 경작지에서 토양시료를 채취하

였고 3반복으로 DGGE band pattern을 분석하였다. 토양시료는 옥수수 생장 특성과

환경변화를 고려하여 옥수수 파종직후 4월부터 8월까지 토양을 채취하였는데, 특히

옥수수 생육이 왕성했던 6월 20일부터 7월 12일까지는 7일 간격으로 4회에 걸쳐 토

양시료를 채취하였다.

옥수수 파종 직후인 4월에는 품종과 옥수수 파종에 관계없이 포장 내 시험구 전

체에서 비교적 균질한 DGGE DNA band pattern이 관찰되었다 (Fig. 31, A). 한편,

옥수수가 왕성하게 자라기 시작하는 6월에도 각 실험구와 대조구 토양을 대상으로

분석된 DGGE profile이 서로 유사한 것으로 관찰되었다 (Fig. 31, B와 C). 한편, 배

양방법에서 옥수수 재배 후 5-8주의 LM 옥수수와 non-LM 옥수수 토양사이에 섬

유소분해세균의 밀도가 다소 차이가 나는 것으로 나타났는데, 분자생물학적 방법으

로 얻어진 DGGE profile에서도 6월 20일의 LM 옥수수와 non-LM 옥수수 토양사

이에 3-4개의 DNA band의 위치 및 강도에 차이가 있는 것으로 관찰되었다 (Fig.

31, B).

옥수수를 경작한 지 약 3개월 정도 지난 7월 초부터 건조 조건을 가해준 토양의

DGGE band pattern에서 다른 경작 토양에서는 관찰되지 않는 DGGE band가 나타

나기 시작하였는데 (Fig. 32, 화살표), 정상 조건에서 재배된 LM 옥수수와 비형질전

환 옥수수 경작 토양사이에는 유사한 DGGE pattern이 관찰되었지만, 건조 조건에

51

서 재배된 비형질전환 옥수수 토양의 DGGE profile은 이들과 많이 다른 것으로 관

찰되었다 (Fig. 32, D and E). 이러한 결과는 7월 26일의 DGGE profiles에서도 관

찰되어 건조 조건에서 재배된 비형질전환 옥수수 경작 토양의 DGGE profile이 정

상 조건에서 재배된 옥수수 토양의 DGGE profile과 다른 것으로 나타났다 (Fig. 33,

F). 건조 조건에서 재배된 옥수수 토양의 측정된 수분함유율은 다른 정상적인 조건

에서 재배된 옥수수 토양의 수분함유율보다 7월 초부터 7월 말까지의 기간 동안에

크게 낮은 것으로 나타났는데, 이 건조 스트레스로 인해 옥수수 재배 토양의 미생

물군집 구조가 크게 변한 것으로 판단된다. 한편, 옥수수 수확 후인 8월 16일에는

토양의 수분함유율에 큰 차이가 없었는데, 이에 따라 이 시점의 옥수수 재배 토양

의 DGGE band pattern의 차이는 크지 않은 것으로 관찰되었다 (Fig. 33, G).

7월 12일의 DGGE band pattern을 BioNumerics software를 이용하여 Pearson

Correalation Cluster를 분석한 결과 비형질전환 옥수수 (wild type)의 토양과 LM

옥수수 토양이 93.4%의 유사도를 보이며 그룹화 된 반면에, 건조 조건을 가해준 토

양의 DGGE band pattern은 약 87.4%의 유사도 수준에서 이들과 그룹화되는 것으

로 관찰되었다 (Fig. 35, A). 또한 7월 26일의 DGGE band pattern을 BioNumerics

software를 이용하여 Pearson Correalation Cluster를 분석한 결과 비형질전환 옥수

수의 토양과 LM 옥수수 토양이 92.7%의 유사도를 보이며 그룹화 된 반면에, 건조

조건을 가해준 토양의 DGGE band pattern은 약 87.9%의 유사도 수준에서 이들과

그룹화되는 것으로 관찰되었다 (Fig. 35, B). 7월 12일과 26일의 옥수수 재배 토양

에서 얻어진 DGGE band pattern에 유의한 차이가 있는가를 조사하기 위해 DGGE

profile에 나타난 DNA band의 수, 위치, 강도의 정량 값을 이용하여 통계분석을 한

결과, 정상 조건에서 재배된 LM 옥수수와 비형질전환 옥수수 토양사이에는 t-test

에서 이들 DGGE profile사이에 유의한 차이가 없는 것으로 분석되었고, 이들 토양

과 건조 조건이 가해진 옥수수 토양사이에는 t-test에서 유의한 차이가 있는 것으로

분석되었으며 (0.05<P), 또한 ANOVA 분석에서도 95%의 신뢰수준에서 유의한 차

이가 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 LM 옥수수와 비형질전환 옥수수를 정

상적인 조건에서 재배한 경우에는 이들 토양의 세균군집 구조에 유의한 차이가 없

지만, 건조 조건을 가해준 토양의 세균군집은 크게 달라진다는 것을 가리킨다.

위의 결과로 볼 때 옥수수 재배 후 6월까지는 토양의 수분함유율에 큰 차이가

없어서 건조 조건을 가해준 토양, 비형질전환 옥수수 경작 토양, LM 옥수수 경작

토양의 토양미생물의 군집 구조에 큰 차이가 없지만, 수분함유율이 크게 차이 나는

7월에는 건조 조건을 가해준 토양의 세균군집이 크게 변하였고, 이러한 변화가

Real-time PCR-DGGE 방법에 의해 검출된 것으로 보인다.

52

한편, 계절에 따른 옥수수 재배 토양의 세균군집 구조의 변화를 16S Real-time

PCR-DGGE 방법으로 분석한 결과가 Fig. 34에 나타나 있다. 계절 변화에 따른 옥

수수 재배 토양의 DGGE profile의 유사도를 분석한 결과, LM 옥수수 토양과 비형

질전환 옥수수 토양의 경우에는 6월과 7월 토양이 91.8%의 유사도를 보이며 그룹화

되었고, 8월 토양과는 90.1%의 유사도로 그룹화 되었다. 하지만 봄인 4월 토양과는

81.9%의 낮은 유사도로 그룹화 되었다 (Fig. 36, A). 이 cluster 분석을 바탕으로 하

여 t-test를 실시한 결과 여름인 6월, 7월 그리고 8월의 형질전환과 비 형질전환 사

이에서는 유의한 차이가 없었지만 봄인 4월 토양과는 유의한 차이를 보였다

(0.05<P). 또한 95% 신뢰도 수준에서 ANOVA 분석한 결과 여름인 6월, 7월, 8월

토양의 DGGE profile 사이에는 큰 차이가 없었으나, 봄인 4월 토양의 DGGE

profile과는 유의한 차이를 보였다.

건조 조건에서 재배된 옥수수 토양의 계절별 DGGE profile에 대해 BioNumerics

program을 사용해 Pearson correlation Cluster를 분석한 결과, 여름철에서는 수분

함유율이 비슷한 시점인 6월과 8월의 토양은 94.8%의 유사도를 보이며 그룹화 되었

고, 수분함유율이 현저히 낮은 7월 토양과는 87.1%의 낮은 유사도로 그룹화 되었다.

그리고 여름철인 6, 7, 8월의 토양은 봄인 4월 토양과는 74.8%의 매우 낮은 유사도

로 그룹화 되었다 (Fig. 36, B). 이 cluster 분석을 바탕으로 하여 t-test를 실시한

결과 6월과 8월 사이엔 유의한 차이가 없었지만 7월 토양과는 유의한 차이를 보였

고, 4월 토양과도 유의한 차이를 보였다 (0.05<P). 또한 95%신뢰도를 바탕으로

ANOVA 분석한 결과 6월과 8월 토양사이에는 유의한 차이가 없었지만, 7월 토양이

나 4월 토양과는 유의한 차이를 보였다. 이러한 결과로 보아 LMO 작물의 재배가

토양미생물군집에 미치는 영향보다는 건조 조건 처리나 계절적 변화와 같은 환경요

소에 의해 토양미생물군집이 더 크게 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다.

한편, 배양방법의 결과와 Real-time PCR-DGGE 방법의 결과를 비교하였을 때, 배

양방법에서는 환경조건을 변화시켜도 LM 옥수수와 non-LM 옥수수 토양사이에 전체

세균의 밀도에 유의한 차이가 없는 것으로 관찰되었으나, Real-time PCR-DGGE 기

법에서는 환경조건을 변화시켰을 때 DGGE profile에 큰 차이가 있는 것으로 관찰되

었다. 이와 같이 배양방법은 세균의 전체 밀도 변화를 분석할 수 있으나, 세균군집 구

조의 변화를 분석할 수 없는 것으로 나타나 LM 작물에 의한 토양미생물상의 변화를

정확하게 평가하기 위해서는 배양방법과 분자생물학적 방법 (Real-time PCR-DGGE)

을 함께 사용하여 분석, 평가할 필요가 있다고 판단된다.

53

(A) April 12, 2011 (B)June 20, 2011 (C)June 28, 2011

Fig. 31. Real-time PCR-DGGE 기법을 이용한 LM옥수수 토양세균군집 분석

강원대 실험 포장의 LM옥수수, 비형질전환 옥수수, 건조조건의 비형질전환 옥수수 경작지의 (A) 4월 17일 토양 (옥수수 파종 직

후), (B) 6월 20일 토양, (C) 6월 28일 토양.

54

(D) July 5, 2011 (E) July 12, 2011

Fig. 32. Real-time PCR-DGGE 기법을 이용한 LM옥수수 토양세균군집 분석.

강원대 실험 포장의 LM옥수수, 비형질전환 옥수수, 건조조건의 비형질전환 옥수수

경작지의 (D) 7월 5일 토양, (E) 7월 12일 토양.

(F) July 26, 2011 (G) August 16, 2011

Fig. 33. Real-time PCR-DGGE 기법을 이용한 LM옥수수 토양세균군집 분석.

강원대 실험 포장의 LM옥수수, 비형질전환 옥수수, 건조조건의 비형질전환 옥수수

경작지의 (F) 7월 26일 토양, (G) 8월 16일 토양.

55

(H) Seasonal variation

Fig. 34. LM 옥수수 경작 토양에서의 계절적 변화에 따른 토양세균군집 구조의 변

화. 1, 4, 7, 10, Dry soil; 2, 5, 8, 11, 비형질전환 옥수수 경작 토양; 3, 6, 9, 12, LM

옥수수 경작 토양.

56

(A)

(B)

Fig. 35. BioNumerics 프로그램에 의한 7월 12일과 7월 26일 토양의 16S rDNA PCR-DGGE pattern의 Cluster 분석

57

(A)

(B)

Fig. 36. BioNumerics 프로그램에 의한 계절별 16S rDNA PCR-DGGE pattern의 Cluster 분석

58

다. 확립된 프로토콜의 과학적 타당성 확보

본 과제에서 토양미생물군집 구조를 분석하는데 있어서 분자생물학적 방법으로

사용하고 있는 16S rDNA Real-time PCR-DGGE 방법은 이미 국제학술지인

Journal of Microbiological Methods에 논문으로서 게재 발표되었는데 (J. Microbiol.

Methods 78 (2009) 216-222), 이 방법에 대한 국내의 다른 과학자의 의견을 수렴하

기 위해 한국미생물학회(B011), 한국미생물생명공학회(A-23) 등 관련학회 (2011년

도 춘계학회)에 포스터를 발표하였고, 국립환경과학원 LMO 심사위원회에서 발표하

였으며, 그 평가 내용은 다음과 같다.

① 종래의 다른 DGGE 방법에서 나타나는 DGGE band의 수보다 본 연구의 16S

rDNA Real-time PCR-DGGE 방법에서 나타나는 DGGE band의 수가 훨씬 더 많

아 토양미생물 군집의 구조를 더 정확하게 분석할 수 있고, DGGE band도 기존의

방법보다 매우 뚜렷하고 선명하게 나타나 본 16S rDNA Real-time PCR-DGGE 방

법은 토양뿐만 아니라 다양한 환경시료의 미생물 군집 구조를 연구하는데 아주 좋

은 방법으로 평가됨.

② 기존의 DGGE 방법에서는 DGGE band의 수도 적을 뿐만 아니라 통계분석에서

도 DGGE band의 존재 유무를 바탕으로 하여 서로 다른 시료에서 얻어진 DGGE

profile간에 차이가 있는지를 분석하였으나, 본 16S rDNA Real-time PCR-DGGE

방법에서는 DGGE band의 존재 유무는 물론이고 band intensity도 함께 고려하여

통계적 유의성 여부를 판단할 수 있다는 점에서 본 16S rDNA Real-time

PCR-DGGE 방법이 훨씬 더 개선된 방법이라고 평가됨.

③ 본 16S rDNA Real-time PCR-DGGE 방법에서 얻어진 DGGE profile을 보면 반

복 실험 간에 DGGE pattern이 매우 유사하게 나타나는 것으로 보아 본 16S rDNA

Real-time PCR-DGGE 방법의 재현성과 신뢰성이 높은 것으로 평가됨.

④ 본 16S rDNA Real-time PCR-DGGE 방법으로 얻어진 DGGE profile을 보면

LMO 작물 경작 토양과 비형질전환 작물의 경작 토양사이에 별 차이가 없는 것으

로 나타났는데, 본 16S rDNA Real-time PCR-DGGE 방법의 유용성과 민감성을 좀

더 확인하기 위해서는 옥수수 경작 토양이외에도 다른 다양한 토양과 환경시료를

대상으로 하여 DGGE 실험을 할 필요가 있다고 평가됨.

⑤ 본 16S rDNA Real-time PCR-DGGE 방법에서는 16S rDNA 염기서열의 V3

region을 대상으로 하여 실험이 진행되었는데, 16S rDNA 염기서열의 다른 variable

region을 대상으로 하여 Real-time PCR-DGGE 실험을 수행해서 결과를 상호 비교

분석할 필요가 있다고 평가됨.

