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TAK-751S(Gb3ア ナ ログ)の 志 賀 毒 素 吸着 作 用

1)国立小児病院小児医療研究センター感染症研究部

2)武田薬品工業株式会社創薬研究本部薬理研究所

竹 田 多 恵1)吉 野 健 一1)足 立 枝里 子1)山 形 匡子1)

内田 寛1)小 此木 研 二2)飯 沢 祐 史2)

(平成10年6月9日 受付)

(平成10年7月14日受理)

Key words: TAK-751S, Shiga toxin, enterohemorrhagic E. coli,

toxin adsorbent, Gb3 analog

要 旨

志 賀毒 素(Stx)吸 着 剤 であ るTAK.751S(Synsorb Pk)のin vitro有 効 性 につ い て検 討 した.簡 便

性,迅 速性 を勘 案 し,精 製 したStx1お よびStx2を 用 い,培 養 細胞(ACHN)に よる比 色法 に よ りTAK-

751Sの 特 異的 毒素 吸着作 用 お よび各種 条件 下 にお け る毒 素吸 着作 用 に及 ぼす影響 を検 討 した.

その結果,37℃,60min反 応 させ るこ とに よ りStx受 容体 と類似 す る化 学構造 を もつ本 剤 は,ヒ ト消

化管 内 と似 た条 件下 でStx1お よびStx2を よ く吸着 し,基 材 のChromosorb Pと は異 な る特異 的毒 素吸

着性 を示 す こ とが確 認 で きた.さ らに,臨 床 で混 合 され る可能 性 の高 い加工 食 品,新 鮮 な野菜 や果物 お

よび抗 菌薬 な どの存 在下 におい て もTAK-751SのStx吸 着能 は影響 を受 けず,ま た,抗 菌薬 その もの の

抗 菌力 を低 下 させ ない ことが 明 らか とな り,腸 管 出血 性大 腸菌 感染 症 の治療 に本 剤 を種 々 の食 品 と混 ぜ

て抗菌 薬 を併用 投与 して も差 し支 えない もの と考 え られ た.

序 文

腸 管 出 血 性 大 腸 菌(Enterohemorrhagic Es-

cherichia coli; EHEC)1)2)は,1977年Konowal-

chukら が 患 者 の血 便 か ら分 離 し,Vero細 胞 に毒

性 を示 す 毒 素 を産 生 す る こ とを報 告3),そ れ以 来,

そ の 毒 素 はVero毒 素(VT)と 呼 ば れ,出 血 性 大

腸 炎(HC),溶 血 性 尿 毒 症 症 候 群(HUS)4)あ る い

は血 栓 性 血 小 板 減 少 性 紫 斑 病 の誘 因 と して 知 ら れ

て い る.

研 究 の進 歩 と と もにVTの 種 類 や 数 も増 加 し,

か つ,VT1が 赤 痢 菌 の 産 生 す る志 賀 毒 素 と同 一 で

あ る こ と5)か ら一 時 期,志 賀 毒 素 様 毒 素(Shiga-

like toxin;SLT)と 呼 ば れ た6)が,現 在 で は一 般

に志 賀 毒 素(Shiga toxin;Stx)と 総 称 さ れ て い

る7)8).

EHEC感 染症 は,海 外で は1982年 米合衆国 の

ファース トフー ドレス トランチェーン店の集団発

生事例のハ ンバーガーか らEHEC O157:H7が

確認9)され,ハ ンバーグ病 とも呼ばれている.

その後,規 模の違いこそあれカナダ,欧 州,オ ー

ス トラリア,南 アメリカ,ア フリカで も集団発生

がある.本 邦 においてもEHEC O157に よる1990

年の集団発生10)から急速 に研究の進歩があり,ま

た,行 政による対策が採 られるようになってきて

いるが,本 疾患の発生動態,感 染経路,予 防法,

治療法など解決されなければならない問題が残 さ

れている.

