2555 ิทยาลัทยาลิลปากรยศ...animal feed by high performance liquid...

การหาปรมาณโคลสตนซลเฟตในอาหารสตว โดยเทคนคลคควดโครมาโตกราฟฟประสทธภาพสง

โดย นางสาวพวงทอง พวงแกว

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเคมวเคราะห

ภาควชาเคม บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2555 ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

DETERMINATION OF COLISTIN SULFATE

IN ANIMAL FEED

BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) TECHNIQUES

By

Miss Puangtong Puangkaew

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in Analytical Chemistry

Department of Chemistry

Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2012

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

สำนกหอ


บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “การหาปรมาณโคลสตนซลเฟตในอาหารสตวโดยเทคนคลคควดโครมาโตกราฟฟประสทธภาพสง” เสนอโดย นางสาวพวงทอง พวงแกว เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเคมวเคราะห

……........................................................... (ผชวยศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ)

คณบดบณฑตวทยาลย วนท..........เดอน.................... พ.ศ...........

อาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1. อาจารย ดร.ศรรตน ชสกลเกรยง 2. อาจารย ดร.ศภชย ศภลกษณนาร คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ .................................................... ประธานกรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.ดลฤด ฉมพาล) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ (อาจารย ดร.ยภาพร สมนอย) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ (อาจารย ดร.ศรรตน ชสกลเกรยง) (อาจารย ดร.ศภชย ศภลกษณนาร) ............/......................../.............. ............/......................../..............

สำนกหอ


ง

53310201 : สาขาวชาเคมวเคราะห คาสาคญ : โคลสตน ซลเฟต/HPLC/ยาสตว/อาหารสตว พวงทอง พวงแกว : การหาปรมาณโคลสตนซลเฟตในอาหารสตวโดยเทคนคลคควดโครมาโตกราฟฟประสทธภาพสง. อาจารยทปรกษาวทยานพนธ : อ.ดร. ศรรตน ชสกลเกรยง และ อ.ดร.ศภชย ศภลกษณนาร. 112 หนา. Colistin sulfate เปนยาปฏชวนะทใชในการรกษาสตวทตดเชอในระบบทางเดนอาหาร เกษตรกรจะผสมยาในอาหารสตวตามขนาดและวธใชทระบบนเอกสารกากบยา อยางไรกตามการใชยาผดวธและเกนขนาดทาใหยานตกคางมายงผบรโภค งานวจยนไดมงเนนการพฒนาวธวเคราะหปรมาณ colistin sulfate ใหมความถกตองและแมนยา โดยการใชเครองมอทราคาไมสง จากการทดลองหาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะห colistin พบวา Column ทเลอกใช คอ Zorbax Eclipse XDB C18 column (5 m,150 x 4.6 mm ID) โดยมสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 : acetonitrile (76:24, v:v) ทอตราการไหล 1.0 mL/min เปนสารละลาย Mobile phase ตรวจวดโดยใช UV detector ทความยาวคลน 215 nm ในการทดสอบความใชไดของวธวเคราะหพบวาวธวเคราะหน มความสมพนธเชงเสนตรงของสญญาณกบความเขมขนในชวง 25 – 400 mg/L ดวย correlation coefficient (R2) เทากบ 0.998 ความถกตองและความแมนยาของวธวเคราะหภายในวนเดยวกนและระหวางวน ทาการทดลองโดยใชสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมโดยผานขนตอนเหมอนกบการเตรยมตวอยาง medicated feed โดยใหมความเขมขนสดทายเปน 25, 150, 400 mg/L พบวา %recovery อยในชวง 92.98 – 115.25% และ %RSD ตากวา 7.90% ซงอยในชวงเกณฑทยอมรบไดตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC คาขดจากดของการตรวจพบ (LOD) และคาขดจากดของการวเคราะหเชงปรมาณ (LOQ) เทากบ 9.46 mg/L และ 13.93 mg/L ตามลาดบ การเตรยมตวอยาง medicated premix ทาโดยการเจอจางในสารละลายผสม acetronitrile: DI water (20:80) และการเตรยมตวอยางอาหารสตวทาโดยการสกดดวย 0.1 M HCl จากนนตกตะกอนโปรตนทมอยในอาหารสตวดวยสารละลายกรด 0.1 M HCl ผสม acetronitrile แลวจงนาไปกาจดตวรบกวนและเพมความเขมขนของสารละลายตวอยางกอนวเคราะหดวย HPLC โดยใชเทคนค solid phase extraction วธวเคราะหปรมาณ colistin sulfate ทพฒนาขนในงานวจยนมความ เหมาะเปนอยางยงทจะนาไปใชในหองปฏบตการควบคมคณภาพการผลตยาและอาหารสตว ภาควชาเคม บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2555 ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1. ....................................... 2. ………..........................

สำนกหอ


จ

53310201 : MAJOR : (ANALYTICAL CHEMISTRY)

KEY WORD : COLISTIN SULFATE/HPLC/MEDICATED PREMIX/ANIMAL FEED

PUANGTONG PUANGKAEW : DETERMINATION OF COLISTIN SULFATE IN

ANIMAL FEED BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

TECHNIQUES. THESIS ADVISOR: SIRIRAT CHOOSAKOONKRIANG, Ph.D., AND SUPACHAI

SUPALAKNARI, Ph.D. 112 pp.

Colistin is an antibiotics used in veterinary practice. Diseases in animals are usually

treated by adding the drug (liquid or solid medicated premix) to animal feed. However, if it is

used at high concentration, colistin sulfate will be toxic to animals, and the residual in meat

products can be harmful to consumers. In this study, the simple, inexpensive and rapid high

performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the determination of

colistin sulfate in medicated premixes and animal feed. The chromatographic column was a

ZORBAX Eclipse XDB-C18 column. The mobile phase was 30 mM sulfate buffer (pH 2.5):

acetonitrile (76:24) and the flow rate was 1.0 mL/min. The UV detector was used at wavelength

of 215 nm. An excellent linearity was of 25 - 400 mg/L (r2=0.998). Accuracy and precision of the

method were evaluated using colistin sulfate samples at concentrations of 25, 150 and 400 mg/L.

Intra- and inter-day precisions (%RSD, n=3) were less than 7.90%, and accuracy (%recovery)

was 92.98 – 115.25%. Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 9.46 and

13.93 mg/L respectively. The medicated premix sample was dissolved in acetronitrile:DI water

(20:80). The feed sample was extracted by 0.1 M HCl, then the protein in animal feed was

precipitated with acidic acetronitrile. The extract was preconcentrated and the matrix was

removed by solid phase extraction technique. The results demonstrated that HPLC method

developed in this work is appropriate for direct and rapid determination of colistin sulfate in

commercial medicated premixes and animal feed.

Department of Chemistry Graduate School, Silpakorn University

Student's signature ........................................ Academic Year 2012

Thesis Advisors' signature 1. ........................................... 2. ................................................

สำนกหอ


ฉ

กตตกรรมประกาศ

ในการจดทาวทยานพนธครงนสาเรจลลวงไดดวยความชวยเหลอ คาแนะนา จาก ดร. ศรรตน ชสกลเกรยง อาจารยทปรกษา ผชวยศาสตราจารย ดร. ดลฤด ฉมพาล อาจารยประธานกรรมการตรวจสอบวทานพนธ ดร.ศภชย ศภลกษณนาร และอาจารย ดร.ยภาพร สมนอย คณะกรรมการ ผวจยขอกราบขอบพระคณเปนอยางสง

ขอกราบขอบพระคณโครงพฒนาและสงเสรมผมความสามารถพเศษทางวทยาศาสตรและเทคโนโลย (พสวท.) และภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากรในการสนบสนนเงนทนวจย ขอขอบพระคณ บรษทไทยเมจฟารมาซวตคล จากด (Thai Meiji

Pharmaceutical Co., Ltd.) ในการสนบสนนสารมาตรฐาน colistin sulfate และตวอยางอาหารสตว สดทายขอกราบขอบพระคณบดา มารดา ครอบครว ทใหคาปรกษา ใหความชวยเหลอ

และเปนกาลงใจทดเสมอมาในการทาวจยในครงน คณคาและคณประโยชนของงานวจยเลมนขอมอบเปนเครองบชาพระคณบดา มารดา ครอาจารยทกทานทใหการอบรมสงสอนสรางความรแกผวจย

สำนกหอ


ช

สารบญ

หนา บทคดยอภาษาไทย………..…………………………………………………………………….... ง บทคดยอภาษาองกฤษ…………..………………………………………………………………... จ กตตกรรมประกาศ…………………….………………………………………………………..... ฉ สารบญตาราง……………………….………………………………………………………….... ฌ

สารบญภาพ……………………….…………………………………………………………...... ฐ บทท

1 บทนา………………………………………………………………………………… 1

ความเปนมาและความสาคญของปญหา………………..…………………..…… 1

วตถประสงคของการวจย……………………………………………….………. 2

สมมตฐานในการวจย…………………………………………………...……… 2

ขอบเขตของการวจย………………………………………………….………… 2

ขอจากดในการวจย……………………………………………………………... 3

กรอบแนวคดในการวจย………………………………………………………… 3

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ……………………………………………………... 4

2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ……………………………...………….……………... 5

Colistin…………………...…………………………………………………….. 5

Gentamicin……………………………………………………………………… 10

อาหารสตว…………..………...………………………………………………… 10

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)………………………….. 20

การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ…...…………………………………. 24

งานวจยทเกยวของ…………………………………………..…….…………… 31

3 วธดาเนนการวจย………………………………………………………………………. 35

เครองมอ อปกรณ สารเคมและตวอยางทใชในการทดลอง……………………. 35 การเตรยมสารละลาย…………………………………………………………… 38

การเตรยมตวอยางในการวเคราะหดวยเทคนค HPLC …………………………. 40

สภาวะของเทคนค HPLCทใชในการวเคราะหตวอยาง…………………………. 44

วธการทดลอง……………………………………………………………………. 44

สำนกหอ


ซ

บทท 4 ผลการทดลอง…………………………………………………………………………... 49

การหาสภาวะของเทคนค HPLC ทเหมาะสมในการวเคราะห colistin sulfate….. 49 การตรวจสอบความใชไดของวธวเคราะห………………………………………. 59

การทดลองหาวธการเตรยมตวอยางทเหมาะสม…………...……………………. 67 การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated premix

และตวอยาง medicated feed………………………………………….... 70

การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated feed ชนด B โดย

วธการใช standard addition method …………….……..………………. 75 5 สรป อภปรายและขอเสนอแนะ…………...…………………………………………… 80

สรปและอภปรายผลการวจย……………………………………..…………….. 80

ขอเสนอแนะ……………………………………………………….…………… 81

รายการอางอง…...…………………………………………………………………………….. 82

ภาคผนวก…………………………………………………………………………………..….. 86

ประวตผวจย…………………………………………………………………………………... 112

สำนกหอ


ฌ

สารบญตาราง

ตารางท หนา 2.1 ลกษณะเฉพาะของ colistin A และ colistin B (identity)………………………. 6

2.2 ปรมาณสารตกคางสงสดทกาหนดใหพบไดในสนคาปศสตว (ประกาศกรมปศสตว) ………………………………………………….

9

2.3 ปรมาณสารตกคางสงสดทกาหนดใหพบไดในสนคาปศสตว (Council regulation (EEC) No 2377/90)………………………………..

9

2.4 คณสมบตของ detector ชนดตางๆ…………………………………………….. 24

2.5 ระดบความถกตองของการวเคราะหตวอยางทระดบความเขมขนตางกน……… 25

2.6 เกณฑการยอมรบ %Recovery ตามมาตรฐานทางอาหารและยา……………….. 27

2.7 ความสมพนธระหวางคาความเขมขนกบ Predicted Horwitz

จากการทดสอบซา……………………………………………………….

28

3.1 เครองมอ อปกรณและแหลงทมาของเครองมอทใชในการทดลอง……………. 35

3.2 รายชอสารเคม แหลงทมาและเกรดทใชในการทดลอง………………………… 36

3.3 ตวอยาง medicated Premix บรษทผผลตและปรมาณ colistin sulfate

ทระบบนฉลากยา………………………………………………………...

37

3.4 ชนดของตวอยางอาหารสตวผสมยาสาเรจรป (medicated feed) ลกษณะภายนอกและปรมาณ colistin sulfate ทผสมในอาหารสตว……..

37

3.5 การเตรยมสารละลายมาตรฐานสาหรบการสรางกราฟมาตรฐาน………………. 39

3.6 การเตรยมตวอยาง medicated premix………………………………………….. 40

3.7 ชดการวเคราะห colistin sulfate ในตวอยางอาหารสตวโดยใชวธ standard

addition method………………………………………………………….

47

4.1 retention time ของ colistin และ gentamicin…………………………………… 50

4.2 peak area ของสารละลายมาตรฐานทง 7 ความเขมขน ทใชในการสรางกราฟมาตรฐาน…………………………………………

60

4.3 คา slope, intercept และ correlation coefficient (R2) ทไดจากการทดลอง

สรางกราฟมาตรฐานซา 6 ครง…………………………………………...

63

4.4 การศกษาความสมพนธในเชงเสนตรง (Linearity)…………………………….. 63

สำนกหอ


ญ

ตารางท หนา 4.5 relative standard deviation percentage (%RSD) จากการทดสอบความแมนยา

ของ retention time และ peak area ratio ของวธการวเคราะห (n = 10)…..

64

4.6 การศกษาความความแมนยาของวธวเคราะห (Intra and inter-day precision)…………………………………………...

65

4.7 การวเคราะหสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมโดยผานขนตอน

เหมอนกบการเตรยมตวอยาง medicated premix โดยใหมความเขมขน

สดทายเปน 5 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ฉด

ซา 10 ครง………………………………………………………………..

66

4.8 ผลการวเคราะหตวอยางอาหารสตวชนด B เขมขน

200 mg colistin sulfate/ kg feed ผลเมอใช Phenomenex

Strata-X cartridges เปนคอลมนสาหรบทา SPE…………………………

69

4.9 ผลการวเคราะหตวอยางอาหารสตวชนด B เขมขน

200 mg colistin sulfate/ kg feed ผลเมอใช Sep-Pak plus

360 mg C18 column เปนคอลมนสาหรบทา SPE………………………..

70

4.10 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix……………………………………. 72

4.11 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A………………………………. 73

4.12 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B………………………………. 75

4.13 ผลการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg) ชดท 1…………...

78

4.14 ความเขมขนของ colistin sulfate ในตวอยาง medicated feed ชนด B ทหาโดยวธ standard addition method…………………………………...

79

ตารางผนวก

ก.1 การศกษาความแมนยาของวธภายในวนเดยวกน

(Intra-day precision) ของ colistin sulfate standard

solutions 25 mg/L………………………………………………………..

95

ก.2 การศกษาความแมนยาของวธภายในวนเดยวกน


solutions 150 mg/L………………………………………………………

96

สำนกหอ


ฎ

ตารางผนวก หนา ก.3 การศกษาความแมนยาของวธภายในวนเดยวกน


solutions 400 mg/L………………………………………………………

96

ก.4 การศกษาความแมนยาของวธระหวางวน

(inter-day precision)ของ colistin sulfate standard

solutions 25 mg/L………………………………………………………..

97



solutions 150 mg/L……………………………………………………..

98



solutions 400 mg/L……………………………………………………..

99

ก.7 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ A……………………………. 100

ก.8 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ B……………………………. 101

ก.9 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ C…………………………… 101

ก.10 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ D…………………………… 101

ก.11 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 10% ………………… 102

ก.12 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 40% ………………… 102

ก.13 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B เขมขน 80 ppm ……………... 102

ก.14 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B เขมขน 150 ppm ……………. 103

ก.15 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B เขมขน 1500 ppm …………... 103

ก.16 ผลการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg) ชดท 2 ………….

104

ก.17 ผลการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg) ชดท 3 ………….

105

ก.18 ผลการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 150 mg/kg) ชดท 1 ………

106


107

สำนกหอ


ฏ

ตารางผนวก หนา ก.20 ผลการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห

( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 150 mg/kg) ชดท 3 ………

108


109


110


111

สำนกหอ


ฐ

สารบญรป

รปท หนา 1.1 กรอบแนวคดในการวจย……………………………..………………………… 3

2.1 สตรโครงสรางโมเลกลของ colistin และกรดอะมโนทเปนองคประกอบ………. 5

2.2 สตรโครงสรางโมเลกลของ gentamicin ………………………………………. 10

2.3 องคประกอบทสาคญของเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง……….. 21

2.4 ทอทางเดนของลนในตาแหนงรอ(wait)และในตาแหนงฉด(inject)……………. 23

3.1 สารมาตรฐาน Gentamicin sulfate ทใชในการทดลอง…………………………. 36

3.2 แผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated premix………………………………… 41

3.3 แผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated feed ชนด A…………………………… 42

3.4 แผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated feed ชนด B ………………………… 43

4.1 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L

(ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย)…………………………

49

4.2 องคประกอบของ colistin ทระบใน EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0…. 51

4.3 spectrum ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50, 100,

200, 250, 500 mg/L……………………………………………………...

52

4.4 spectrum ของสารละลายมาตรฐานgentamicin sulfate เขมขน 400,

200, 80 mg/L…………………………………………………………….

52

4.5 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 mg/L……. 53

4.6 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 500 mg/L…… 54

4.7 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L

และสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L…………

55



56


(ม gentamicin sulfate เขมขน 50 mg/L ผสมอย) ………………………..

57


(ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ท flow rate 0.7 mL/min………………………………………………….

58

สำนกหอ


ฑ

รปท หนา 4.11 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 80 mg/L

(ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ท flow rate 1.0 mL/min………………………………………………….

58

4.12 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทง 7 ความเขมขน


53

4.13 กราฟมาตรฐานของการวเคราะห colistin sulfate โดยใชอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ในแกน Y ……………………………………………

61

4.14 กราฟมาตรฐานของการวเคราะห colistin sulfate โดยใชอตราสวนระหวาง peak area ของ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate

ในแกน Y………………………………………………………………...

61

4.15 กราฟมาตรฐานของการวเคราะห colistin sulfate โดยใชอตราสวนระหวาง peak area ของ colistin A ตอ peak area ของ gentamicin sulfate

ในแกน Y………………………………………………………………...

62

4.16 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed เขมขน 80 mg colistin sulfate/ kg feed เมอใช สารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ 0.1 M hydrochloric acid (60:40) เปน

precipitating reagent……………………………………………………..

67

4.17 chromatogram ของการวเคราะหตวอยางอาหารสตวชนด B เขมขน

200 mg colistin sulfate/ kg feed ผลเมอใช Phenomenex Strata-X

cartridges เปนคอลมนสาหรบทา SPE………………………………….

68

4.18 chromatogram ของการวเคราะหตวอยางอาหารสตวชนด B เขมขน

200 mg colistin sulfate/ kg feed ผลเมอใช Sep-Pak plus 360 mg

C18 column เปนคอลมนสาหรบทา SPE………………………………..

69

4.19 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ A………….. 70

4.20 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ B………….. 71

4.21 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ C………….. 71

4.22 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ D………….. 71

4.23 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 10%.. 72

สำนกหอ


ฒ

รปท หนา 4.24 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 40%.. 73

4.25 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B

เขมขน 80 ppm (mg colistin sulfate/ kg feed)……………………………

74


เขมขน 1500 ppm (mg colistin sulfate/ kg feed)…………………………

74


เขมขน 2000 ppm (mg colistin sulfate/ kg feed)…………………………

74

4.28 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed ชนด B ตวอยางลาดบท 1 ของชดวเคราะหท 1 ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg)…………………...

76


76


77


77

4.32 กราฟ standard addition method ของการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg) ชดท 1…………………………………………………………………….

78

รปผนวก

ก.1 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 mg/L…….. 87

ก.2 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 500 mg/L…… 87

ก.3 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L

สภาวะท 1………………………………………………………………..

88

สำนกหอ


ณ

รปผนวก หนา ก.4 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L

สภาวะท 1………………………………………………………………..

88


สภาวะท 2………………………………………………………………..

89

ก.6 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L

สภาวะท 2………………………………………………………………..

89


สภาวะท 3 ……………………………………………………………….

90

ก.8 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L

สภาวะท 3 ……………………………………………………………….

90

ก.9 chromatogramสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L

(ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ………………………...

91



92



92



93



93



94



94



95

ก.17 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed เมอใช TCA เขมขน 30%,v/v (ใน DI water) เปน precipitating reagent ………………………

100

สำนกหอ


ด

รปผนวก หนา ก.18 กราฟ standard addition method ของการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชด

การวเคราะห(ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg)

ชดท 2 ……………………………………………………………………

104

ก.19 กราฟ standard addition method ของการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชด


ชดท 3 ……………………………………………………………………

105



ชดท 1 ……………………………………………………………………

106



ชดท 2 ……………………………………………………………………

107



ชดท 3 ……………………………………………………………………

108



ชดท 1 ……………………………………………………………………

109



ชดท 2 ……………………………………………………………………

110



ชดท 3 ……………………………………………………………………

111

สำนกหอ


1

บทท 1 บทนา

1. ความเปนมาและความสาคญของปญหา

Colistin sulfate เปนยาปฏชวนะทใชในการรกษาสตวทตดเชอในระบบทางเดนอาหาร ซงยาปฏชวนะนออกฤทธในการทาลายเชอแบคทเรยแกรมลบ เชน อ.โคไล (E.coli), ซลโมเนลลา(Salmonella sp.) และ วบรโอ (Vibrio sp.) เปนตน ในทองตลาดมการผลตยาปฏชวนะ colistin sulfate ในรปแบบยาสาหรบผสมในอาหารสตวทงทมลกษณะเปนของแขงและของเหลว (Solid and liquid medicated premixes) การใชยานเกษตรกรจะผสมยาในอาหารสตวหรอผสมในนาตามขนาดและวธใชทระบบนเอกสารกากบยา สวนอกรปแบบหนงของยาปฏชวนะ colistin sulfate ทมขายในทองตลาด คอ อาหารสตวททาการผสม colistin sulfate สาเรจรป (medicated feed) รปแบบอาหารสตวทผสมยามาแลวดงกลาวนสะดวกตอเกษตรกรและมกนยมใชเลยงสกรระยะตงแตแรกเกดถงสกรทมนาหนกตว 25 kg อยางไรกตามการใหยาปฏชวนะแกสตว ไดแก เปด ไก สกร และวว เกษตรกรควรมความรในการใชยาและควรปฏบตตามเอกสารกากบยาอยางเครงครด เนองจากการใชยาผดวธและเกนขนาด สงผลใหยาปฏชวนะตกคางมายงผบรโภค การปองกนและแกไขปญหายาปฏชวนะตกคางในผลตภณฑอาหารทไดจากสตวอยในความสนใจและความตระหนกรวมกนของหนวยงานทงภาครฐและเอกชนทเกยวของกบการคมครองผบรโภค การควบคมปรมาณสารตกคางสงสดในประเทศไทยระบในประกาศกรมปศสตว เรองปรมาณสารตกคางสงสดทกาหนดใหพบไดในสนคาปศสตว ฉบบวนท 12 เดอนกรกฎาคม พ.ศ. 2549 กาหนดใหพบ colistin ไดในระดบไมเกน 150 μg/kg ในกลามเนอ ไขมน ตบของสตวเพอบรโภคทกชนดและไมเกน 300 μg/kg ในไข[1] นอกจากนองคกรในยโรปไดมการผลกดนใหมการตรวจสอบความเปนเนอเดยวกน ความเสถยร และความสามารถในการเกบรกษายาปฏชวนะใหมประสทธภาพ โดยมการตรวจสอบทงในรปแบบยาสาหรบผสมในอาหารสตวและในอาหารสตวทผสมยาแลวสาเรจรป[2] ดงนนจงมความจาเปนอยางยงทกระบวนการผลตยาปฏชวนะตองมการควบคมผลตภณฑใหปรมาณยาตรงกบเอกสารกากบยาเพอใหเกดความปลอดภยในการใชยา และยงสงผลถงความปลอดภยในการบรโภคผลตภณฑทไดจากสตว นอกจากนจะลดปญหาขอกดกนการรบซอเนอสตวและผลตภณฑอาหารทไดจากสตวของประเทศผนาเขาอกดวย งานวจยนจงมงเนนการพฒนาวธการวเคราะหหาปรมาณ colistin sulfate โดยเทคนค High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ทตรวจวด