59

⑥ 본 연구과제에서 확립된 16S rDNA real-time PCR-DGGE 방법이 일반화되고

프로토콜화되어 다른 연구자가 기술적으로 쉽게 사용할 수 있으면 좋을 것으로 평

가됨.

2) 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향 평가

새로운 여러 가지 LMO 작물이 개발되면서 해충 저항성 유전자, 항생제 저항성

유전자, 제초제 저항성 유전자 등의 다양한 유전물질이 형질전환 식물체에 도입되

고 있다. 이들 LMO 작물을 재배하는 과정에서 LMO 작물에 도입된 인위적인 유전

물질의 자연생태계로의 유출 및 다른 토양미생물로의 전이 가능성에 대해 환경위해

성 측면에서 여러 연구자의 관심의 대상이 되어왔다. 그러나 지금까지의 연구에서

는 도입유전물질의 토양 잔류 정도에 대해 잘 밝혀져 있지 않고, 토양미생물로의

이동성 등에 대해 아직 잘 밝혀져 있지 않다. 이러한 결과의 주요 요인은 LMO 작

물에 도입된 유전물질의 토양에서의 운명(fate)에 대한 중장기적인 연구가 부족하

고, 유전물질을 전달받은 토양미생물을 검출하는 방법이 제한되어 있다는 점이다.

따라서 본 연구에서는 국내 유통 중인 옥수수 작물에 도입된 해충 저항성 유전자

cry1F의 토양에서의 검출기법을 조사하고 cry1F 유전자의 토양에서의 정량분석 기

법을 조사하였다. 또한, 카나마이신 저항성 유전자는 일부 LMO 작물을 개발하는데

사용되고 있는 바, 이 카나마이신 유전자가 토양에 유출되었을 때 카나마이신이 가

해지는 조건에서 어느 정도 토양에 잔류하고, 토양미생물로 어느 정도 전이될 수

있는지를 분석하였다.

(1) 토양에서의 도입유전자의 background 분석 방법 조사

해충 저항성 유전자 cry1F가 도입된 LM옥수수 작물이 재배되는 토양을 대상

으로 하여 cry1F 유전자의 검출기법과 정량분석기법을 조사하고, 카나마이신 저항

성 유전자의 background 수준과 잔류량을 분석하였다. cry1F 유전자와 카나마이신

저항성 유전자의 잔류 수준을 산출하기 위해 각 일정량의 유전자를 LM옥수수 토양

에 각각 접종하여 각 표준토양시료로부터 전체 soil DNA를 추출하였고, 추출된 soil

DNA를 이용하여 real-time PCR 분석 후 Ct값 (Threshold cycle 또는 Crossing

point, CP)을 산출하였으며, Ct값과 유전자 농도와의 상관관계를 분석하여 각 도입

유전자의 검량선 (standard curve)을 작성하였다.

60

a) LM옥수수에 도입된 cry1F 유전자의 토양에서의 background 조사

LM옥수수가 재배되는 토양에 존재하는 cry1F 유전자의 background를 분석하기

위하여 real-time PCR 기법을 활용하였다. cry1F 유전자를 가지고 있는 형질 전환

된 E. coli DH10B (cry1F)를 열처리하여 연속 희석한 후, 102-107 cfu,/g soil 수준

으로 LM옥수수가 재배되는 토양에 각각 접종하였다. 접종된 각 토양시료에서 전체

soil DNA를 추출하고 real-time PCR 기법에 의해 얻어지는 각각의 Ct 값을 비교

분석한 결과, 토양에 접종한 유전자 농도의 로그값과 Ct값 사이에 Fig. 47와 같은

비례관계가 관찰되었다.

Fig. 37. LM옥수수 토양에서의 cry1F 유전자 농도와 Ct값의 상관관계

위의 결과에서 cry1F 유전자의 농도가 102 copies/g soil 수준까지는 Ct값이 비

교적 일정하게 유지되고 있는 반면에, 102-107 copies/g soil 수준의 범위에서는 Ct

값이 일정하게 감소하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과로 볼 때 강원대학교 LM

옥수수 포장 내 토양에는 LM옥수수의 도입유전자 cry1F가 101-102 copies/g soil

수준으로 background로 존재하고 있음을 알 수 있었다.

b) LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 background 조사

LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 background를 조사하기 위

하여 카나마이신 저항성 유전자를 형질 전환한 E. coli DH10B (Kmr)를 배양, 열처

61

리한 후, LM옥수수 토양에 101-107cfu/g soil 수준으로 각각 접종하였다. 각 접종된

토양에서 전체 soil DNA를 추출한 후 real-time PCR 방법에 의해 Ct값을 산출하고

접종된 E. coli 밀도와 비교 분석한 결과, PCR Ct값과 E. coli 밀도사이에 Fig. 48

와 같은 결과를 얻었다.

Fig. 38. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자 농도와 Ct값의 상관관계

위의 결과에서 카나마이신 저항성 유전자의 농도가 103 copies/g soil 수준까지는

Ct값이 비교적 일정하게 나타나고 있고, 103-107 copies/g soil 수준의 범위에서는

카나마이신 저항성 유전자의 농도와 Ct값 사이에 일정한 비례관계가 존재함을 알

수 있었다. 이러한 결과는 LM옥수수 토양에 카나마이신 저항성 유전자가 약

102-103 copies/g soil 수준으로 이미 background로 존재한다는 것을 가리킨다.

(2) 도입유전자의 토양내 수평적 전이 검출기법 조사

일부 LM작물에 도입유전자로 사용되는 카나마이신 저항성 유전자가 카나마이신

의 선택압 및 영양성분으로써 glucose가 제공되는 조건의 토양에서 어느 정도 잔류

하는지, 또한 토양미생물에 어느 정도 이동되는지를 조사하기 위하여, 카나마이신

저항성 유전자를 가지고 있는 형질 전환된 E. coli DH10B (Kmr)를 배양, 열처리한

후 LM옥수수 토양에 접종하였다. 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있는 E. coli

DH10B (Kmr)를 접종한 실험군 (K1, K2, K3) 과 카나마이신 저항성 유전자를 가지

62

고 있지 않은 E. coli DH10B를 접종한 대조군 (C1, C2, C3) 에 각각 glucose를

100ug/g soil 수준으로 Time 0에 처리하였으며, 항생제 카나마이신을 25 ug/g soil

수준으로 Time 0와 Time 45일에 각각 처리하였다.

a) 카나마이신 선택압 조건에서의 토양 세균 밀도 변화 조사

강원대학교 LM옥수수 토양 150g을 사용한 각각의 실험군에는 카나마이신 저항

성 유전자가 들어 있는 E. coli DH10B (Kmr) (107copies/g soil) 와 항생제 카나마

이신 및 glucose를 처리하였고, 각각의 대조군에는 카나마이신 저항성 유전자를 가

지고 있지 않은 E. coil DH10B (107copies/g soil)와 항생제 카나마이신 및 glucose

를 처리하였다. 이후 일정한 시간 간격으로 토양시료를 채취하여 토양세균의 밀도

변화를 비교 조사하였다(Fig. 39).

Fig. 39. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자와 카나마이신 처리에

따른 총 세균수의 변화

카나마이신 저항성 유전자와 항생제 카나마이신을 처리한 시료에서 Time 0의

총 세균 개체수는 2.0×107 cfu/g soil수준으로 관찰되었고, 대조군의 토양에서는

1.7×107 cfu/g soil으로 나타나 실험군과 대조군사이에 큰 차이가 없음을 확인하였

다. 처리 후 9일에는 실험군의 토양에서는 총 세균이 1.9×107 cfu/g soil, 대조군은

1.6×107 cfu/g soil 으로 나타났으며, Time 0의 세균 밀도와 유의한 차이가 없음을

63

확인하였다. 처리 후 23일에는 실험군과 대조군의 토양 세균 밀도는 각각 9.0×106,

1.0×107 cfu/g soil 수준으로 관찰되었다. 그 후 계속된 실험에서 79일 이후 163일까

지 실험군과 대조군의 토양 세균 밀도는 각각 9.5×106-1.1×107 cfu/g soil,

1.0×107-1.3×107 cfu/g soil의 분포를 보이는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과로 볼

때 카나마이신 저항성 유전자와 항생제 카나마이신 및 glucose처리에도 불구하고

이 실험기간 동안에는 토양 총 세균밀도에 미치는 영향이 거의 없음을 알 수 있었

다.

한편, 카나마이신 저항성 세균의 밀도를 분석하였을 때, 카나마이신 저항성 유전

자와 카나마이신을 처리한 실험군과 항생제 카나마이신만 처리한 대조군에서 Time

0에 각각 3.3×104cfu/g soil, 3.6×10

4cfu/g soil의 수준을 보였고, 처리 후 9일에는

각각 2.8×104 cfu/g soil, 3.2×104 cfu/g soil의 수준을 보였다. 그 후 163일까지 계속

된 실험에서 카나마이신 저항성 세균의 밀도는 실험군 토양에서 2.1×104-3.6×104

cfu/g soil의 분포를 나타냈고, 대조군 토양에서는 2.0×104-3.5×104 cfu/g soil의 분포

를 보여, 실험기간 동안에는 실험군과 대조군사이에 큰 차이가 없이 일정한 분포를

보이는 것으로 관찰되었다 (Fig. 40).

Fig. 40. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자와 카나마이신 처리에

따른 카나마이신 저항성 세균 개체수의 변화.

64

b) 카나마이신 저항성 유전자의 수평적 전이 검출

앞의 실험을 통해 기존 LM옥수수 토양에 존재하는 카나마이신 저항성 토착세균

의 밀도가 약 104 cfu/g soil의 수준으로 나타났고, real-time PCR 분석을 통해 처

리된 카나마이신 저항성 유전자의 토양 background가 약 102-103 copies/g soil 수

준으로 존재하는 것을 확인하였다. 본 실험에서는 배양, 열처리한 E. coli DH10B

(Kmr)세균을 LM옥수수 토양에 인위적으로 방출한 후, 접종된 카나마이신 저항성

유전자가 토양의 토착미생물로 전이되었는지를 조사하기 위하여 배양된 카나마이신

저항성 세균을 대상으로 하여 도입유전자 (Kmr) 의 검출 및 분포를 조사하였다.

실험군의 time 0에서 배양세균의 도입유전자 검출한계를 조사하기 위하여 10-2,

10-3으로 희석한 토양시료를 카나마이신배지에 100씩 도말하여 28에서 배양하

였다. 이후 각각의 희석배수로부터 배양된 세균 집락 전체를 harvest하여 genomic

DNA를 추출하고 카나마이신 저항성 유전자의 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을

수행하였다. 실험 결과, 실험군과 대조군 모두에서 10-2의 plate에서는 171bp 크기의

카나마이신 저항성 DNA band가 검출되었으나 10-3의 plate 세균에서는 도입한 카

나마이신 저항성 유전자와 일치하는 유전자가 검출되지 않았다 (Fig. 41).

Fig. 41. Time 0 (왼쪽), 52일 (가운데), 163일 (오른쪽)후에 10-2, 10-3 의 배양

plate에서 회수된 균체에서의 카나마이신 저항성 유전자의 PCR 검출. M, 100bp

DNA ladder; P, positive control

이러한 결과로 볼 때, LM옥수수 토양에 방출된 도입유전자(Kmr)의 배양된 세

균에서의 검출 한계가 10-2의 plate임을 알 수 있었다. 그 후 계속된 실험에서 52일

후, 그리고 163일 후의 plate에서 전체 genomic DNA를 추출하여 분석한 결과,

Time 0와 마찬가지로 10-2 plate의 실험군과 대조군 모두에서 171bp 크기의 카나마

이신 저항성 DNA band가 검출되었으나, 10-3 plate의 배양된 세균에서는 접종한 카

65

나마이신 저항성 유전자의 DNA band가 검출 되지 않았다. 이러한 결과로 볼 때

glucose를 영양원으로 접종한 환경에서도 접종된 카나마이신 저항성 유전자가 토양

세균으로 광범위하게 전이, 확산되지는 않은 것으로 판단된다.

c) barcoded pyro-sequencing 기법에 의한 카나마이신 저항성 유전자의 토양미생

물로의 전이성 분석

일부 LM작물에 도입유전자로 사용되는 카나마이신 저항성 유전자가 카나마이신

의 선택압 및 영양성분으로써 glucose가 제공되는 조건의 토양에서 시간이 지남에

따라 어느 정도 잔류하는지, 또한 토양미생물에 어느 정도 이동되는지를 조사하기

위하여, 카나마이신 저항성 유전자를 처리한 LM옥수수 토양과 처리하지 않은 대조

군 토양을 대상으로 하여 이 유전자의 토양미생물로의 이동성을 barcoded

pyro-sequencing 방법에 의해 분석하였다. 이 barcoded pyro-sequencing 분석에서

는 카나마이신 저항성 유전자를 처리한 LM옥수수 토양과 처리하지 않은 대조군 토

양을 대상으로 하여 0일, 52일, 107일, 163일에 각 토양시료를 채취하였다. 채취된

각 토양시료에서 카나마이신에 내성을 보이는 미생물을 카나마이신 선택배지에 배

양한 후 균체를 회수하여 전체 미생물의 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA

를 대상으로 하여 접종된 카나마이신 저항성 유전자를 검출하는 PCR primer를 사

용하여 Nested PCR 방법에 의해 target 유전자를 증폭하였고, 증폭된 PCR 시료를

Agilent Bioanalyser DNA 7500 Assay를 통하여 정량 분석 후 (Fig. 42) Roche GS

FLX junior로 전체 염기서열을 분석하였다.

pyro-sequencing 분석 결과, 각 PCR 시료에서 11400–13917 read를 얻었으며, 동

일한 염기서열을 포함하고 있는 replicate sequences가 94.7%-96.3%를 차지하였다.