1996年 大阪府堺市における世界最大 ともいわれ

る本感染症の集団発生11)に先立ち,本 邦における

対策の一環 として1996年6月,腸 管出血性大腸菌

感染症の診断治療 に関する研究班が設置 され,一

別刷請求先:(〒154-0004)世 田谷 区太子堂3-35-31

国立小児病院小児医療研究センター感染

症研究部 竹 田 多恵

感染症学雑誌 第72巻 第9号

TAK-751Sの 志賀毒素吸着作用　 925

次,二 次医療機関のためのO157感 染症治療のマ

ニュアルが策定 された.引 き続き,同 年9月,治

療法 を探索す るためEHECが 産生するStxに 対

して,厚生省 はベロ毒素吸着剤の研究班を設置し,

Stx吸 着剤の研究が開始 された.既 に,Armstrong

らがStxの 宿主受容体 であるグロボ トリオ シル

セラ ミド(Gb3)と 類似の化学構造をもつように珪

藻土基材(Chromosorb P)に 化学的にトリサッカ

ライ ドを導入 したGb3ア ナログ(Synsorb Pk,武

田薬 品工業株式会社 の治験薬 コー ド名:TAK-

751S,Fig.1)がStxを 吸着することを報告12)し

ていた ことか ら,筆 者 らはその開発会社 である

SYNSORB Biotech Inc.(以 下SBI社)を 訪問,

詳細を調査した結果,第1相 試験13)における健康

成人志願者糞便から回収されたSynsorb Pkに は

HCあ るいはHUSの 小児患者の糞便中のStxを

in vitroで 吸着する活性が残存 してお り,こ の こ

とはChromosorb Pに 共有結合 した8-メ トキ シ

カルボニルオクチル トリサッヵライ ドがヒ トの胃

および小腸などの消化過程においても化学的にも

消化酵素学的にも分解 を受け難いこと,お よび乳

幼児,小 児 を対象 とした第II相 比較試験でプラセ

ボ投 与 群 に比 べ て本 剤 投 与 群 で はHUSへ の移 行

を抑 制 し,死 亡 例 や 問題 とな る有 害 事 象 が な い こ

とが 判 明 した.本 邦 のEHEC感 染 症 の 発 生 が収 束

傾 向 で は あ った が,本 剤 が 乳 児 に も安 心 して 投 与

で き る内 服 製 剤 で あ り,早 急 に そ の 効 果 を検 討 す

る価 値 が あ る もの と考 え,本 剤 の毒 素 吸 着 特 異 性,

本 剤 と混 合 使 用 され る可 能 性 の あ る食 物 や抗 菌 薬

な どの 毒 素 吸 着 に 及 ぼす 影 響 な ど の基 礎 的検 討 を

行 っ た の で そ の 結 果 を報 告 す る.

材 料 と方 法

1.吸 着 剤

TAK-751S (Synsorb Pk; Lot No, A05-002,

961-009; SYNSORB Biotech Inc.)お よび そ の

基 材 で あ るChromosorb P (Lot No.8 31, World

Minerals)を 使 用 した.こ れ らの う ちSynsorb Pk

Lot No. A05-002は カ ナ ダ 小 児 腎 臓 病 研 究 セ ン

ター のE.Orrbine博 士 か ら,Lot No.961-009は

SBI社 か ら贈 与 を受 けた.ま た,Chromosorb Pは

カ ナ ダ ア ル バ ー タ大 学 のG.D.Armstrong博 士 か

ら贈 与 を受 け た.

2.志 賀 毒 素(Stx)

Stx1とStx2の 精 製 に は そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 を組

Fig.1 Chemical structure of TAK-751S (Synsorb Pk)

Chemical name: 8-carbamoyloctyl α-D-galactopyranosyl (1-4) β-D-galactopyranosyl (1-4).

