secuenciación automática

8/16/2019 Secuenciación automática

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INTRODUCCIÓN

Cada nucleótido está formado por un azúcar: ladesoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser de

cuatro tipos diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina

(C) timina (!) un grupo fosfato"

#a estructura de un determinado A$% está definida por la

ordenación o &secuencia& de las bases nitrogenadas enla cadena de polinucleótidos, residiendo precisamente en

esta secuencia de bases la información gen'tica del

A$%"

#a estructura en doble 'lice del A$%, con elapareamiento de bases limitado (A!* GC), implica que

el orden o secuencia de bases de una de las cadenas

determina automáticamente el orden de la otra, por ello

se dice que las cadenas son complementarias"


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SECUENCIACIÓN DE ADN

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Métodos clásicos de secuenciación

Método químico de Maxam y Gilbert Método enzimático de Sanger

Secuenciación automática empleando el método enzimático Secuenciación con cebadores fluorescentes Secuenciación con terminadores fluorescentes

Secuenciadores automáticos

Secuenciadores capilares Secuenciadores en geles desnaturalizantes

Equipamiento

Secuenciador en geles ABI 377 Modo operativo: Preparación de las muestras.

Otros métodos de secuenciación automática de ADN

Secuenciación de ADN empleando microarrays Pirosecuenciación

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Gracias a la +C, la &insuficiente cantidad de A$%& a no esuna limitación en la in-estigación en .iolog/a 0olecular, ni en

los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio del

A$%" 1l número de aplicaciones de esta t'cnica parecen

infinitas, continúan creciendo sin parar" 2na de sus posibles

aplicaciones se centra en la secuenciación del A$% demuestras biológicas"

PCR

Investigación

forense

Aislamiento

de genes

Estudios de

identidad y filiación

Mutagénesis

dirigida

Diagnóstico de

enfermedades

hereditarias y cáncer

Diagnóstico

de genes


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MÉTODOS CLÁSICOS DESECUENCIACIÓN

#os dos protocolos clásicos de secuenciación (m'todo

qu/mico enzimático) comparten etapas comunes"

Marcado: 1s necesario marcar las mol'culas a secuenciar

radiacti-a o fluorescentemente

Searación: Cada protocolo genera una serie de cadenassencillas de A$% marcadas cuos tama3os se diferencian en

una única base" 1stas cadenas de distintas longitudes

pueden separarse por electroforesis en

geles desnaturali!antes de acrilamidabisacrilamidaurea,

donde aparecen como una escalera de bandas cua longitud

-ar/a en un único nucleótido"

+ara obtener estas cadenas

se emplean dos procedimientos:

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MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM YGILBERT

1sta t'cnica consiste en romper cadenas de A$% de

cadena sencilla marcadas radiacti-amente con

reacciones qu/micas espec/ficas para cada una de las

cuatro bases"

#os productos de estas cuatro

reacciones se

resuel-en, por electrofor'sis,

en función de su tama3o en

geles de poliacrilamida donde

la secuencia puede leerse

en base al patrón de bandas

radiacti-as obtenidas"


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MÉTODO ENZIMÁTICO DESANGER

Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador,

cebador o "primer" complementario de una región

del ADN molde anterior a donde va a iniciarse lasecuencia.

Este cebador se utiliza como

sustrato de la enzima ADN

polimerasa I que va a

extender la cadena

copiando de forma

complementaria el molde

de ADN.

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SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICAEMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO

Es una alternativa al método de Sanger. Consisteen marcar el oligo cebador o los terminadores conun compuesto fluorescente y activar la reacción

de secuencia. Los productos de la reacción sedetectan directamente durante la electroforésis alpasar por delante de un láser que al excitar losfluoróforos permite detectar la fluorescenciaemitida.


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SECUENCIACIÓN EMPLEANDO CEBADORESFLUORESCENTES

4e realizan cuatro

reacciones de secuencia

distintas en cada una de

las cuales se a3ade eloligonucleótido o cebador

marcado con una sonda

fluorescente distinta un

dd%!+ diferente en cada

una de ellas" Al finalizar

las cuatro reacciones se

mezclan en un único tubo

Ó


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SECUENCIACIÓN EMPLEANDOTERMINADORESFLUORESCENTES

4e realiza una única reacción de secuencia en presencia

de los cuatro dd%!+s, cada uno de ellos marcados con

una sonda fluorescente distinta"