또한 서로 다른 sequence를 가지고 있는 unique read가 504-638개의 분포를 보였

고, 대부분의 unique read는 한 개의 단일 read였다. 염기서열과 크기가 동일한 상

위 10개의 large cluster가 34.6-40.3%를 차지하였고, 전체 read 중에서 400bp이상의

read는 7.3-10%에 해당하는 959-1359개의 분포를 보였다. 400bp 이상의 범위에서

target gene에 99% 일치하는 read수는 374-651 read로 32.0-53.0%를 차지하였다.

target gene에 99%의 sequence similarity를 보이는 이들 sequences를 비교 분석한

결과, 카나마이신 저항성 유전자를 처리한 토양과 처리하지 않은 토양사이에서 이

들 sequences가 발생, 검출되는 빈도가 상호 비슷하게 관찰되었다. 이러한 결과로

볼 때, 접종된 카나마이신 저항성 유전자가 토양미생물로 광범위하게 전이, 확산되

지는 않은 것으로 분석되었다 (Fig. 43).

66

67

Fig. 42. 카나마이신 저항성 유전자를 접종한 LM옥수수 토양 (K0-K163)과 접종하

지 않은 대조군 토양 (C0-C163)의 Nested PCR product의 Agilent Bioassay 결과.

68

Fig. 43. 카나마이신 저항성 유전자를 접종한 LM옥수수 토양과 접종하지 않은

대조군 토양의 target 카나마이신 저항성 유전자의 read 수.

(3) 도입유전자의 토양 잔류수준 분석기법 조사

a) LM옥수수 도입유전자 cry1F 의 정량 분석

앞의 실험에서 LM옥수수에 도입된 해충 저항성 유전자 (cry1F)가 강원대학교의

LM옥수수 실험 포장의 토양에 약 101-102 copies/g soil 수준으로 background로 들

어 있는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 하여 LM옥수수 토양시료에 해충 저항성

유전자 (cry1F)를 101-107 copies/g soil로 각각 접종하였고, 접종된 토양으로부터

전체 soil DNA를 추출한 후 real-time PCR을 이용하여 해충 저항성 유전자

(cry1F)의 정량분석을 위한 standard curve를 작성하였다 (Fig. 44).

69

Fig. 44. LM옥수수에 도입된 해충 저항성 유전자 (cry1F) 의 standard curve

LM옥수수에 도입된 해충 저항성 유전자 (cry1F)의 토양에서의 잔류 수준 분석

에는 4월 파종 직후의 토양시료와 옥수수 생육이 가장 왕성하였던 6-7월의 2개 시

료(6월 28일과 7월 12일)를 비롯하여 7월 중순을 지나 완숙단계로 접어든 LM옥수

수의 토양시료와 수확 후인 8월 시료가 사용되었다. 해충 저항성 유전자 (cry1F)의

잔류 분석은 LM옥수수 토양, 비형질전환 옥수수 토양과 물을 주지 않은 dry 토양

을 대상으로 하여 3반복으로 수행되었다. 각 시기별로 채취한 토양시료에서 전체

soil DNA를 추출한 후 real-time PCR을 이용하여 cry1F 유전자의 Ct값을 조사하

였다 (Fig. 45). LM옥수수가 재배되기 전인 4월 토양시료에서는 품종과 작물재배에

관계없이 Ct값이 비슷한 수준으로 나타났으며 이후 비형질전환 옥수수와 dry 토양

에서는 옥수수 생육 전과 차이를 보이지 않았다. 반면 LM옥수수의 경우에는 생육

단계별로 토양에서의 도입유전자 cry1F 잔류 수준에 변화를 보였다. 옥수수가 왕성

한 생육단계로 접어든 6월 말경의 토양에서 Ct값이 상당히 감소했으며 7월 종자성

숙이후로 Ct값이 증가하였으나 여전히 비형질전환 옥수수와 control 토양의 cry1F

유전자 잔류 수준과 차이를 보였다. 그러나, 옥수수의 생육단계가 지난 7월 말 토양

에서는 Ct값이 비형질전환 옥수수와 dry 토양의 cry1F 유전자 잔류수준과 비슷해

졌으며, 8월에는 LM옥수수의 Ct값이 옥수수 파종직후인 4월의 수준으로 되돌아감

을 확인할 수 있었다.

70

Fig. 45. LM옥수수 포장 토양에서의 해충 저항성 도입유전자 cry1F 의 Ct값 변화.

위에서 얻은 각 토양시료의 Ct값을 standard curve로부터 얻은 정량식에 대입하

여 토양에서의 해충 저항성 유전자 cry1F 의 밀도를 조사하였다. 옥수수 생육 전의

토양에서는 6.2×101-8.5×101 copies/g soil 로 토양의 원래의 background수준을 보였

다. 이후 LM옥수수 토양에서 cry1F 유전자 잔류 수준은 옥수수 생육단계로 접어들

면서 점차 증가하여 6월 말경의 토양에서는 6.7×103 copies/g soil 로 처음의

background 수준보다 약 100배 증가한 것으로 나타났다. 7월 초 종자성숙기의 토양

에서는 4.6×103 copies/g soil 의 수준으로 줄기와 뿌리 신장생장이 활발하였던 6월

에 비해 감소하였으나 비형질전환 옥수수와 dry 토양의 잔류량에 비해 해충 저항성

유전자 cry1F 의 밀도가 여전히 높게 나타났다. 그러나, 7월 말의 토양에서는

cry1F 유전자의 잔류농도가 2.57×102 copies/g soil 으로 산출되었으며, 8월 토양에

서는 3.4×101 copies/g soil 수준으로 검출되어 옥수수 파종전인 4월의 토양 잔류수

준으로 회복되었음을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 LM옥수수에 도입된

해충 저항성 유전자 cry1F 가 LM옥수수가 활발하게 생육하던 시기인 6월에 일부

토양으로 방출되고 있으며, LM옥수수가 활발한 생육을 멈추고 완숙 단계로 감에

따라 토양 잔류 수준이 점차로 감소하여 생육시기가 지난 후에는 원래의

background 수준인 옥수수 시험구의 4월의 수준에 가깝게 회복되었음을 알 수 있

었다. 한편 해충 저항성 유전자 cry1F의 영향을 받지 않은 dry 토양과 비형질전환

옥수수 토양에서는 옥수수 재배기간 동안에 이 유전자가 각각 2.8×101–9.0×101,

2.4×101–6.1×101 copies/g soil 의 범위로 검출되어 실험기간 동안에 원래의

background 잔류 수준에 머물고 있는 것으로 관찰되었다 (Fig. 46).

71

Fig. 46. LM옥수수 토양에서의 해충 저항성 도입유전자 (cry1F) 의 잔류수준 변화.

b) LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 정량 분석

강원대학교의 LM옥수수 토양시료에 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있는 E.

coli DH10B (Kmr)를 107 cfu/g soil 수준으로 접종하고 glucose를 100ug/g soil, 항

생제 카나마이신을 25 ug/g soil의 농도로 처리한 후, real-time PCR 방법을 이용해

도입된 유전물질이 어느 정도 잔류하는지 정량적으로 분석하였다. 대조군 토양에는

카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있지 않은 E. coli DH10B 를 107 cfu/g soil 수

준으로 접종하고 glucose 및 항생제 카나마이신을 실험군과 같은 농도로 처리하였

다. 실험군(K1, K2 and K3)과 대조군 (C1, C2 and C3)은 각각 3반복으로 수행되었

고, 일정한 시간 간격으로 토양시료를 채취하여 전체 soil DNA를 추출하고

real-time PCR에 의해 Ct값을 측정하였다. 앞의 실험에서 LM옥수수 시험구 토양에

카나마이신 저항성 유전자가 약 103 copies/g soil 수준으로 잔류하는 것을 확인한

바 있다. 따라서 정량을 위한 standard curve는 카나마이신 저항성 유전자가

103-107 copies/g soil로 처리된 토양의 DNA를 이용하여 작성하였으며 (Fig. 47) 이

를 통해 얻은 검량식에 각각의 Ct값을 대입하여 시료 내 도입유전자의 잔류 수준을

분석하였다.

72

Fig. 47. 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 standard curve

실험군과 대조군의 토양에서 Time 0를 비롯하여 각각 9일 후, 23일 후, 52일

후, 79일 후, 107일 후, 135일 후, 163일 후의 토양시료를 채취하여 전체 soil DNA

를 추출한 후 카나마이신 저항성 유전자에 특이적인 primers를 사용하여 real-time

PCR을 수행하였다. 그 결과 실험군인 K1, K2, K3 토양시료의 Ct값은 Time 0에 비

교하였을 때 실험시작 후 9일 시료에서 Ct값이 급격히 증가하는 것으로 관찰되었

고, 23일 후부터는 Ct값이 완만하게 증가하는 것으로 나타났다 (Fig. 48). 이는 LM

옥수수 토양에 107 copies/g soil 수준으로 처리한 카나마이신 저항성 유전자가 실험

시작 후 초반 9일 동안 빠르게 분해되고, 그 후 시간이 지남에 따라 점차 완만하게

분해되어 없어지고 있음을 나타낸다. 한편 카나마이신 저항성 유전자가 처리되지

않은 대조군에서는 9일 후에도 카나마이신 저항성 유전자에 대한 real-time PCR의

Ct값이 거의 일정하게 유지되는 것으로 관찰되어 LM옥수수 토양에 background로

들어 있는 카나마이신 저항성 유전자의 background 수준이 항생제 카나마이신의

처리에도 큰 변화가 없음을 알 수 있었다.

73

Fig. 48. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 Ct값 변화.

위의 실험에서 얻어진 각 토양시료의 Ct값을 standard curve의 정량식을 통해

토양 내 카나마이신 저항성 유전자의 잔류수준을 분석하였다. LM옥수수 토양의 실

험군에 도입된 카나마이신 저항성 유전자 (Kmr) 의 밀도는 Time 0의 토양 시료에

서는 토양에 처리한 형질전환 E. coli DH10B (Kmr)의 밀도에 따라 9.2×106

copies/g soil 로 검출되었으나, 9일 후의 토양에서는 처음 처리한 카나마이신 저항

성 유전자의 수준보다 약 60배 감소한 1.5×105 copies/g soil의 수준으로 잔류하는

것으로 나타났다. 23일 후의 토양에서는 6.4×104 copies/g soil, 52일 후에는 4.2×104

copies/g soil, 79일 후에는 3.3×104 copies/g soil, 107일 후에는 2.5×104 copies/g

soil 의 수준으로 검출되었다. 이후 계속된 실험에서 135일 후에는 1.8×104 copies/g

soil, 163일 후에는 1.4×104 copies/g soil 의 수준으로 검출되어 시간이 지남에 따라

접종된 카나마이신 저항성 유전자가 점차 분해되어 없어지는 것으로 관찰되었다

(Fig. 49).

74

Fig. 49. LM옥수수 토양에서의 카나마이신 저항성 유전자의 잔류수준 변화.

이러한 결과로 볼 때 옥수수 토양에 처리된 카나마이신 저항성 유전자는 실험 후

23일에 원래 처리된 수준보다 약 143배 정도 감소하였고, 163일 후에는 약 622배

정도 감소하여 실험 기간 동안에 접종된 카나마이신 저항성 유전자의 약 99.8%가

분해되어 없어진 것으로 나타났다. 한편 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있지

않은 E. coli DH10B를 처리한 대조군의 토양에서는 시간경과에 상관없이 카나마이

신 저항성 유전자가 약 102-103 copies/g soil 수준으로 검출되어 이 실험기간 동안

에는 time 0의 수준이 계속 유지되고 있는 것으로 관찰되었다 (Fig. 49).

75

Ⅳ. 결 론

일반세균 개체수는 재배 기간 내 LM옥수수와 nonLM옥수수 근권토양의 변화가

다양하여 일관성 있는 결과를 얻을 수 없었다. 진균 균사길이는 상당기간 LM옥수

수 근권토양이 나머지 두 토양시료보다 약간 더 높은 결과를 보이나 그다지 유의성

있는 차이는 아니었다. 반면 방선균의 개체수 분석 결과 재배 초기에 유의성 있는

차이가 있었는데 이는 재배 초기에 건조 중량에 대한 유의성이 없으므로 건조 환경

에 의한 영향은 아닌 것으로 보인다. 또한 상당수의 기능적 미생물군은 LM옥수수

근권토양이 상당 기간 높은 개체수를 나타내었으며 특히 섬유소분해세균과 단백질

분해세균은 오차범위를 넘어서는 정도로 nonLM옥수수 근권토양보다 높은 결과를

보였으며 통계적 유의성을 나타내었으며 이는 제1차년도 결과와도 상당히 유사하였

다. 식물뿌리에서 arbuscular mycorrhizae 집락화조사 결과 LM옥수수 근권토양에서

더 높은 비율로 균근이 형성 되었는데 이는 제1,2차년도와 같은 결과이다. 반면에

리그닌효소 활성은 일관된 경향을 나타내지 않았으며 LM옥수수와 nonLM옥수수

근권토양이 유사하거나 큰 차이를 나타내지 않았다.

개체수 및 활성 측정 결과를 통계분석한 결과 섬유소분해세균의 개체수에서 유

의성 있는 결과를 얻었으며, 균사 길이, 방선균의 개체수도 유의성의 경계수준을 나

타내었다. Ecoplate의 AWCD 만으로는 군집간의 유의성 있고 일관성 있는 상관관

계 및 변화 양상을 찾기 어려웠으나, 유의성 있는 개체수 항목과 탄소기질 이용도

를 PCA한 결과 LM옥수수 근권토양과 nonLM옥수수 근권토양이 유의성 있는 차이

가 없었다.