β-D-glucopyranoside siloxypropyl diatomite

平成10年9月20日

926　 竹田 多恵 他

み 込 ん だ組 換 え型 大 腸 菌 を使 用 した.す なわ ち,

Stx1は,Escherichia coli(以 下E.coli)O157:

H7 strain 83-1386のStx1遺 伝 子 領 域2.1kb Bam

HI-Blg II断 片 を ベ ク タ ーpUC118に 組 み 込 み,

こ れ をE.coliMC1061に 形 質 転 換 した もの で あ

る14).Stx2は,E.coliO157:H7strainJ-2のStx2

遺 伝 子 領 域4.6kb EcoRI断 片15)を ベ ク タ ー

pCH283に 組 み 込 み,こ れ をE.coli MC1061に 形

質 転 換 した もの で あ る.そ れ ぞ れ の 菌 体 抽 出液 か

ら精 製 を行 った.精 製 法 は 基 本 的 に は既 報16)17)に

従 った.精 製 の 最 終 段 階 で 高 速 液 体 ク ロマ トグ ラ

フ ィ ー に よ るゲ ル ろ過(TSK-gel G-2000SW)を

行 い,単 一 の ピ ー ク とし て得 られ る標 品 を用 い た.

得 ら れ た 精 製Stx1,Stx2は 強 い 毒 性 を 示 し,

1～10pg/mlで 培 養 細 胞(ヒ ト尿 細 管 腫 瘍 細 胞;

ACHN)に 対 し て50%の 細 胞 毒 性(CD50)を 示 し

た.

3.溶 解 液,加 工 食 品,野 菜 や 果 物 な どの生 鮮 食

品 お よ び抗 菌 薬

Phosphate buffered saline, pH7.0 (PBS)お

よ びEagle's-MEM (EMEM)は 日水 製 薬 製 品 を,

Tryptic soy broth (TSB), Mueller-Hinton broth

(MHB)はDifco社 製 品 を使 用 した.

加 工 食 品 の う ち ペ ー ス ト状 の チ ョコ レ ー ト,

ヨー グル ト,カ ス タ ー ドプ リ ン は市 販 品 を,ベ ビー

フー ド(鴨 肉 シチ ュ ー,ビ ー フ デ ィナ ー)お よび

お 粥 は 当院 の使 用 品 を 用 い た.ま た,生 鮮 野 菜 お

よび 果 物 類 は 市販 品 を購 入 し,直 ち に 実 験 に供 し

た.

Fosfomycin(FOM;静 注 用 ホ ス ミシ ン(R)S,明

治 製 菓),kanamycin(KM;注 射 用 硫 酸 カ ナ マ イ

シ ン明 治,明 治 製 菓)は 市 販 品 を用 いた.norflox-

acin(NFLX)は バ ク シダ ー ル(R)錠(杏 林 製 薬)か

ら武 田 薬 品 研 究 所 で 抽 出 した も の を用 い た .各 薬

剤 は1.28mg/mlと な る よ う にPBSお よ びTSB

に溶 解 した.た だ し,NFLXに つ い て は最 終 液 量

の5%の1規 定NaOHで 溶 解 後,PBSお よ び

TSBで 最 終 液 量 とし た.

4.TAK-751Sの 毒 素 吸 着 性 の検 討

1)StxのACHN細 胞 毒 性 に対 す る 吸 着 剤 の

中和 活 性 の測 定

TAK-751Sお よ び そ の 基 材 で あ るChrornosor-

bPのStx吸 着 特 異 性 を ニ ュー トラ ル レ ッ ド法18)

を 改 変 した 方 法19)に よ り検 討 した.2mlの 蓋 付 き

遠 心 分 離 用 プ ラ ス チ ック チ ュー ブ(Eppendorf-

microcentrifuge tube)にPBSま た はTSB 1ml

お よびTAK-751Sあ るい はChromosorb P50mg

を 測 り入 れ,Stx1ま た はStx225ngを 添 加 し た

後,密 栓 し,小 型 回 転 培 養 器(48rpm)に 装 着 し,

37℃,60minイ ン キ ュベ ー トした.そ の 混 合 物 を

0.22μmの メ ン ブ ラ ン フ ィル タ ー(Millipore)で

滅 菌 ろ過 し,ろ 液 か らE-MEMで2倍 段 階 希 釈 系

列 を作 成 した.各 希 釈 液10μlを90μlのACHN細

胞 浮 遊 液(105個)に 添 加 し,37℃,3日 間CO2イ

ンキ ュベ ー タ ー で 培 養 後,生 残 細 胞 数 をニ ュ ー ト

ラ ル レ ッ ド法(波 長540nmの 吸 光 度)で 比 色 定 量

した.な お,Stx1ま た はStx2を 溶 解 液 に加 え て 同

様 に処 理 し た もの を対 照 と した.