สำนกหอ


2

ดวย UV detector ใหมความถกตอง แมนยา สะดวก และประหยด เหมาะสาหรบนาประยกตใชในงานควบคมคณภาพการผลตยาและควบคมคณภาพการผลตอาหารสตวทม colistin sulfate ผสมสาเรจรป 2. วตถประสงคของการวจย 2.1 เพอหาวธการวเคราะหหาปรมาณ colistin sulfate ทมความถกตอง แมนยา และราคาไมแพง เหมาะสมกบการนาไปใชในการหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางยาสาหรบผสมอาหารสตวและในตวอยางอาหารสตวทผสม colistin sulfate สาเรจรป 2.2 เพอนาวธวเคราะหทไดไปใชในกระบวนการตรวจสอบคณภาพการผลตยาและอาหารสตวในโรงงานได 3. สมมตฐานในการวจย

เทคนค HPLC ทตรวจวดดวย UV detector สามารถใชในการวเคราะหหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางยาสาหรบผสมอาหารสตวและในตวอยางอาหารสตวทผสม colistin sulfate สาเรจรปไดประสบความสาเรจโดยพจารณาเกณฑการยอมรบ accuracy และ precision จากมาตรฐานอาหารและยาของ AOAC

4. ขอบเขตของการวจย

ในการวจยครงนมขอบเขตของการวจยดงน 4.1 การหาวธวเคราะหทเหมาะสมทดลองโดยหาสภาวะตางๆทเกยวของกบเทคนค

HPLC ไดแก ชนดของสารละลายบฟเฟอรทใช pH ของสารละลายบฟเฟอร อตราสวนของ organic phase ตอสารละลายบฟเฟอรทใชเปนสารละลายตวพา อตราการไหลของสารละลายตวพา ความยาวคลนทใชในการตรวจวดปรมาณสารดวย UV detector

4.2 การทดสอบความใชไดของวธวเคราะหทดลองโดยการใชสารมาตรฐาน Colistin sulfate ละลายในสารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ deionized water (20:80) แลวพจารณาความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐานทสรางขน (linearity) ความเขมขนตาสดทสามารถตรวจวดไดโดยเทคนคน (LOD) ความเขมขนตาสดทสามารถวเคราะหเชงปรมาณไดเชอมนโดยเทคนคน (LOQ) ความถกตองของวธ (accuracy) และความแมนยาของวธ (precision)

4.3 การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในอาหารสตว ทดลองโดยมการเตรยมตวอยางอาหารสตวเพอกาจดตวรบกวนการวเคราะหแลวหาปรมาณดวยเทคนค HPLC ทตรวจวด

สำนกหอ


3

ดวย UV detector ซงพจารณาประสทธภาพของผลการวเคราะหโดยใช % Recovery และ %RSD ของตวอยางอาหารสตวททราบปรมาณการเตม colistin sulfate

5. ขอจากดในการวจย

การวจยนมขอจากด คอ การวเคราะหหาปรมาณ colistin sulfate ดวยเทคนค HPLC ทตรวจวดดวย UV detector เกดการรบกวนในการตรวจวดคอนขางสงจากสารอนๆทเปนองคประกอบในตวอยางอาหารสตวทมคณสมบตในการดดกลนแสง UV เชนเดยวกบ colistin sulfate ดงนนกระบวนการเตรยมตวอยางอาหารสตวทมจดประสงคในการกาจดตวรบกวนเหลานมความจาเปนอยางยง แตอยางไรกตามกระบวนการเตรยมตวอยางหลายขนตอนอาจทาใหความถกตองและแมนยาของการวเคราะห colistin sulfate ในอาหารสตวลดลงได

6. กรอบแนวคดในการวจย

รปท 1.1 กรอบแนวคดในการวจย

สารมาตรฐาน colistin sulfate

พจารณาความใชไดของวธจาก %Recovery และ %RSD

หาสภาวะทเหมาะสมทางเทคนค HPLC

ทดลองในตวอยางยาสาหรบผสมในอาหารสตวทมขายในทองตลาด

ททราบปรมาณ colistin sulfate จากฉลากกากบยา

ทดลองในตวอยางอาหารสตว ททราบปรมาณการเตม

colistin sulfate

พจารณาความถกตองในการวเคราะหตวอยางอาหารสตวจาก % recovery และ %RSD โดย

เปรยบเทยบตามมาตรฐานของ AOAC

พจารณาความถกตองในการวเคราะหตวอยางยาจาก %recovery และ % RSDโดยเปรยบเทยบตามมาตรฐานของ AOAC

4

7.ประโยชนทคาดวาจะไดรบ สามารถนาวธวเคราะหทวจยสาเรจไปใชในกระบวนการตรวจสอบคณภาพการผลตยา

สตวและอาหารสตวในโรงงานไดจรงเพอลดตนทนในการควบคมคณภาพการผลตจากเดมทมคาใชจายสงในการวเคราะหดวยเครองมอราคาแพง

5

บทท 2

เอกสารและงานวจยทเกยวของ

การหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางยาสาหรบผสมอาหารสตว (medicated

premix) และตวอยางอาหารสตวผสมยาสาเรจรป (medicated feed) ผวจยไดศกษาเอกสารและงานวจยทเกยวของดงน

1. colistin

1.1 โครงสรางโมเลกล colistin เปนยาปฏชวนะในกลม polymixin ทสกดไดมาจากเชอ Bacillus polyrnyxa subspecies colistinus [3] โครงสรางโมเลกลของ colistin ประกอบดวยกรดอะมโน 3 ชนด ไดแก leucine (Leu) threonine (Thr) และ diaminobutyric acid (DAB) ลกษณะของโครงสรางโมเลกลแบงเปนสองสวน สวนแรก คอ สวนทเปนวงของ peptide โดยภายในวงประกอบดวยกรดอะมโนตอกน 7 โมเลกล สวนทสอง คอ สายโซตรงของกรดอะมโนทตอกน 3 โมเลกล โดยทปลายสายดาน N ของกรดอะมโนในโซตรงถกแทนทดวย fatty acid [4] แสดงดงรปท 2.1

รปท 2.1 สตรโครงสรางโมเลกลของ colistin และกรดอะมโนทเปนองคประกอบ

ทมา : Suzuki, T. et al. (1963). “Studies on the Chemical Structure of Colistin: I. Fractionation, Molecular

Weight Determination, Amino Acid and Fatty Acid Composition.” Journal of

Biochemistry 54: 25-33.

6

colistin เปนสารผสมทมองคประกอบอยางนอย 13 ชนด [5] แตทงนองคประกอบหลกของ colistin มเพยงสองชนด คอ colistin A (polymyxin El) และ colistin B (polymyxin E2) โดยทงสององคประกอบมการจดเรยงตวของกรดอะมโนในโครงสรางโมเลกลเหมอนกน แตกตางกนเพยง fatty acid ทแทนทบรเวณปลายสายดาน N ของโซตรง ซง colistin A ม fatty acid เปน 6-

methyloctanoic acid สวน colistin B ม fatty acid เปน 6-methylheptanoic acid [6] ไดแสดงลกษณะเฉพาะตวของ colistin A และ colistin B [29] ในตารางท 2.1

ตารางท 2.1 ลกษณะเฉพาะของ colistin A และ colistin B (identity)

Identities and

physical property

colistin A colistin B

International

Union of Pure and

Applied Chemistry

(IUPAC) Names

N-[3-amino-1-[[1-[[3-amino-1-

[[6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-(1-

hydroxyethyl)-12,15-bis(2-

methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-

heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-

heptazacyclotricos-21-

yl]carbamoyl]propyl]carbamoyl]-2-

hydroxypropyl]carbamoyl]propyl]-

6-methyl-octanamide

N-[3-amino-1-[[1-[[3-amino-1-

[[6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-(1-

hydroxyethyl)-12,15-bis(2-

methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-

heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-

heptazacyclotricos-21-

yl]carbamoyl]propyl]carbamoyl]-2-

hydroxypropyl]carbamoyl]propyl]-

5-methyl-heptanamide

molecular formula C53H100N16O13 C52H98N16O13

molecular weight 1169.5 1155.4

ทมา : Friedlander , Lynn G. and Arnold, D. Colistin. Accessed April 6, 2013. Available from

ftp://ftp.fao.org/ag/agn/jecfa/vetdrug/2-2006-colistin.pdf

7

1.2 คณสมบตอนๆของ colistin [29]

รปแบบทมขายในทองตลาด

(commercial available form)

: colistin sulfate

ลกษณะทเหนภายนอก (appearance)

: ผงสขาว

จดหลอมเหลว (melting point)

: 215-219 ºC (colistin sulfate)

ความสามารถในการละลาย (solubility)

: colistin sulfate ละลายไดดในนา ละลายไดบางสวนใน

methanolไมละลายใน ether acetone และ chloroform

1.3 ประวตการใชและกลไกการออกฤทธ ในป ค.ศ.1950 colistin สกดไดเปนครงแรกจากเชอแบคทเรยบาซลลส โพลไมซา

ในสปชสยอย โคลสตนส (Bacillus polyrnyxa subspecies colistinus) โดย Koyama และคณะ [3] และนามาใช เปนยาครงแรกในประเทศญปน หลงจากนนจงมการนามาใชในยโรปและสหรฐอเมรกาตามลาดบ ยานถกนามาใชรกษาโรคตดเชอทวไปอยเปนเวลานาน 20 ป จนกระทงมการเรมใชยาปฏชวนะกลมอนๆทมประสทธภาพและปลอดภยมากขน ความนยมของการนา colistin มาใชจงลดลง ในป ค.ศ.1987 colistin ถกนากลบมาใชอกครง โดยเฉพาะอยางยงใชสาหรบฆาเชอแบคทเรยแกรมลบ คอ P.aeruginosa และ A.baumannii ซงดอยาปฏชวนะทกขนานแตไมดอยา colistin [7]

ยาปฏชวนะชนดนออกฤทธในการทาลายเชอแบคทเรยแกรมลบ เชน อ.โคไล (E.coli), ซลโมเนลลา (Salmonella sp.) และ วบรโอ (Vibrio sp.) เปนตน โมเลกลของ colistin จะมประจเปนบวก (cationic peptide antibiotic) เมออยในเซลลแบคทเรย ทาใหจบกบผนงเซลลของแบคทเรย

โดยโมเลกลของ colistin นนจะไปขบแคลเซยมและแมกนเซยมทผนงเซลลออก ทาใหผนงเซลลรวสงผลใหแบคทเรยตายในทสด เนองจากกลไกการออกฤทธของยานแตกตางจากยากลมอนและมกลไกไมเกยวของกบเอนไซมตางๆ จงทาใหมโอกาสนอยทแบคทเรยจะดอยา [7]

1.4 การระบขนาดของยา colistin

ยาทผลตจากบรษทตางๆ มปรมาณของ colistin แตกตางกน จงมการระบขนาดของยานดวย International Unit (IU) กลาวคอ 1 IU ของยา colistin หมายถง ปรมาณยาทยบยงการเจรญเตบโตของ E.coli 95 I.S.M. ในอาหารเลยงเชอ 1 mL ท pH 7.2 โดย 1 mg ของ colistin base ทบรสทธมปรมาณยา 30,000 IU และ 1 mg ของ colistin sulfate มปรมาณยา 20,000 IU [6] ยกตวอยาง เชน ยาสตวชนด D ระบขางฉลากวา 1 g ของยา มปรมาณ colistin sulfate 1,000,000 IU

สำนกหอ


8

นนหมายความวา ใน 1g ม ปรมาณ colistin sulfate = (1,000,000 IU)/(20,0000 IU/mg colistin

sulfate) = 50 mg colistin sulfate = 0.05 g colistin sulfate ดงนน ยาสตวชนด D เขมขน = (0.05 g colistin sulfate /1g medicated premix)X 100 = 5 %(W/W)

1.5 การนามาใชในการรกษาสตว colstin ทมขายในทองตลาดอยในรปของเกลอซลเฟตและเกลอโซเดยม สารปฏชวนะ

นถกนามาใชในการรกษาสตวโดยใชเปนยาเพอยบยงการตดเชอทเกดจากแบคทเรยแกรมลบ ซงปกตเกลอ colistin sulfate มกใชรกษาโรคตดเชอในลาไสของสกร เปด ไก ววและกระตาย ขนาดการใชยาทแนะนา คอ 75,000 IU ตอนาหนกตว 1 kg ตอวนสาหรบสตวปก และ 100,000 IUตอนาหนกตว 1 kg ตอวนสาหรบวว สกร และกระตาย ซงขนาดทแนะนาดงกลาวนสอดคลองกบขนาดการใชยา คอ ปรมาณ colistin 3.33 mg ตอนาหนกตว 1 kg ตอวน โดยใหยานตดตอกน 3-5 วนวธการใหยานทาโดยการเตมยา (liquid or solid medicated premix) ผสมลงในนา นม หรออาหารสตวในปรมาณทระบบนฉลากกากบยา ยกตวอยาง เชน ยาสาหรบผสมอาหารสตวชนดหนงทมปรมาณ colistin 40% (W/W) ระบขนาดและวธใชบนฉลากกากบยา [8] ดงน ขนาดและวธใช : สกร ใชยา 0.4 กโลกรม (มเนอยา 160 ppm) ผสมอาหาร 1 ตน ใหสตวกนตดตอ 3-5 วน

ลกสกร ใชยา 0.15 กโลกรม (มเนอยา 60 ppm) ผสมอาหาร 1 ตน ใหสตวกนตดตอ 3-5 วน

สตวปก ใชยา 0.1 กโลกรม (มเนอยา 40 ppm) ผสมอาหาร 1 ตน ใหสตวกนตดตอ 3-5 วน

ระยะหยดยา : งดใหยาสตวกอนฆาเพอบรโภค อยางนอย 7 วน

การเกบรกษา : เกบในสถานทแหงและเยน อณหภมไมเกน 30 องศาเซลเซยส และปองกนแสงแดด อยางไรกตามการใหยาปฏชวนะแกสตว เกษตรกรควรมความรในการใชยาและ

ควรปฏบตตามเอกสารกากบยาอยางเครงครด เนองจากการใชยาผดวธและเกนขนาดสงผลใหยาปฏชวนะตกคางมายงผบรโภค การปองกนและแกไขปญหายาปฏชวนะตกคางในผลตภณฑอาหารทไดจากสตวอยในความสนใจและความตระหนกรวมกนของหนวยงานทงภาครฐและเอกชนทเกยวของกบการคมครองผบรโภค การควบคมปรมาณสารตกคางสงสดในประเทศไทยระบในประกาศกรมปศสตว เรองปรมาณสารตกคางสงสดทกาหนดใหพบไดในสนคาปศสตว ฉบบวนท 12 เดอนกรกฎาคม พ.ศ. 2549 กาหนดใหพบ colistin ไดในระดบไมเกน 150 μg/kg ในกลามเนอ ไขมน ตบและไมเกน 300 μg/kg ในไขของสตวเพอบรโภคทกชนด [1] ดงแสดงในตารางท 2.2

นอกจากนองคกรในยโรปไดมการผลกดนใหมการตรวจสอบความเปนเนอเดยวกน ความเสถยร และความสามารถในการเกบรกษายาปฏชวนะใหมประสทธภาพ โดยมการตรวจสอบทงในรปแบบยาสาหรบผสมในอาหารสตวและในอาหารสตวทผสมยาแลวสาเรจรป[2] ดงแสดงในตารางท 2.3

สำนกหอ


9

ตารางท 2.2 ปรมาณสารตกคางสงสดทกาหนดใหพบไดในสนคาปศสตว (ประกาศกรมปศสตว)

ชนดสารตกคาง ชนดสตว ชนดตวอยาง ปรมาณสาตกคางสงสด

( μg/kg )

หมายเหต

colistin สตวเพอบรโภคทกชนด

กลามเนอ

ไขมน

ตบ

ไต

ไข

150

150

150

200

300

-

ทมา : กรมปศสตว. (2549). “ประกาศกรมปศสตว เรอง กาหนดมาตรฐานสารตกคางสาหรบสนคาปศสตว.” 12 กรกฎาคม.

ตารางท 2.3 ปรมาณสารตกคางสงสดทกาหนดใหพบไดในสนคาปศสตว (Council regulation

(EEC) No 2377/90)

Pharmacologically

active substance Maker residue Animal Species MRLs

( μg / kg )

Target tissues

colistin colistin bovine, ovine,

porcine,

chicken, rabbits

150 muscle

150 fat

150 liver

200 kidney

bovine, ovine 50 milk

chicken 300 eggs

ทมา : EMEA. (2002). “Committee for Veterinary Medicinal Products Colistin. Summary report

(2) EMEA/MRL/815/02-FINAL.” January.

10

2. Gentamicin

ในงานวจยนไดเลอกใช gentamicin sulfate ทอยในรปแบบยาสาหรบฉดสตว (injection form) เปน internal standard ดงนนผวจยจงไดตนควาขอมลของ Gentamicin ดงน

Gentamicin เปนยาปฏชวนะในกลม aminoglycoside ใชในการรกษาโรคทตดเชอตดเชอแบคทเรยชนดแกรมลบและแกรมบวกบางชนด จากงานวจยของ M. Laki และคณะ[30] ไดระบโครงสรางโมเลกลของ gentamicin ดงรปท 2.2 เหนไดวา gentamicin มหลายองคประกอบ ไดแก gentamicin C1, gentamicin C1a, gentamicin C2, gentamicin C2a, gentamicin C2b กลาวคอ เมอหมแทนท R1 , R2 และ R3 แตกตางกน gentamicin จะมชอเรยกทตางกนไป เชน gentamicin C1 มหมแทนท R1 , R2 และ R3 เปน CH3 CH3 และ H ตามลาดบ แตเมอเปน gentamicin C1a มหมแทนท R1 , R2 และ R3 เปน H ทงหมด จงสามารถกลาวไดวา gentamicin เปนสารผสมทมหลายองคประกอบ

รปท 2.2 สตรโครงสรางโมเลกลของ gentamicin

ทมา : Laki, M. et al. (2011). “Determination of Gentamicin Released from Orthopedic Carrier

System by a Novel HPLC Method.” Journal of Chromatographic Science 49: 177-181. 3. อาหารสตว (Feed)

3.1 ความหมาย สารกรมไทยสาหรบเยาวชน เลมท 14 ไดใหความหมายของอาหารสตวไววา อาหารสตว หมายถง วตถตางๆ ทมสารอาหารเปนประโยชนในการบารงรางกายและไมเปนพษตอสตว เชน รา ปลายขาว เมลดขาวโพด ปลาปน กากถวตางๆ มนสาปะหลง ตลอดจนหญาและพชในวงศถวบางชนด เรานาเอาวสดพลอยไดจากอาหารมนษยเหลานมาผสมเขาดวยกนตามสดสวนทตองการใหเปนอาหารผสมสาเรจรปสาหรบเลยงสตว [9]

11

พระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525 “อาหารสตว” คอ วตถทมงหมายเพอใชเลยงสตวท รฐมนตรโดยคาแนะนาของคณะกรรมการควบคมคณภาพอาหาสตวประกาศเปนอาหารสตวในราชกจจานเบกษา [10]

Association of American Feed Control Officials ซงเปนทยอมรบกนทวโลกใหนยามวา “อาหารสตว หมายถงวตถทสตวกนได และใหสตวกนเพอใหพลงงานหรอสารอาหาร แกสตวชนดนนได” จากนยามนจะเหนไดวา อาหารสตว หมายถงวตถทสตวกนไดตามปกตในแตละวน

แลวไดรบโภชนะทจาเปนในการสรางเนอเยอตางๆ เพอบารงรางกายใหมสขภาพสมบรณแขงแรง

สามารถทจะประกอบกจกรรมของสงมชวตไดตามปกต โภชนะทจาเปนตอการดารงชวตของสตว ไดแก นา คารโบไฮเดรต โปรตน ไขมน แรธาต และวตามนซงจะพบเปนสวนประกอบในวตถดบทนามาใชผสมเปนอาหารสตว โดยไมคานงถงสารเจอปนใดๆ ทปนเปอนมากบวตถดบโดยมไดเจตนา และพบไดในอาหารสตวตามปกต เชน ขบวนการผสมวตถดบ เปนตน ซงสารเจอปนเหลานอาจจะเปนประโยชนหรอเปนโทษตอสตวกได 3.2 สวนประกอบของอาหารสตว สวนประกอบทางเคมของอาหารสตวหรอโภชนะในอาหารสตว แบงออกเปน 6ประเภท [11] ดงน

3.2.1 นา (water) ประกอบดวยไฮโดรเจนและออกซเจน มสตรทางเคมคอ H2O

3.2.1.1 แหลงนา สตวไดรบจะไดจากอาหาร หรอจากการดมนาโดยตรงกได และนอกจากนยงไดรบนาจากขบวนการเผาผลาญอาหารอกดวย เชน การเผาผลาญกลโคส ดงน

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + พลงงาน

นาทไดจากขบวนการเผาผลาญอาหารน เรยกวา metabolic water ซงสตวทจาศลจะใชประโยชนของนาแหลงน

3.2.1.2 หนาทของนาตอรางกายสตว 3.2.1.2.1 เปนสวนประกอบของเซลลและเนอเยอ

3.2.1.2.2 ชวยขนสงโภชนะตาง ๆ

3.2.1.2.3 ชวยขบของเสย

3.2.1.2.4 เปนสอกลางทาใหเกดปฏกรยาเคมในรางกาย เชน ขบวนการเผาผลาญอาหาร

3.2.1.2.5 ควบคมอณหภมใหปกต เชน การขบเหงอ เปนตน

3.2.1.2.6 รกษารปรางของเซลลใหปกต

3.2.1.2.7 เปนสวนสาคญของนาในไขขอ (synovial fluid)

สำนกหอ


12

3.2.1.2.8 ปองกนการกระทบกระเทอนอวยวะภายในทสาคญ เชน สมอง

หวใจ และลกสตวในทอง เปนตน

3.2.1.3 การเลอกซอวตถดบอาหารสตวจากองคประกอบของนา จะตองมนาเปนองคประกอบตากวารอยละ 13 เพราะนาเปนสาเหตททาใหเกดการเปลยนแปลงทางเคมและชวเคมของอาหาร รวมทงมผลใหจลนทรยโดยเฉพาะเชอรา Aspergillus flavus ทผลตสารพษอลฟาทอกซน (alfatoxin) เจรญเตบโตได

3.2.2 คารโบไฮเดรต (carbohydrate) มธาตคารบอน ไฮโดรเจน และออกซเจนเปนสวนประกอบหลก โดยมสตรทวไปคอ (CH2O)n คารโบไฮเดรตเปนสวนประกอบสาคญของพชทกชนด ในสตวกมบางแตจานวนนอยซงจะอยในรปไกลโคเจน

3.2.2.1 ประเภทคารโบไฮเดรต

3.2.2.1.1 แบงตามจานวนของอณของนาตาล ไดแก monosaccharides เชน

กลโคส กาแลคโตส ฟรคโตส เปนตน disaccharides เชน ซโคส แลคโตส เปนตน trisaccharides

เชน แรฟฟโนส เปนนาตาลทไดจากหวบทและพบในพชชนสงหลายชนด polysaccharides เชน

แปง ไกลโคเจน และเซลลโลส เปนตน

3.2.2.1.2 แบงตามการยอยไดของคารโบไฮเดรต ไดแก คารโบไฮเดรตทยอยงาย (nitrogen-free extract หรอ NFE) คอ แปง และไกลโคเจน คารโบไฮเดรตทยอยยาก (crude

fiber หรอ CF) เชน เซลลโลส เฮมเซลลโลส และลกนนในผนงเซลลของพช

3.2.2.2 หนาทของคารโบไฮเดรต

3.2.2.2.1 ใหพลงงานและความรอน

3.2.2.2.2 เกบไวเปนพลงงานสารอง เชน ไกลโคเจน หรอเปนไขมนสะสมไว

3.2.2.3 การเลอกซอวตถดบอาหารสตวจากองคประกอบของคารโบไฮเดรต

จะตงราคาตามปรมาณแปงทมอยในวตถดบอาหารสตวแหลงพลงงาน เชน การใหราคามนสาปะหลงตามปรมาณแปงในหวมน เปนตน จากการวเคราะหหาปรมาณคารโบไฮเดรตโดยวธประมาณ (proximate analysis)จะตองวเคราะหหาคาเปนรอยละของความชน โปรตน เยอใย ไขมน

