藥用植物細胞培養與二次代謝物生產

中華民國九十六年八月二十七日

•一. 植物細胞培養的重要應用•二. 植物二級代謝物的重要性•三. 藥用植物栽培目前遭遇之問題•四. 藥用植物細胞培養之優點•五. 植物細胞培養技術之分類•六. 植物二級代謝之生產•七. 結論

課程大綱

植物組織培養

•將植物體的部分細胞或組織與母體分離，在適當的條件下加以培養，使它們能夠生長、發育、分化與增殖的技術

•原理是來自植物細胞的全能性分化能力，也就是植物體內的某一類細胞，能夠獨立發育並且分化成為完整的植物成體。

組織培養

• 1898 Harberlandt提出植物細胞具有分化成整株植物的分化全能能力。他進行植物細胞的培養，但細胞僅存活一個月，而且沒有分化。

• 1939 Gautheret & White可以長期繼代培養胡蘿蔔與煙草細胞。• 1957 Skoog & Miller 發現培養基中auxins(植物生長素) cytokinins

(細胞分裂素)的比例可以決定煙草細胞分化成根或芽。• 1958/59 Reinert, Steward由胡蘿蔔的體細胞培養出體胚。• 1960 Morel建立了利用蘭花莖頂細胞培養來大量繁殖無病毒幼苗

的技術。• 1962 Morel & Skoog 提出培養液的Murashige 基本配方。• 196？ Cocking 利用酵素分解細胞壁，開始進行細胞質體培養。

臺灣珍稀藥用植物

•藉由誘導莖節再生可以繁殖海芙蓉、台灣龍膽、輪葉沙參和臺灣金線連種苗

•利用組織培養誘導當歸及延胡索體胚發生與分化。

•此外，也建立臺灣紅豆杉、臺灣白芷和恆春山藥的細胞懸浮培養技術，並分別生產紅豆杉醇、白芷素和山藥皂素等藥效成分。

細胞懸浮培養技術用於培養大量的植物細胞，以萃取重要的植物二次代謝物，並可減輕由野外棲地採集野生

植物的壓力。

• 紅豆杉（紫杉）紫杉醇為威尼（Wani）博士與其研究人員，於一九六九年從太平洋紫杉的樹皮中萃取而來，是一種雙草烯胺類的化合物，同時發現此化合物具有抗腫瘤效果。最近，美國食品藥物管理局（FDA）已允許利用紫杉醇治療卵巢癌及乳癌，且對於黑色素腫瘤、肺癌與其他固體腫瘤亦具有療效。

如果，自紫杉樹皮萃取紫杉醇是商業上的唯一來源，大約三公釐厚的太平洋紫杉樹皮只含0.001％的紫杉醇，一棵百年老樹大約有三公斤的樹皮，約含有 30 毫克的紫杉醇，此量僅為治療一位癌症病人一次療程的劑量。若以一個全程治療需要二公克紫杉醇來計算，則需要七棵百年紫杉老樹的樹皮才足夠一個癌症病人的需要，因此紫杉醇臨床的供應上仍然存在著許多限制。

對一棵樹進行剝皮處理，無疑將殺死這一棵樹，因此大規模採集紫杉樹皮以生產紫杉醇，將導致太平洋紫杉在短短數年內即自地球上消失。基於上述理由，研究癌症化學治療藥劑紫杉醇的另一種生產方式，是目前最熱門的課題。

世界上大約有 11 種紫杉屬植物，且都生長於北半球。目前為止已有 10 種紫杉屬植物建立組織與細胞培養系統，其中包括體胚及體胚相似物的培養。而且大部分均含有抗癌的植物鹼——紫杉醇，以及與紫杉醇相似的化合物。

臺灣紅豆杉是生長於海拔約二千公尺左右的臺灣特有珍貴樹種，已被列為瀕危且急需保護的稀有高級樹種。為了開發紫杉醇的新來源，針對臺灣紅豆杉的樹皮與葉片等不同組織的萃取液，利用高效液相層析儀，進行紫杉醇與紫杉醇相關化合物定性與定量分析，結果顯示臺灣紅豆杉葉片萃取液中具有較高的紫杉醇與其類同物含量。

• 山藥為薯蕷屬、薯蕷科植物，在傳統中藥中常用為滋補強壯劑。臺灣土產恆春山藥的塊根含有高品質與高產量的活性化合物，已被農民廣泛繁殖與栽培。山藥塊根在市場上常供不應求，主要因為塊根不僅具有藥用的功效，亦可做為食物的來源，而塊根中最重要的活性化合物──山藥皂素，是合成多種重要類固醇藥物的前驅物。

為增加山藥皂素的產量，以及熟練其純化的過程，農試所及朝陽科技大學已成功建立恆春山藥的細胞懸浮培養。利用來自恆春山藥的零餘子或莖節的癒合組織，培養於含有 0.1 毫克／公升二氯苯氧乙酸與 3％蔗糖的液態穆拉許給─史酷格培養基中，以轉速為每分鐘 120 轉的震盪器培養，可得細緻且分散均勻的懸浮細胞。雖然 6％蔗糖的處理可獲得較大的細胞生產量，但山藥皂素的產量仍以 3％蔗糖的處理較高。