Real-time PCR-DGGE 기법에 의해 LM옥수수 토양, nonLM옥수수 토양, dry

condition에서 재배된 nonLM 옥수수 토양의 세균군집 구조의 변화를 비교 분석한

결과, 주어진 한 시점에서는 LM옥수수 토양과 nonLM옥수수 토양의 세균군집의

DGGE profile에 별 차이가 없었으나, dry condition에서 재배된 nonLM 옥수수 토

양의 세균군집 구조와는 큰 차이를 보였다. BioNumerics 방법에 의해 DNA band의

존재유무와 강도 (intensity)를 대상으로 하여 DGGE pattern을 통계적으로 분석한

결과, 각 주어진 시점에서는 LM옥수수와 nonLM옥수수 재배 토양 사이에 유의한

차이가 없었으나, dry condition의 nonLM 옥수수 재배 토양과는 유의한 차이를 보

이는 것으로 나타났다 (p>0.05). 또한, 계절적 흐름에 따른 토양세균군집의 DGGE

pattern은 상당한 변화가 있는 것으로 관찰되었는데, 이를 BioNumerics 방법에 의

해 분석하였을 때 봄과 여름의 옥수수 경작 토양의 DGGE profile 사이에 Pearson

correlation이 낮게 나타나 계절적으로 토양세균군집의 구조가 유의한 수준으로 변

76

화되었음을 알 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 1, 2, 3차 년도에서 개발, 검증된

real-time PCR-DGGE 기법이 토양미생물군집 구조를 분석하는데 있어서 신뢰성과

재현성이 높을 뿐만 아니라, 환경변화와 계절적 변화에 따른 토양미생물군집 구조

의 변화를 검출할 수 있을 정도로 그 민감도가 높음을 확인하였다.

한편, 배양방법의 결과와 real-time PCR-DGGE 방법의 결과를 비교하였을 때, 배

양방법에서는 환경조건을 변화시켜도 LM 옥수수와 nonLM 옥수수 토양 사이에 전체

세균의 밀도에 유의한 차이가 없는 것으로 관찰되었으나, real-time PCR-DGGE 기법

에서는 환경조건을 변화시켰을 때 DGGE profile에 큰 차이가 있는 것으로 관찰되었

다. 이와 같이 배양방법은 세균의 전체 밀도 변화를 분석할 수 있으나, 세균군집 구조

의 변화를 분석할 수 없는 것으로 나타나 LM작물에 의한 토양미생물상의 변화를 정

확하게 평가하기 위해서는 배양방법과 분자생물학적 방법 (real-time PCR-DGGE)을

함께 사용하여 분석, 평가할 필요가 있다고 판단된다.

LM옥수수가 재배된 시험구 토양에서의 해충저항성 유전자 (cry1F)와 카나마이

신 저항성 유전자의 background 수준은 각각 102, 103 copies/g soil 수준으로 관찰

되었다. LM옥수수에 도입된 해충저항성 유전자는 LM옥수수의 생육이 활발한 시기

인 6월과 7월에 토양잔류수준이 크게 증가하였으나, 옥수수를 수확한 후인 8월에는

그 잔류수준이 감소되어 LM옥수수를 파종한 4월의 원래의 수준으로 회복되는 것으

로 관찰되었다. 카나마이신 저항성 유전자를 방출한 토양에서 총세균과 카나마이신

저항성 세균의 밀도 변화는 실험기간 동안에 대조군과 큰 차이가 없는 것으로 관

찰되었고, 카나마이신 저항성 유전자는 방출 23일 후 그 잔류수준이 약 143배 정도

감소하였고, 실험 기간 동안에 접종된 카나마이신 저항성 유전자의 약 99.8%가 분해

되어 없어지는 것으로 관찰되었다.

카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되지 않은 토양에서 카나마이신에

저항성을 갖는 미생물을 agar 배지에 배양한 후 균체의 genomic DNA를 추출하여

PCR 분석한 결과, 카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되지 않은 토양에

서 동일하게 10-2 plate에서 positive DNA band가 검출되었다. 또한, 균체에서 추출된

genomic DNA를 대상으로 하여 pyrosequencing에 의해 전체 카나마이신 저항성 유

전자의 염기서열을 분석한 결과, 카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양과 접종되

지 않은 토양에서 검출된 카나마이신 저항성 유전자의 발생빈도가 서로 비슷한 것으

로 나타났다. 이러한 결과로 볼 때, 카나마이신 저항성 유전자가 접종된 토양에서 카

나마이신 저항성 유전자의 다른 토양미생물로의 광범위한 전이, 확산은 발생하지 않

은 것으로 분석되었다.

77

V. 활용방안 및 향후계획

제1,2차와 3차년도 연구를 통해 특이적인 경향성을 나타내거나 LM옥수수와

nonLM옥수수 근권토양 간에 유의성 있는 차이를 보이는 조사항목 (섬유소분해세

균과 단백질분해세균의 개체수, 방선균) 및 매우 유사한 결과를 나타내는 조사항

목들 (일반세균과 균사길이, Ecoplate 기질이용수 및 기질이용도 등)은 차후에

반복실험 후 통계분석을 통해 유의성을 재확인하고 LM작물의 영향 여부를 판단할

수 있는 정량적 기준을 도출해야 할 것이다. 한편 Bt corn에서 lignin 함량 증가로

인한 낮은 생분해가 보고된 바 있어 (Flores et al., 2005) 이 역시 장기적인 조사가

필요하며 또한 3차년도에 추가로 조사한 lignin 분해효소 활성을 반복실험하여 통계

분석을 통해 유의성을 재확인하고 LM작물의 영향 여부를 판단할 수 있는 정량적

기준을 도출해야 할 것이다.

LM작물의 영향 여부를 판단할 수 있는 정량적 기준은 먼저 문헌조사를 통한 개

체수 범위 내에 들어가는지를 조사한다. 또한 LM과 nonLM작물 사이에 유의성 있

는 차이를 나타내는 조사항목에서 통계학적으로 95% 신뢰수준 (p<0.05)을 나타낼

수 있는 개체수와 활성의 차이를 기본으로 하고 기존의 연구결과와 비교하여 구체

적인 판단기준을 결정할 예정이다. 또한 LM옥수수와 nonLM옥수수 근권토양 내의

측정치가 매우 유사하여 통계적 유의성을 나타내지 않았던 조사항목에서 만일 어느

정도 차이가 나타나면 통계학적으로 유의성 있는 (p<0.05) 차이인지를 계산하여

LM작물의 영향 여부에 대한 정량적 기준으로 삼을 수 있을 것이다.

Real-time PCR-DGGE 기법에 의해 얻어진 결과를 보면 반복실험 간에 변동이

거의 없고, 작물재배토양과 비경작토양 사이에는 DGGE pattern에 다소의 차이가

있으며, 계절적 흐름에 따라서는 매우 큰 차이를 보이는 것으로 관찰되었는바, 이

DGGE 기법은 LM 작물의 재배에 따른 토양미생물상의 변화를 검출, 평가할 수 있

는 분자생물학적 방법으로 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 3차년도 연구에서는 1,

2차년도 연구 내용을 바탕으로 하여 LMO에 의한 토양미생물상의 변화를 분석하는

real-time PCR-DGGE 기법의 일반화된 프로토콜을 점검하기 위해 문헌조사를 통

해 DGGE DNA pattern에 유의한 차이가 있는지를 판단하는 기준을 조사하고, 환경

변화에 따른 DGGE profile의 변화 양상을 비교 분석하여 real-time PCR-DGGE 기

법의 민감성을 조사한다. 이러한 결과를 종합하여 최종적으로 LM 작물에 의한 토

양미생물상에 대한 환경위해성 여부를 분석하는 분자생물학적 방법인 16S rDNA

real-time PCR-DGGE 기법의 프로토콜을 제안, 활용할 수 있을 것으로 생각된다.

78

LM작물이 토양에 미치는 효과가 계절적 변화, 토양 종류와 농경 방법 같은 환

경 요인에 의해 큰 영향을 받을 수 있다고 보고되었다 (Icoz and Stotzky, 2008). 따

라서 비료 시비, 토양 pH 변화 등 농경지에서 흔히 일어날 수 있는 환경변화에 따

른 LM작물의 영향을 조사할 필요가 있다. 또한 배양법이건 비배양법이건 어느 한

가지 방법만으로 토양미생물 군집 또는 구성원의 일부 동태를 정확히 파악하기 어

려우며 여러 방법을 조합하거나 추가적인 방법으로 확인하는 것이 권장되기도 하였

다 (Icoz and Stotzky, 2008). 따라서 본 연구에서도 여러 가지 방법을 이용한 장기

적이고 반복적인 조사를 통해 LM작물에 의한 영향에 대한 결론을 내려야 할 것이

며 비배양법에 의한 결과와도 비교하여 LM옥수수가 토양미생물군집에 미치는 영향

을 평가할 수 있는 방법을 종합적으로 평가할 예정이다.

79

Ⅵ. 연차별 주요 내용 및 결과 요약

1년차(2009) 2년차(2010) 3년차(2011)

국내 유통 중인 LMO

가 토양미생물 생태계에

미치는 영향 확인 기법

개발

토양미생물 군집변화

분석을 위한 배양 및 활성

측정 방법 조사

-배양계수와 활성측정방

법 중 많은 항목에서 실

험 결과의 재현성이 높은

편이었음. 대체로 적은 실

험오차로 개체군과 활성

의 변화 경향을 비교하기

가 용이하였음.

-일반세균, 진균과 남세

균의 배양계수와 균사체

길이는 nonLM옥수수 근

권토양에서 약간 높은 개

체수를 나타내었음.

-방선균은 재배 초기에

유의성 있는 차이로 LM

옥수수 근권토양이 높음.

-섬유소분해세균, 전분분

해세균, 단백질분해세균과

지질분해세균의 개체군은

LM옥수수 근권토양에서

약간 높은 개체수를 나타

내며 특히 섬유소분해

세균과 단백질분해세균은

유의성을 가짐.

-형광성 세균, 탈수소

효소와 FDA 가수분해

활성은 일관된 경향이나

차이가 없었음.

-LM옥수수에서 nonLM옥

수수보다 높은 비율로 균

근이 형성됨.

국내 유통 중인 LMO

가 토양미생물 생태계에

미치는 영향 확인 기법

개발

토양미생물 군집변화

분석을 위한 배양 및 활성

측정 방법 조사

-일반세균과 진균 균사길

이는 유의성은 없으나 상

당기간 LM옥수수 근권토

양에서 약간 더 높은 결

과를 보임.

-섬유소분해세균과 단백

질분해세균은 LM옥수수

근권토양이 통계적으로

유의성 있게 높은 결과를

나타냄.

-전분분해세균, 지질분해

세균, 무기인산염-용해세

균, K-용해세균은 LM옥

수수와 nonLM옥수수 근

권토양 간의 유의성 있는

차이가 없었음.

-Biolog assay를 이용한

기능적 다양성의 경우 여

러 기질 종류에서 nonLM

옥수수 근권토양이 높았

음.

-LM옥수수에서 nonLM옥

수수보다 높은 비율로 균

근이 형성됨.

-여러 일반적 또는 특이

적 효소 활성은 일관된

경향이나 차이를 나타내

지 않았음.

국내 유통 중인 LMO

가 토양미생물 생태계에

미치는 영향 확인 기법 개

발

토양미생물 군집변화

분석을 위한 배양 및 활성

측정 방법 조사

-일반세균은 nonLM 옥수

수토양과 LM 옥수수토양

간에 변화의 일관성이나

유의차가 없었음.

-방선균과 진균 균사길이

는 상당기간 LM옥수수

근권토양이 약간 더 높은

결과를 보이는데 방선균은

초기에 유의성이 있으며

진균 균사길이는 유의성의

경계 수준을 나타내었음.

-섬유소분해세균과 단백

질분해세균은 LM옥수수

근권토양이 높은 결과를

보였으며 특히 섬유소분해

세균은 통계적으로 유의성

있는 차이가 있었음.

-Biolog assay를 이용한

기능적 다양성의 경우 일

관된 경향이 없음.

-LM옥수수에서 nonLM옥

수수보다 높은 비율로 균

근이 형성됨.

-리그닌 분해효소 활성은

일관된 경향이나 차이를

나타내지 않았음.

-Ecoplate assay에 리그닌

을 첨가한 경우 유의성 있

는 차이나 경향이 없음.

80

1년차(2009) 2년차(2010) 3년차(2011)

기존 배양법을 보완

하기 위한 신규 분자생

물학적 기법 조사

-primer, dNTP농도,

DGGE gel 조건, PCR

조건 등을 분석하여

real- time PCR DGGE

기법의 최적 조건을 확

립함.

-토양 DNA와 토양미

생물 DNA 추출방법을

비교 분석한 결과 soil

DNA spin kit 방법이

반복성과 신뢰성이 높

은 것으로 나타남.

-문헌조사를 통해 pyro

sequencing 방법의 적

용가능성을 조사함.

-토양미생물상의 분류

군별 DGGE 분석방법

을 문헌조사한 결과 질

소고정효소를 대상으로

한 PolF/PolR primer

조합을 확정함.

토양미생물 생태계

에 미치는 장기적 영향

평가

-16S rRNA 유전자와

카나마이신 저항성 유

전자를 대상으로 하여

real-time PCR에 의한

토양세균의 background

검출 방법을 확립함.

-카나마이신 유전자의

토양세균으로의 전이성

을 조사하기 위해 배양

된 콜로니와 카나마이

신 저항성 유전자의 밀

도 변화를 분석한 결과

카나마이신 저항성 유

전자의 이동성이 관찰

되지 않음.

기존 배양법을 보완하기 위

한 신규 분자생물학적기법 조사

-Real-time PCR DGGE 분석

결과 토양세균 군집이 계절적

으로는 변화를 보이나 LM과

nonLM옥수수 사이에는 큰 차

이가 없었음.

-DGGE profile은 DNA band의

유무, 수, 강도를 대상으로

BioNumerics 방법에 의해 통계

적 분석이 가능함.