และเถา นามารวมกนแลวลบออกจาก 100 จงจะไดปรมาณคารโบไฮเดรตทยอยงาย คอ แปง ซงวธดงกลาวนนจะใชเวลานาน จงมการผลตเครองมอวดหาปรมาณแปงออกมาเพอความสะดวกและรวดเรวในการหาปรมาณแปงในวตถดบอาหารสตว จะไดเปนขอมลในการตงราคาซอวตถดบอาหารสตวตอไป

สำนกหอ


13

3.2.3 ไขมน (lipids หรอ ether extract หรอ EE) มคารบอนตางจากคารโบไฮเดรต

จะใหพลงงานมากกวาคารโบไฮเดรต 2.25 เทา จะมมากในไขมนสตวและเมลดของพชนามน

3.2.3.1 ประเภทของไขมน

3.2.3.1.1 ไขมนธรรมดา จะประกอบดวย กลเซอรอล 1 อณและกรดไขมน

3 อณ ถาอยในสภาพเหลวจะเปนนามน (oil) แตถาเปนของแขงจะเปนไขมน (fat)

3.2.3.1.2 ไขมนประกอบ เปนไขมนธรรมดาทมสารอนเพมขนมา เชน

ฟอสฟอลปด ไกลโคลปดและไลโปโปรตน เปนตน

3.2.3.1.3 อนพนธไขมน เกดจากการสลายตวของไขมนธรรมดาและไขมนประกอบ เชน กรดไขมน รวมทงสารอนๆทไดจากไลโปโปรตน

3.2.3.1.4 ไขมนเบดเตลด ไดแก สารอนๆทมคณสมบตคลายไขมน มกพบวาอยรวมกบไขมนในธรรมชาต เชน สารสเตอรอยด และไวตามนทละลายในไขมน เปนตน

3.2.3.2 กรดไขมน (fatty acid) แบงประเภทไดดงน 3.2.3.2.1 กรดไขมนแบงตามสตรโครงสราง ไดแก กรดไขมนไมอมตว

คอ กรดไขมนทสตรโครงสรางมพนธะคอยางนอย 1 ตาแหนง และกรดไขมนอมตว คอ กรดไขมนทสตรโครงสรางมพนธะเดยวทงหมด

3.2.3.2.2 กรดไขมนแบงประเภทตามโภชนาการ ไดแก กรดไขมนทจาเปน (essential fatty acid หรอ EFA) ม 3 ชนด คอ linoleic acid, linolenic acid และ arachidonic

acid สตวไมสามารถสงเคราะหเองได ตองไดรบจากอาหาร และกรดไขมนทไมจาเปน (non-

essential fatty acid หรอ NEFA) เชน palmitic acid และ lauric acid เปนตน ซงสตวสามารถสงเคราะหเองได

3.2.3.3 หนาทของไขมน

3.2.3.3.1 ใหพลงงานและความรอน

3.2.3.3.2 ปองกนการกระทบกระเทอนอวยวะทสาคญ

3.2.3.3.3 ชวยในการขนสงสารทละลายในไขมน

3.2.3.4 การเลอกซอวตถดบจากองคประกอบของไขมน วตถดบอาหารสตวทมไขมนสง จะเปนสาเหตทาใหเกดปฏกรยาออกซเดชน (oxidation) ของไขมนเมอเกบไวนานๆ ทาใหเกดเหมนหนได ซงสตวจะไมชอบกนอาหารทมกลนดงกลาว ดงนนถงแมจะมวธวเคราะหหาปรมาณไขมนโดยวธประมาณกตาม ผซอวตถดบอาหารสตวกจะตรวจสอบคณภาพของวตถดบอาหารสตวทางกายภาพกอนโดยเฉพาะกลนเหมนหน ถามกลนนแสดงวาอาหารเกาซงไมควรซอไปเลยงสตว

สำนกหอ


14

3.2.4 โปรตน (protein) มองคประกอบทางเคมซบซอน ประกอบดวยคารบอน

ไฮโดรเจน ออกซเจน และไนโตรเจน บางชนดอาจมซลเฟอร หรอฟอสฟอรสดวย ลกษณะสาคญของโปรตน คอ มไนโตรเจนรอยละ 16

3.2.4.1 กรดอะมโน แบงออกเปน 2 พวก คอ

3.2.4.1.1 กรดอะมโนจาเปน (essential amino acid หรอ EAA) สตวตองไดรบจากอาหารเพราะไมสามารถสงเคราะหเองไดม 10 ตว คอ อารจนน (arginine, Arg) อสตดน

(histidine, His) ไอโซลซน (isoleucine, Isoleu) ลซน (leucine, Leu) ไลซน (lysine, Lys) เมทไธโอนน (methionine, Meth) ฟรนนลาลานน (phenyllalanine, Phen) ทรโอนน (threonine, Thre)

ทรฟโตเฟน (tryptophan,Tryp) และวาลลน (valine, Val) ในสตวปกจะเพม ไกลซน (glycine, Gly)

กลตามคแอซด (glutamicacid, Glu) และ โปรลน (proline, Pro)

3.2.4.1.2 กรดอะมโนไมจาเปน (non-essential amino acid หรอ NEAA)

สตวจะสามารถสงเคราะหเองได เชน อะลานน (alanine, Ala) และแอสปารตคแอซด (aspartic acid,

Asp) เปนตน

3.2.4.2 หนาทของโปรตน

3.2.4.2.1 เปนสวนประกอบของรางกายสตว 3.2.4.2.2 เปนสวนประกอบของนายอย ฮอรโมน ภมคมกนโรค

3.2.4.2.3 รกษาสภาพความสมดลของของเหลวภายในและภายนอกเซลล 3.2.4.2.4 ใชเปนพลงงาน

3.2.4.3 การเลอกซอวตถดบอาหารสตวตามปรมาณโปรตน จะเลอกซอและใหราคาวตถดบอาหารสตวแหลงโปรตนตามปรมาณโปรตนรวมทมอยในวตถดบอาหารสตวนน ๆ

ทงนมกพบการปลอมปนของวตถดบอาหารสตวแหลงโปรตนมาก เพราะเปนแหลงทมราคาแพง

จาเปนตองใชในสตรอาหารในปรมาณมากเปนอนดบสองรองลงมาจากวตถดบอาหารสตวแหลงพลงงาน ในการวเคราะหหาปรมาณโปรตนจะใชวธของ Kjeldahl method แตจะใชเวลานาน จงมการผลตเครองมอวดหาปรมาณโปรตนออกมาเพอความสะดวกและรวดเรวในการหาปรมาณโปรตนในวตถดบอาหารสตว จะไดเปนขอมลในการตงราคาซอวตถดบอาหารสตวตอไป ทงนเมอผลการวเคราะหออกมามปรมาณโปรตนรวมสงอาจเปนโปรตนทเกดจากการปลอมปนอาหารดวยขนไกปนหรอยเรยกไดจาเปนตองมการตรวจสอบการปลอมปนตอดวยวธทางกายภาพโดยใชวธสองดวยกลองสเตอรโอไมโครสโคป (sterio microscope) เรยกวธ feed microscopy หรออาจตรวจหาสงปลอมปนดวยวธทางเคมกได

สำนกหอ


15

3.2.5. วตามน (vitamins) แบงออกเปน 2 พวก ดงน 3.2.5.1 วตามนละลายในไขมน คอ วตามน A, D, E และ K

3.2.5.2 วตามนละลายในนา คอ วตามน B ทกชนด และ C

3.2.6 แรธาต (minerals) แบงออกเปน 4 พวก ดงน 3.2.6.1 แรธาตทจาเปน (essential หรอ indispensible elements) ตองมใน

อาหาร แบงออกเปน 2 กลม

3.2.6.1.1 macroelements หรอ major minerals รางกายตองการในปรมาณทคอนขางมากม 7 ตวคอ แคลเซยม (calcium, Ca) คลอรน (chloline, Cl) แมกนเซยม (magnesium,

Mg) ฟอสฟอรส (phosphorus, P) โปแตสเซยม (potassium, K) โซเดยม (sodium, Na) และซลฟอร (sulphur, S)

3.2.6.1.2 microelements หรอ trace minerals รางกายตองการนอยแตขาดไมได ม 7 ตว คอ ไอโอดน (iodine, I) แมงกานส (manganese, Mn) เหลก (iron, Fe) สงกะส (zinc,

Zn) ทองแดง (copper, Cu) โคบอลต (cobalt, Co) และโมลบดนม (molibdinum, Mo)

3.2.6.2 แรธาตทเกยวของกบปฏกรยาในรางกายบางปฏกรยา และยงพสจนไมไดวาจาเปนตองกนเขาไปหรอไม เชน ลเทยม (litium, Li) นคเกล (nickle, Ni) และแคดเมยม

(cadmium, Cd) เปนตน

3.2.6..3 แรธาตไมจาเปน ไมมบทบาทตอสตว แตพบวาในรางกายสตว เชน

อะลมเนยม (aluminium,Al) อารเซนค (arsenic, As) และตะกว (lead, Pb) เปนตน

3.2.6..4 แรธาตทเปนพษ (toxic elements) รางกายอาจตองการในบางครง แตถามมากเกนไปจะทาใหเปนพษ เชน ฟลออไรด (fluorine, F) ซลเนยม (selenium, Se) เปนตน

3.3 วตถทเตมในอาหารสตว (Feed additives)

Association of American Feed Control Officials ใหนยามไววา “Additive หมายถงวตถหรอสารใดๆ จะเปนชนดเดยวกน หรอหลายชนดรวมกนกไดทใชเตมเขาไปในอาหารสตวทผสมจากวตถดบหลก (basic feedstuffs) หรอผสมจากสวนอนเพอใหไดผลตามวตถประสงคอยางใดอยางหนงโดยเฉพาะ” โดยทวไปจะใชผสมลงไปในอาหารสตวในปรมาณทนอยมากๆ เปนปรมาณของสวนในลานสวน เปนตน การใชผสมสารหรอวตถเหลาน ตองมการควบคมวธการผสมดวยความระมดระวงเปนพเศษ feed additives แบงออกไดเปน 2 ประเภทไดแก feed additives ทจดอยในพวกอาหารหลก เชน กรดอะมโนทบรสทธ แรธาต และวตามนตางๆ และfeed additives ทไมไดจดเปนพวกอาหารหลก แตใชเพอวตถประสงคเฉพาะอยาง พวกนสวนใหญจะเปนสารเคมทเตมลงไปเพอใชในการเรงการเจรญเตบโตหรอปองกนการตดเชอจลชพ สารเคมพวกนไดแก ยา

สำนกหอ


16

ปฏชวนะ สารปองกนการตดเชอจลชพ ฮอรโมน เอนไซม ยาถายพยาธ เภสชเคมภณฑ สารอดเมด

สารถนอมคณภาพอาหาร สารปรงแตงกลนรสตางๆ ยาและเภสชเคมภณฑอนๆ เปนตน

3.3.1 ชนดของวตถทเตมในอาหารสตว ตามพระราชบญญตการควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525 [10] ไดกาหนดชอ ประเภทชนดหรอลกษณะของวตถทเตมในอาหารสตวทใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวเพอขายตลอดจนอตราสวนหรอปรมาณทใหใช หรอหามมใหใชวตถนนเกนกาหนดไว ซงปรมาณทเหมาะสมนตองไดรบความเหนชอบจากกรมปศสตวดวย

มการจาแนกวตถทเตมในอาหารสตวเพอใหไดวตถประสงคอยางใดอยางหนงโดยเฉพาะไดเปนหลายชนด ไดแก

3.3.1.1 สารผสมลวงหนา (premix) หมายถง สารปลกยอยกอนผสมหรอผลตภณฑซงประกอบดวยวตถทเตมในอาหารสตวชนดใดชนดหนงหรอมากกวา ผสมกบสอทเหมาะสม โดยมปรมาณของสอไมนอยกวารอยละ 50 ยกเวนวตถทเตมในอาหารสตวในกลมสารเรงการเจรญเตบโต ซงจะตองมสอไมนอยกวารอยละ 80 ทงนผลตภณฑดงกลาวตองมวตถประสงคเพอใชในการผลตเปนอาหารสตว สาหรบไก เปด สกร โค กระบอเทานน และสารผสมลวงหนานน

ไมวาจะมชนดหนงหรอหลายชนดรวมกน เพอผสมกบสอในผลตภณฑทใชเปนอาหารสตว ตองใชในปรมาณทเหมาะสมตามทไดรบความเหนชอบจากกรมปศสตว

3.3.1.2 สอ (Carrier) หมายถง วตถทใชในการเจอจาง หรอใชเปนสวนผสมของวตถทเตมในอาหารสตว และหมายความรวมถงสอประเภทสวนของพชและธญพช ประเภทแรธาต ประเภทกากนาตาล ประเภทผลตผลทเหลอจากการหมก และประเภทอนทไดรบความเหนชอบจากกรมปศสตว

3.3.1.3 วตามน หมายถง วตถทใชเตมในอาหารสตวและใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดทกชนด ในปรมาณทเหมาะสมและกรมปศสตวเหนชอบดวย ตวอยางของวตถประเภทน เชน วตามน A วตามน D วตามน E วตามน K และวตามน C เปนตน

3.3.1.4 แรธาต หมายถง วตถทเตมในอาหารสตวทอยในรปของเกลอของแรธาตตางๆ และใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดทกชนด โดยเมอใชเปนสวนผสมทาเปนอาหารสตวสาเรจรปแลว ตองมชนดของแรธาตบางชนดไดไมเกนปรมาณตามทกาหนดไว วตถประเภทน ไดแก โคบอลต ทองแดง คลอรน ไอโอดน แมงกานส แคลเซยม ซลเนยม ฟลออรน

เหลก แมกนเซยม ฟอสฟอรส กามะถน และโพแทสเซยม

3.3.1.5 กรดอะมโน หมายถง วตถทใชเตมในอาหารสตวและใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดทกชนด ในปรมาณทเหมาะสมและกรมปศสตวเหนชอบดวย

สำนกหอ


17

วตถประเภทน ไดแก ไลซน เมไทโอนนอารจนน ฮสดน ซสตน ทรปโทแฟน เฟนลอะลานน ลวซน

ทรโอนน แวลน ไอโซลวซน ไทโลซน

3.3.1.6 สารเรงการเจรญเตบโต หมายถง วตถทใชเตมในอาหารสตวและใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดทกชนดโดยเมอใชเปนสวนผสมทาเปนอาหารสตวผสมสาเรจรปแลว ตองมชนดของสารเรงการเจรญเตบโตบางชนดไดไมเกนในปรมาณทไดกาหนดไวในสตวแตละชนด วตถประเภทนไดแก avoparcine, chlortetracycline, enramycin, flavophospholipol, lincomycin, mitrovin, oxyttracycline, tyloain, virginiamicin และ zinc-bacitracin

3.3.1.7 สารถนอมคณภาพอาหารสตว หมายถง วตถทใชเตมในอาหารสตวและใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดทกชนดไดในปรมาณท เหมาะสม โดยเมอใชเปนสวนผสมทาเปนอาหารสตวผสมสาเรจรปแลว ตองมชนดของสารถนอมคณภาพอาหารสตวบางชนดไดไมเกนในปรมาณทไดกาหนดไว วตถประเภทน ไดแก

3.3.1.7.1 สารปองกนจลนทรย ไดแก propionic acid, sodium propionate,

calcium proionate, benzoic acid และ sodium benzoate ถาหากตองการใชสารจลนทรยรวมกน ใหใชไดโดยเมอตรวจวเคราะหอาหารผสมสาเรจรปแลว จะตองมอตราสวนหรอปรมาณไมเกนปรมาณสงสดของสารปองกนจลนทรยทกาหนดใหไดสงสดทผสมรวมอยดวย คอ ไมเกนรอยละ

0.3 ตวอยางไดแก benzoic Acid + sodium benzoate ใหใชไดไมเกนรอยละ 0.1

3.3.1.7.2 สารปองกนความหน ไดแก propyl gallate, octyl gallate,

dodecyl gallate, bytylated hydroxyanislol (B.H.A.), bytylated hydroxytoluene (B.H,T.),

ethoxyquin, ethalenediaminetetra acetate (EDTA)

3.3.1.8 สารปรงแตงอาหารสตว หมายถง วตถทใชเตมในอาหารสตวและใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดทกชนดโดยเมอใชเปนสวนผสมทาเปนอาหารสตวผสมสาเรจรปแลว ตองมชนดของสารทใชปรงแตงอาหารสตวบางชนดไดไมเกนในปรมาณทไดกาหนดไว วตถประเภทน ไดแก

3.3.1.8.1 สารเพมกลนและรส ไดแก anise oil, vanilla, monosodium

glutamate, saccharin sodium

3.3.1.8.2 สารชวยอดเมด ไดแก pulverized bentonite, hemicellulose+

lignin, polymethylcarbamide, silicon dioxide

3.3.1.8.3 สารปองกนการเปนกอน ไดแก kaolin, ball clay, calcium

silicate

สำนกหอ


18

3.3.1.9 สารปรบปรงคณภาพซากสตวและผลตภณฑสตว หมายถง วตถทใชเตมในอาหารสตวและใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดทกชนด โดยเมอใชเปนสวนผสมทาเปนอาหารสตวผสมสาเรจรปแลวตองมชนดของสารปรบปรงคณภาพซากสตวและผลตภณฑสตวไดไมเกนในปรมาณทไดกาหนดไว วตถประเภทน ไดแก canthaxanthin, citranaxanthin, carotenoids, capxanthin, lutein, cryptoxanthin, violaxanthin, canthaxanthin,

zeaxanthin, citranazanthin

3.3.1.10 สารเสรมชวนะ (probiotics) หมายถง วตถทใชเตมในอาหารสตวใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดทกชนดในปรมาณทเหมาะสม และกรมปศสตวเหนชอบดวย วตถประเภทน ไดแก yeast, Streptococcus faecium Cernelle68, Lactobacillus planturum,

lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Pediocucius sp.

3.3.1.11 สารเอนไซมหรอสารมฤทธคลายเอนไซม หมายถง วตถทเตมในอาหารสตว และใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวไดในปรมาณทเหมาะสมและกรมปศสตวเหนชอบ ไดแก citric acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, monosodium orthophosphate

3.3.1.12 สารคลายคมหนอนแมลง หมายถง วตถทเตมในอาหารสตว และใหใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตวได โดยเมอใชเปนอาหารสตวสาเรจรป ตองมวตถประเภทนไมเกนปรมาณทกาหนด ตวอยางเชน cyromazine ใหใชในไกไขไดไมเกน 5 มลลกรมตอกโลกรม

และมระยะทใชงดสารนกอนฆาสตวเพอใชบรโภคอยางนอย 7 วน

3.4 อาหารสตวผสมยาสาเรจรป ประกาศกระทรวงสาธารณสข เรอง การกาหนดรายละเอยดเกยวกบหลกเกณฑและวธการในการผลตยาแผนปจจบน ตามกฎหมายวาดวยยา พ.ศ. 2554 [12]

กลาววา “อาหารสตวผสมยา (medicated feeding stuff)” หมายความวา ผลตภณฑทมสวนผสมระหวางผลตภณฑยาสตวกบอาหารสตวทเตรยมขนสาเรจรปพรอมจาหนาย และมงหมายใหนาไปใชใหสตวกนโดยไมตองผานกระบวนการอนใดอก เนองดวยมคณสมบตในการรกษา

ปองกน หรอคณสมบตอน ๆตวอยางเชน ใชเพอการวเคราะหโรค การฟนฟสขภาพ การแกไขหรอดดแปลงหนาททางสรรวทยาในสตว

3.4.1 เปาหมายทใชยาและเภสชเคมภณฑผสมลงไปในอาหารสตว คอ

3.4.1.1 ปองกนและรกษาโรคสตว เนองจากสตวเลยงในรปอตสาหกรรมมเปนจานวนมาก เมอสตวปวย การรกษาจาเปนทจะตองหาวธทสะดวกและรวดเรว พบวาการใหยาโดยวธผสมอาหารเปนวธทใหผลดอยางหนง เพราะสตวจานวนมากไดกนทกตวในเวลาเดยวกน

สำนกหอ


19

ประหยดเวลา ประหยดแรงงาน เชน phenothiazine, thibenzole และ piperazine ใชเปนยาถายพยาธ poloxalene ใชปองกนโรคทองอดในโค ซงการใชจะมขอกาหนดควบคมดวยกฎหมายยา

3.4.1.2 ใชเปนสารเรงการเจรญเตบโต (growth promotor) การใหยาทสามารถทาใหสตวมการเจรญเตบโต มนาหนกเพมขนหรอเพมผลผลตขนไดนนเพอวตถประสงค คอ

3.4.1.2.1 ลดจานวนหรอละลายจลชพทกอใหเกดโรคลดลง ทงๆ ทสตวยงไมแสดงอาการปวยใหเหน

3.4.1.2.2 ทาลายจลชพทสรางพษซงเปนผลในการทาลายการเจรญเตบโตของสตว

3.4.1.2.3 ลดหรอทาลายจลชพทสรางหรอสงเคราะหสารอาหาร แขงกบจลชพทสงเคราะหสารอาหารใหรางกาย

3.4.1.2.4 กระตนจลชพทสงเคราะหสารอาหารใหรางกายเพมมากขน

3.4.1.2.5 ทาใหผนงลาไสบางลง การดดซมสารอาหารกจะดขน

3.4.1.2.6 ลดจลชพทสรางแอมโมเนย หรอ สารพษทไดจากการทาลายไนโตรเจนในลาไสซงถามสารภาพพวกนมากสตวจะเจรญเตบโตไมด

3.4.1.2.7 ทาใหสตวมความตองการนาและอาหารมากขน ลาไสของสตวกจะชมนามากขน

3.4.2 ผลของการใชยาและเภสชเคมภณฑเปนเวลานาน การใชยาและเภสชมภณฑผสมลงไปในอาหารสตวใหสตวกนกจะมผลขางเคยงหลายอยางซงอาจสงผลถงสขภาพและอนามยของสตวและมนษยดวย พบวาถาเลยงสตวโดยใหกนยาปฏชวนะนานๆจะเกดผลคอ

3.4.2.1 จลชพในรางกายสตวเกดดอตอยาทใช และจลชพเหลานสามารถทาใหมนษยเกดโรคไดดวย เมอสตวหรอมนษยปวยจะไมสามารถใชยานนรกษาไดอก

3.4.2.2 สตวเกดอาการแพยาบางชนด และยานนสามารถสะสมอยในเนอสตว ตกคางถงมนษยไดดวย และมนษยกอาจแพยาไดโดยไมรตว

3.4.2.3 เกดปฏกรยาของรางกายตอยานนในทางตรงกนขาม (drug adverse

reaction) ทาใหการวนจฉยโรคของมนษยและสตวผดไปจากความเปนจรง

3.4.2.4 ยาบางชนดกอใหเกดเซลลมะเรงไดทงในมนษยและสตว 3.4.2.5 มการเปลยนแปลงกระบวนการ metabolism ในรางกายของสตวนนๆ

การใชยาผสมในอาหารสตวจงมความสาคญอยางมาก ทงในแงเศรษฐกจ และสขภาพอนามยของมนษยและสตว หลายประเทศจะมการจากดการใชยาผสมในอาหารสตว โดยเฉพาะใชในรปสารเรงการเจรญเตบโต และจะมการควบคมจากดชนดและวธใชอยางเขมงวด โดยเฉพาะใน

สำนกหอ


20

กลมประเทศ E.E.C. จะยอมใหใชยาปฏชวนะผสมในอาหารสตวไดเฉพาะยาทไมใชปองกนและรกษาโรคในมนษยเลย โดยจะตองกาหนดปรมาณทใช ระยะงดใชยากอนสงโรงฆา สาหรบในประเทศอนถงแมจะมความแตกตางกนบางในวธการใช แตหลกการทวไปกคลายกบกลม E.E.C.

4. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

4.1 หลกการทางานของเครอง HPLC

HPLC หรอโครมาโทกราฟฟของเหลวสประสทธภาพสงเปนเทคนคการวเคราะหสารเชงคณภาพ (qualitative analysis) และเชงปรมาณ (quantitative analysis) ทนยมใชมากวธหนง โดยสามารถใชกบงานดานตางๆไดอยางกวางขวาง เชน ในการวเคราะหทางอาหาร ยา ยาฆาแมลง การแพทย สมนไพร และสงแวดลอม เปนตน เทคนคนสามารถตรวจวเคราะหสารทมปรมาณตาๆไดในระดบไมโครกรม (μg) ถงพโคกรม (pg) เมอเลอกใชเครองตรวจวดทเหมาะสม HPLC เปนเทคนคแยกสารผสมแบบใชเครองสบแรงดนสง (high pressure pump) สบตวทาละลายซงทาหนาทเปนเฟสเคลอนท (mobile phase) พาสารตวอยางทถกฉดเขาทางชองฉดสาร(injector) ผานอนภาคทเปนเฟสอยกบท (stationary phase) ซงบรรจอยในคอลมน (column) สารผสมตวอยางจะเคลอนทผานคอลมนและถกแยกออกมา ผานเขาสเครองตรวจวด(detector) ในเวลาทตางกน สญญาณทวดไดจะอยในรปสญญาณไฟฟาตามเวลาและปรมาณของสารแตละตวทตรวจวดได จากนนสญญาณจะถกสงไปยงเครองบนทกสญญาณ เพอแสดงผลออกมาเปนโครมาโทแกรม (chromatogram)

หลกการแยกของสารคอ ของเหลวความดนสงจะสรางแรงพา(impelling force) ดนสารตาง ๆ ในสารตวอยางผานไปบนตวกลางทไมเคลอนท เรยกวา เฟสอยกบท (stationary phase) ซงเฟสอยกบทจะสรางแรงหนวง (retention force) ตอสารชนดตางๆ แรงนจะแตกตางกนขนอยกบ

ขนาด รปราง ประจความจาเพาะ (specificity) การดดซบ(adsorption) การละลาย(solubility) ดงนนความแตกตางกนของแรงหนวง จงทาใหโมเลกลของสารแตละชนดเคลอนทออกมาจากคอลมนในเวลาหนวง (retention time) ทแตกตางกน

4.2 องคประกอบของเครอง HPLC

รปรางของเครองมอจะแตกตางกนไปตามบรษทผผลตแตมองคประกอบหลกทสาคญเหมอนกน [13] ดงแสดงในรปท 2.3 คอ

สำนกหอ


21

รปท 2.3 องคประกอบทสาคญของเครองโครมาโทกราฟฟของเหลวประสทธภาพสง

ทมา : ชชาต อารจตรานสรณ. โครมาโทกราฟเหลวความดนสง. เขาถงเมอวนท 6 เมษายน 2556.

เขาถงไดจาก http://home.kku.ac.th/chuare/12/HPLC.pdf

4.2.1 solvent (mobile phase) เปนตวแปรทมความสาคญมากในการแยกสารตวอยางออกเปนองคประกอบยอย solvent ทใชเปน mobile phase ใน HPLC ไดแก organic solvent

รวมทง aqueous solution ของเกลอชนดตาง คณสมบตทสาคญบางประการของ mobile phase ทใชใน HPLC ไดแก

4.2.1.1 ไมทาปฏกรยากบ column หรอ packing material

4.2.1.2 สามารถละลายสารตวอยางได 4.2.1.3 ปราศจากอนภาคเลกๆ (ทาใหเกดการอดตนใน column เปนการเพม

ความดนในระบบ) และสารละลายตวอยางทกชนดกอนการวเคราะหโดยใช HPLC ควรกรองผานกระดาษกรองทมรพรนขนาด 0.45 – 0.5 μm

4.2.1.4 บรสทธปราศจากสงเจอปนซงรวมถงพวก preservative และ stabilizer

ตางๆ สาหรบนากลนจะตองปราศจากสารอนทรยและแบคทเรยตางๆ

4.2.1.5 เหมาะสมกบชนดของ detector ทใช

22

4.2.2 pump ทาหนาทสบ mobile phase เพอสงเขาส column ในอตราเรวทเลอกใช ความดนของระบบจะขนอยกบอตราการเคลอนทของ mobile phase (ถาความเรวสงจะทาใหเกดความดนสง) นอกจากนยงขนอยกบ viscosity ของ mobile phase ขนาดของ packing material และความยาวของ column อกดวย โดยปกตความดนทใชมกไมเกน 4,000 psi pump สามารถแบงออกไดเปน 2 แบบ

4.2.2.1 isocratic pump ใชอตราสวนของ mobile phase ไดคงทตลอดเวลา 4.2.2.2 gradient pump เปน pump ทสามารถควบคมการเปลยนแปลง

อตราสวนของ mobile phase ไดตามเวลาทกาหนด

4.2.3 injector เปนอปกรณทใชควบคมปรมาตรของสารตวอยางทไหลเขาสcolumn ซงสวนใหญจะอยในชวง 0.5-10 μL สามารถแบงออกไดเปน 2 ชนด คอ

4.2.3.1 ชนดไซรงก เปนชนดทใชไซรงกขนาดเลกดดสารตวอยางตามปรมาตรทตองการฉดผานเยอกน (septum) ซงมกเปนยางซลโคนดานบนคอลมน ตวฉดชนดนอาจมการรวบรเวณรทฉดเพราะคอลมนมความดนสง

4.2.3.2 ชนดโรตาร (rotary type) เปนชนดทใชลนควบคมการฉดสารตวอยางเขาคอลมน โดยในขนตอนแรกจะใชไซรงกฉดสารตวอยางเขาไปในทอพกสารตวอยาง (sample

loop) ซงมปรมาตรคงท (fixed loop injector) (รปท 2.4 ก) หลงจากนนจงหมนลนใหสารละลายซงเปนเฟสเคลอนทไลของเหลวทงหมดลงสคอลมน (รปท 2.4 ข) นอกจากนยงสามารถดดสารตวอยางเขาไปในปรมาตรทตองการฉดเขาไปในทอพกสารตวอยางซงมสารละลายอยกอนแลวบางสวน เมอหมนลนไปทตาแหนงฉด (syringe loop injector) สารละลายจะพาสารตวอยางทงหมดเขาไปในคอลมน [13]

4.2.4 column อาจทาจากแกว พลาสตก หรอเหลกกลาไรสนม มความยาวในการใชงานตงแต 10-150 cm เสนผานศนยกลางประมาณ 1- 25 mm ในงานวเคราะหใชขนาด 1 – 5 mm column ม 2 ชนด คอ

4.2.4.1 analytical column มความยาวประมาณ 10 - 30 cm เสนผานศนยกลางอยในชวง 4 - 10 mm วสดทใชทาภาชนะบรรจ เชน stainless steel polyethylene แกว เปนตน สาหรบสวนทเปน packing material ทบรรจอยภายใน ไดแก silica based resins bonded phases

เปนตน

4.2.4.2 guard column นยมตอระหวางสวน injector และกอน analytical

column ซงจะทาหนาทกรองอนภาคหรอสงสกปรกทปนเปอนมากบสารตวอยางรวมทงตวทา

สำนกหอ


23

ละลาย เพอชวยยดอายการใชงานของ analytical column สวนทเปน packing material จะคลายคลงกบ analytical column

รปท 2.4 ทอทางเดนของลนในตาแหนงรอ(wait)(ก) และในตาแหนงฉด(inject)(ข)



4.2.5 detector มหนาทวดปรมาณของสารเพอสงใหเครองบนทกผลทาการบนทกคาและแสดงกราฟของสารชนดตางๆ detector มหลายชนดขนอยกบประเภทของสารทตองตรวจวดตวอยางเชน ตวไวแสง (photo detector) ใชสาหรบการวดสารทมสหรอมความขน ตววดแสงฟลออเรสเซนซ (fluorescence detector) ใชสาหรบวดปรมาณสารทสามารถเปลงแสงฟลออเรสเซนซได ตววดดชนหกเห (refractive index detector) ใชสาหรบวดสารละลายทใสและมตวถกละลายอย ตววดกมมนตภาพรงส (radioactivity detector) ใชสาหรบวดสารกมมนตรงส detector แตละชนดมความไวและขอจากดในการใชงานแตกตางกน ดงตารางท 2.4 [13]

24

ตารางท 2.4 คณสมบตของ detector ชนดตางๆ

ชนด

ความไว

(g/mL)

ผลของ

อณหภม ผลของอตรา การไหล

หมายเหต

UV absorption 5x10 -5 นอย ไมมผล นยมใชในชวง 254-280 nm

IR absorption 10 -6 นอย ไมมผล -

Fluorometry 10 -10 นอย ไมมผล -

Refractive index 5x10 -7 - ไมมผล วดความแตกตางดชนหกเหของ

สารตวอยางและเฟสเคลอนท Conductivity 10 -8 ±1 0 ºC มผล -

Flame ionization 10 -8 ไมมผล มผล สารตวอยางถกเผาใหเปน

ไอออน และถกจบโดยแอโนดเพลท

Mass spectrometry 10 -10 ไมมผล ไมมผล วเคราะหสารไดถง 0.2-1.0 ng



4.2.6 เครองบนทกผล (recorder) ใชสาหรบแสดงตาแหนงของสารทออกมาจากคอลมนเพอประโยชนในการจาแนกชนดของสารหรอคานวณหาปรมาณสาร ซงสามารถคานวณไดจากความสงของยอดพค (peak high) หรอพนทใตพค (peak area)

5. การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ (method validation)

การตรวจสอบความใชได ตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025 : 2005 [15] หมายถง การยนยนโดยการตรวจสอบและจดทาหลกฐานทเปนรปธรรม เพอแสดงวาขอกาหนดพเศษตางๆ

สาหรบการใชตามทตงใจไวโดยเฉพาะสามารถบรรลผลไดครบถวน method validation จะครอบคลมถงสมบตของวธการวเคราะห ดงน

5.1 ความถกตอง (accuracy)

accuracy หมายถง ความถกตองของวธการวเคราะหทวดไดคาใกลเคยงกบคาทแทจรงมากทสด แสดงวาการวเคราะหนนมความถกตองสง (high accuracy) แตถาคาทวดไดหางไกลจากคาจรงแสดงวาการทดสอบนนมความถกตองนอย (low accuracy) การหา accuracy ทาไดโดย

25

5.1.1 วเคราะห CRM (Certified Reference Material) อยางนอย 7 ซา และนามาคานวณหาระดบความถกตองในรปของความผดพลาดสมพทธ (relative error) หรอความถกตองสมพทธ (relative accuracy)

เกณฑการยอมรบโดยทวไปของ relative error คอไมเกน 10% relative accuracy อย

ระหวาง 90 ถง 110 % สาหรบคา relative error ระดบความถกตองยงขนอยกบความเขมขนของสารตวอยางทวเคราะห ดงตารางท 2.5 [14]

ตารางท 2.5 ระดบความถกตองของการวเคราะหตวอยางทระดบความเขมขนตางกน

ทมา : AOAC International. (2002). “Requirements for Single Laboratory Validation of Chemical

Method.” AOAC International. Accessed April 6, 2013. Available from

http://www.aoac.org/Ag_ Materials/additives/aoac_slv.pdf

การหาระดบความถกตองโดยการวเคราะห CRM นอกจากพจารณาจากคา relative

error และ relative accuracy แลว อาจใชการเปรยบเทยบคาทวเคราะหได (7ซา) ของ CRM กบคาทแทจรงของCRM โดยใชสถต t-test การทดสอบคา t-test ทาโดยการเปรยบเทยบคา t จากการคานวณ กบคา tจากตาราง (critical t-value ; tc)

26

= คาเฉลยของ CRM ทวเคราะหได μ = คาทแทจรงของ CRM

SD = คาเบยงเบนมาตรฐาน (standard deviation)

n = จานวนครงททาซา

tc ดไดจากตาราง t – distribution ซงคา tc ขนอยกบระดบความเชอมน และคา degree

of freedom (df = n-1) ถาคา t ทไดจากการคานวณมากกวา tc แสดงวาคาทแทจรงของ CRM กบคาทวเคราะหไดมความแตกตางกนอยางมนยสาคญ แตถาคา t ทไดจากการคานวณมคานอยกวา tc แสดงวาคาทแทจรงของ CRM กบคาทวเคราะหได ไมมความแตกตางอยางมนยสาคญ

5.1.2 ในกรณทไมสามารถหา CRM ทเหมาะสมในการวเคราะหได สามารถจะหา estimated accuracy ไดโดย การหาคาเปอรเซนตการคนกลบ (%recovery) โดยใชตวอยางทเตมสารมาตรฐาน(spiked sample) ซงจะมขอจากดวา accuracy ทไดนนครอบคลมเฉพาะขนตอนทวเคราะห spiked sample เทานน การทา recovery จะทา 3 ระดบความเขมขน

เกณฑการยอมรบขนอยกบความเขมขนของตวอยาง เกณฑการยอมรบ %recovery เพอใชเปนแนวทางในการทดสอบตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC nternational [16] แสดงในตารางท 2.6

27

ตารางท 2.6 เกณฑการยอมรบ %Recovery ตามมาตรฐานทางอาหารและยา

ความเขมขน recovery limit, %

100 % 98-101

10 % 95-102

1 % 92-105

0.1 % 90-108

0.01 % 85-110

10 μg/g (ppm) 80-115

1 μg/g (ppm) 75-120

10 μg/kg (ppb) 70-125




5.2 การตรวจสอบความเทยง (precision)

ความเทยงจะแสดงในรปของ repeatability ไดแก repeatability standard deviation (s)

หรอ relative standard deviation (RSD) [17] โดยดาเนนการ ดงน

5.2.1 ทาการทดสอบตวอยางซาในชวงความเขมขนทครอบคลมชวงการใชงาน

ความเขมขนละ 10 ซา (ไมนอยกวา 7 ซา) ใชขอมลชดเดยวกบการหาความแมนได โดยใชผลการทดสอบวสดอางองรบรอง หรอ spiked/fortified sample

5.2.2 ทดสอบอยางนอย 3 ความเขมขน คอ ความเขมขนตา กลาง สง หรอระดบความเขมขนท LOQ (ถามการหา LOQ) และหรอ 0.5 เทา 1.0 เทา 1.5 เทา (หรอ 2.0 เทา) ของคาความเขมขนทกาหนด (target concentration)

5.2.3 คานวณคา repeatability ตามทวธมาตรฐานแสดงขอมลไว เชน repeatability

standard deviation (s) หรอ relative standard deviation (RSD)

5.2.4 นาคาทไดไปเทยบกบเกณฑทกาหนด ใหเลอกวธใดวธหนง ดงน

5.2.4.1 วธท 1 เกณฑการยอมรบทถกกาหนดไวแลว ไดแก ขอกาหนดตามกฎหมายขอกาหนดของลกคา ตามวธมาตรฐานกาหนด เชน คา repeatability ของหองปฏบตการในแตละความเขมขน ควรมคานอยกวาหรอใกลเคยงกบคา reproducibility ทวธมาตรฐานกาหนด

28

5.2.4.2 วธท 2 การประเมนผลตาม Horwitz equation ใหนาคาการคานวณ

RSD จากการทดสอบซา มาเปรยบเทยบกบ RSD จากการคานวณใน สตรของ Horwitz equation ซงเปนสมการท Dr. William Horwitz แหงสถาบน AOAC ไดทาการศกษาขอมลการทา collaborative

study จากเอกสาร มากกวา 4,000 ฉบบ [16] โดยสรปเปนสมการ Horwitz equation ดงน

จากสมการ Horwitz equation ขางตน เมอคานวณ RSD ทความเขมขนตางๆ จะไดคา Predicted Horwitz [16] ดงตารางท 2.7

ตารางท 2.7 ความสมพนธระหวางคาความเขมขนกบ Predicted Horwitz จากการทดสอบซา

Concentration Conc. Ratio : C Predicted Horwitz

RSDR RSDr

100 % 1 2.0 1.3

10 % 0.1 2.8 1.9

1 % 0.01 4.0 2.6

0.1 % 0.001 5.7 3.7

0.01 % 0.0001 8.0 5.3

10 ppm 0.00001 11.3 7.5

1 ppm 0.000001 16.0 10.6

10 ppb 0.0000001 22.6 14.9

(RSDR = ทดสอบซาจากหลายหองปฏบตการ และ RSDr = ทดสอบซาในหองปฏบตการเดยวกน)




29

เกณฑการยอมรบความเทยงตาม Horwitz equation คอ คา RSD จากการทดสอบ/ทดลอง

ตองนอยกวา RSD จากสตรในการคานวณ ตามสมการ Horwitz equation แตถา RSD จากการทดสอบ/ทดลอง มากกวา RSD จากสตรในการคานวณ ใหหาคา HORRAT จากสตร ดงน

ซงคาท AOAC ยอมรบ คอ HORRAT นอยกวาหรอเทากบ 2 และคาท EU, Codex ยอมรบ

คอ HORRAT นอยกวา 2

5.3 การหาคา LOD และ LOQ ( limit of detection and limit of quantitation )

LOD (limit of detection) หมายถง คาความเขมขนตาสดทวเคราะหไดในตวอยางทสามารถตรวจวดได และ LOQ (limit of quantitation ) หมายถง คาความเขมขนตาสดทวเคราะหไดในตวอยางทสามารถหาปรมาณหรอรายงานผลโดยม accuracy และ precision ทยอมรบได [14]

LOD และ LOQ หาไดโดยการวด blank ของตวอยาง (sample blank) อยางนอย 7 ซา และนามาคานวณหาคาเฉลย และคา SD

LOD = คาเฉลยของ sample blank + 3 SD

LOQ = คาเฉลยของ sample blank +10 SD กรณ sample blank หาคาไมได ใหเตมสารมาตรฐานทคาความเขมขนตาๆ ลงใน

sample blank ทาอยางนอย 7 ซา หาคา SD

LOD = 3 SD

LOQ = 10 SD กรณไมสามารถหา sample blankได ใหนาตวอยางทมความเขมขนตาๆมาวเคราะห ทา

อยางนอย 7 ซา หาคา SD

LOD = 3.14 SD (กรณทา 7 ซา) LOQ = 10 SD

5.4 ความสมพนธเชงเสนตรงและชวงความเขมขนททดสอบ (linearity and range)

linearity หมายถง ความสามารถของวธการวเคราะหทจะทาใหวเคราะหแลวไดผลการวเคราะหทเปนสดสวนกบความเขมขนของสารทวเคราะหในชวงความเขมขนทกาหนด

30

range หมายถงชวงความเขมขนของสารทจะวดตงแตความเขมขนตาสดถงความเขมขนสงสดทวดแลวม accuracy precision และ linearity อยในระดบทมความถกตองยอมรบไดตามขอกาหนด

linearity ทาโดยการวเคราะห CRM หรอ sample blank ทเตมสารมาตรฐานใหมความเขมขนอยางนอย 5 ระดบความเขมขนตงแตนอยไปจนมากทสด วเคราะหหาคาสญญาณ เทยบเปนความเขมขน ทา 3 ซาแตละระดบความเขมขน นาคาทไดมาเขยนกราฟเสนระหวางคาสญญาณกบคาความเขมขน และคานวณหาคาสมประสทธสหสมพนธ(correlation coefficient, r) เกณฑการยอมรบไดโดยทวไปคา r จะตองมคาอยระหวาง 0.995 – 1.000 range ทาโดยการวเคราะหตวอยางทตองการหาปรมาณสารในชวงความเขมขนตางๆ กน และ คานวณคาความเขมขนในชวงทให accuracy และ precision ทยอมรบได หรอทาการวด CRM ทมความเขมขนตางๆ[14]

5.5 สภาพไว (sensitivity)

sensitivity หมายถง ความสามารถในการวดความเขมขนทแตกตางกนนอยทสด

วธการวเคราะหทมความไวสงจะสามารถตรวจวเคราะหสารในปรมาณนอยมากหรอเปนวธทสามารถแยกความเขมขนของสารทแตกตางกนนอยมากไดถกตอง sensitivity (S) ของวธทดสอบหรอของเครองมอเปนอตราสวนของการเปลยนแปลงของสญญาณ (response) R ตอการเปลยนแปลงความเขมขน(concentration) C

S = dR/dc

R = f (C)

ถาเขยนกราฟระหวาง R หรอ dR/dc กบ C จะไดกราฟเสนตรงนนคอ R = kc แสดงวาสภาพไวจะมคาคงทตลอดชวงความเขมขน ถา slope(k)ชน แสดงวามสภาพไวสง (high sensitivity)

ดงนน sensitivity ของการวเคราะหหาไดจากคา slope ของ calibration function

5.6 ความจาเพาะ (selectivity หรอ specificity )

selectivity หมายถง ความสามารถของวธวเคราะหทจะวเคราะหเฉพาะสารทตองการจะวเคราะห โดยทสารนนเปนเพยงสวนประกอบหนงในสารละลายนน ๆ หรอวธการวเคราะหทมความสามารถในการเลอกวดเฉพาะสารทตองการจะวด จงกลาวไดวาวธวเคราะหนนมความจาเพาะ(specific) การศกษา specificity ของวธการวเคราะหทาไดโดยการวเคราะหตวอยางทมหรอเตมสารรบกวนอน แลวตรวจสอบดวาสารรบกวนเหลานนมผลกระทบตอการวเคราะหหรอไม และสาร

สำนกหอ


31

รบกวนเหลานนทาใหการตรวจวด หรอการหาปรมาณสารทตองการทราบผดไป (มากขนหรอนอยลง ) หรอไม

5.7 ความคงทน ( ruggedness)

ruggedness บางครงอาจจะใชคาวา robustness หมายถง ความคงทนของวธการทดสอบทแมวาจะทาในหองปฏบตการทตางกน กใหผลการทดสอบทมความคลาดเคลอนเพยงเลกนอย หรออาจจะไมมผลกระทบตอผลการวเคราะหอยางมนยสาคญ การทดสอบหา ruggedness

ของวธการวเคราะหทาโดยการเปลยนแปลงวธการวเคราะหใหตางไปจากเดมเลกนอยและสงเกตการเปลยนแปลงทเกดขนตามมา การเปลยนแปลงวธวเคราะห ไดแก สงแวดลอม เวลา อณหภม pH

เปนตน และการเปลยนแปลงทเกดขนจะประเมนจากคา accuracy และ precision

6. งานวจยทเกยวของ

Colistin ไดรบความสนใจจากผวจยหลายกลมโดยวตถประสงคการวจยเพอศกษาและระบองคประกอบของ colistin และเพอพฒนาวธการหาปรมาณ colistin ในตวอยางชนดตางๆ เชน เนอ ตบ ไต นม และผลตภณฑทไดจากสตวจาพวกไก สกรและวว เปนตน ซงงานวจยทเกยวของมดงน

Shoichi Yamatani[18] ใชเทคนค ทางจลชวะวทยา (microbiological assay) ในการหาปรมาณ colistin ใน premix โดยสกดตวอยางดวย 1 M hydrochloric acid (หลงจากนนปรบ pH

เปน 5.9 - 6.1, แลวเจอจางดวย buffer ได % recovery ในชวง 95 – 104 % และ %RSD ตากวา 5.1 ทระดบความเขมขนในชวง 0.5 -10 g/kg ซงเทคนค microbiological assay นเปนเทคนคทงายสาหรบการวเคราะหหาความเขมขนของ colistin แตมขอเสย คอ sensitivity ตาและใชเวลานาน[19] และมผวจยไดเลอกใชหลากหลายวธในการวเคราะห colistin sulfate ไดแก paper chromatography[4],

thin layer chromatography[20], isotachophoresis[21], electrophoresis[22] and liquid

chromatography[23] เทคนค liquid chromatography เปนเทคนคหลกทถกนามาใชในการวเคราะหและแยก

องคประกอบทผสมกนของ colistin งานวจยทผวจยไดนามาพฒนาประยกตใชในการหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางอาหารสตว มดงน

Orwa และคณะ[5] ประสบความสาเรจในการแยกองคประกอบหลกของ colistin คอ colistin A colistin B และองคประกอบทมปรมาณนอยของสารผสม colistin โดยใช a YMC Pack

Pro, C-18 column มสารละลาย mobile phase เปน acetonitrile - sodium sulphate (0.7% m/v) -

สำนกหอ


32

phosphoric acid (6.8% v/v) –water (21.5:50:5:23.5) ทอตราการไหลเทากบ 1.0 mL/min ตรวจวดดวยเทคนค UV detection ทความยาวคลน 215 nm

วธวเคราะหของ European Pharmacopoeia 5.0[24] แนะนาวธการ แยกสารผสม colistin โดยใชสารสารละลาย mobile phase เปน acetonitrile - sodium sulphate buffer pH 2.3-2.5

