Secuenciación de proteínas

Métodos de: Sanger Edman

La secuenciaciòn de proteínas es el proceso por medio del cual se determina el orden exacto de los residuos de aminoácidos en una proteína, es decir, su estructura primaria

Frederick Sanger(1918 -), investigador de la universidad de Cambridge (Inglaterra) es uno de los pioneros en la secuenciación de proteínas. Sanger se dedicó a la investigación del metabolismo de los aminoácidos y la determinación de la estructura de la insulina.

Para identificar al aminoácido localizado en el

extremo amino terminal de la cadena polipeptídica, Sanger desarrolló un método, en el cual el dinitrofluorobenceno (DNFB) reacciona con los grupos α-amino de los aminoácidos N-terminales, para formar un dinitrofenil-derivado (DNP) del aminoácido. La unión entre el grupo DNFB y el aminoácido no se rompe por hidrólisis ácida suave. De este modo, el aminoácido que se ha transformado en el derivado DNP, puede ser aislado luego de la hidrólisis del polipéptido. El derivado DNP del aminoácido, que corresponde al extremo amino terminal, puede ser identificado por cromatografía de intercambio iónico, en papel o capa fina.

Degradación de Edman

La secuencia en una cadena de polipéptidos se puede determinar por el proceso de degradación de Edman ( la secuencia de residuos se denomina estructura primaria ). En cada ciclo de este procedimiento el residuo N-terminal de la proteína reacciona con el reactivo de Edman y se lleva a cabo una serie de reacciones que dan como resultado la ruptura de los enlaces peptídicos en los cuales se va a identificar la estructura del aminoácido N- terminal. 

Procedimiento

A pH de 9 el residuo N-terminal de una cadena polipeptídica reacciona con el reactivo de Edman. Posteriormente el tratamiento del feniltiocarbamoilpéptido con ácido trifluoroácetico (F3 CCOH) libera un derivado anilinotiazolina del residuo del aminoácido N- terminal sin romper los otros enlaces peptídicos de la cadena del polipéptido.

La anilinotiazolina se extrae y se trata con ácido acuoso, el cual provoca un reacomodamiento del derivado de modo que forma el derivado estable feniltiohidantoína.

Este derivado se puede identificar entonces cromatográficamente.

El resto de la cadena polipeptídica se regresa a las condiciones alcalinas, y el residuo de aminoácido que al principio estaba en segunda posición ahora es el nuevo residuo N-terminal y es sometido nuevamente al mismo procedimiento.

El rendimiento del procedimiento de degradación de Edman puede acercarse al 100%.

Con solo algunos picomoles de muestra se puede dar la secuencia de hasta 30 residuos o más.

Este método debe ser complementado por otros procedimientos de fragmentación para obtener la estructura primaria de proteínas grandes.