-Pyrosequencing 분석결과 LM

과 nonLM 토양미생물의 군집

구조에 큰 차이가 없었음. 이

방법은 반복성이 낮고 종 분석

이 어려워 LM 재배지의 토양

미생물 분석에 적합하지 않음.

-Nested PCR-DGGE 방법으로

질소고정유전자를 대상으로 하

여 토양미생물 군집 구조의 변

화를 조사한 결과 반복성과 신

뢰성이 낮았음.

토양미생물 생태계에 미치

는 장기적 영향평가

-LM옥수수 토양에서의 해충저

항성 유전자(cry1F)와 카나마

이신 저항성 유전자의 배경 수

준은 각각 102, 103 copies/g

soil 수준으로 관찰됨.

-배양방법과 PCR 방법으로 분

석한 결과 카나마이신 저항성

유전자가 다른 토양미생물로의

이동 확산은 검출되지 않았음.

-카나마이신 저항성 유전자는

토양방출 82일 후 잔류량이 약

200배 정도 감소하였고, 그 후

에는 비교적 일정하게 유지됨.

-LM옥수수에 도입된 해충저항

성 유전자의 토양 잔류량은 옥

수수 생육이 활발한 시기에 크

게 증가하고 수확 후에는 파종

시기 수준으로 감소하였음.

기존 배양법을 보완

하기 위한 신규 분자생

물학적 기법 조사

-LM옥수수 토양의 세

균군집에 대한 real-

time PCR DGGE 기법

의 민감성 분석 결과 환

경요소 변화에 의해 토

양미생물 군집구조가 크

게 변화하였음.

-관련학회와 LMO 심사

위원회 발표에서 real-

time PCR DGGE 기법

의 반복성과 신뢰성이

높다고 평가됨.

토양미생물 생태계에

미치는 장기적 영향평가

-LM 옥수수토양에서의

해충저항성 유전자

(cry1F)와 카나마이신

저항성 유전자의 배경

수준은 각각 102, 103

copies/g soil 수준으로

관찰됨.

-pyrosequencing에 의해

카나마이신 저항성 유전

자의 토양내 수평적 전

이성을 분석한 결과 이

유전자의 다른 토양미생

물로의 이동 확산은 검

출되지 않았음.

-LM옥수수에 도입된

해충저항성 유전자는

LM옥수수의 생육이 활

발한 시기인 6월과 7월

에 토양 잔류수준이 크

게 증가하였으나 그 후

점차 분해되어 없어지는

것으로 관찰됨.

81

Ⅶ. 참고문헌

Ahn, J.H., Kim, M.C., Shin, H.C., Choi, M.K., Yoon, S.S., Kim, T., Song, H.G.,

Lee, G..H., and Ka, J.O. (2006) Improvement of PCR amplification bias for

community structure analysis of soil bacteria by denaturing gradient gel

electrophoresis. J . Microbiol. Biotechnol. 16, 1561-1569.

Baptista J., Davenporta R., Donnellya T., and Curtisa T. (2008) The microbial

diversity of laboratory-scale wetlands appears to be randomly assembled.

Microbiol. & Biotechnol. 42, 3182-3190.

Bernbom N., Nørrung B., Saadbye P., Mølbak L., Vogensen F., and Licht T.

(2005) Comparison of methods and animal models commonly used for

investigation of fecal microbiota: Effects of time, host and gender. J .

Microbiol. Meth. 66, 87-95.

Boon N., De Windt W., Verstraete W., Top E. (2001) Evaluation of nested

PCR-DGGE (denaturing gradient gel lectrophoresis) with group-specific

16S rRNA primers for the analysis of bacterial communities from different

wastewater treatment plants., FEMS Microbiol Ecol 39, 101-112.

Brusetti K., P. Francia, C, Bertolini, A. Pagliuca, S. Borin, C. Sorlini, A.

Abruzzese, G. Sacchi, C. Viti, L. Giovannetti, E. Giuntini, M. Bazzicalupo, D.

Daffonchio (2004) Bacterial communities associated with the rhizosphere of

transgenic Bt 176 maize (Zea mays) and its non transgenic counterpart. P lant

Soil 266, 11-21.

Cirvilleri G., S. Spina, C. Iacona, A. Catara, and R. Muleo (2008) Study of

rhizospjere and phylosphere bacterial community and resistance to bacterial

canker in genetically engineered phytochrome A cherry plants. J . P lant

Physiol. 165, 1107-1119.

Coelho, M.R.R. Marriel, I.E. Jenkins, S.N. Lanyon, C.V. Seldin, L. O'Donnell,

A.G. (2009) Molecular detection and quantification of nifH gene sequences in

the rhizosphere of sorghum (Sorghum bicolor) sown with two levels of

nitrogen fertilizer Appl. Soil Ecol. 42, 48-53.

Dave, S., Lieven W., Eva M., Willy V., and Steven D.S. (2003) Impact of

agricultural practices on the Zea mays L. endophytic community, Appl.

Environ. Microbiol. 70, 1475-1482.

Dedysh S.N., Ricke P., and Liesack W. (2004) nifH and nifD phylogenies :an

82

evolutionary basis for understanding nitrogen fixation capabilities of

methanotrophic bacteria. Microbiology (UK) 150, 1301-1313.

Devare M., C. Jones, and J. Thies (2004) Effect of Cry3Bb transgenic corn and

tefluthrin on the soil microbial community: biomass, activity, and diversity. J .

Environ. Qual. 33, 837-843.

Donegan K., D. Schaller, J. Sone, L. Ganio, G. Reed, P. Hamm, and R. Seidler

(1995) Microbial populations, fungal species diversity, and plant pathogen

levels in field plots of potato plants expressing the Bacillus thuringiensis var.

kurstaki endotoxin. Transgenic Res. 5, 25-35.

Ferreira L., J. Molina, C. Brasil, and G. Andrade (2003) Evaluation of Bacillus

thuringiensis bioinsecticidal protein effects on soil microorganisms. P lant Soil

256, 161-168.

Flores S., D. Saxena, and G. Stotzky (2005) Transgenic Bt plants decompose

less in soil than non-Bt plants. Soil Biol. Biochem. 37, 1073-1082.

Fromin N, Hamelin J, Tarnawski S, Roesti D, Jourdain-Miserez K, Forestier N,

Teyssier-Cuvelle S, Gillet F, Aragno M, and Rossi P. (2002) Statistical

analysis of denaturing gel electrophoresis (DGGE) fingerprinting patterns.

Environ Microbiol 4, 634-643.

Fry J.C., G. Webster, B.A. Cragg, A.J. Weightman, R.J. Parkes (2006) Analysis

of DGGE profilles to explore the relationship between prokaryotic community

composition and biogeochemical processes in deep sea floor sediments from

the PeruMargin FEMS Microbiol Ecol 58, 86-88.

GS FLX Amplicon DNA Library Preparation Method Manual 454-Roche (2007)

Gupta, V. and S. Watson (2004) Ecological impacts of LM cotton on soil

biodiversity: Below-ground production of Bt by LM cotton and Bt cotton

impacts on soil biological processes. Australian Government Department of the

Environment and Heritage. CSIRO Land and Water, pp. 1-72.

Huber J.A., D.B.M. Welch, H.G. Morrison, S.M. Huse, P.R. Neal, D.A. Butterfield,

and M.L. Sogin (2007) Microbial population structures in the deep marine

biosphere. Science 318, 97-100.

Huse S.M., L. Dethlefsen, J.A. Huber1, D.M. Welch1, D.A. Relman, and M.L.

Sogin (2008) Exploring microbial diversity and taxonomy using SSU rRNA

hypervariable tag sequencing. PLoS genetics 4, 1-10.

Icoz I. and G. Stotzky (2008) Fate and effects of insect-resistant Bt crops in

soil ecosystems. Soil Biol. Biochem. 40, 559-586.

Jacobson M. R., Bringle K. E., Bennett L. T., Setteerquist R.A., Wilson M.S.,

83

Cash V.L., Beynon J., Newton W.E., and Dean D.R. (1989) Physical and

genetic map of the major nif gene cluster from Azotobacter vinelandii. J .

Bacteriol. 171, 1017-1027.

Joergensen R.G. and P.C. Brookes (1990) Ninhydrin-reactive nitrogen

measurements of microbial biomass in 0.5M K2SO4 extracts. Soil Biol.

Biochem. 22, 1023-1027.

Johansen C., Bjerrum L., and Pedersen K. (2007) Impact of salinomycin on the

intestinal microflora of broiler chickens, Act. Veterina. Scandi. 49-30.

Koske, R. and J. Gemma (1989) A modified procedure for staining roots to

detect VA mycorrhiazs. Mycol. Res. 92, 486-505.

Kourtev P, Nakatsu C., and Konopka A. (2009) Inhibition of nitrate reduction by

chromium(VI) in anaerobic soil microcosms. Appl. Environ. Microbiol. 75,

6249-6257.

Luiz F., W. Roesch, R.R. Fulthorpe, A. Riva, G. Casella, K.M.H. Adwin, A.D

Kent, S.H. Daroub, F.A. Camargo, W.G. Farmerie, and E.W. Triplett (2007)

Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity. Inter. Soc.

Microb. Ecol. 1, 283-290.

Lund V. and J. Goksoyr (1980) Effects of water fluctuations on microbial mass

and activity in soil. Microb. Ecol. 6, 115-123.

Lupwayi N., K. Hanson, K. Harker, G. Clayton, R. Blackshaw, J. O'Donovan, E.

Johnson, Y. Gan, R. Irvine, and M. Monreal (2007) Soil microbial biomass,

functional diversity and enzyme activity in glyphosate-resistant wheat-canola

rotations under low-disturbance direct seeding and conventional tillage. Soil

Biol. Biochem. 39, 1418-1427.

Marusina A. I., Bulygina E. S., Kuznetsov B. B., Turova. T. P., Kravchenko I.

K., and Gal’chenko V. F. (2001) A system of oligonucleotide primers for

amplification of nifH genes of different taxonomic groups of prokaryotes,

Mikrobiologiya 70, 86-91. Microbiology (Engl, Transl.) 70, 73-78.

Marcus D. and B. Hill (2008) The genome sequencer FLXTM system. Longer

reads, more applications, straight forward bioinformatics and more complete

data sets. J . Biotechnol. 136, 3-10.

McCaig A.E., Glover L.A. and Prosser J.I. (2001) Numerical analysis of

grassland bacterial community structure under different land management

regimens by using 16S ribosomal DNA sequence data and denaturing gradient

gel electrophoresis banding patterns. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4554-4559.

Muchaonyerwa, P., S. Waladde, P. Nyamugafata, S. Mpepereki, G. Ristori (2004)

84

Persistence and impact on microorganisms of Bacillus thuringiensis proteins in

some Zimbabwean soils. P lant Soil 266, 41-46.

Muyzer G. and K. Smalla (1998) Application of denaturing gradient gel

electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE)

in microbial ecology. Int. J . Gen. Mol. Microbiol. 73, 127-141.

Noah F., M. Hamady, C.L. Lauber, and R. Knightd (2008) In situ analysis of

native microbial communities in complex samples with high particulate loads

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 17994-17999.

Ohkuma M., Noda S., Usami R., Horikoshi K., and Kudo T. (1996) Diversity of

nitrogen fixation genes in the symbiotic intestinal microflora of the termite

Reticulitermes speratus, Appl. Environ. Microbiol. 62, 2747-2752.

Pearson, K (1926) On the coefficient of radical likeliness. Biometrika 18,

105-117.

Poly F., Monrozier L.J., and Bally R. (2001) Improvement in the RFLP procedure

for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in

soil. Res. Microbiol. 152, 95-103.

Qi Z., Dierckens K., Defoirdt T., Sorgeloos P., Boon N., Bao Z., and Bossier P.

(2009) FEMS Microbiol. Ecol. 292, 23-29.

Rui Y., G. Yi, J. Zhao, B. Wang, Z. Li, Z. Zhai, Z. He, Q. Li (2005) Changes of

Bt toxin in the rhizosphere of transgenic Bt cotton and its influence on soil

functional bacteria. World J . Microbiol. & Biotechnol. 21, 1279-1284.

Schloss P.D. and J. Handelsman (2005) Introducing DOTUR, a computer

program for defining operational taxonomic units and estimating species

richness. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1501-1506.

Saxena D. and G. Stotzky (2001) Bacillus thuringiensis (Bt) toxin released from

root exudates and biomass of Bt corn has no apparent effect on earthworms,

nematodes, protozoa, bacteria, and fungi in soil. Soil Biol. Biochem. 33,

1225-1230.

Schutter M. and R. Dick (2001) Shifts in substrate utilization potential and

structure of soil microbial communities in response to carbon substrates. Soil

Biol. Biochem. 33, 1481-1491.

Shen R.F., H. Cai, and W.H. Gong (2006) Transgenic Bt cotton has no apparent

effect on enzymatic activities or functional diversity of microbial communities

in rhizosphere soil. P lant Soil 285, 149-159.

Sigmonet P., Grosjean M.C., Misra A.K., Nazaret S., Cournoyer B., and Normand

P. (1991) Frankia genus-specific characterization by polymerase chain reaction,

85

Appl. Environ. Microbiol. 57, 3278-3286.

Sundaresan V. and Ausubei F.M. (1981) Nucleotides sequence of the gene

coding for the nitrogenase in iron protein from Klebseilla pneumonia, J . Biol,

Chem. 256, 2808-2812.

Torok I. and Kondorosi A. (1981) Nucleotide sequence of the R. meliloti

nitrogenase reductase (nifH) gene, Nucleic Acids Res. 9, 5711-5723.

Tzeneva V., Salles J., Naumova N., de Vos W., Kuikman P., Dolfing J., and

Smid H. (2009) Effect of soil sample preservation, compared to the effect of

other environmental variables on bacterial diversity. Res. Microbiol. 160,

89-98.