(22/78,v/v) บน C18 column และตรวจวดทความยาวคลนเดยวกบ Orwa Cancho-Grand และคณะ[23] รายงานถงประโยชนในการใชเทคนค solid phase

extraction (SPE) ในการกาจดโปรตนและกรดอะมโนทรบกวนการวเคราะหหาปรมาณ colistin ในอาหารสตว ซง Cancho-Grand และคณะไดทาการทดสอบประสทธภาพของวธโดยทดลองกบอาหารสตวทผสม colistin สาเรจรปทมขายในทองตลาดพบวา SPE ชวยในการกาจด matrix

interferences ไดด ทาใหวธนม selectivity ด

Li และคณะ[25] ไดพฒนานาเทคนคการตรวจวดแบบ fluorometric detection มาวเคราะหหาปรมาณ colistin ในตวอยางเลอดมนษย โดยการสกด colistin ดวย SPE C18 cartridge

และเตม 9-fluoranylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) ลงใน SPE C18 cartridge เดยวกนน เพอสรางสารทสามารถตรวจวดไดดวยเทคนค fluorometry ซงเปนครงแรกทมการนา FMOC-Cl มาใชเปน derivatizing reagent ในการวเคราะหหาปรมาณ colistin

นอกจากการนยมเลอกใช UV และ fluorometric detection เปนเทคนคการตรวจวดแลว อกเทคนคหนงทนยมนามาใชกนมาก คอ mass spectrometric detection เนองจากเปนเทคนคทม selectivity และ sensitivity สง ดงเชน ในป ค.ศ. 2005 Sin และคณะ[26] ไดพฒนาวเคราะหปรมาณ colistin ในนมวว โดยใชเทคนค electrospray LC–MS/MS detection ซงโปรตนในตวอยางนมววจะถกตกตะกอนดวยกรดผสม trichloroacetic – formic acid กอนการวเคราะห ถดมาในป ค.ศ.2006

ผวจยคณะเดยวกน[27]ไดใชเทคนคพฒนาเทคนคโดยสกดตวอยางนมววและเนอสตว ดวย

hydrochloric acid แลวกาจดตวรบกวนและเพมความเขมขนของตวอยางกอนวเคราะหโดยใช Phenomenex Strata-X cartridges ซงอกกลมวจยทไดนาเทคนค LC-MS/MS มาใชวเคราะห คอ

Cheng และคณะ[28] พวกเขาไดหลกเลยงทจะใชกระบวนการ derivatization และ SPE แตไดเลอกใช trichloroacetic acid (TCA) เพอตกตะกอนโปรตนทรบกวนการวเคราะห colistin ในตวอยางเลอดหน ผลการทดลองพบวาเทคนคนมความไว ความถกตอง และแมนยา โดยไมตองการเตรยมตวอยางทยงยากมากนก

จากงานวจยทไดกลาวถงนนสวนมากใชเทคนค HPLC ในการวเคราะหหาปรมาณ colistin แตกตางกนเพยงการเลอกใชเทคนคการตรวจวด การเลอกใช fluorimetric detection ในการตรวจวด จาเปนตองมกระบวนการ derivatization ซงหากในขนตอนนควบคมการเกดปฏกรยาไมด

สำนกหอ


33

อาจสงผลตอความแมนยา (reproducibility) ของการวเคราะหได สวนเทคนคการตรวจวดดวย mass

spectrometric detection แมจะม sensitivity สง แตเครองมอ LC-MS/MS ราคาสงมาก ดงนนเทคนคการตรวจวดแบบ UV detection ทมราคาถก เปนเครองมอพนฐานทสวนมากพบไดในหองปฏบตการดานเคม จงมความเหมาะสมทจะนามาพฒนาสาหรบใชในการวเคราะหหาปรมาณ colistin ในยาสตวและอาหารสตว เพอนาไปใชประโยชนจรงในหองปฏบตการควบคมคณภาพการผลตอาหารสตวในโรงงานตอไป

นอกจากนในผวจยนไดศกษางานวจยทเกยวของกบการหาปรมาณ colistin ในตวอยางชนดตางๆโดยใชเทคนค HPLC แลวรายงานสรปมาดงตารางท 2.8

ตารางท 2.8 งานวจยทเกยวของในการหาปรมาณ colistin ในตวอยางชนดตางๆ

Year Samples /

propose

Mode of

detection Mobile phase Sample pretreatment Ref.

2000

Separate

components

of colistin

UV

Acetonitrile:

sodium sulfate(0.7% v/v):

phosphoric acid (6.8% v/v):

water (21.5:50:5:23.5:.5)

- [5]

2003

Separate

components

of colistin

UV Acetonitrile: 1.2 mM sodium

sulfate (70:30) - [31]

2005

Separate

components

of colistin

UV

30 mM Na2SO4 buffer

(adjusted to pH 2.3-2.5 with

H3PO4): acetonitrile (76:24, v/v)

- [24]

1998 Feed Fluorescence

Acetonitrile: aqueous sodium

sulphate: triethylammonium

phosphate (pH 2.8)

Extraction by HCl [32]

2001 Medicated

feed Fluorescence Acetonitrile : water (75: 25, v/v)

Extraction by HCl

and SPE method [23]

Ref. = references

34

ตารางท 2.8 (ตอ)

Year Samples /

propose

Mode of

detection Mobile phase Sample pretreatment Ref.

2001 Plasma Fluorescence Acetonitrile: THF: water

(87:4:13, v/v)

Extraction by

MeOH-TCA and

SPE method

[25]

2005 Feed Fluorescence Acetonitrile : water (75: 25, v/v)

Dynamic

ultrasound-assisted

extraction by

50% methanol

[33]

2005 Milk LC-MS/MS

Elution program of

ammonium formate buffer

(saturated ammonium formate:

formic acid: acetonitrile: water,

1:5:50:950, v/v/v/v)

and 0.1% formic acid in

acetonitrile

Milk samples were

deproteinized and

extracted with a

mixture of

TCA/formic acid

[26]

2006

Milk and

animal

tissues LC-MS/MS

A mixture of 0.1% formic acid in

water and 0.1% formic acid in

acetonitrile in a gradient elution

Extraction by HCl

and SPE method [27]

2010 Plasma LC-MS/MS

A mixture of 0.1% formic acid in

water and 0.1% formic acid in

acetonitrile in a gradient elution

TCA was used as

protein precipitating

reagent

[28]

2009

Quantitation

of colistin

sulfate

Evaporative

light scattering

detection

A binary mixture of 37.5 mM

TFA in water and 37.5mM TFA

in acetonitrile in a gradient

elution

- [34]

Ref. = references

16

35

บทท 3 วธดาเนนการวจย

1. เครองมอ อปกรณ สารเคมและตวอยางทใชในการทดลอง

1.1 เครองมอและอปกรณทใชในการทดลอง ตารางท 3.1 เครองมอ อปกรณและแหลงทมาของเครองมอทใชในการทดลอง

เครองมอและอปกรณ แหลงทมาของเครองมอทใชในการทดลอง

HPLC system ประกอบดวย Waters delta 600 controller,

Waters 600E pump, Waters 2487 dual wavelength

absorbance detector และ Empowers software

Waters

Guard column รน KJ0-4282 cartridge system Phenomenex

Zorbax Eclipse XDB C18 column Agilent Technologies

UV-Vis spectrophotometer รน 61103A HEWLETT PACKARD

Hot plate & Magnetic stirrer M 22/1 Framo®- Gerätetechnik

Canivator Ultrasonic Cleaner Mettler Mlectronic Corporation

Vortex mixer รน G-560E Vortex-Genie Analytical Balance OHAUS

Centrifuge รน MIKRO 22R Hettich zentrifugen

pH meter METTLER TOLEDO

Sep-Pak plus 360 mg C18 Waters Corporation

Phenomenex Strata-X cartridges Phenomenex

Syringe 3mL Nipro(Thailand) Corp., Ltd Verticlean Nylon Syringe Filter, 13mm, 0.45μm Vertical chromatography Co.,Ltd

Nylon Membrane Filters Agela Technologies

เครองปน Panasonic รน MX-795N Panasonic

36

1.2 สารเคมทใชในการทดลอง 1.2.1 สารมาตรฐาน Colistin sulfate

สารมาตรฐาน Colistin sulfate ไดรบสนบสนนจาก บรษทไทยเมจฟารมาซวตคล จากด (Thai Meiji pharmaceutical Co., Ltd.) โดยสารมาตรฐานนมลกษณะเปนผงละเอยด สขาว และมฉลากกากบความบรสทธของสารเทากบ 99.98%

1.2.2 สารมาตรฐาน Gentamicin sulfate สารมาตรฐาน Gentamicin sulfate ทใชในการทดลองนใชเปนยาสาหรบฉดสตว

(injection form) ของบรษท General drug house Co., Ltd. โดยสารมาตรฐานทใชนเปนสารละลายใส บนฉลากกากบยาระบความเขมขนเทากบ 40,000 mg/L

1.2.3 สารเคมอนๆ ทใชในการทดลอง ตารางท 3.2 รายชอสารเคม แหลงทมาและเกรดทใชในการทดลอง

สารเคม แหลงทมา เกรด Sodium sulfate anhydrous Fluka Purum p.a.≥99.0%

Phosphoric acid Fluka Purum p.a.≥99.0%

Trifluoric acid Fluka Purum p.a.≥98.0%

Acetronitrile SIGMA-ALDRICH HPLC grade Methanol Merck Analytical grade

Hydrochloric acid Merck Analytical grade

รปท 3.1 สารมาตรฐาน Gentamicin sulfate ทใชในการทดลอง

37

1.3 ตวอยางยาสาหรบผสมอาหารสตว (medicated premix) และตวอยางอาหารสตวผสมยาสาเรจรป (medicated feed)

1.3.1 ตวอยาง medicated premix ซอมาจากรานจาหนายยาสตวในจงหวดนครปฐมจานวน 4 ตวอยาง แสดงในตารางท 3.3

ตารางท 3.3 ตวอยาง medicated Premix บรษทผผลตและปรมาณ colistin sulfate ทระบบนฉลากยา

ตวอยาง medicated premix บรษทผผลต ปรมาณ colistin ทระบบน

ฉลากยา (%w/w) A Nutrichem Co., Ltd. 10

B MacroPhar Co., Ltd. 2

C General drug house Co., Ltd. 40

D General drug house Co., Ltd. 5

1.3.2 ตวอยาง medicated feed ไดรบการสนบสนนจาก บรษท ไทยเมจฟารมาซวตคล จากด (Thai Meiji Pharmaceutical Co., Ltd.) โดยมตวอยางอาหารสตว 2 ชนด คอ อาหารสตวชนด A (ผงบดละเอยด) และอาหารสตวชนด B (อาหารสตวอดเมดทขายในทองตลาด) ดงตารางท 3.4

ตารางท 3.4 ชนดของตวอยางอาหารสตวผสมยาสาเรจรป (medicated feed) ลกษณะภายนอกและปรมาณ colistin sulfate ทผสมในอาหารสตว

medicated feed ลกษณะภายนอก ปรมาณ colistin ทผสมในอาหารสตว ชนด A

ตวอยาง A1 ผงบดละเอยด สนาตาลออน

10 % (g colistin/g feed)

ตวอยาง A2 40% (g colistin/g feed)

ชนด B ตวอยาง B1

อดเมด สนาตาล ทรงกระบอก ยาวประมาณ 0.5 - 1 cm

80 mg colistin sulfate/kg feed

ตวอยาง B2 150 mg colistin sulfate/kg feed

ตวอยาง B3 200 mg colistin sulfate/kg feed

38

2. การเตรยมสารละลาย 2.1 สารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ Deionized water อตราสวน 20:80

(สารละลาย blank) ผสม acetronitrile ปรมาตร 200 mL กบ deionized water ปรมาตร 800 mL ในขวดรป

ชมพขนาด 1000 mL 2.2 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 500 mg/L

ชง colistin sulfate 25 mg ละลายดวย Deionized water 40 mL ใสขวดปรมาตรขนาด

50 mL แลวปรบปรมาตรเปน 50 mLดวย acetronitrile ใน จะไดสารละลาย colistin sulfate เขมขน 500 mg/L

2.3 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 250 mg/L ปเปตสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 500 mg/L (จากขอ 2.2) 5.00 mL ใส

ขวดปรมาตรขนาด 10 mL แลวปรบปรมาตรเปน 10 mL ดวยสารละลาย blank







2.7 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 400 mg/L ปเปตสารละลาย gentamicin sulfate ทซอมาในรปแบบยาสาหรบฉดสตว(ม

gentamicin sulfate เขมขน 40,000 mg/L) 1.00 mL ใสขวดปรมาตรขนาด 100 mL แลวปรบปรมาตรดวยสารละลาย balnk

2.8 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 200 mg/L ปเปตสารละลาย gentamicin sulfate เขมขน 400 mg/L (จากขอ 2.4) 5.00 mL ใสขวด

ปรมาตรขนาด 10 mL แลวปรบปรมาตรดวยสารละลาย balnk

สำนกหอ


39

2.9 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ปเปตสารละลาย gentamicin sulfate เขมขน 400 mg/L (จากขอ 2.4) 2.00 mL ใสขวด

ปรมาตรขนาด 10 mL แลวปรบปรมาตรดวยสารละลาย balnk

2.10 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate สาหรบสรางกราฟมาตรฐาน นาสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 500 mg/L (จากขอ 2.2) และสารละลาย

มาตรฐาน gentamicin sulfate 400 mg/L (จากขอ 2.4) มาเจอจางในขวดปรมาตรขนาด 10 mL ดวยสารละลาย blank จนมความเขมขนสดทายตามตารางท 3.5

2.11 การเตรยมสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5

ชง Sodium sulfate anhydrous 4.46 g ละลายดวย Deionized water ปรมาตร 1000 mL

แลวปรบ pH ใหเปน 2.5 ดวยสารละลายกรด Phosphoric acid เขมขน 70% (v/v)

ตารางท 3.5 การเตรยมสารละลายมาตรฐานสาหรบการสรางกราฟมาตรฐาน

ลาดบทของสารละลายมาตรฐาน

สารละลายมาตรฐาน colistin sulfate

สารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate

ความเขมขน (mg/L)

ปรมาตรของสารละลายมาตรฐาน colistin

sulfate 500 mg/L ทเตม (mL)

ความเขมขน (mg/L)

ปรมาตรของสารละลายมาตรฐาน gentamicin

sulfate 400 mg/L ทเตม(mL)

blank 0 0 80 2.00

1 25 0.50 80 2.00

2 50 1.00 80 2.00

3 80 1.60 80 2.00

4 100 2.00 80 2.00

5 150 3.00 80 2.00

6 200 4.00 80 2.00

7 400 8.00 80 2.00

40

3. การเตรยมตวอยางในการวเคราะหดวยเทคนค HPLC 3.1 การเตรยมตวอยาง medicated premix

3.1.1 ชงตวอยาง medicated premix ปรมาณ 0.1-0.5 g ตามตารางท 3.6 (ขนกบปรมาณ colistin ในตวอยาง)โดยการชงละเอยด

3.1.2 ละลายตวอยาง medicated premix ดวยสารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ Deionized water อตราสวน 20:80 (สารละลาย blank) ปรมาตร 20 - 30 mL นาไป sonicate เปนเวลา 30 นาท และกวนใหเขากนโดยใช magnetic stirrer เปนเวลา 30 นาท นาสารละลายทเตรยมไดมาปรบปรมาตรดวยสารละลาย blank ตามตารางท 3.6 (ขนกบปรมาณ colistin ในตวอยาง)

3.1.3 จากนนปเปตสารละลายในขอ 2 และสารละลาย gentamicin sulfate (internal

standard) เขมขน 400 mg/L ตามตารางท 3.6 ใสขวดปรมาตรโดยสาหรบตวอยาง A B C ใสขวดปรมาตรขนาด 10 mL และตวอยาง D ใสขวดปรมาตรขนาด 25 mL แลวจงปรบปรมาตรดวยสารละลาย blank จะไดสารละลายตวอยางทม gentamicin sulfate ผสมอยเขมขน 80 mg/L ซงไดแสดงแผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated premix ดงรปท 3.2

3.1.4 นาสารละลายทไดในขอ 3.1.3 ไปกรองโดยใช verticlean nylon syringe

filter ขนาดรพรน 0.45μm กอนการวเคราะหโดยเทคนค HPLC

ตารางท 3.6 การเตรยมตวอยาง medicated premix

ตวอยาง medicated premix A B C D

ปรมาณยาทชง (g) 0.20 0.20 0.15 0.50

ปรมาตรทเจอจางดวย

สารละลาย balnk ครงท 1 (mL)

*การเตรยมขอ 3.1.2

50 50 50 25

ปรมาตรทปเปต

สารละลายจากขอ 3.1.2 (mL)


3 8 1 6

ปรมาตรสารละลาย gentamicin sulfate

400 mg/L ทเตม (mL)


2 2 2 5

41

รปท 3.2 แผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated premix

3.2. การเตรยมตวอยาง medicated feed 3.2.1 การเตรยมตวอยาง medicated feed ชนด A

3.2.1.1 ชงตวอยาง medicated feed ปรมาณ 0.10 - 0.25 g โดยการชงละเอยด 3.2.1.2 ละลายตวอยาง medicated feed ดวยสารละลาย blank ปรมาตร 20 - 30

mL นาไป sonicate เปนเวลา 30 นาท และกวนใหเขากนโดยใช magnetic stirrer เปนเวลา 30 นาท

นาสารละลายทเตรยมไดกรองผานกระดาษกรองแลวปรบปรมาตรเปน 50 mL ดวยสารละลาย blank

3.2.1.3 จากนนปเปตสารละลายในขอ 3.2.1.2 มา 1 mL แลวเตมสารละลาย

gentamicin sulfate (internal standard) 400 mg/L ปรมาตร 2 mL แลวปรบปรมาตรเปน 10 mL ดวยสารละลาย blank ซงในสารละลายตวอยางนม gentamicin sulfate ผสมอยเขมขนเทากบ 80 mg/L

ไดแสดงแผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated feed ชนด A ดงรปท 3.3

3.2.1.4 นาสารละลายทไดในขอ 3.2.1.3 ไปกรองโดยใช verticlean nylon

syringe filter ขนาดรพรน 0.45μm กอนการวเคราะหโดยเทคนค HPLC

medicated premix 0.15 -0.5 g

เตมสารละลาย blank ปรมาตร 25 - 30 mL

sonicate 30 นาท กวนโดยใช magnetic stirrer 30 นาท

ปรบปรมาตร ดวยสารละลาย blank ครงท 1 ตามตารางท 9

เตมสารละลาย gentamicin sulfate 400 mg/L และปรบปรมาตร ดวยสารละลาย blank ปเปต

ตามตารางท 9

42

รปท 3.3 แผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated feed ชนด A

3.2.2 การเตรยมตวอยางอาหารสตวผสมยาสาเรจรป (Medicated feed) ชนด B

3.2.2.1 นาตวอยางอาหารสตวผสมยาสาเรจรป (Medicated feed) ชนด B ไปบดละเอยดดวยเครองเครองปน Panasonic รน MX-795N

3.2.2.2 ชงตวอยางทบดแลว 2 g ดวยเครองชงละเอยด แลวนามาสกดดวย 0.1

M hydrochloric acid ปรมาตร 10 mL โดยการ sonicate เปนเวลา 60 นาท เขยาเปนเวลา 30 นาท

จากนนนาไปเหวยงทความเรว 3300 rpm อณหภม 4ºC เปนเวลา 20 นาท แยกสารละลายสวนใสเกบไวและบนทกปรมาตร

3.2.2.3 เตมสารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ0.1 M hydrochloric acid (60:40) ปรมาตร 5 ml นาไปเหวยงทความเรว 3300 rpm อณหภม 4ºC เปนเวลา 10 นาท แยกสารละลายสวนใสเกบไวและบนทกปรมาตร

3.2.2.4 จากนนนาสารละลายสวนใสในขอ 3.2.2.3 ทสกดไดไปกาจดตวรบกวนทเหลอโดยเทคนค solid phase extraction (SPE) การทา SPE เลอกใช Sep-Pak plus 360 mg

C18 cartridges เปนคอลมน โดยมขนตอนการทาคอ ปรบสภาวะคอลมนกอนดวย methanol ปรมาตร 5 mL แลวตามดวย deionized water ปรมาตร 5 mL จากนนจงโหลดสารละลายสวนใสในขอ 3 และบนทกปรมาตรทโหลด แลวจงลางสงเจอปนทเกาะในคอลมนดวยสารละลาย 0.1 M HC1

ปรมาตร 3 mL สดทายชะ colistin sulfate ออกจากคอลมนดวย methanol ปรมาตร 2 mL

Medicated feed 0.10 - 0.52 g

เตมสารละลาย blank ปรมาตร 25 - 30 mL

sonicate 30 นาท กวนโดยใช Magnetic stirrer 30 นาท

ปรบปรมาตร เปน 50 mL ดวยสารละลาย blank

เตมสารละลาย gentamicin sulfate 400 mg/L 2.00 mL และปรบปรมาตรเปน 10 mL ดวยสารละลาย blank

ปเปต มา 1.00 mL

กรองผาน filter paper

43

3.2.2.5 นาสารละลายทไดจากขนตอน SPE ในขอ 3.2.2.4 ระเหย methanol ใหแหงดวยไอของไนโตรเจนโดยใชเวลาประมาณ 10 นาท แลวจงนามาปรบปรมาตรดวยสารละลาย gentamicin sulfate (Internal standard) เขมขน 80.00 mg/L ปรมาตร 0.5 mL ซงไดแสดงแผนภาพการเตรยมตวอยางอาหารสตวผสมยาสาเรจรป (Medicated feed) ดงรปท 3.4

3.2.2.6 นาสารละลายในขอ 3.2.2.5 ไปกรองโดยใช verticlean nylon syringe

filter ขนาดรพรน 0.45μm กอนการวเคราะหโดยเทคนค HPLC

รปท 3.4 แผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated feed ชนด B

เหวยงทความเรว 3300 rpm, 4ºC, 10 นาท

medicated feed บดละเอยด

2 g

เตมสารละลาย 0.1 M HCl ปรมาตร 10 mL

sonicate 60 นาท เขยา 30 นาท เหวยงทความเรว 3300 rpm,

4ºC, 20 นาท

ขนตอนการทา SPE (C18 cartridge) ปรบสภาพคอลมนดวย methanol 5 mL,

DI water 5 mL โหลดสารละลายสวนใสและบนทกปรมาตรทโหลด ลางตวรบกวนดวย0.1 M HC1 3 mL ชะ colistin sulfate ออกดวย methanol 2 mL

เปาใหแหงดวย N2 (g)

แยกสารละลายสวนใส และบนทกปรมาตร แยกสารละลายสวนใส

และบนทกปรมาตร

เตม Acetronitrile:0.1 M HCl (60:40) 5 mL

เตม gentamicin sulfate

80.00 mg/L 0.5 mL

44

4. สภาวะของเทคนค HPLCทใชในการวเคราะห Column : Zorbax Eclipse XDB C18 column

(5 m,150 x 4.6 mm ID)

Mobile phase : สารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 :

acetonitrile (76:24, v:v)

Flow rate : 1.0 mL/min

Detector wavelength : 215 nm

Injection volume : 20 L

5. วธการทดลอง 5.1 การหาสภาวะของเทคนค HPLC ทเหมาะสมในการวเคราะห colistin sulfate

5.1.1 การหาความยาวคลนทเหมาะสมในการตรวจวดดวย UV detector นา DI

water, สารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5

(24:76, v/v), สารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50, 100, 200, 250, 500 mg/L และ สารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 400, 200, 80 mg/L ไปวดการดดกลนแสงดวยเทคนค UV-Vis spectrophotometry ชนด diode array

5.1.2 การทดลองหาสารละลายตวพา (mobile phase) ทเหมาะสมทาการทดลองโดยวเคราะหสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate, สารละลายมาตรฐาน gentamicin และสารละลายผสมระหวางสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate และ gentamicin sulfate ดวยเทคนค HPLC โดยปรบสภาวะของสารละลายตวพาและสภาวะของเครอง HPLC ไดแก

5.1.2.1 pH ทเหมาะสมของสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM ทใชสาหรบผสมกบ acetronitrile เปนสารละลายตวพา

5.1.2.2 อตราสวนโดยปรมาตรทผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4

เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile ซงสภาวะการชะสารออกจากคอลมนไดทาการทดลองทงในแบบ isocratic elution และ gradient elution