利用高效液相層析儀，分析不同培植體來源的懸浮細胞中山藥皂素含量，結果發現零餘子來源的懸浮細胞每克乾重含有 3.3％的山藥皂素，明顯高於莖節來源的 0.3％。比較組織培養品與栽培的塊根，發現零餘子來源懸浮細胞中山藥皂素的含量幾乎和塊根一致，因此利用細胞懸浮培養技術生產山藥的活性化合物──山藥皂素，應是相當可行的方法。

將傳統藥用植物的種原，以無菌培養的方式加以保存，對於提供化學上分析與醫藥上研究是相當重要的課題。利用組織培養繁殖技術，除了可大量生產無感病的本土藥用植物，使它們在自然棲地上重現外，更可在國際研究機構間進行種原的安全交換。此外，根據研究結果指出，利用植物細胞懸浮培養的方式，可生產紫杉醇、山藥皂素與白芷素等重要的醫藥用化合物，值得業界投入進行量產。

一. 植物細胞培養的重要應用

•1. 育種與品種改良•2. 人工種子•3. 藥用植物基材生產•4. 二級代謝物生產•5. 基因重組蛋白表現系統•6. 基因功能解析

二. 植物二級代謝物的重要性

•中草藥使用率逐年增加,在美國1993年3%的人增加到1998年的37%的人口使用植物治病

•全世界超過75%人口依賴植物來源的藥物治病•在美國每年植物來源藥物銷售值約30億美金•25%之臨床用藥來自於植物•植物精油與食品添加市場超過50億美金之產值

•這些產品大多為植物之二級代謝物

三.藥用植物栽培目前遭遇之問題

•天然環境改變,適當棲息地愈來愈少•氣候每年改變,品質難以掌控•栽培面積大,土地成本高•栽種期長,耗費人工多•cGMP困難•植物細胞培為可能解決方法之一

四.藥用植物細胞培養之優點

•品系穩定,產品品質不受環境影響•自動化程度高,人工土地使用精簡•大量化容易,符合cGMP要求•結合基因工程技術,易於提高活性物質濃度

•無GMO環境污染疑慮•產品回收容易•可產生特殊代謝產物

五.植物細胞培養技術之分類

1. 懸浮性細胞培養(Suspension Cell Culture)優點: 製備容易,成長快速易於操作,有適當生物

反應器可用,易於放大缺點: 需植物激素,無分化機制,不利二級代謝物

生產,細胞穩定性差適用:大量生產單細胞,基因轉殖細胞培養

日日春細胞

2.植物組織培養(Plant Tissue Culture)

•優點:具細胞分化機制,可生產二級代謝物

•缺點:大量化困難,製備費時•適用:植株再生,二級代謝物生產

3.固定化細胞培養(Immobilized Cell Culture

•優點:具細胞組織化,可生產二級代謝物,可連續操作生產,容易大量化,產物容易回收

•缺點:製備費時,不耐高剪切力,批次間變異大

•適用:高單價且分泌型二級代謝物之生產

4.毛根狀組織培養(Hairy Root Culture)

•優點:具細胞分化與組織能力,培養基簡單不需植物激素,具高二級代謝物生產力,基因穩定,可連續式生產

•缺點:尚無適當生物反應器,大量化困難

•適用:高單價二級代謝物之生產

誘導方法:

植物組織(根,莖,葉)表面殺菌

Agrobacterium rhizogenes infection

Petri Dish Selection

Flask or Bioreactor

Antibiotics

Hairy root of Datura stramonium

Hairy root of Digitalis lanata

六. 植物二級代謝之生產

•1. 何謂二級代謝物?•2. 二級代謝物的功能•3.二級代謝物的生理功能•4. 影響二級代謝物的因素

二級代謝物•由一級代謝物(amino acid,glycolysisintermidiate,TCA,fatty acid,…)所組成

•通常與細胞成長無關,與細胞組織化,細胞分化有關

•具有對抗環境之功能,如抗蟲,抗旱,殺菌,抗uv等功能

•具有提升免疫,抗自由基,抗菌,抗病毒,抗腫瘤等生理功能

•種類包括Flavonoids,Terpenoids,Polyketides,Alkaloids,Steroids,Polysaccharides,

植物細胞培養生產二級代謝物之策略

•1. 細胞株篩選•2. 培養基最適化•3. 培養條件最適化•4. 誘導刺激物(Elicitor)添加•5. 前驅物或中間產物添加•6. 反饋抑制之移除•7. 基因工程技術

誘導刺激物(Elicitor)添加

•許多植物二級代謝物與對抗細菌,病毒,昆蟲等有關,適當給予這些壓力,有助代謝物之產生

•細胞感染,細胞組成刺激,金屬離子刺激等均有提升產量之功效

•結論:若能了解二級代謝物之原始功能,添加Elicitor,對產量將有非常大之幫助

反饋抑制之移除

•二級代謝物對細胞而言具有毒性,過量儲存於細胞內會有反饋抑制現象

•連續將二級代謝物由細胞內釋放,進一步由培養基中移除對產量有很大提升效果

•結論:產物釋放與吸附將有效解除反饋抑制提高生產效率

七.結論

•植物組培具有可cGMP化,適合中草藥產業

•植物組培技術仍處嬰幼兒階段,對技術導向公司有利

•適當生物反應器之設計與開發,是植物組培技術能否商業化的關鍵

•台灣本土性藥用植物值得研發

謝謝指教