Ueda T., Suga Y., Yahiro N., and Matsuguchi T. (1995) Remarkable N2-fixing

bacterial diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis

of nifH genes equences, J . Bacteriol. 177, 1414-1417.

Van der Gucht K., K. Sabbe, L. De Meester, N. Vloemans, G. Zwart, M. Gillis,

and W. Vyverman (2001) Contrasting bacterioplankton community composition

and seasonal dynamics in twoneighbouring hypertrophic freshwater lakes.

Environ Microbiol 3, 680–90.

Wariishi, H., K. Vallis, and M.H. Go (1992) Manganese(I1) oxidation by

manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium

J . Biol. Chem. 267, 23689-23695.

Wartiainen I., T. Eriksson, W. Zheng, and U. Rasmussen (2008) Variation in the

active diazotrophic community in rice paddy-nifH PCR-DGGE analysis of

rhizosphere and bulk soil. App. Soil Ecol. 39, 65-75.

Yang C.H. and D.E. Crowley (2000) Rhizosphere microbial community structure

in relation to root location and plant iron nutritional status. Appl. Environ.

Microbiol. 66, 345-351.

Yang C.H., D.E. Crowley, and J.A. Menge (2001) 16SrDNA fingerprinting of

rhizosphere bacterial communities associated with healthy and Phytophthora

infected avocado roots. FEMS Microbiol. Ecol. 35, 129-136.

Young J.P.W., in: Stacy G., Burris R. H., and Evans H.J. (Eds.) (1992)

Biological nitrogen fixation, phylogenic classification of nitrogen-fixing

organisms, Chapman and Hall, New York, 43-86.

Yu-Kui Rui, Guo-Xiang Yi, Jing Zhao, Bao-Min Wang, Zhao-Hu Li, Zhi-Xi

Zhai, Zhong-Pei He (2005) Changes of Bt toxin in the rhizosphere of transgenic

Bt cotton and its influence on soil functional bacteria. World Journal of

Microbiology & Biotechnology. 21, 1279-1284.

Zehr J.P. and MacReynolds L.A. (1989) Use of degenerate oligonucleotides for

86

amplification of the nifH gene from the marine cyanobacterium Trichodes

miumthiebautii, Appl. Environ. Microbiol. 55, 2526-2552.

Ⅷ. 부 록

1. LM작물이 토양미생물군집에 미치는 영향평가를 위한 배양 및 활성측정

기법 정리

(1) 격리온실 설치, LM옥수수 재배 및 토양시료 채취

1) 토양시료 채취

LM옥수수 재배 시 대조군으로 nonLM옥수수를 구분하여 재배하며 미파종 대조

군을 별도로 둔다. 옥수수 생장이 활발하여 근권에 큰 영향을 미칠 수 있는 시기인

4∼5엽 시기부터 수꽃이 나오는 출수기 때까지 매주 근권토양을 채취하고 나머지

시기에는 2-3주 간격으로 근권토양을 채취한다. 각각 다른 구역에서 자라는 3개의

옥수수 개체로부터 표층 토양을 약 2∼3cm 걷어낸 후 뿌리 자체가 포함되지 않게

뿌리 근처 약 1∼3cm의 근권토양을 총 약 500g 정도 채취하고 잘 혼합하여 1개의

혼합시료를 만들어 1개의 반복시료로 하며 총 3반복의 혼합시료를 준비한다. 대조

구 시료는 옥수수 미파종 토양의 표면을 2∼3cm 걷어낸 후 채취하고 근권토양과

동일하게 준비한다. 토양은 2 mm 체로 거른 후 일부는 drying oven(105)에서 12

시간 건조시켜 건조중량을 측정하여 토양의 수분함량을 조사하며 나머지 토양에서

미생물 군집을 분석한다.

2) 토양미생물 군집변화 분석을 위한 배양방법 조사

가. 일반세균 군집밀도 분석

토양세균 밀도는 소위 일반세균이라 하는 호기성 종속영양세균의 개체수를 측정

한다 (종속영양 평판계수, heterotrophic plate count). King's B medium 3g을 증류

수 980ml (최종은 1000ml)에 넣는다. pH 7.0으로 맞춘 후, 여기에 agar 15g을 넣고

고압멸균 한다. 멸균이 끝난 후, 배지의 온도가 50 정도 되면 Cycloheximide

(200mg/ml EtOH) 10ml을 넣고 잘 섞은 후 petri dish에 분주한다. 채취한 옥수수

근권토양을 잘 섞어서 1g을 취한 후, 멸균된 0.85% 생리식염수로 토양 희석액 10ml

을 조제한 다음, 그 중 1ml을 취하여 차례로 10-1~10-7까지 희석하고 이를 King's B

medium에 100씩 3반복으로 도말한다. 희석액이 도말된 배지를 incubator에서 2

87

8, 48시간 배양 후, 배지에 나타난 집락을 계수한다. 집락수에 토양 희석배율을

환산하여 토양 1g당 일반세균 개체수를 구한다.

나. 진균군집 밀도 분석

진균군집 밀도는 배양계수 대신 균사체 길이를 측정한다. 채취한 옥수수 근권토

양을 잘 섞어서 1g을 취한 후, 멸균된 0.85% 생리식염수로 토양 희석액 10ml을 조

제한 다음, 그 중 1ml을 취하여 차례로 9ml의 멸균 생리식염수에 연속희석 한다.

적절한 희석배율로 희석된 토양 현탁액 1ml에 acridine orange(0.01%) 1ml을 첨가

하여 30초 내지 1분간 염색하고 black polycarbonate membrane filer(0.2 pore

size)에 여과한다. 여과된 membrane을 형광현미경(200) 하에서 stage micrometer

와 ocular micrometer를 이용하여 하나의 현미경 시야 내 균사의 길이를 측정한다.

만일 현미경에 화상분석 프로그램과 길이 측정 기능이 있는 경우에는 그 프로그램

을 이용한다. 현미경 시야 1개 넓이와 여과막의 전체 여과부위 넓이를 측정하여 1

개 현미경 시야 내 균사체 길이로부터 여과막 전체 내의 균사체 길이를 계산한 후

토양 희석배수로 환산하여 토양 1g당 총 균사체의 길이를 계산하여 진균의 밀도를

측정한다.

다. 방선균 군집 밀도 분석

증류수 990ml (최종은 1000ml)을 준비하고 여기에 sodium caseinate 0.2g,

KH2PO4 0.5g, MgSO4․7H2O 0.2g, FeCl3․6H2O 0.5g을 가하여 용해시킨 후 pH를

6.5～6.7으로 조정하고 pH 조절 후 agar 15g을 넣고 고압멸균 한다. 채취한 옥수수

근권토양을 잘 섞어서 10g을 취한 후, 멸균된 0.85% 생리식염수로 토양 희석액

100ml로 조제한 다음, 그 중 1ml을 취하여 차례로 10-1~10-7까지 희석하고 45

water bath에서 16시간 열을 가한 후 이를 준비한 sodium caseinate agar 배지에

100씩 3반복으로 도말한다. 희석액이 도말된 배지를 28에서 6일간 배양한 후,

배지에 나타난 집락을 계수한다. 집락수에 토양 희석배율을 환산하여 토양 1g당 방

선균 개체수를 구한다.

라. 섬유소분해세균과 단백질분해세균의 개체수 조사

근권토양에 존재하는 종속영양세균이 잘 이용할 수 있는 중요한 미생물 생장기

질인 cellulose와 protein을 분해할 수 있는 미생물의 밀도 조사를 위해 각 성분을

영양소로 포함시킨 선택배지 위에 적당하게 희석된 토양 현탁액을 도말하여 일정

시간 배양 후 자라나는 미생물의 집락을 계수한다. 집락수에 토양 희석배율을 환산

88

하여 토양 1g당 각 세균의 개체수를 구한다.

섬유소분해세균은 선택배지 (CMC 5g, TSB 3g, 한천 18g, 증류수 1 리터)에 적

절한 희석배율로 희석된 토양 현탁액을 도말 배양한 후 0.1% Congo red 용액을 뿌

려 30분간 둔 후 1M NaCl 용액으로 세척한다. 섬유소 분해세균은 집락 주위의 붉

은 색이 탈색되어 둥근 원이 생기며 이를 계수한다. 단백질 분해세균은 선택배지

(skim milk 10g, TSB 3g, 한천 18g, 증류수 1 리터)에 적절히 희석된 토양 현탁액

을 도말 배양한다. 배지 전체가 반투명한 우유빛인데 단백질 분해세균이 자라나면

집락 주위가 투명해지며 이를 계수한다.

마. 세균군집의 기능적 다양성 조사

Biolog plate를 이용하여 탄수화물, 아미노산, 중합체 등의 탄소기질 이용능에 따

른 토양미생물군집의 functional diversity를 조사한다. 토양 10g을 0.145M NaCl 용

액 95ml에 현탁하고 10-3까지 연속 희석한 후 125를 Biolog EcoplateTM (Biolog

Inc., USA)의 각 well에 접종한다. 접종된 Ecoplate를 25에서 배양하면서 매 24시

간마다 96시간까지 595nm에서의 흡광도를 plate reader로 측정한다. 3가지 종류의

Ecoplate 기질 (탄수화물, 아미노산과 중합체)에 대해 평균 well-color 측정을 위해

72시간 흡광도를 이용한다. Average well color development (AWCD)를 다음 식으

로 계산한다.

AWCD =∑(C-R)/n

C: 각 well의 OD560nm

R: Control well의 OD590nm

n: 기질의 수(31)

사. 통계분석

모든 실험 결과는 SPSS ver. 18 프로그램을 이용하여 Analysis of Variance

(ANOVA)와 principal components analysis (PCA)를 시행하였다. ANOVA는 신뢰

수준 95%로 유의성을 평가하고 Scheffe test를 이용하여 사후 분석한다.

2. 기존 배양법을 보완하기 위한 신규 분자생물학적 방법

1) Soil DNA extraction

89

본 실험에 사용된 토양시료는 2mm 체로 식물의 조직과 자갈 등을 걸러낸 뒤,

FastDNA® SPIN®Kit (MP Biomedicals, Irvine, CA)를 이용하여 soil DNA를 추출

하였다.

① Lysing Matrix E Tube에 sample soil 500을 담는다.

② Soil sample을 넣은 tube에 978의 Sodium Phosphate Buffer와 122의

MT Buffer를 첨가한다.

③ 미리 차게 해둔 bead-beater를 5000rpm으로 맞추고 90초간 작동시킨다.

④ Bead beating이 끝나면 soli sample이 들어 있는 Lysing Matrix E Tube을

얼음에 넣어 식힌 후 다시 ③의 과정을 1회 더 반복한다.

⑤ 위 과정이 끝나면 4, 14000rpm, 5분 간 원심분리 한다.

⑥ 원심분리가 끝난 뒤 supernatant를 1.5 시험관에 옮기고 여기에 250 PPS

reagent를 넣는다. 그리고 이들이 잘 섞일 수 있도록 1분 간 inverting한다.

⑦ 이것을 다시 4, 14000rpm, 6분 간 centrifuge후 pellet이 딸려오지 않게

supernatant만 2 test tube에 옮긴다.

⑧ Binding Matrix Suspension을 충분히 섞어준 후 supernatant가 들어있는 2

test tube에 1 넣고 3분 동안 흔들어 준 다음 room temp.에서 5～10분 동안

놓아두어 DNA가 binding된 silica matrix가 가라앉도록 한다.

⑨ Binding matrix가 섞여오지 않게 위쪽의 supernatant 700를 pipet을 이용해

조심스럽게 제거한 뒤, 남은 supernatant와 silica matrix를 다시 섞어준다. 이

중에서 700를 catch tube에 끼워둔 SPIN™ Filter에 넣고 4, 14000rpm, 1분

간 원심분리한다. Catch tube에 모인 flow-through를 버리고 남은 supernatant

에 suspension한 silica matrix를 이용하여 같은 과정을 계속 반복해준다.

⑩ 미리 잘 흔들어 섞어 둔 SEWS-M을 500 SPIN™ Filter에 넣고 실온, 14000

rpm, 1분 간 원심분리 한다. Flow-through를 버리고 SEWS-M Wash solution

을 filter에서 완전히 제거하기 위해서 실온, 14000rpm, 2분 간 원심분리 한다.

⑪ SPIN™ Filter를 새로운 catch tube에 옮긴 뒤 tube 뚜껑을 열어 둔 상태에서

5분 간 공기 중에서 건조시킨다. 여기에 50 DES (DNase/ pyrogen free

water) 를 넣고 tube를 가볍게 tapping 또는 낮은 속도로 vortex하여 DES가

matrix 속으로 충분히 스며들어 섞일 수 있도록 해준다.