5.1.2.3 อตราการไหล (flow rate) ของสารละลายตวพา สภาวะทจะเลอกใชเปนสารละลายตวพา คอ สภาวะทให retention time ทเหมาะสม

และสามารถแยก colistin A, colistin B และ gentamicin ไดดทสด โดยพจาณาจากการคานวณคาresolution และ asymmetry factor

สำนกหอ


45

5.2 การตรวจสอบความใชไดของวธวเคราะห (Method validation) เพอตรวจสอบวาวธการวเคราะหสามารถนาไปใชวเคราะหหาปรมาณ colistin sulfate

ในตวอยางยาสาหรบผสมอาหารสตว (Medicated Premix) และตวอยางอาหารสตวผสมยาสาเรจรป (Medicated feed)ไดจรง

การตรวจสอบความใชไดของวธวเคราะห มดงน 5.2.1 ความสมพนธในเชงเสนตรง (Linearity) ทาการทดลองโดยฉดสารละลาย

มาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมขนสาหรบสรางกราฟมาตรฐาน (สารละลายทเตรยมขนในขอ 2.10) ความเขมขน 7 ระดบ ไดแก 25, 50, 80, 100, 150, 200, 400 mg/L จากนนสรางกราฟมาตรฐานโดยพลอตระหวางความเขมขนของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ในแกน X กบอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ในแกน Y แลวคานวณหาสมการเสนตรงจากกราฟและพจาณาคา correlation

coefficient (R2) ทาการทดลองซา 6 ครง แลวหาคาเฉลยทไดเปนสมการเสนตรงของวธน 5.2.2 การตรวจสอบความแมนยา (precision) ของวธวเคราะห

5.2.2.1 ตรวจสอบความแมนยาของ peak area และ retention time ทาการทดลองโดยการฉดสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 25 mg/L (ม gentamicin sulfate

เขมขน 80 mg/L ผสมอย) เขาเครอง HPLC ซา 10 ครงแลวคานวณหาคา % relative standard

deviation (%RSD) retention time และอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate

5.2.2.2 ตรวจสอบความแมนยาของวธวเคราะหภายในวนเดยวกนและระหวางวน (Intra- inter day precision) ทาการทดลองโดยใชสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมโดยผานขนตอนเหมอนกบการเตรยมตวอยาง medicated premix โดยใหมความเขมขนสดทายเปน 25, 150, 400 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) วเคราะหสารละลายนดวยเทคนค HPLC โดยฉดซาความเขมขนละ 3 ครง ทาการทดลองซา 3 วน แลวคานวณหา % recovery และ % relative standard deviation (%RSD)

5.2.3 การหาคาขดจากดของการตรวจพบ (Limit of detection, LOD) และคา ขดจากดของการวเคราะหเชงปรมาณ (Limit of quantification, LOQ) ทาการทดลองโดยใชสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมโดยผานขนตอนเหมอนกบการเตรยมตวอยาง medicated premix โดยใหมความเขมขนสดทายเปน 5 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) วเคราะหสารละลายนดวยเทคนค HPLC โดยฉดซา 10 ครง นาคาอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ทไดทง

สำนกหอ


46

10 ครงมาคานวณหาคา standard deviation (SD) จากนนจงคานวณหาความเขมขนทตรงกบสญญาณ 3SD จากสมการความสมพนธเชงเสนตรงของกราฟมาตรฐาน คาความเขมขนทคานวณไดน คอ LOD และคานวณหาความเขมขนทตรงกบสญญาณ 10SD จากสมการความสมพนธเชงเสนตรงของกราฟมาตรฐาน คาความเขมขนทคานวณไดน คอ LOQ

5.3 การทดลองหาวธการเตรยมตวอยางทเหมาะสม 5.3.1 การทดลองหาสารละลายทเหมาะสมทใชสาหรบการตกตะกอนตวรบกวน

(precipitating reagent) ในตวอยาง medicated feed ชนด B กอนนาไปทา SPE ทาการทดลองโดยเตรยมตวอยางตามแผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated feed ชนด B ในรปท 3.3 โดยใช precipitating reagent ไดแก สารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ 0.1 M hydrochloric acid (60:40) และสารละลาย trichloroacitric acid (TCA) เขมขน 30%,v/v (ใน DI water) จากนนพจารณาจาก chromatogram ของตวอยางวาสามารถกาจดตวรบกวนทมอยในอาหารสตวไดหรอไม จงพจารณาเลอก precipitating reagent ทเหมาะสมทสดในการตกตะกอนเพอกาจดตวรบกวนในตวอยาง medicated feed กอนการทา SPE

5.3.2 การทดลองหาคอลมนทเหมาะสมทใชสาหรบการทา SPE เพอกาจดตวรบกวนในตวอยาง medicated feed ชนด B และเพอเพมความเขมขนของสารตวอยางกอนวเคราะหดวยเทคนค HPLC ทดลองใชคอลมน SPE 2 ชนด คอ Sep-Pak plus 360 mg C18 column และ Phenomenex Strata-X cartridges สาหรบ Sep-Pak plus 360 mg C18 column ทาการทดลองโดยเตรยมตวอยางตามแผนภาพการเตรยมตวอยาง medicated feed ชนด B ในรปท 3.4 สาหรบ Phenomenex Strata-X cartridges ทาการทดลองโดยเตรยมตวอยางตามแผนภาพการเตรยมตวอยาง

medicated feed ชนด B ในรปท 3.4 แตในกระบวนการทา SPE ทาการทดลองดงน คอ ปรบสภาวะคอลมนกอนดวย methanol ปรมาตร 3 mL แลวตามดวย deionized water ปรมาตร 3 mL จากนนจงโหลดสารละลายสวนใสในขอ 3 และบนทกปรมาตรทโหลด แลวจงลางสงเจอปนทเกาะในคอลมนดวย diethyl ether ปรมาตร 2 mL และตามดวยสารลาย acetone เขมขน 2%, v/v (ใน DI water)

สดทายชะ colistin sulfate ออกจากคอลมนดวยสารละลายผสมระหวางสารละลายกรด formic acid

เขมขน 2% กบ methanol (30:70, v/v) ปรมาตร 2 mL จากนนพจารณาเลอกคอลมน SPE ทเหมาะสมทสดจากการคานวณหาความเขมขนของตวอยางเปรยบเทยบกบปรมาณทระบบนฉลากสนคา แลวคานวณหา % recovery

สำนกหอ


47

5.4 การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated premix และตวอยาง medicated feed โดยวธการใช calibration curve method

ทาการทดลองโดยเตรยมตวอยาง medicated premix และตวอยาง medicated feed ตามวธการเตรยมตวอยางแตละชนดทกลาวถงแลวในขอ 3 จากนนวเคราะหดวยเทคนค HPLC แลวนาคาอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ทไดมาคานวณหาปรมาณ colistin sulfate ทมอยในตวอยางโดยใชสมการความสมพนธเชงเสนตรงของกราฟมาตรฐาน จากนนประเมนความถกตองของวธการเตรยมตวอยางและวธวเคราะหโดยคานวณหา %recovery เทยบกบคาทระบบนฉลากสนคา ( labeled

amount)

5.5 การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated feed ชนด B โดยวธการใช standard addition method

1 ชดการวเคราะหประกอบดวยตวอยางจานวน 4 ตวอยาง ดงตารางท 3.7

ตารางท 3.7 ชดการวเคราะห colistin sulfate ในตวอยางอาหารสตวโดยใชวธ standard addition

method

ลาดบทของตวอยางในชดการวเคราะห

ปรมาณตวอยางทชง*

(g)

ปรมาตรของสารละลาย colistin sulfate เขมขน 100 mg/L

(ทเจอจางใน 0.1 M HCl) ทเตมในตวอยาง, (mL)

ปรมาณ colistin sulfate ทเตมลงในตวอยาง, (mg)

1 2.xxx 0 0

2 2.xxx 2 0.2

3 2.xxx 4 0.4

4 2.xxx 6 0.6

* ในการชงตวอยางตองชงดวยเครองชงละเอยดและทาการบนทกนาหนกทกตวอยาง

ชงตวอยางประมาณ 2 g จานวน 4 ตวอยางใน 1 ชดการวเคราะห แลวเตมสารมาตรฐาน

colistin sulfate ลงในตวอยางโดยใชวธการเตมสารละลาย colistin sulfate เขมขน 100 mg/L(ทเจอจางใน 0.1 M HCl) ตามปรมาตรทระบในตารางท 3.7 จากนนเตมสารละลาย 0.1 M HCl (mL) จนมปรมาตร 10 mL แลวทาการสกด colistin ตามวธการเตรยมตวอยางทกลาวถงแลวในขอ 3 นาสารละลายตวอยางทเตรยมไดไปวเคราะหดวยเทคนค HPLC คานวณหาคาความเขมขนของ

สำนกหอ


48

ปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางทง 4 ใน 1 ชดการวเคราะหจากปรมาณ colistin sulfate ทเตมกบนาหนกตวอยางทชงจะไดคาความเขมขนในหนวย mg colistin sulfate/ kg feed ซงจะใชคาความเขมขนนสรางกราฟ standard addition โดยพลอตในแกน X จากนนนาคาอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ทไดจาก chromatogram ในแตละตวอยางพลอตในแกน Y จะไดกราฟ standard addition ทม 4 จด กราฟทไดเปนเสนตรง และทตาแหนงเมอ Y = 0 เสนกราฟจะตดแกนท –X คา X ทตดแกนนน คอ ความเขมขนของตวอยางในหนวย mg colistin sulfate/ kg feed จากนนประเมนความถกตองของวธวเคราะหโดยคานวณหา %recovery

สำนกหอ


22

49

บทท ผลการทดลอง

1. การหาสภาวะของเทคนค HPLC ทเหมาะสมในการวเคราะห colistin sulfate

จากการวเคราะหแยกองคประกอบทผสมกนของ colistin ททาการทดลองโดยการฉดสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L เปน internal standard) โดยใชสารละลาย mobile phase คอ สารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM

pH 2.5 (ปรบ pH ดวย H3PO4) : acetonitrile (76:24, v:v) ทอตราการไหล 1.0 mL/min แลวตรวจวดโดยใช UV detector ทความยาวคลน 215 nm ไดผลการทดลองแสดงดง chromatogram ในรปท 4.1

รปท 4.1 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L (ม gentamicin

sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย)

จาก chromatogram พบวา peak ของ colistin A, colistin B และ gentamicin แยกกนไดด โดย retention time ของ colistin B ประมาณ 3.2 นาท และ retention time ของ colistin A

ประมาณ 5.6 นาท โดย colistin B ถกชะออกจากคอลมนกอน colistin A เนองจากในโครงสรางโมเลกลของ colistin ทงสองมกรดอะมโนเหมอนกนตางกนเพยง fatty acid โดย colistin A ม fatty

acid คอ 6-methyloctanoic acid สวน colistin B ม fatty acid คอ 6-methylheptanoic acid นนคอ ตางกนทหมแทนททปลายสายของ fatty acid ซง colistin B มจานวน CH3 นอยกวา colistin A 1 หม

50

จงทาให colistin B ถกชะออกจากคอลมนกอน colistin A และจาก chromatogram เหนวา gentamicin sulfate แยกเปน 2 องคประกอบ ท retention time ประมาณ 8.2 และ 10.1 นาท เนองจาก gentamicin sulfate นนเปนสารผสมซงสอดคลองทกบงานวจยของ ของ M. Laki และคณะ [30] ทรายงายวา gemtamicin เปนสารผสมทมหลายองคประกอบ ผวจยไดรายงาน retention time ของ colistin และ gentamicin ทสภาวะการทดลองนดงตารางท 4.1

ในการพจารณาเลอก internal standard ผวจยไดคนควางานวจยทเกยวของกบการหาปรมาณ colistin แลวพบวามการใช netilmicin sulfate [25] เปน internal standard แตงานวจยทผวจยพฒนาขนนไมสามารถใชสารเปน internal standard ไดเนองจากไมดดกลนแสง UV ผวจยจงไดพจารณาหาสารอนมาใชเปน internal standard แลวมงพจารณาสารจาพวก antibiotic ทมการวเคราะหโดยใชเทคนค HPLC แลวตรวจวดดวย UV detector จากงานวจยของ M. Laki และคณะ[30] รายงานการวเคราะห gentamicin โดยใชเทคนค HPLC-UV ผวจยจงไดทดลองวดการดดกลนแสงของ gentamicin sulfate แลวพบวาดดกลนแสง UV ได และดดกลนชวงความยามคลนเดยวกนกบ colistin sulfate และสามารถหาสภาวะทเหมาะสมทางเทคนค HPLC ท gentamicin sulfate ไมรบกวนการวเคราะห colistin sulfate ได ดงนนในงานวจยนจงไดเลอกใช gentamicin sulfate เปน internal standard

ตารางท 4.1 retention time ของ colistin และ gentamicin

retention time (min) peak identification

3.2 colstin B

5.6 colstin A

8.2 gentamicin

10.1 gentamicin

ผลการทดลองนสอดคลองกบรายงานการวเคราะหทแนะนาโดย European

Pharmacopoeia 5.0 [24] ททาการแยกองคประกอบของ colistin โดยใช C18 column มสารสารละลาย mobile phase เปน acetonitrile : สารละลายบฟเฟอร Na2SO4 pH 2.3 -2.5 ทปรบ pH ดวยสารละลายกรด Phosphoric acid (22:78, v:v) รายงานวาสามารถแยกองคประกอบของ colistin ได 5

องคประกอบ คอ E1, E2, E3, E1I และ E1-MOA ดงแสดงรปท 4.2โดยในEuropean

Pharmacopoeia 5.0 ระบวาพบ peak ของ E1, E2, E3, E1I และ E1-MOA ท retention time เทากบ

51

16, 7.2, 8.0, 12.8 และ 17.6 นาท ตามลาดบ ซงสอดคลองกบผลการทดลองของผวจยทสามารถอธบายไดวา colistin B จะถกชะออกจากคอลมนกอน colistin A และเมอพจารณาผลการวเคราะหของผวจยรวมกบ European Pharmacopoeia 5.0 สามารถสนนษฐานไดวา peak ของ colistin A ในผลการทดลองนประกอบดวยองคประกอบทระบใน European Pharmacopoeia 5.0 คอ E1, E1I

และ E1-MOA ซง colistin ทง 3 องคประกอบนแตกตางกนเพยงการจดตวแบบสามมตในโครงสรางโมเลกล แตมมวลโมเลกลเทากบ 1170 เหมอนกน คอ ม CH3 มากกวา 1 หมในโครงสราง จงถกชะออกจากคอลมนชากวา และ colistin B นนประกอบดวยองคประกอบทระบใน

European Pharmacopoeia 5.0 คอ E2 และ E3 ทง 2 องคประกอบนแตกตางกนเพยงการจดตวแบบสามมตในโครงสรางโมเลกล แตมมวลโมเลกลเทากบ 1155 เหมอนกน จงถกชะออกจากคอลมนเรวกวา

รปท 4.2 องคประกอบของ colistin ทระบใน EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0

การระบวา retention time ของ colistin B นอยกวา colistin A นนยงสอดคลองกบงานวจยของ J. Orwa และคณะ[5] ซงใชสารละลายตวพา คอ Acetonitrile: sodium sulfate

(0.7% v/v): phosphoric acid (6.8% v/v): water (21.5:50:5:23.5:.5) นอกจากนยงสอดคลองกบอกหลายงานวจย ไดแก D. W. Sin และคณะ [27] และ S. Morales-Munoz และคณะ [33]

ในงานวจยนไดทาการทดลองหาสภาวะทางเทคนค HPLC ดงน

1.1 การหาความยาวคลนทเหมาะสมในการตรวจวดดวย UV detector วธวเคราะหทแนะนาของ European Pharmacopoeia 5.0 [24] แยกสารผสม colistin

โดยใช C18 column มสารสารละลาย mobile phase เปน acetonitrile : สารละลายบฟเฟอร Na2SO4

52

pH 2.3 -2.5 ทปรบ pH ดวยสารละลายกรด Phosphoric acid (22:78, v:v) และตรวจวดดวย UV

detector ทความยาวคลน 215 nm จงไดทดลองนาสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50,

100, 200, 250, 500 mg/L และ สารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 80, 200, 400 mg/L

ไปวดการดดกลนแสงดวยเทคนค UV-Vis spectrophotometry ชนด diode array โดยใชสารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 (22:78, v:v) เปน blank ได spectrum ดงแสดงในรปท 4.3 และ 4.4

รปท 4.3 spectrum ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50, 100, 200, 250, 500 mg/L

จากรปท 4.3 เหนวา colisttin sulfate มคณสมบตในการดดกลนแสง UV ในชวงความยาวคลนประมาณ 230 ถง 200 nm

รปท 4.4 spectrum ของสารละลายมาตรฐานgentamicin sulfate เขมขน 400, 200, 80 mg/L

53

จากรปท 4.4 เหนวา gentamicin sulfate มคณสมบตในการดดกลนแสง UV ซงความยาวคลนทมการดดกลนแสงสงสด คอ 256 และ 201 nm โดยชวงความยาวคลนท gentamicin

sulfate และ colistin sulfate สามารถดดกลนแสงได คอ ชวงประมาณ 200 - 220 nm นน ดงนนทความยาวคลน 215 nm ตามวธวเคราะหของ European Pharmacopoeia 5.0 [24] จงสามารถเลอกใชเปนความยาวคลนสาหรบการตรวจวด colistin sulfate ทใช gentamicin sulfate เปน internal

standard ได

1.2 การทดลองหาสารละลายตวพา (mobile phase) ทเหมาะสม 1.2.1 การทดลองหา pH ทเหมาะสมของสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30

mM ทใชสาหรบผสมกบ acetronitrile เปนสารละลายตวพา วธวเคราะห colistin sulfate ทแนะนาใน European Pharmacopoeia 5.0 [24] มการใชสารละลายตวพา คอ สารละลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.3- 2.5 กบ acetonitrile (78:22, v:v) ผวจยจงทดลององคประกอบของ colistin โดยการทดลองฉดสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50, 500 mg/L โดยใช pH ของสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM ท pH 2.5 ผลการทดลองทไดแสดงเปน chromatogram ของการวเคราะหสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 และ 500 mg/L ในรปท 4.5 และ 4.6 ตามลาดบ

รปท 4.5 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 mg/L

54

รปท 4.6 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 500 mg/L

จาก chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 และ 500 mg/L เหนวาสารละลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ

acetonitrile (78:22, v:v) สามารถแยกองคประกอบของ colistin ไดเปน 2 องคประกอบ โดย colistin

B ม retention time ประมาณ 6 นาท และ colstin A ม retention time ประมาณ 14 นาท ดงนนผวจยจงเลอกใชสารละลายสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM ท pH 2.5 ผสมกบ acetonitrile เปนสรละลายตวพา นอกจากนผวจยพจารณาเหนวาหากใชสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM ทม pH ตาเกนไปอาจสงผลใหอายการใชงานของคอลมนลดลงหรออาจทาใหคอลมนเสยได จงไดทาการทดลองใชสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM ทปรบ pH ใหสงขนเปน pH 3.1

แตผลการทดลองพบวาสารละลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 3.1

กบ acetonitrile (78:22, v:v) ไมเหมาะสมทจะใชสารละลายตวพาเนองจาก ไมสามารถแยก colstin

A กบ colistin B ได (แสดงผลการทดลองในภาคผนวก) กลไกลการแยกภายในคอลมนนนจะเกดแรงดงดดระหวาง primary amine (-NH2) ใน

โครงสรางของ colistin กบ silanol groups ทอยใน silica-based C18 column ซงจะกอใหเกด peak tailing ดงนนเมอใชสารละลายตวพาทม pH ตาจะชวยลดปญหานไดโดย silanol groups จะถก protonated จงลดแรงดงดดลง และในขณะเดยวกนเมอ pH ของสารละลายตวพาตากวา pKa ของ colistin จะทาให colistin มประจเปนบวกซงจะชวยลด retention time ได

55

1.2.2 การทดลองหาอตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile ทเลอกใชเปนสารละลายตวพา ในการทดลองใชสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L สารละลายมาตรฐาน gentamicin

sulfate เขมขน 100 mg/Lและสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 mg/L (ม gentamicin

sulfate เขมขน 50 mg/L ผสมอย) ฉดเขาเครอง HPLC เพอพจารณาวาในสภาวะใดทสามารถแยก peak ของ colistin A, colistin B และ gentamicin sulfate ได สภาวะท 1 :อตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile เทากบ 78:22 (v:v)

ผลการทดลองทไดแสดงเปน chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate

เขมขน 100 mg/L และสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L ในรปท 4.7

รปท 4.7 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L และสารละลาย

มาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L

จาก chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L และสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L เหนวา peak ของ colistin และ gentamicin sulfate นนซอนทบกบ ดงนนสภาวะท 1 (อตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบพเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile เทากบ 78:22) ไมสามารถใชวเคราะห colistin sulfate ดวยเทคนค HPLC โดยใช gentamicin sulfate เปน internal

standard ได

56

สภาวะท 2 :อตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile เทากบ 77:23

ผลการทดลองทไดแสดงเปน chromatogram ของการวเคราะหสารละลายมาตรฐาน

colistin sulfate เขมขน 50 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 50 mg/L ผสมอย) ในรปท 4.8



จาก chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 50 mg/L ผสมอย) เหนวา peak ของ colistin A, colistin B และ gentamicin sulfate นนซอนทบกบ ดงนนสภาวะท 2 (อตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile เทากบ 77:23) ไมสามารถใชวเคราะห colistin sulfate ดวยเทคนค HPLC โดยใช gentamicin sulfate เปน internal

standard ได

สภาวะท 3 :อตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบพเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile เทากบ 76:24

ผลการทดลองทไดแสดงเปน chromatogram ของการวเคราะหสารละลายมาตรฐาน

colistin sulfate เขมขน 50 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 50 mg/L ผสมอย) ในรปท 4.9

57



จาก chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 50 mg/L ผสมอย) เหนวา peak ของ colistin A, colistin B และ gentamicin นนแยกกนไดด ไมซอนทบกน โดย retention time ของ colistin B ประมาณ 3.0 นาท และ retention time ของ colistin A ประมาณ 5.4 นาท และ gentamicin sulfate แยกเปน 2

องคประกอบ ท retention time ประมาณ 7.7 และ 9.2 นาท ดงนนสภาวะท 3 (อตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ

acetronitrile เทากบ 76:24 ) เปนสภาวะทเหมาะสมทสามารถใชวเคราะห colistin sulfate ดวยเทคนค HPLC โดยใช gentamicin sulfate เปน internal standard ได นอกจากนผวจยยงไดทาการทดลองปรบสภาวะของสารละลายตวพาแบบ gradient elution แตกไมสามารถแยก peak ของ colistin A, colistin B และ gentamicin sulfateได

1.2.3 การทดลองหาอตราการไหลของสารละลายตวพาทเหมาะสม (flow rate) ทาการทดลองโดยฉดสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 80 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) โดยใชอตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile เทากบ 76:24 แลวปรบอตราการไหลของสารละลายตวพาเทากบ 0.7 และ 1.0 mL/min

58


sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ท flow rate 0.7 mL/min


sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ท flow rate 1.0 mL/min

จาก chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 80 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ท flow rate 0.7 mL/min พบวา retention time ของ colistin B ประมาณ 6.0 นาท และ retention time ของ colistin A ประมาณ 8.5 นาท และ gentamicin

sulfate ท retention time ประมาณ 9.0 และ 11.0 นาท ซง peak ของ colistin A และ gentamicin

59

ซอนทบกนโดย และ chromatogramของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 80 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ท flow rate 1.0 mL/min พบวา peak ของcolistin A

colistin B และ gentamicin sulfate แยกกนไดดโดย retention time ของ colistin B ประมาณ 3.1

นาท และ retention time ของ colistin A ประมาณ 5.4 นาท และ gentamicin sulfate ท retention

time ประมาณ 8.2 และ 10.1 นาท ดงนน flow rate ทเหมาะสมทใชในสภาวะของเทคนค HPLC นคอ 1.0 mL/min

2. การตรวจสอบความใชไดของวธวเคราะห (method validation) 2.1 ความสมพนธในเชงเสนตรง (linearity) ผลการทดลองแสดง chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยม

ขนสาหรบสรางกราฟมาตรฐาน ทความเขมขน 7 ระดบ ไดแก 25, 50, 80, 100, 150, 200, 400 mg/L