$e modo alternati-o, la secuenciación puede lle-arse a

cabo empleando terminadores marcados cada uno con unfluoróforo diferente" 1sta qu/mica es mas sencilla porque

permite lle-ar a cabo la reacción en un solo tubo, en que

se a3aden los cuatro terminadores marcados"


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SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS

Secuenciadores automáticos cailares

1xisten instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan

una alternati-a clara al sistema basado en geles de

acrilamida5bisacrilamida donde este soporte a sido sustituido

por un pol/mero que se inecta de forma automática en un

capilar antes de cargar la muestra de

secuenciación* las muestras se -an

analizando una a una" 1ste tipo de

secuenciadores se utiliza para lecturas

no superiores a unos 678pb"


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SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EN GELESDESNATURALIZANTES DE ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA

#a secuenciación automática mediante geles

desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de

acrilamida5bisacrilamida entre dos cristales montados

adecuadamente sobre el cassette que sir-e de soporte para

los mismos que posteriormente se acoplará en el

secuenciador automático para proceder a la carga de la

muestras"#a secuenciación automática

mediante geles desnaturalizantes, se

realiza polimerizando un gel de

acrilamida5bis entre dos cristalesmontados adecuadamente sobre el

cassette que sir-e de soporte para los

mismos que posteriormente se

acopla en el secuenciador automático

para proceder a la carga de lamuestras"


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EQUIPAMIENTO

Secuenciador automático ABI 377

9ntroducir en un tubo de +C la muestra de A$% de doble cadena, el

primer a utilizar la mezcla de reacción9+rogramar la reacción de +C (multiplicación del A$%) sometiendo lamezcla anterior a ;7 ciclos de las siguientes caracter/sticas: C

(desnaturalización), ?7s a 67>C (anillamiento) 6min" a @8>C (elongación)"91nfriar el tubo a 6>C9+urificar el resultado de la reacción de secuencia de +C, en una

solución de etanol cloruro magn'sico: dear precipitar la mezcla,

centrifugar eliminar por aspiración el etanol"9esuspender el resultado de la reacción de +C en un peque3o -olumen

de formamida: azul de dextrano"9$esnaturalizar la muestra calentándola durnte ; min" a =8>C" 1nfriar en

ielo"

9Cargar los fragmentos de A$% fluorescentes en el gel de secuencia"

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OTROS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

Secuenciación de AD" emleando microarrays

Princiio:

1xisten mucas -ariedades de microarras o A$%cips como

tambi'n se les denomina" .ásicamente un microarra consiste

en una matriz de &pocillosB microminiaturizados sobre un

substrato de -idrio en donde se

implantan, utilizando di-ersas t'cnicas, cadenas simples de

oligonucleótidos"

1l poder aderir una cadena corta de oligo

4obre una superficie plana es decisi-o en el dise3o de los

microarras"


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$ado que conocemos la secuencia distribución

de los oligonucleótidos en el microarra podemos,

al excitar el microarrra con un laser estar las

cadenas ibridadas fluorescentemente, conocer laubicación de las cadenas de las mismas su

secuencia"

#isuali!ación t$ica de una secuenciación mediante microarrays


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Pirosecuenciación

4e trata de un m'todo simple consistente, útil para la

secuenciación de fragmentos de A$% de tama3os

peque3os o medianos"

1tapas del proceso:

9 2n cebador espec/fico se une a una cadena de A$%sencilla en presencia de d%!+4, A$% polimerasa, A!+

sulfurilasa, luciferasa apirasa as/ como de los

sustratos A+4 (adenosina 7 fosfosulfato) luciferina"

9

1l primero de los cuatro d%!+s se a3ade a la reacción"#a A$% polimerasa cataliza su incorporación a la

cadena* si este d%!+ es complementario de la

secuencia del A$% molde se libera ++i en una cantidad

equimolar a la cantidad de nucleótido incorporado"


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APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN DE ADN

$etección de mutaciones

4ecuenciación de A$%s fósiles

$iagnóstico de enfermedades gen'ticas

dentificación de especies control de cruces

entre animales

+roecto genoma umano


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PROYECTO GENOMA HUMANO

1l +roecto Genoma umano es un proecto

internacional cuo obeti-o final es obtener una

descripción completa del genoma umano a tra-'s

de la secuenciación del A$%" 1l genoma que se

in-estiga es el genoma nuclear"

$esde su inicio, el proecto a

sido ustificado especialmente por los

beneficios m'dicos que se espera

obtener del conocimiento de la

estructura de cada gen umano"


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secuenciación automática

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