⑫ Room temp., 14000rpm, 1분간 centrifuge후 DES에 녹은 DNA가 Catch

Tube에 모이게 한다. (-20 stored)

2) 16S rRNA의 real-time PCR-DGGE 분석

90

a) 변곡점 결정 PCR

∙PCR conditions

10X PCR buffer (1.5 mM MgCl2,, Takara) 5.0

dNTP (2.5mM each) 5.0

F352TA (20pmole/) 1.25

515r (20pmole/) 1.25

Bovine serum albumin (10mg/) 5.0

25X SYBR Green I 1.0

Template (20～50ng/) 1.0

rTaq DNA polymerase (5U/, Takara) 0.5

Tot. vol 50.0

F352TA-GCa : 5'-ACTCCTACGGGAGGC-3'

(aGC-clamp : CCGGGCGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGCGGGGCACGG

GCGC)

515r : 5'-ACCGCGGCTGCTGGCAC-3'

∙Real-time PCR system

step 1. 94 °C 5 min

step 2. 94 °C 1 min

step 3. 51 °C 1 min

step 4. 72 °C 1 min

go to step2 40 more times

step 6. 72 °C 30 min

b) 16S rRNA PCR

위에서 결정된 변곡점까지 동일한 PCR components를 Real-time PCR

system을 이용하여 16S rDNA를 증폭시킨다.

c) PCR 산물 혼합 및 농축

변곡점까지 반응한 PCR산물은 매우 낮은 농도로 존재하므로 PCR산물 50

를 모두 취하여 MinElute PCR purification kit(Quiagen)를 이용해 정제․농축

한다. (약 12) 1.5% agarose gel에 농축된 PCR products 1ul씩 loading하여

gel상에서 밴드밝기를 Bionumerics software version 4.00 (Applied Maths,

91

Kortrijk, Belgium)을 이용하여 측정하여 동일하게 조절하여 DGGE gel에

loading하여 분석한다.

d) DGGE 분석

① 시약 및 재료

∙ 40% Acrylamide/Bis(37.5:1)

∙ 10% Ammonium persulfate

∙ 10% TEMED solution

∙ DCode Dye Solution (10)

Bromophenol blue 0.05 g

Xylene cyanol 0.05 g

1x TAE buffer 10

∙ 2x Gel Loading Dye (10)

2% Bromophenol blue 0.05 g

2% Xylene cyanol 0.05 g

100% Glycerol 7

3° DW 2.5

∙ 50X TAE buffer

50X TAE buffer (1ℓ)

Tris-base 242.0g

Acetic acid, glacial 17.1

0.5M EDTA(pH 8.0) 100.0

0.5M EDTA (1ℓ, pH 0.8)

EDTA 186.1gNaOH 20g

∙ Denaturing stock solution

% denaturing Low(43%) High (63%)

40% Acrylamide/Bis 17.5 17.5

50x TAE buffer 1 1

Formamide 8.6 12.6

Urea 9.03g 13.23g

3° DW to 50 to 50

시약은 모두 molecular biology 급 시약을 사용할 것.

92

5분간 degas, 0.40 filtering, 호일로 싸서 4 한달간 보관.

∙Model 475 gradient delivery system (BIO-RAD)

② Denaturing gel 제작

14% Acryamide gel의 low와 high denatuing stock solution을 16mL씩 취한

뒤, High denaturing solution에는 Dcode dye 320를 넣고 혼합하여 준비해둔

다. Denaturing solution 16mL에 10% Ammonium persulfate solution 144와

10% TEMED solution 144를 넣고 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 섞는다.

Model 475 gradient delivery system을 이용하여 gel sandwitch에 denaturing

solution을 주입한 뒤, 2시간 동안 굳힌다.

③ 전기영동

16S rRNA sample 10와 2x Gel Loading Dye 10 loading한다. 1X TAE

buffer, 60, 20V에서 20분간 prerunning 후 60V로 전환하여 28시간동안 전기

영동을 한다.

④ Gel staining

전기영동이 끝나면 gel을 분리 후 3차 증류수 150과 15 SYBR green I

(10,000X conc. in DMSO, Cambrex) 을 혼합하여 준비한 뒤 20분 정도 담가두

어 staining 한 후 3차 증류수에서 20분간 destaining한다. DNA image analyzer

를 이용하여 DNA band pattern을 분석한다.

3) 질소고정유전자 (nifH ) 의 DGGE 분석

a) nifH gene nested PCR

① 1st PCR (FGPH19/PolR)

93

∙PCR conditions (429bp)

10X PCR buffer (1.5 mM MgCl2, Enzynomics) 3.0

dNTP (2.0mM each) 3.0

FGPH19 (20pmole/) 0.75

PolR (20pmole/) 0.75

Template (20～50ng/) 1.0

nTaq DNA polymerase (5U/, Enzynomics) 0.5

Tot. Vol 30.0

FGPH19 : 5'-TACGGCAARGGTGGNATHG-3'

PolR : 5'-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3'

∙ PCR system

step 1. 95 °C 5 min

step 2. 94 °C 1 min

step 3. 55 °C 1 min

step 4. 72 °C 2 min

go to step2 34 more times

step 6. 72 °C 10 min

② 2nd PCR (PolF/AQER)

∙PCR conditions (320bp)

10X PCR buffer (1.5 mM MgCl2, Enzynomics) 3.0

dNTP (2.0mM each) 3.0

PolF (20pmole/) 0.75

AQER (20pmole/) 0.75

Template (1st PCR products) 1.0

nTaq DNA polymerase (5U/, Enzynomics) 0.5

Tot.Vol 50.0

PolF-GCa : 5'-TGCGAYCCSAATGCBGACTC-3'

(aGC-clamp : CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGC

CCC)

AQER : 5'-GACGATGTAGATYTCCTG-3'

∙PCR system

step 1. 95 °C 5 min

94

step 2. 94 °C 1 min

step 3. 55 °C 1 min

step 4. 72 °C 1 min

go to step2 34 more times

step 6. 72 °C 10 min

PCR산물은 1.5% agarose gel에 1ul씩 loading하여 gel상에서 밴드밝기를

Bionumerics software version 4.00 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium)을 이용

하여 측정한 후 동일하게 조절하여 DGGE gel에 loading하여 분석한다.

b) DGGE 분석

① 시약 및 재료

∙ 40% Acrylamide/Bis(37.5:1)

∙ 10% Ammonium persulfate

∙ 10% TEMED solution

∙ DCode Dye Solution

∙ 2x Gel Loading Dye

∙ 50X TAE buffer

∙ Denaturing stock solution

% denaturing Low(40%) High (70%)

40% Acrylamide/Bis 10 10

50x TAE buffer 1 1

Formamide 8 12

Urea 8.4g 14.7g

3° DW to 50 to 50

시약은 모두 molecular biology 급 시약을 사용할 것.

5분간 degas, 0.40 filtering, 호일로 싸서 4 한달간 보관.

∙Model 475 gradient delivery system (BIO-RAD)

② Denaturing gel 제작

8% Acryamide gel의 low와 high denatuing stock solution을 16mL씩 취한 뒤,

95

High denaturing solution에는 Dcode dye 320를 넣고 혼합하여 준비해둔다.

Denaturing solution 16mL에 10% Ammonium persulfate solution 144와 10%

TEMED solution 144를 넣고 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 섞어준다.

Model 475 gradient delivery system을 이용하여 gel sandwitch에 denaturing

solution을 주입한 뒤, 2시간 동안 굳힌다.

③ 전기영동

16S rRNA sample 10와 2x Gel Loading Dye 10 loading한다. 1X TAE

buffer, 60, 20V에서 20분간 prerunning 후 60V로 전환하여 16시간 동안 전기

영동을 한다.

④ Gel staining

전기영동이 끝나면 gel을 분리 후 3차 증류수 150과 15 SYBR green I

(10,000X conc. in DMSO, Cambrex) 을 혼합하여 준비한 뒤 20분 정도 담가

두어 staining 한 후 3차 증류수에서 20분간 destaining한다. DNA image

analyzer를 이용하여 DNA band pattern을 분석한다.

3. 토양미생물 생태계에 미치는 장기적 영향평가

1) 토양에서의 도입유전자의 잔류 수준 분석 방법

가. LM옥수수 도입유전자 (cry1F ) 의 잔류수준 분석

LM식물의 도입유전자 cry1F의 정량적 분석을 위하여 LM옥수수로부터 cry1F

유전자를 분리하여 vector에 삽입 후 클로닝을 통하여 형질전환 E. coli DH10B를

제작한다. 형질 전환된 대장균을 LM옥수수 토양 5g에 101-107 cfu/g soil으로 접

종한 각 표준시료로부터 soil DNA를 추출한 뒤 real-time PCR을 이용하여

standard curve를 작성하고 토양에서의 cry1F 의 background를 분석한다.

a) cloning of cry1F gene

GMO 옥수수 잎에서 DNA를 추출(Qiagen) 후 cry1F specific primer를 이용

하여 PCR 증폭하였다.

96

① cry1F gene 분리

∙cry1F gene PCR conditions (272pb)

10X buffer (Enzynomics) 5

Cry1F primer (20pmol/) 5

Cry1R primer (20pmol/) 5

dNTP (each 2.5mM) 5

Template DNA 1

nTag pol. (5u/, Enzynomics) 0.5

D.W 28.5

Tot. vol 50

Cry1F: 5'-CATTCGCGTACACCATTGTC-3'

Cry1R: 5'-CACTTCGTTGCCTGAACTGA-3'

∙ PCR programs

94 5min

94 1min

55 1min

72 1min 30sec

29 times go to 2step (30cycles)

72 10min

4 hold

② Gel loading (Easycast electrophoresis system)

0.7% agarose gel 100ml, 12 wells, 100V, 1hr

Marker : 100bp ladder(2)

Sample : 약 40 (가능한 많이)

③ Gel excision

Image analyser 위에 gel을 올리고 UV를 켜고 band(272bp)를 확인한다. (UV

가 과다 노출될시 pyrimidine dimer의 형성 및 ligation에 영향을 줄 수 있으므로

주의한다.) 멸균한 cutter를 이용하여 band (약 272bp)를 분리한다. 이때 gel의

무게가 200mg을 넘지 않도록 한다.

97

④ Gel extraction

QIAquick Gel Extraction kit를 이용한다.

ⅰ) Gel 무게의 약 3배의 Buffer QC를 E-tube에 넣는다.

ⅱ) 50, 10min, 2-3분 간격으로 vortex하여 gel을 완전히 용해시킨다.

ⅲ) Gel mixture를 QIAquick column에 넣고 13000rpm, room temp, 1분간

centrifuge한다. (※ column에 들어갈 수 있는 최대용량은 800)

ⅳ) Filtrate 제거 후 0.5ml Buffer QC를 column에 가하고 13000rpm, 1min(실

온).

ⅴ) Column을 빼서 filtrate를 버리고 column을 다시 끼운다.

ⅵ) 0.5 Buffer QC를 column에 가하고 13000rpm, room temp, 1분간

centrifuge한다.

ⅶ) 0.75 Buffer PE를 column에 가하고 2분 후 13000rpm, room temp, 1분간

centrifuge한다.

ⅷ) Filtrate를 제거 후 13000rpm, room temp, 1분간 centrifuge한다.

ⅸ) Column을 새로운 E-tube에 옮긴 뒤, 30 Buffer EB (TE buffer 대체 사용

가능)를 column membrane 중앙에 가하여 1min 후 15000rpm, room temp, 1

분간 centrifuge한다. (4 stored)

⑤ Ligation

PCR증폭 된 cry1F 유전자를 pGEM-T Easy vector(Promega)에 삽입한다.

12X Rapid ligation Buffer(vortexing) 5.0

3°D.W. 1.5

PCR product 2.5

pGEM-T Easy vector(50ug/ 0.5

T4 ligase 0.5

Tot. vol 10.0

Test tube를 호일에 싸서 4에서 4시간 이상 보관한다.

⑥ Transformation

E.coli (DH10B)를 이용하여 다음과 같은 방법으로 형질전환한다.

98

ⅰ) 시약 및 재료

∙ SOB(1ℓ, pH 7.0)

Bacto-tryptone 20 g

Bacto-yeast extract 5 g

NaCl 0.5 g

3° DW 950

250mM KCl(1.86g/100 DW) 10

5N NaOH 약 200

∙ 2M MgCl2

∙ 1M glucose

∙ Competent cell. (DH10B)

∙ cry1F 유전자와 pGEM-T Easy vector의 ligation

∙ Cuvette.

∙ Electroporation.

ⅱ) Com cell, cuvette, vector는 얼음에 넣어두고, E-tube에 SOB 1, 2M

MgCl2 5와 1M glucose 20을 넣고 vortex한 후 spin down시킨다.(SOC 제

작)

ⅲ) Vector 2.5를 competent cell tube에 가하고 pipetting하여 섞은 뒤, 32.5

전부를 cuvette에 넣어 주고 바닥을 톡톡 쳐서 cuvette바닥에 가라앉게 한다.

ⅳ) Cuvette의 물기를 닦아낸 후 electroporation (200Ω, 1.7V, 4-4.5msec)한다.

ⅴ) Electroporation이 끝나면 재빨리 clean bench로 가져와서 SOC를 cuvette에

넣고 pipetting 후 모두 회수하여 SOC tube에 넣는다.

ⅵ) SOC tube를 37배양기에 1시간 동안 보관한다.

ⅶ) SOC가 배양될 동안 LB+ampicillin (100/) agar (pH 7.5)를 clean bench

에서 30분 간 건조 후 X-gal (50mg/ml) 20를 spreading하여 다시 30분간

건조한다.

ⅷ) SOC tube에서 100를 취해 위의 agar에 spreading후, 37에서 하루 동안

배양한다.

ⅸ) 형질전환 된 white colony는 loop나 멸균된 이쑤시개를 이용하여 200,

LB+ampicillin (100/) 배지에 접종한다. 37 shaking incubator에서 하루

동안 배양한다.

ⅹ) 위에서 배양된 균은 새로운 200, LB+ampicillin (100/) 배지에 1을

접종한 뒤 37 shaking incubator에서 배양한다.

99

xi) 분광광도계를 이용하여 2시간이후부터 20분 간격으로 OD600 값을 측정한다.

(Blank : LB+ampicillin (100/) medium)

xii) OD600값이 0.5～0.6이 되면, 50mL tube에 옮겨 4, 4,500rpm에 15분 간

centrifuge한다.

xiii) Supernatant를 제거하고 0.85% saline을 넣고 4, 4,500rpm에 15분 간

centrifuge를 2회 더 반복한 뒤 pellet을 잘 풀어 최종 부피가 10이 되도록

한다. (4stored)

b) cry1F gene의 quantitative PCR

도입유전자(cry1F)의 정량적 분석을 위해 real-time PCR (Roche LightCycler

480)을 이용한다.