รปท 4.12 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทง 7 ความเขมขน (ม

gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย)

จาก chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทง 7 ความเขมขน แสดง

peak area ในตารางท 4.2

60

ตารางท 4.2 peak area ของสารละลายมาตรฐานทง 7 ความเขมขน ทใชในการสรางกราฟมาตรฐาน

สารละลายมาตรฐาน

ความเขมขนของ colistin sulfate

(mg/L)

peak area

colistin B

tr 3.2 min

colistin A

tr 5.6 min

gentamicin

tr 8.2 min

gentamicin

tr 10.1 min

1 25 30691 11253 208449 32271

2 50 74198 27387 174797 28258

3 80 122104 48423 183353 26994

4 100 191299 76947 208000 28187

5 150 300462 113030 206164 30704

6 200 352868 128228 191929 19654

7 400 735341 287449 181857 27719

จากนนสรางกราฟมาตรฐานโดยพลอตระหวางความเขมขนของสารละลายมาตรฐาน

colistin sulfate ในแกน X กบอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B

ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ในแกน Y แลวคานวณหาสมการเสนตรงจากกราฟและพจารณาคา correlation coefficient (R2) ไดดงรปท 4.13

นอกจากนไดนาขอมลในตารางท 4.2 ทดลองสรางกราฟมาตรฐานอก 2 แบบ คอ แบบ

ทใชอตราสวนระหวาง peak area ของ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate พลอตในแกน Y แสดงในรปท 4.14 และ แบบทใชอตราสวนระหวาง peak area ของ colistin A ตอ peak area

ของ gentamicin sulfate พลอตในแกน Y แสดงในรปท 4.15 เพอทดลองวากราฟมาตรฐานควรพลอตโดยใช peak area ของ peak ใดบางและพจารณาความเปนเสนตรงจากคา correlation

coefficient (R2) และ sensitivity จากคาความชนทไดจากสมการเสนตรง

61

รปท 4.13 กราฟมาตรฐานของการวเคราะห colistin sulfate โดยใชอตราสวนระหวางผลรวมของ

peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ในแกน Y

รปท 4.14 กราฟมาตรฐานของการวเคราะห colistin sulfate โดยใชอตราสวนระหวาง peak area

ของ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ในแกน Y

62

รปท 4.15 กราฟมาตรฐานของการวเคราะห colistin sulfate โดยใชอตราสวนระหวาง peak area

ของ colistin A ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ในแกน Y

เมอพจารณากราฟมาตรฐานทง 3 แบบพบวาคา correlation coefficient (R2) ของทง 3

แบบมคาเทากบ 0.99 แตเมอพจารณาความชนจากสมการเสนตรงพบวาคาความชนทมคาสงทสด คอ ความชนทไดจากกราฟทพลอตแกน Y โดยใชอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate โดยความชนทสงสด คอ ม sensitivity มากทสด ดงนนในการสรางกราฟมาตรฐานทใชในงานวจยนจงเลอกใช peak area ratio

ทคานวณ ดงน

ทาการทดลองสรางกราฟมาตรฐานซา 6 ครง โดยใช peak area ratio คอ อตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ไดผลการทดลองดงตารางท 4.3

63

ตารางท 4.3 slope intercept และ correlation coefficient (R2) ทไดจากการทดลองสรางกราฟ

มาตรฐานซา 6 ครง

การสรางกราฟมาตรฐานครงท slope intercept R2

1 0.014 -0.219 0.998

2 0.012 -0.149 0.999

3 0.013 -0.098 0.999

4 0.013 -0.066 0.994

5 0.019 -0.341 0.999

6 0.016 -0.122 0.998

mean 0.015 -0.166 0.998

sd 0.003 0.100 0.002

จากตารางท 4.3 สามารถเขยนสมการเสนตรงของวธวเคราะห colistin sulfate ดวยสภาวะการทดลองนโดยใช gemtamicin sulfate เปน internal standard ไดเปน y = 0.015x-0.166 correlation coefficient (R2) เทากบ 0.998 และไดแสดงเปนตารางสรปในการศกษาความสมพนธในเชงเสนตรง (linearity) ไวดงตารางท 4.4

ตารางท 4.4 การศกษาความสมพนธในเชงเสนตรง (linearity)

linearity (mg/L) 25.00 - 400.00

regression equation* y = 0.015x-0.166

standard deviation of slope 0.003

standard deviation of intercept 0.1

correlation coefficient 0.998

standard deviation of correlation coefficient 0.002

*Based on six calibration curves, y: peak area ratio, x:colistin concentration (mg/L)

64

2.2 การตรวจสอบความแมนยา (precision) ของวธวเคราะห 2.2.1 ตรวจสอบความแมนยาของ peak area และ retention time ทาการทดลอง

โดยการฉดสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 25 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80

mg/L ผสมอย) เขาเครอง HPLC ซา 10 ครงแลวคานวณหาคา % relative standard deviation

(%RSD) ของ retention time และอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate แสดงผลการทดลองในตารางท 4.5 พบวา %RSD

ของคา retention time ของพค colistin B colistin A และ gentamicin มคาไมเกน 3.00% และ %RSD ของ Peak area ratio มคา 6.50%

ตารางท 4.5 relative standard deviation percentage (%RSD) จากการทดสอบความแมนยาของ retention time และ peak area ratio ของวธการวเคราะห (n = 10)

ครงทฉด

retention time (min)

peak area ratio colistin B colistin A gentamicin gentamicin

1 3.059 5.184 7.608 9.569 0.065

2 3.017 5.231 7.617 9.533 0.069

3 3.153 5.292 7.674 9.568 0.069

4 2.854 5.087 7.519 9.436 0.068

5 2.949 5.207 7.526 9.433 0.060

6 2.906 5.11 7.54 9.467 0.060

7 3.043 5.12 7.494 9.395 0.073

8 3.029 5.12 7.524 9.441 0.063

9 3.007 5.183 7.949 9.396 0.063

10 3.023 5.141 7.495 9.446 0.064

mean 3.004 5.1675 7.5946 9.4684 0.065

%RSD

(n=10) 2.79 1.23 1.82 0.69 6.50

65

2.2.2 ตรวจสอบความแมนยาของวธวเคราะหภายในวนเดยวกนและระหวางวน (Intra- inter day precision) โดยใชสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมโดยผานขนตอนเหมอนกบการเตรยมตวอยาง medicated premix โดยใหมความเขมขนสดทายเปน 25, 150, 400

mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) วเคราะหสารละลายนดวยเทคนค HPLC โดยฉดซาความเขมขนละ 3 ครง ทาการทดลองซา 3 วน แลวคานวณหา % recovery และ% relative

standard deviation (%RSD) แสดงผลในตารางท 4.6

ตารางท 4.6 การศกษาความแมนยาของวธวเคราะห (intra and inter-day precision)

intra-day(n=3)

colistin sulfate

solutions (mg/L)

found

(mean SD) (mg/L)

%RSD

(n=3)

%recovery

25 23.98 1.89 7.90 95.92

150 146.06 5.77 3.95 97.37

400 461.01 4.71 1.02 115.25

inter-day(n=9)

colistin sulfate

solutions

(mg/L)

found

(mean SD) (mg/L)

%RSD

(n=9)

%recovery

25 23.25 1.34 5.77 92.98

150 153.81 9.20 5.98 102.54

400 447.95 6.98 1.56 111.99

จากตารางท 4.6 พจารณา % recovery พบวาอยในชวง 92.98 – 115.25% โดย

% recovery ตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC ทระดบความเขมขน 100 -1000 mg/L คอ ชวง 85 – 108 % ซงผลการทดลองทไดพบวาทสาระลาย colistin sulfate เขมขน 25 และ 150 mg/L

มคาอยในเกณฑมาตรฐาน แตสาระลาย colistin sulfate 400 mg/L มคาสงกวาเกณฑมาตรฐาน

66

เลกนอย และ พจารณาจาก %RSD โดย %RSD ทไดจากการทดลองเมอนามาคานวณหาคา

HORRAT พบวานอยกวา 2 ดงนน %RSD อยในเกณฑทยอมรบได

2.3 การหาคาขดจากดของการตรวจพบ (Limit of detection, LOD) และคา ขดจากดของการวเคราะหเชงปรมาณ (Limit of quantification, LOQ)

ผลการทดลองการวเคราะหสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมโดยผานขนตอนเหมอนกบการเตรยมตวอยาง medicated premix โดยใหมความเขมขนสดทายเปน 5 mg/L

(ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) โดยฉดซา 10 ครง แสดงดงตารางท 4.7

ตารางท 4.7 การวเคราะหสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมโดยผานขนตอนเหมอนกบการเตรยมตวอยาง medicated premix โดยใหมความเขมขนสดทายเปน 5 mg/L (ม gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ฉดซา 10 ครง

ครงท (n) peak area peak area

ratio colistin B colistin A gentamicin gentamicin

1 9232 4354 157591 22919 0.075

2 10755 5783 169989 24776 0.085

3 11359 5007 164479 31315 0.084

4 9938 5567 157563 24030 0.085

5 9820 3856 168045 27336 0.070

6 9570 4692 176293 24206 0.071

7 10301 3513 174772 29267 0.068

8 9360 4451 182627 27037 0.066

9 9124 4120 176503 25946 0.065

10 9372 3259 167497 26585 0.065

mean 0.073

SD 0.008

67

จากนนนาคาอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ทไดทง 10 ครงมาคานวณหาคา standard deviation (SD) แลวจงคานวณความเขมขนทตรงกบสญญาณ 3SD (LOD) และความเขมขนทตรงกบสญญาณ 10SD

(LOQ) จากกราฟมาตรฐาน ได คา LOD เทากบ 9.46 mg/L และ LOQ เทากบ 13.93 mg/L

3. การทดลองหาวธการเตรยมตวอยางทเหมาะสม 3.1 การทดลองหาสารละลายทเหมาะสมทใชสาหรบการตกตะกอนตวรบกวน (precipitating reagent) ในตวอยาง medicated feed ชนด B กอนนาไปทา SPE

Cheng และคณะ[28] ไดใช Trichloroacetic acid (TCA) เขมขน 30%,v/v (ใน DI

water) เพอตกตะกอนโปรตนทรบกวนการวเคราะห colistin ในตวอยางเลอด ผวจยจงไดทดลองใชสารละลาย trichloroacitric acid (TCA) เขมขน 30%,v/v (ใน DI water) เปน precipitating reagent พบวา สารละลาย trichloroacitric acid (TCA) เขมขน 30%,v/v (ใน DI water) ไมสามารถกาจดตวรบกวนในอาหารสตวไดเนองจากม peak รบกวนสงมากจนไมสามารถมองเหน peak ของ colistin

ได จากนนผวจยจงไดทดลองใชสารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ 0.1 M hydrochloric acid (60:40) เปน precipitating reagent พบวา สามารถกาจดตวรบกวนไดบางสวน ดงรปท 4.16 ซงการใชสารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ 0.1 M hydrochloric acid (60:40) เปน precipitating

reagent มความเหมาะสมในการใชเตรยมตวอยางอาหารสตว

รปท 4.16 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed เขมขน 80 mg colistin sulfate/ kg

feed เมอใช สารละลายผสมระหวาง acetronitrile กบ 0.1 M hydrochloric acid (60:40) เปน precipitating reagent

68

3.2 การทดลองหาคอลมนทเหมาะสมทใชสาหรบการทา SPE เพอกาจดตวรบกวนในตวอยาง medicated feed ชนด B และเพอเพมความเขมขนของสารตวอยางกอนวเคราะหดวยเทคนค HPLC ทดลองใชคอลมน SPE 2 ชนด คอ Sep-Pak plus 360 mg C18 cartridges และ Phenomenex Strata-X cartridges ในการทดลองนใชตวอยางอาหารสตวชนด B ความเขมขนของตวอยาง 200 mg colistin sulfate/ kg feed ผลการทดลองในการใช Phenomenex Strata-X cartridges เปนคอลมนสาหรบทา SPE chromatogram แสดงในรปท 4.17 และพบวาได % recovery ประมาณ 40 % ดงแสดงในตารางท 4.8

รปท 4.17 chromatogram ของการวเคราะหตวอยางอาหารสตวชนด B เขมขน 200 mg colistin

sulfate/ kg feed ผลเมอใช Phenomenex Strata-X cartridges เปนคอลมนสาหรบทา SPE

69

ตารางท 4.8 ผลการวเคราะหตวอยางอาหารสตวชนด B เขมขน 200 mg colistin sulfate/ kg feed

ผลเมอใช Phenomenex Strata-X cartridges เปนคอลมนสาหรบทา SPE

ตวอยาง

นาหนกของ

ตวอยาง(g)

peak area ratio ความเขมขนของสารละลายตวอยางท

ฉด

( mg/L)

ความเขมขนของตวอยาง

(mg

colistin

sulfate/

kg feed )

ครงทฉด

mean SD

%

recovery

1 2 3

1 1.0350 0.443 0.438 0.560 0.480 0.069 43.23 83.53 41.76

2 1.0543 0.396 0.436 0.441 0.424 0.025 37.72 85.86 42.93

ผลการทดลองในการใช Sep-Pak plus 360 mg C18 cartridges เปนคอลมนสาหรบทา SPE เพอกาจดตวรบกวนทมในตวอยางอาหารสตวชนด B แสดง chromatogram ในรปท 4.18 และพบวาได % recovery ประมาณ 80 -92 % ดงแสดงในตารางท 4.9

รปท 4.18 chromatogram ของการวเคราะหตวอยางอาหารสตวชนด B เขมขน 200 mg colistin

sulfate/ kg feed ผลเมอใช Sep-Pak plus 360 mg C18 cartridges เปนคอลมนสาหรบทา SPE

70

ตารางท 4.9 ผลการวเคราะหตวอยางอาหารสตวชนด B เขมขน 200 mg colistin sulfate/ kg feed

ผลเมอใช Sep-Pak plus 360 mg C18 cartridges เปนคอลมนสาหรบทา SPE

ตวอยาง นาหนกของตวอยาง(g)

Peak area ratio ความเขมขนของ

สารละลายตวอยางทฉด

( mg/L)

ความเขมขนของตวอยาง

(mg colistin

sulfate/ kg

feed )

ครงทฉด

Mean SD

%

recovery

1 2 3

1 1.0042 1.204 1.265 1.213 1.227 0.033 82.54 164.40 82.19

2 1.1083 1.267 1.284 1.259 1.270 0.013 84.79 183.61 91.80

ดงนนคอลมนทเหมาะสมทใชสาหรบการทา SPE เพอกาจดตวรบกวน (matrix

interferences) ในตวอยาง medicated feed ชนด B และเพอเพมความเขมขนของสารตวอยางกอนวเคราะหดวยเทคนค HPLC คอ Sep-Pak plus 360 mg C18 cartridges

4. การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated premix และตวอยาง medicated feed ผลการทดลองการหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated premix chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ A B C และ D แสดงในรปท 4.19, 4.20, 4.21 และ 4.22 ตามลาดบ

รปท 4.19 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ A (สารละลายตวอยาง

ม colistin sulfate เขมขน 180 mg/L)

71

รปท 4.20 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ B (สารละลายตวอยาง


รปท 4.21 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ C (สารละลายตวอยาง


รปท 4.22 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ D (สารละลายตวอยาง


72

ตารางท 4.10 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix

medicated premix

Sample

labeled

amount

(%w/w)

amount found

(%w/w) %recovery

%RSD

(n=3)

A 10 10.99 109.90 2.15

B 2 1.89 94.50 3.53

C 40 43.13 107.83 1.46

D 5 4.75 95.00 4.68

จากตารางท 4.10 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix พบวา % recovery อยในชวง 94.50 – 109.90 % โดย % recovery ตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC คอ ชวง 95 – 102 % ซงผลการทดลองไดคาสงกวาในชวงเกณฑทยอมรบไดตามมาตรฐานเลกนอย และ %RSD ของตวอยาง A B และ C ทไดจากการทดลองเมอนามาคานวณหาคา HORRAT พบวานอยกวา 2 ดงนน %RSD อยในเกณฑทยอมรบได มเพยงของตวอยาง D เทานนทนาคา %RSD มาคานวณหาคา HORRAT แลวพบวามากกวา 2

ผลการทดลองการหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated feed ชนด A chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 10% และ

40% (g colistin/g feed) แสดงในรปท 4.23 และ 4.24 ตามลาดบ

รปท 4.23 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 10%

73

รปท 4.24 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 40%

ตารางท 4.11 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A

sample Labeled amount

(%w/w)

Colistin found

(%w/w) %recovery

%RSD

(n=3)

A1 10 9.37 93.68 2.48

A2 40 36.6 91.51 4.27

จากตารางท 4.11 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed พบวา % recovery อยในชวง 91.51 – 93.68 % โดย % recovery ตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC คอ ชวง 95

– 102 % ซงผลการทดลองไดคาตากวาในชวงเกณฑทยอมรบไดตามมาตรฐานเลกนอย แตกถอวาอยในเกณฑด ไมตากวา 90% และ %RSD ของตวอยาง A1 ทไดจากการทดลองเมอนามาคานวณหาคา HORRAT พบวานอยกวา 2 ดงนน %RSD อยในเกณฑทยอมรบได แตเมอคา %RSD ของตวอยาง A2 มาคานวณหาคา HORRAT แลวพบวามากกวา 2

ผลการทดลองการหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated feed ชนด B

chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B เขมขน 80, 150 และ

200 ppm (mg colistin sulfate/ kg feed) แสดงในรปท 4.25, 4.26 และ 4.27 ตามลาดบ

74

รปท 4.25 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B เขมขน 80 ppm

(mg colistin sulfate/ kg feed)

รปท 4.26 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B เขมขน150 ppm

(mg colistin sulfate/ kg feed)

รปท 4.27 chromatogram ของการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B เขมขน 200 ppm (mg

colistin sulfate/ kg feed)

75

ตารางท 4.12 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B

sample Labeled amount

(mg colistin sulfate/kg feed)

Colistin found

(mg colistin sulfate/kg feed) %recovery

%RSD

(n=3)

B1 80 73.63 92.10 7.55

B2 150 140.65 93.77 5.53

B3 200 185.48 92.74 0.68

จากตารางท 4.12 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B พบวา % recovery

อยในชวง 92.10 – 93.77 % โดย % recovery ตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC คอ ชวง 85 – 110 % ซงผลการทดลองไดอยในชวงเกณฑทยอมรบไดและ %RSD ของ medicated feed ชนด B ทไดจากการทดลองเมอนามาคานวณหาคา HORRAT พบวานอยกวา 2 ดงนน %RSD อยในเกณฑทยอมรบได 5. การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated feed ชนด B โดยวธการใช standard addition method

จากการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B ความเขมขนทระบขางฉลาก 3 ระดบ คอ 80, 150, 200 mg colistin sulfate/kg feed โดยทาการทดลองความเขมขนละ 3 ชดการวเคราะห chromatogram ของตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะหทความเขมขน 80 mg colistin sulfate/kg

feed แสดงในรปท 4.28 ถง 4.31

76

รปท 4.28 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed ชนด B ตวอยางลาดบท 1 ของชดวเคราะหท 1 ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg)

รปท 4.29 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed ชนด B ตวอยางลาดบท 2 ของชดวเคราะหท 1 ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg)

77

รปท 4.30 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed ชนด B ตวอยางลาดบท 3 ของชด

วเคราะหท 1 ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg)

รปท 4.31 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed ชนด B ตวอยางลาดบท 4 ของชด

วเคราะหท 1 ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg)

สรางกราฟสาหรบ standard addition method โดยคานวณหาคาความเขมขนของปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางทง 4 ใน 1 ชดการวเคราะหจากปรมาณ colistin sulfate ทเตมกบนาหนกตวอยางทชงจะไดคาความเขมขนในหนวย mg colistin sulfate/ kg feed ซงจะใชคาความเขมขนนพลอตในแกน X จากนนนาคาอตราสวนระหวางผลรวมของ peak area ของ colistin A กบ colistin B ตอ peak area ของ gentamicin sulfate ทไดจาก chromatogram ในแตละตวอยางพลอตในแกน Y จะไดกราฟ standard addition ทม 4 จด กราฟทไดเปนเสนตรงและทตาแหนงเมอ Y = 0

เสนกราฟจะตดแกนท –X คา X ทตดแกนนน คอ ความเขมขนของตวอยางในหนวย mg colistin

sulfate/ kg feed สรางกราฟจากผลการวเคราะหในตารางท 4.13 จะไดกราฟ standard addition

method แสดงในรปท 4.32

78

ตารางท 4.13 ผลการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg) ชดท 1

นาหนกตวอยาง

(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin

A gentamicin gentamicin

2.0197 0 0.00 196111 46916 299218 23509 0.75

2.0172 0.2 99.15 680987 232348 289746 250912 1.69

2.0201 0.4 198.01 979032 339830 279872 260930 2.44

2.0251 0.6 296.28 1397302 596236 290891 276509 3.51

รปท 4.32 กราฟ standard addition method ของการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg) ชดท 1

จากกราฟ standard addition method ไดสมการเสนตรงคอ y = 0.0091x + 0.7423 จะหาจดตดแกนแกน x แทนคา y = 0 ในสมการ ไดคา x = 81.57 mg colistin sulfate/ kg feed

79

ทาการทดลองดงกลาวกบตวอยาง medicated feed ชนด B ความเขมขนทระบขางฉลาก 3 ระดบ คอ 80, 150, 200 mg colistin sulfate/kg feed โดยทาการทดลองความเขมขนละ 3 ชดการวเคราะห (ผลการทดลองแตละชดแสดงในภาคผนวก) สรปผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B แสดงในตารางท 4.14

ตารางท 4.14 ความเขมขนของ colistin sulfate ในตวอยาง medicated feed ชนด B ทหาโดยวธ standard addition method

sample labeled amount

(mg colistin sulfate

/kg feed)

colistin found(mg colistin sulfate/kg feed) mean

%recovery

%RSD (n=3)

ชดท 1 ชดท 2 ชดท 3

B1 80 81.57 79.44 76.03 79.01 98.77 2.79

B2 150 150.50 155.10 146.14 150.58 100.39 4.48

B3 200 189.26 184.18 188.21 187.22 93.61 2.68

จากตารางท 4.14 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B โดยวธ standard

addition พบวา % recovery อยในชวง 93.61 – 100.39 % โดย % recovery ตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC คอ ชวง 85 – 110 % ซงผลการทดลองไดอยในชวงเกณฑทยอมรบไดและ %RSD ของ medicated feed ชนด B ทไดจากการทดลองเมอนามาคานวณหาคา HORRAT พบวานอยกวา 2 ดงนน %RSD อยในเกณฑทยอมรบได

80

บทท สรป อภปรายและขอเสนอแนะ

1. สรปและอภปรายผลการวจย

จากการทดลองหาปรมาณ colistin sulfate โดยใช column คอ Zorbax Eclipse XDB C18 column (5 m,150 x 4.6 mm ID) มสารละลาย mobile phase คอ สารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 (ปรบ pH ดวย H3PO4) : acetonitrile (76:24, v:v) ทอตราการไหล 1.0 mL/min แลวตรวจวดโดยใชUV detector ทความยาวคลน 215 nm พบวาสามารถแยกสารผสม colistin ไดเปน 2 องคประกอบ คอ colistin A และ colistin B และสาหรบงานวจยนเลอกใช gentamicin sulfate เปนสารละลาย Internal standard โดยใชในรปแบบยาสาหรบฉดสตว (injection form) ซงเปนสารละลายใส มความบรสทธสงสามารถใชแทนสารมาตรฐาน gentamicin sulfate ได

เมอเปรยบเทยบผลการทดลองในการแยกองคประกอบของ colistin พบวางานวจยนสอดคลองกบงานวจยของ European Pharmacopoeia 5.0 [24] J. Orwa และคณะ[5] D. W. Sin และคณะ[27] และ S. Morales-Munoz และคณะ[33] โดยระบตรงกนวา colistin B ม retention time นอยกวา colistin A เนองจากในโครงสรางมหม CH3 นอยกวา colistin A จานวน 1 หม

ในการทดสอบความใชไดของวธวเคราะหพบวาความสมพนธเชงเสนตรงของสญญาณกบความเขมขนในชวง 25 – 400 mg/L ม correlation coefficient (R2) เทากบ 0.998 คาขดจากดของการตรวจพบ (Limit of detection, LOD) และคา ขดจากดของการวเคราะหเชงปรมาณ (Limit of quantification, LOQ) เทากบ 9.46 mg/L และ 13.93 mg/L ตามลาดบ ความแมนยาของวธวเคราะหภายในวนเดยวกนและระหวางวน (Intra- inter day precision) ทาการทดลองโดยใชสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate ทเตรยมโดยผานขนตอนเหมอนกบการเตรยมตวอยาง medicated premix โดยใหมความเขมขนสดทายเปน 25, 150, 400 mg/L พบวา %recovery อยในชวง 92.98 – 115.25% และ %RSD ตากวา 7.90% ซงอยในชวงเกณฑทยอมรบไดตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC จากการทดลองนาวธวเคราะหในงานวจยนมาประยกตใชในการวเคราะหหาปรมาณ colistin sulfate ในยาสตวทมขายในทองตลาดพบวา %recovery อยในชวง 94.50 – 109.90% %RSD ตากวา 5.00 % การวเคราะหหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางอาหารสตวโดยเทคนค calibration curve method ได %recovery ในชวง 92.10 – 93.77%, %RSD ตากวา

สำนกหอ


81

7.55% และเมอใชเทคนค standard addition method ได %recovery ในชวง 93.61 – 100.39%, %RSD ตากวา 4.50% จากการพจารณาความถกตองและความแมนยาของวธโดยใช % recovery และ %RSD ตามลาดบพบวาอยในชวงเกณฑทยอมรบไดตามมาตรฐานทางอาหารและยาของ AOAC

จากงานวจยของ B. Cancho Grande และคณะ[23] ทไดหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางอาหารสตว ไดเลอกใชเทคนค HPLC ในการแยกองคประกอบของ colistin แลวตรวจวดดวย fluorescence detector กลมผวจยนไดสรางกราฟมาตรฐานใน matrix เดยวกบตวอยางซงเปนแนวทางทด แตทงนการเตรยมตวอยางจะตองผานขนตอนการ Derivatization เพอทาให colistin สามารถตรวจวดไดดวยดวย fluorescence detector ซงหากควบคมกระบวนการนไมดอาจสงผลตอความแมนยาของการวเคราะหได เมอนามาพจารณารวมกบวธวเคราะหทผวจยไดพฒนาขนในงานนทใชการตรวจวดดวย UV detector นนเหนวาจะชวยลดขนตอนการทา Derivatization ไปได ซงอาจเปนการเพมความแมนยาของวธวเคราะหใหดขน

ดงนน วธวเคราะหปรมาณ colistin sulfate ทพฒนาขนในงานวจยนเปนเทคนคทใชเครอง HPLC – UV ซงเปนเครองมอทราคาไมสง มความถกตองและแมนยา เหมาะเปนอยางยงทจะนาไปใชในหองปฏบตการควบคมคณภาพการผลตยาและอาหารสตว

2.ขอเสนอแนะ

ในการวเคราะหหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยางอาหารสตว โดยใชเทคนค calibration curve method ควรมการสรางกราฟมาตรฐานใน matrix เดยวกนกบตวอยางเพอลดปญหาของ matrix interferences ในการวเคราะห และควรมการทดลองหาปรมาณ colistin sulfate โดยเทคนคอนๆหรอใชเทคนค HPLC ทมตวตรวจวดตางกน แลวนาผลการทดลองมาทดสอบคาทางสถตเพอประเมนผลวธทพฒนาขนน

สำนกหอ


82

รายการอางอง

[1] กรมปศสตว. (2549). “ประกาศกรมปศสตว เรอง กาหนดมาตรฐานสารตกคางสาหรบสนคาปศสตว.” 12 กรกฎาคม.