∙ PCR conditions

Water, PCR-grade 3.0

Cry1F primer(20pmole/) 1.0

Cry1R primer(20pmole/) 1.0

LightCycler480 SYBR Green 1 Master 2Ｘ 10.0

Template DNA(20-50ng/) 5.0

Tot. vol 20.0

Cry1F: 5'-CATTCGCGTACACCATTGTC-3'

Cry1R: 5'-CACTTCGTTGCCTGAACTGA-3'

∙ PCR Programs

Program name Cycles Analysis Mode

Pre-incubation 1 None

Amplification 45 Quantification

Melting curve 1 Melting curves

Cooling 1 None

100

∙Temperature targets

Target

()

Acquisition

mode

Hold

(hh:mm:ss)

Ramp rate

(/s)

Acquisition

(per )Pre-incubation

95 None 00: 05: 00 4.4 -

Amplification

95 None 00: 00: 10 4.4 -

60 None 00: 00: 20 2.2 -

72 Single 00: 00: 30 4.4 -

Melting curve

95 None 00: 00: 05 4.4 -

65 None 00: 01: 00 2.2 -

97 Continuous - - 10

Cooling

40 None 00: 00: 10 1.5 -

c) Standard curve 작성

토양 내 잔류하는 대상유전자 cry1F의 background 농도를 기준으로

107copies/g soil까지 접종한 토양시료에서 soil DNA를 추출한다. 이를 표준시료

로 이용하여 real-time PCR 방법에 의해 도입유전자 농도와 Ct값의 상관관계를

형성하는 standard curve를 작성하고 검량식을 구한다. 시험대상 토양에서 soil

DNA를 추출한 후 real-time PCR에 의해 cry1F 유전자의 Ct값을 산출한 다음

standard curve에 비교하여 토양에서의 cry1F 유전자의 잔류수준을 산출한다.

나. 카나마이신 저항성 유전자의 잔류 수준 분석 방법

카나마이신 저항성 유전자(Kmr)를 도입한 형질 전환된 E. coli DH10B를 8

0에서 10분간 열처리 한 후 LM옥수수 토양에 101-107cfu/g soil으로 각각 접

종하여 표준토양시료를 만들고 각 토양시료에서 soil DNA를 추출한다. 추출된

soil DNA 시료를 대상으로 하여 real-time PCR을 수행함으로써 카나마이신 저

항성 유전자 (Kmr) 증폭에 따른 Ct값을 조사한다. 접종된 형질 전환된 E. coil

농도의 로그값과 Ct값 사이에 직선식의 상관관계를 갖는 최소 농도를 조사하는

데, 이때의 최소농도는 LM옥수수 토양에 잔류하는 카나마이신 저항성 유전자의

background 수준을 나타낸다.

101

a) cloning of kanamycin resistant gene

① 카나마이신 저항성 유전자 형질전환

ⅰ) 시약 및 재료

∙ SOB(1ℓ, pH 7.0)

Bacto-tryptone 20 g

Bacto-yeast extract 5 g

NaCl 0.5 g

3° DW 950

250mM KCl(1.86g/100 DW) 10 5N NaOH 약 200

∙ 2M MgCl2

∙ 1M glucose

∙ Competent cell.(DH10B)

∙ pF1K T7 vector (Kmr coding 1,001-1,795pb)

pF1K T7 벡터

∙ Cuvette.

∙ Electroporation.

ⅱ) Com cell, cuvette, vector는 얼음에 넣고, E-tube에 SOB 1, 2M MgCl2 5

와 1M glucose 20을 넣고 vortex한 후 spin down시킨다.(SOC 제작)

ⅲ) pF1K T7 vector 2.5를 competent cell tube에 가하고 pipetting하여 섞은

뒤, 32.5 전부를 cuvette에 넣어 주고 바닥을 톡톡 쳐서 cuvette바닥에 가라

앉게 한다.

ⅳ) Cuvette의 물기를 닦아낸 후 electroporation (200Ω, 1.7V, 4-4.5msec)한다.

ⅴ) Electroporation이 끝나면 재빨리 clean bench로 가져와서 SOC를 cuvette에

102

넣고 pipetting 후 모두 회수하여 SOC tube에 넣는다.

ⅵ) SOC tube를 37배양기에 1시간 동안 보관한다.

ⅶ) SOC가 배양될 동안 LB+kanamycin(25/) plate를 clean bench에서 30분

간 건조 후 X-gal (50mg/ml) 20를 spreading하여 다시 30분간 건조한다.

ⅷ) SOC tube에서 100를 취해 위의 agar에 spreading후, 37에서 하루 동안

배양한다.

ⅸ) 형질전환된 백색 집락은 loop나 멸균된 이쑤시개를 이용하여 200,

LB+kanamycin (25/) 배지에 접종하여 37 진탕배양기에서 하루 동안 배

양한다.

ⅹ) 위에서 배양된 균은 새로운 200, LB+kanamycin (25/) 배지에 1을

접종하여 37 shaking incubator에서 배양한다.

xi) 분광광도계를 이용하여 2시간이후부터 20분 간격으로 측정한 OD600 값을 측

정한다. (Blank : LB+kanamycin (25/) medium)

xii) OD600값이 0.8～0.9이 되면, 멸균한 50mL tube에 옮겨 4, 4,500rpm에 15분

동안 원심분리한다.

xiii) Supernatant를 제거하고 0.85% saline을 넣고 4, 4,500rpm에 15분 간

centrifuge를 2회 더 반복한 뒤 pellet을 잘 풀어 최종 부피가 50이 되도록

한다. (4stored)

② 토양 처리

위에서 준비된 형질전환 E. coli DH10B (50) 배양액에서 1을 취하여

0.85% saline 9에 넣고 10-1-10-7 까지 연속 희석한다. 대장균의 개체수를 측

정하기 위해 10-5-10-7로 희석된 시료를 LB+kanmycin (25/) agar에 도말한

후 37에서 하루 동안 배양한다. 연속 희석 후 남은 형질전환 대장균은 80

water bath로 옮겨 10분간 처리 후 상온에서 식혀 4에 보관한다. 이후 배양

된 균의 개체수를 확인하고, 4에 보관하였던 열처리된 형질전환 대장균을 토

양에 접종한다. 접종 후 spatula를 이용해 30분간 충분히 토양을 혼합하고 호일

로 덮어 상온에 보관한다. 토양시료는 적절한 토양수분을 유지하게 하고 3일

간격으로 spatula를 이용하여 충분히 혼합한 뒤 균질한 상태로 유지한다.

b) kanamycin resistant gene의 quantitative PCR

실험군 및 대조군 토양시료에서 soil DNA를 추출하여 real-time PCR (Roche

LightCycler 480)을 이용하여 카나마이신 저항성 유전자 (Kmr)의 정량적 분석을

103

하였다.

∙ PCR conditions (171pb)

Water, PCR-grade 4.5

kanF primer(20pmole/) 0.25

kanR primer(20pmole/) 0.25

LightCycler480 SYBR Green 1 Master 2Ｘ 10.0

Template DNA(20-50ng/) 5.0

Tot. vol 20.0

kanF: 5'-TGAATGAACTGCAGGACGAG-3'

kanR: 5'-ATACTTTCTCGGCAGGAGCA-3'

∙ PCR Programs

Program name Cycles Analysis Mode

Pre-incubation 1 None

Amplification 45 Quantification

Melting curve 1 Melting curves

Cooling 1 None

∙Temperature targets

Target

()

Acquisition

mode

Hold

(hh:mm:ss)

Ramp rate

(/s)

Acquisition

(per )Pre-incubation

95 None 00: 05: 00 4.4 -

Amplification

95 None 00: 00: 10 4.4 -

57 None 00: 00: 20 2.2 -

72 Single 00: 00: 30 4.4 -

Melting curve

95 None 00: 00: 05 4.4 -

65 None 00: 01: 00 2.2 -

97 Continuous - - 10

Cooling

40 None 00: 00: 10 1.5 -

104

c) standard curve 작성

토양 내 잔류하는 대상유전자 kanamycin resistant gene의 background 농도를

기준으로 107copies/g soil까지 접종한 토양시료에서 soil DNA를 추출한다. 이를

표준시료로 이용하여 real-time PCR 방법에 의해 도입유전자 농도와 Ct값의 상

관관계를 형성하는 standard curve를 작성하고 검량식을 구한다. 시험대상 토양

에서 soil DNA를 추출한 후 real-time PCR에 의해 kanamycin resistant 유전자

의 Ct값을 산출한 다음 standard curve에 비교하여 토양에서의 kanamycin

resistant 유전자의 잔류수준을 산출한다.

d) barcoded pyro-sequencing 방법에 의한 카나마이신 저항성 유전자의

전이성 분석

각 microcosm 토양시료의 genomic DNA는 Wizard® Genomic DNA

Purification Kit(Promega)를 사용하여 추출하였다.

실험재료

i) 1.5ml microcentrifuge tubes

ii) water bath, 37°C, 80°C

iii) isopropanol, room temperature

iii) 70% ethanol, room temperature

iv) 50mM EDTA (pH 8.0)

v) 10mg/ml lysozyme

실험방법

i) 대조구 및 카나마이신 저항성 유전자가 방출된 토양에서 자란 전체 콜로니 균

체를 각각 회수한다.

ii) 회수된 균체를 480ul 50mM EDTA에 현탁시킨다.

iii) 현탁시킨 균체에 120ul lysozyme을 넣고 37°C water bath에서 60분간 둔다.

iv) 13,000 × g에서 2분간 원심분리하고 상등액을 제거한다.

v) 600ul의 Nuclei Lysis Solution을 넣고 pipet으로 부드럽게 섞어준다.

vi) 80°C water bath에서 5분간 배양 후 실온에서 식힌다.

vii) 3ul RNase Solution을 첨가하여 섞은 후 37°C water bath에서 60분간 배양

후 실온에서 식힌다.

viii) 200ul Protein Precipitation Solution을 넣고 vortexing 한다.

105

ⅸ) 5분간 얼음에 둔다.

ⅹ) 13,000 × g에서 3분간 원심분리한다.

ⅺ) 상등액을 새 tube에 옮기고 600ul isopropanol을 넣고 섞는다.

ⅻ) 13,000 × g에서 2분간 원심분리한다.

xiii) 600ul 70% ethanol을 넣고 섞은 후 13,000 × g에서 2분간 원심분리한다.

xiv) 상등액을 버리고 15분간 air-dry한다.

xv) 100ul Rehydration Solution을 첨가하고 4°C에서 overnight 한다.

* barcoded pyro-sequencing을 위한 nested PCR

nested PCR에는 FastStart High Fidelity PCR System, dNTPack (Roche)이 사

용 되었다.

1st PCR (Total vol. 50 µl)

FastStart High Fidelity

Reaction buffer, 10× 5ul (1.8 mM MgCl2포함)

DMSO 5 µl

PCR Grade Nucleotide Mix 1 µl

Downstream primer 5 µl (최종 0.4 µM)

Upstream primer 5 µl (최종 0.4 µM)

Template DNA 1 µl (20 ng)

FastStart High Fidelity Enzyme

Blend(5U/µl) 0.5µl (2.5U/reaction)

Water, PCR-Grade up to 50µl

km450F :

5'-AGG CAG CGC GGC TAT CGT G-3‘

km450R :

5'-CCA GCC GGC CAC AGT CGA TG-3'

Thermal cycling

step 1. 95 °C 2 min

step 2. 95 °C 30 min

step 3. 60 °C 30 min

106

step 4. 72 °C 30 min

go to step2 31 more times

step 6. 72 °C 7 min

2nd PCR (Total vol. 50 µl)

FastStart High Fidelity

Reaction buffer, 10× 5ul (1.8 mM MgCl2포함)

DMSO 5 µl

PCR Grade Nucleotide Mix 1 µl

Downstream primer 5 µl (최종 0.4 µM)

Upstream primer 5 µl (최종 0.4 µM)

Template DNA 1 µl (20 ng)

FastStart High Fidelity Enzyme

Blend(5U/µl) 0.5µl (2.5U/reaction)

Water, PCR-Grade up to 50µl

107

List of barcoded primers

Primer1 :

5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-AGGCAGCGCGGCTATCGTG-3‘

Primer2-1 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCGTCAT-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-2 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGAGCTG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-3 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCAGATG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-4 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-CGATGAG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-5 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TCTGCAG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-6 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-AGCGATG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-7 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-ATGCTGAG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

Primer2-8 :

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-TACAGCAG-AG-CCAGCCGGCCACAGTCGATG-3‘

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Thermal cycling

step 1. 95 °C 2 min

step 2. 95 °C 30 min

step 3. 60 °C 30 min

step 4. 72 °C 30 min

go to step2 31 more times

step 6. 72 °C 7 min

PCR 산물 정제 및 농축

PCR산물 50를 모두 취하여 QIAquick PCR purification kit(Quiagen)를 이용

해 정제․농축한다 (total vol 30).

실험방법

i) 250ul의 PB buffer를 50ul PCR sample에 넣고 섞는다.

ii) QIAquick spin column에 300ul의 혼탁액을 넣고 13,000 × g에서 1분간 원심분

리한다.

iii) 원심분리 후 column을 통과한 sample을 제거한다.

iv) 750ul의 PE buffer를 넣고 13,000 × g에서 1분간 원심분리한다.

v) 원심분리 후 column을 통과한 sample을 제거 후 다시 13,000 × g에서 1분간

원심분리한다.

vi) column을 새 1.5ml tube에 둔다.

vii) 30ul EB buffer를 넣고 13,000 × g에서 1분간 원심분리한다.

viii) column을 통과한 DNA 농축, 정제액을 Nanodrop 2000c 에서 확인한다.

위에서 nested PCR 방법에 의해 얻어진 증폭된 PCR 시료를 Agilent Bioanalyser

DNA 7500 Assay를 통하여 정량 분석 후 Roche GS FLX junior로 전체 염기서열

을 분석한다.