[2] EMEA. (2002). “Committee for Veterinary Medicinal Products Colistin. Summary report (2)

EMEA/MRL/815/02-FINAL.” January.

[3] Koyama, Y. et al. (1950). “A new antibiotic colistin produced by spore-forming soil bacteria.”

J. Antibiotics (in Japanese) 3: 457-458.

[4] Suzuki, T. et al. (1963). “Studies on the Chemical Structure of Colistin: I. Fractionation,

Molecular Weight Determination, Amino Acid and Fatty Acid Composition.”

Journal of Biochemistry 54: 25-33.

[5] Orwa, J. et al. (2000). "Development and validation of a liquid chromatography method for

analysis of colistin sulphate," Chromatographia 51: 433-436.

[6] Ikai, Y. et al. (1998). “Isolation of colistin a and b using high-speed counter current

chromatography.” Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies

21: 143-155.

[7] วษณ ธรรมลขตกล. (2551). “โคลสตน: ยาตานจลชพสาหรบรกษาโรคตดเชอแบคทเรยกรมลบดอยา.” เวชบนทกศรราช 1, 3 (กนยายน-ธนวาคม): 152-158

[8] บรษท นตรเคมส จากด. ยาผสมอาหาร Antibiotic. เขาถงเมอวนท 5 เมษายน 2556. เขาถงไดจ า ก http://www.yasatcp.com/index.php?lay=show&ac=cat_show_pro_detail&cid=

20245&pid=78650

[9] โครงการสารานกรมไทยสาหรบเยาวชน โดยพระราชประสงคในพระบาทสมเดจพระเจาอยหว. อาหารสตว. เขาถงเมอวนท 29 มนาคม 2566. เขาถงไดจาก http://kanchanapisek.or.th/kp6/New/sub/book/book.php?book=14&chap=4&page=t14-4-infodetail01.html

[10] กองควบคมคณภาพอาหารสตวกรมปศสตว กระทรวงเกษตรและสหกรณ. (2525). “พระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525.” ตลาคม 2533.

[11] สนนาฏ พลแสง. (2548). “การผลตอาหารสตว .” เอกสารประการเรยนการสอนวชาการผลตอาหารสตว รหส 3503 – 2201 คณะวชาสตวศาสตร วทยาลยเกษตรและเทคโนโลยยโสธร.

สำนกหอ


83

[12] “ประกาศกระทรวงสาธารณสข เรอง การกาหนดรายละเอยดเกยวกบหลกเกณฑและวธการในการผลตยาแผนปจจบน ตามกฎหมายวาดวยยา พ.ศ.2554.” (2554). ราชกจจานเบกษา เลม 128 ตอนพเศษ 75 ง (7 กรกฎาคม 2554): 8-93

[13] ชชาต อารจตรานสรณ. โครมาโทกราฟเหลวความดนสง. เขาถงเมอวนท 6 เมษายน 2556.


[14] จไรรตน มหาเทยน. การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ (method validation). เขาถงเมอวนท 6 เมษายน 2556. เขาถงไดจาก http://reo06.mnre.go.th/home/images/upload /file/report/ Jurairut070509.pdf

[15] International Organization for Standardization. (2005). General requirement for the

competence of testing and calibration laboratories, ISO/IEC 17025(E). 2nd ed.

Geneva: International Organization for Standardization.

[16] AOAC International. (2002). “Requirements for Single Laboratory Validation of Chemical


http://www.aoac.org/Ag_ Materials/additives/aoac_slv.pdf [17] นนทนา กนยานวฒน และนชนาท นาคา. (2555). “แนวทางการตรวจสอบความใชไดของวธ

ทดสอบทางเคม.” รายงานวชาการ ฉบบท สอพ 1/2555 สานกอตสาหกรรมพนฐาน

กรมอตสาหกรรมพนฐานและการเหมองแร. [18] Shoichi Yamatani. (1985). “Quantitative test method for colistin sulfate (premix).” Research

Report of Animal Feed 11: 174

[19] Leroy, P. et al. (1989). “Residue determination of two co-administered antibacterial agents

cephalexin and colistin in calf tissues using high-performance liquid chromatography

and microbiological methods.” Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis 7: 1837-1846.

[20] Thomas, A. H. and Holloway, L. (1978). “Thin-layer chromatographic method for the

identification of the polymyxin.” Journal of Chromatography A 161: 417-420.

[21] Holska, W. and Gwozdz, E. (1989). “Determination of colistin by isotachophoresis.”

Journal of Liquid Chromatography 12: 2761-67.

สำนกหอ


84

[22] Kristensen, H. K. and Hansen, S. H. (1993). “Separation of Polymyxins by Micellar

Electrokinetic Capillary Chromatography.” Journal of Chromatography 628: 309-

315.

[23] Cancho Grande, B. et al. (2001). “Simple HPLC Determination of Colistin in Medicated

Feeds by Pre-Column Derivatization and Fluorescence Detection.”

Chromatographia 54: 481-484.

[24] Council of Europe. (2005). “Colistin sulfate” European Pharmacopoeia 5.0: 1361-1362.

[25] Li, J. et. al. (2001). “A simple method for the assay of colistin in human plasma, using pre-

column derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate in solid-phase

extraction cartridges and reversed-phase high-performance liquid chromatography.”

Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 761: 167-

175.

[26] Sin, D. W. et. al. (2005). “Analysis of major components of residual bacitracin and colistin

in food samples by liquid chromatography tandem mass spectrometry.” Analytica

Chimica Acta 535: 23-31.

[27] Sin, D. W. et. al. (2006). “Detection of residual bacitracin A, colistin A, and colistin B in

milk and animal tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry.”

Analytical and Bioanalytical Chemistry 385: 181-188.

[28] Cheng, C. et. al. (2010). “LC-MS/MS method development and validation for the

determination of polymyxins and vancomycin in rat plasma.” Journal of

Chromatography B 878: 2831-2838.

[29] Friedlander , Lynn G. and Arnold, D. Colistin. Accessed April 6, 2013. Available from

ftp://ftp.fao.org/ag/agn/jecfa/vetdrug/2-2006-colistin.pdf

[30] Laki, M. et al. (2011). “Determination of Gentamicin Released from Orthopedic Carrier

System by a Novel HPLC Method.” Journal of Chromatographic Science 49: 177-

181.

[31] Robert, W. Milne. et al. (2003). “Stability of Colistin and Colistin Methanesulfonate in

Aqueous Media and Plasma as Determined by High-Performance Liquid

Chromatography.” Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47: 1364-1370.

สำนกหอ


85

[32] Morovjan, G., Csokan, P. and Nemeth-Konda, L. (1998). “HPLC Determination of Colistin

and Aminoglycoside Antibiotics in Feeds by Post-Column Derivatization and

Fluorescence Detection.” Chromatographia 48: 32-36.

[33] Morales-Munoz, S. and Luque de Castro, M.D. (2005). “Dynamic ultrasound-assisted

extraction of colistin from feedswith on-line pre-column derivatization and liquid

chromatography-fluorimetric detection.” Journal of Chromatography A 1066: 1–7.

[34] Clarot, I. et al. (2009). “Simultaneous quantitation of tobramycin and colistin sulphate by

HPLC with evaporative light scattering detection” Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 50: 64–67.

สำนกหอ


86

ภาคผนวก

87

1. การศกษา pH ของสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM ท pH 3.1 Mobile phase : สารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 3.1 :

acetonitrile (78:22, v:v) Sample injection : สารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50, 500 mg/L

รปท ก.1 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 50 mg/L

รปท ก.2 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 500 mg/L

88

2. การทดลองหาอตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile ทเลอกใชเปนสารละลายตวพา สภาวะท 1 :อตราสวนโดยปรมาตรของสาระลายผสมระหวางสารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 กบ acetronitrile เทากบ 78:22

รปท ก.3 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L สภาวะท 1

รปท ก.4 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน gentamicin sulfate เขมขน 100 mg/L สภาวะท 1

89




90




91

3. การทดลองหาคอลมนทเหมาะสม ระหวาง Zorbax Eclipse XDB C18column และ Ascentis™ C18 column การทดลองไดเปลยนคอลมนทใชสาหรบวเคราะห colistin sulfate ดวยเทคนค HPLC โดยม gentamicin sulfate เปน internal standard เปน Ascentis™ C18 column เพอใชเปรยบเทยบผลการทดลองจากการใชคอลมนเปน Zorbax Eclipse XDB C18column

Mobile phase : สารละลายบฟเฟอร Na2SO4 เขมขน 30 mM pH 2.5 : acetonitrile (76:24, v:v)

Flow rate : 1.0 mL/min Sample injection : สารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L (ม


รปท ก.9 chromatogramสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L (ม gentamicin

sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) จาก chromatogram เหนวา peak ของ colistin A, colistin B และ gentamicin sulfate

นนซอนทบกนและ peak ของ colistin A, colistin B ตางแยกเปน 2 peak นอกจากนผวจยไดใชคอลมน Ascentis™ C18 column ในการทดลองแยก peak ของ colistin A, colistin B และ gentamicin sulfate แบบ gradient elution แตกไมสามารถแยก peak ของ colistin A และ colistin B ทเหนเปน 2 องคประกอบได ดงนนแมวา Ascentis™ C18 column จะม resolution ทดกวา Zorbax

Eclipse XDB C18column แตกไมสามารถใช Ascentis™ C18 column ในการวเคราะห colistin

sulfate ดวยเทคนค HPLC โดยใช gentamicin sulfate เปน internal standard ทสภาวะนได

92

2. การตรวจสอบความใชไดของวธวเคราะห (Method validation) ความสมพนธในเชงเสนตรง (Linearity)

รปท ก.10 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 25 mg/L (ม gentamicin




93



รปท ก.13 chromatogram ของสารละลายมาตรฐาน colistin sulfate เขมขน 100 mg/L (ม


94





95


gentamicin sulfate เขมขน 80 mg/L ผสมอย) ตรวจสอบความแมนยาของวธวเคราะหภายในวนเดยวกนและระหวางวน (Intra- inter day precision)

ตารางท ก.1 การศกษาความแมนยาของวธภายในวนเดยวกน(Intra-day precision) ของ Colistin

sulfate standard solutions 25 mg/L

Colistin sulfate standard solutions 25 mg/L

ครงท (n)

Peak area Peak area

ratio

Found

(mg/L) colistin B colistin A gentamicin gentamicin

1 25092 8988 186677 22650 0.163 25.98

2 25332 7965 217284 27754 0.136 23.74

3 16750 5208 165597 21100 0.118 22.22

Mean 23.98

SD 1.89

%RSD (n=3) 7.90

% Recovery 95.92

96




ครงท (n)

Peak area Peak area

ratio

Found


1 227098 84583 161841 25006 1.668 151.43

2 233896 85759 177051 21170 1.613 146.80

3 215456 72642 168022 20230 1.530 139.95

Mean 146.06

SD 5.77

%RSD (n=3) 3.95

% Recovery 97.37




ครงท (n)

Peak area Peak area

ratio

Found


1 646435 287776 158080 17593 5.318 455.57

2 656960 270148 156462 14788 5.414 463.56

3 656290 265079 153910 16161 5.418 463.88

Mean 461.01

SD 4.71

%RSD (n=3) 1.02

% Recovery 115.25

97

ตารางท ก.4 การศกษาความแมนยาของวธระหวางวน (inter-day precision)ของ Colistin sulfate

standard solutions 25 mg/L (ทดลองซาความเขมขนละ 3 ครง ซา 3 วน) Colistin sulfate standard solutions 25 mg/L

วนท (n) ครงท

Peak area Peak

area

ratio

Found

(mg/L)

colistin

B

colistin


1

1 24592 6888 187677 23460 0.149 24.84

2 24855 6896 188759 24431 0.149 24.83

3 24278 7002 189776 23989 0.146 24.61

Mean (intra-day) 24.76

2

1 20592 5945 190598 20967 0.125 22.87

2 20855 5967 185908 26789 0.126 22.93

3 20675 5434 189776 25677 0.121 22.52


3

1 20054 5805 195976 24967 0.117 22.17

2 20199 5967 190908 28887 0.119 22.34

3 20089 6170 197776 27677 0.116 22.12


Inter-day accuracy & precision

Mean 23.25

SD 1.34

%RSD (n=9) 5.76

% Recovery 92.99

98




Peak area Peak

area

ratio

Found

(mg/L)

colistin

B

colistin


1

1 261898 92983 168844 25746 1.824 164.39

2 260097 90709 167098 25790 1.819 163.98

3 259278 92570 167760 25989 1.816 163.75


2

1 232590 76098 160598 24967 1.664 151.04

2 234908 79098 162080 24326 1.685 152.79

3 236789 71589 162776 24409 1.647 149.70


3

1 234959 69412 169011 23050 1.585 144.48

2 241903 71909 169091 23187 1.632 148.42

3 239089 68333 168091 24081 1.600 145.73



Mean 153.81

SD 9.20

%RSD (n=9) 5.98

% Recovery 102.54

99




Peak area Peak

area

ratio

Found

(mg/L)

colistin

B

colistin


1

1 622671 287776 158900 17345 5.166 442.90

2 623157 288092 159034 17893 5.150 441.62

3 625830 300574 160264 17956 5.198 445.59


2

1 634812 270148 155119 14799 5.326 456.24

2 633945 269431 154080 14678 5.353 458.51

3 633121 257073 153776 14524 5.289 453.19


3

1 621146 258991 154098 15655 5.185 444.48

2 622983 260125 155091 15692 5.171 443.33

3 624001 264599 155026 15895 5.199 445.66



Mean 447.95

SD 6.98

%RSD (n=9) 1.56

% Recovery 111.99

100

3. การทดลองหาวธการเตรยมตวอยางทเหมาะสม การทดลองหาสารละลายทเหมาะสมทใชสาหรบการตกตะกอนตวรบกวน( precipitating reagent) ในตวอยาง medicated feed ชนด B กอนนาไปทา SPE

จากการทดลองการใชสารละลาย trichloroacitric acid (TCA) เขมขน 30%,v/v (ใน DI

water) เปน precipitating reagent พบวา สารละลาย trichloroacitric acid (TCA) เขมขน 30%,v/v

(ใน DI water)

รปท ก.17 chromatogram ของสารละลายตวอยาง medicated feed เมอใช TCA เขมขน 30%,v/v (ใน

DI water) เปน precipitating reagent

4. การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated premix และตวอยาง medicated feed ตารางท ก.7 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ A

101

ตารางท ก.8 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ B

ตารางท ก.9 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ C

ตารางท ก.10 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated premix ยหอ D

102

ตารางท ก.11 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 10% (g colistin/g feed)

ตารางท ก.12 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด A เขมขน 40% (g colistin/g feed)

ตารางท ก.13 ผลการวเคราะหตวอยาง medicated feed ชนด B เขมขน 80 ppm (mg colistin

sulfate/kg feed)

103


sulfate/kg feed)


sulfate/kg feed)

104

5. การทดลองหาปรมาณ colistin sulfate ในตวอยาง medicated feed ชนด B โดยวธการใช standard addition method

ตารางท ก.16 ผลการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห ( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg) ชดท 2


(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin


2.016 0 0.00 75618 37519 135034 15247 0.75

2.031 0.2 98.49 330409 25633 133840 57221 1.86

2.040 0.4 196.08 352320 124614 140289 20794 2.96

2.026 0.6 296.14 452015 103791 126349 21254 3.77

รปท ก.18 กราฟ standard addition method ของการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห

(ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 80 mg/kg) ชดท 2


y = 0.0103x + 0.8182 R² = 0.994

-4.00

-3.00

-2.00

-1.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

-400.00 -300.00 -200.00 -100.00 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00300 00 400 00 0 00500

mg colistin sulfate/kg feed

Peak area ratio

105



(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin


2.010 0 0.00 295678 67432 287605 243671 0.68

2.025 0.2 98.75 679034 243784 298090 249012 1.69

2.009 0.4 199.09 990342 342553 281994 265343 2.44

2.018 0.6 297.32 1429989 589745 291002 287676 3.49




y = 0.0092x + 0.6995 R² = 0.9956

-2.00

-1.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

-300.00 -200.00 -100.00 0.00 100.00 200.00 300.00 400.0000.00 300.00 0.00400


Peak area ratio

106



(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin


2.002 0 0.00 217511 98316 138802 20899 1.98

2.032 0.2 98.42 402829 146223 136724 14029 3.64

2.057 0.4 194.46 500692 192337 137491 12190 4.63

2.060 0.6 291.25 686299 241491 129893 22342 6.09


( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 150 mg/kg) ชดท 1


y = 0.0138x + 2.0767 R² = 0.9923

-2.00

-1.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

-300.00 -200.00 -100.00 0.00 100.00 200.00 300.00 400.0000 300 00 0 00400


000 Peak area ratio

107

ตารางท ก.19 ผลการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห ( ความเขมขนของตวอยางท

ระบขางฉลาก 150 mg/kg) ชดท 2


(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin


2.0084 0 0.00 220966 99712 141908 18922 1.99

2.0284 0.2 98.60 415542 150981 139878 15090 3.66

2.0431 0.4 195.78 522234 199823 140980 16436 4.59

2.0040 0.6 299.40 687237 250065 139099 12887 6.17




y = 0.0135x + 2.094 R² = 0.9905

-1.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

-300.00 -200.00 -100.00 0.00 100.00 200.00 300.00 400.0000 300 00 0 00400


Peak area ratio

108



(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin


2.0197 0 0.00 220075 98861 137671 14987 2.09

2.0059 0.2 99.71 447653 155661 145079 16650 3.73

2.0241 0.4 197.62 551296 218774 135448 15027 5.12

2.0113 0.6 298.31 699652 268876 134099 14459 6.52




y = 0.0148x + 2.1628 R² = 0.9983

-4.00

-2.00

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

-400.00 -300.00 -200.00 -100.00 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.000 300.00 400.00 0.00500

mg colistim sulfate/kg feed

Peak area ratio

109



(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin


2.0019 0 0.00 504610 218173 196704 87754 2.54

2.0057 0.2 99.72 870467 279572 189296 92719 4.08

2.0098 0.4 199.02 1212063 349872 198419 82991 5.55

2.0021 0.6 299.69 1452853 491436 211624 79313 6.68




y = 0.0139x + 2.6307 R² = 0.995

-4.00

-2.00

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

-400.00 -300.00 -200.00 -100.00 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00300.00 400.00 0.00500


000000Peak area ratio

110



(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin


2.0223 0 0.00 380573 68424 154426 15890 2.64

2.0076 0.2 99.62 410677 151950 133252 12190 3.87

2.0005 0.4 199.95 713109 222765 148791 19152 5.57

2.0057 0.6 299.15 652852 296955 126173 13712 6.79




y = 0.0142x + 2.5916 R² = 0.9957

-4.00

-2.00

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

-400.00 -300.00 -200.00 -100.00 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.000 300.00 400.00 0.00500


00Peak area ratio

111



(g)

Added

colistin

(mg)

mg colistin/

kg feed

Peak area Peak

area

ratio

colistin

B

colistin


2.0093 0 0.00 357458 71623 145699 14489 2.68

2.0057 0.2 99.72 449954 160987 134098 14091 4.12

2.0124 0.4 198.77 711488 200128 139658 15215 5.89

2.0201 0.6 297.01 923345 266955 156878 15890 6.89

รปท ก.25 กราฟ standard addition method ของการวเคราะหตวอยางททดลองใน 1 ชดการวเคราะห( ความเขมขนของตวอยางทระบขางฉลาก 200 mg/kg) ชดท 3

จากกราฟ standard addition method ไดสมการเสนตรงคอ y = 0.0145x + 2.7291 จะหา

จดตดแกนแกน x แทนคา y = 0 ในสมการ ไดคา x = 188.21 mg colistin sulfate/ kg feed

y = 0.0145x + 2.7291 R² = 0.9903

-4.00

-2.00

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

-400.00 -300.00 -200.00 -100.00 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00300 00 400 00 0 00500


y = 0.0145x + 2.72²

Peak area ratio

112

ประวตผวจย

ชอ-สกล นางสาวพวงทอง พวงแกว ทอย 23 ถนนแสงชโตใต ตาบลทาลอ อาเภอทามวง

จงหวดกาญจนบร ประวตการศกษา

พ.ศ. 2549 เปนนกศกษาโครงพฒนาและสงเสรมผมความสามารถพเศษทาง วทยาศาสตรและเทคโนโลย (พสวท.) ในภาควชาเคม คณะวทยาศาสตรมหาวทยาลยศลปากร

พ.ศ. 2552 สาเรจการศกษา ปรญญาวทยาศาสตรบณฑต สาขาวชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร เกยรตนยมอนดบ 2 พ.ศ. 2553 เขาเรยนหลกสตร ปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาเคมวเคราะห คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร

2555 ิทยาลัทยาลิลปากรยศ...animal feed by high performance liquid...

Documents