2)Stx以 外 の細 胞 毒 性 阻 害 因 子 の 検 討

Stx以 外 の細 胞 毒 性 阻害 因 子 の有 無 を検 討 す る

た めE.coli O157:H7V4425株(1996年 堺 市 集 団

株)を 用 い た.菌 体 を10%牛 胎 児 血 清(FCS)を

含 有 す るE-MEMで37℃,一 夜 培 養 後,そ の 培 養

上 清1ml(Stx1お よ びStx2約50ng/mlを 含 有)に

TAK-751Sあ るい はChromosorb P50mgを 加 え

37℃,60minイ ンキ ュベ ー ト後,1)と 同様 な 方 法

でACHN生 残 細 胞 数 を測 定 した.

3)健 康 成 人 糞 便 の添 加

PBS1mlに 健 康 成 人 糞 便 約0.2ml(20%v/v)を

加 え,上 記1)と 同様 な 方 法 に よ り毒 素 吸 着 性 を検

討 した.対 照 と してPBSの み,PBSと 糞 便 の 群 を

設 け た.

4)TAK-751Sの 毒 素 吸 着 に及 ぼ す 影 響 の検 討

各 種 ベ ビー フ ー ドお よ び お粥 は50%(v/v)水 懸

濁 液 を,ま た,新 鮮 な 野 菜 や 果 物 の う ち レタ ス と

キ ャベ ツ は乳 鉢 で摩 砕 し,そ の他 の もの は す り下

ろ し,E-MEMで4倍 に希 釈 した 後,Stx溶 液(8

ng/mlのStx1ま た はStx2)と 等 量 混 合 した .そ の

混 合 液 にTAK-751S50mgを 加 え て1)と 同 様 な

方 法 でACHN生 残 細 胞 数 を測 定 し た.対 照 と し

て 毒 素 単 独 群,食 物,果 汁 な どの 単 独 群 を設 け た.

抗 菌 薬 添 加 の 場 合 に はFOM,KM,NFLXそ れ

感染症学雑誌 第72巻 第9号

TAK-751Sの 志 賀 毒素 吸 着 作 用　 927

そ れ0.64mg,TAK-751S 50mg,Stx1ま た はStx2

25ngをTSB1ml中 で1)と 同 様 な 条 件 で イ ン

キ ュベ ー トし,1)と 同様 な 方 法 で毒 素 吸 着 性 に 及

ぼ す 影 響 を検 討 した.対 照 と してTSBと 抗 菌 薬

お よびTSBと 毒 素 の 群 を設 け た.

5.吸 着 剤 処 理 の 抗 菌 薬 液 お よ び菌 液 の 調 製

PBSお よ びTSBで20mg/mlに 懸 濁 した 吸 着

剤(TAK-751Sま た はChromosorb P)1mlと そ

れ ぞ れ 同 じ溶 解 液 で1.28mg/mlに 調 製 し た 抗 菌

薬 液1mlを 混 和 し,毎 分12回 転 で 転 倒 攪 拌 しな が

ら37℃,60minイ ンキ ュベ ー トした.こ の 混 合 液

を0.22μmの メ ン ブ ラ ン フ ィル タ ー(Millipore)

で ろ過 し た もの を 吸 着 剤 処 理 後 の0.64mg/ml濃

度 の抗 菌 薬 液 と した.使 用 した 菌 株 は,Staphylo-

coccus aureus FDA 209Pお よ びEscherichia coli

NIHJ JC-2を 用 い た.い ず れ も 菌 体 をTSBで

37℃ 一夜 培 養 し,そ の 菌 液 をcation-adjusted

MHB(CAMHB,MHB1,000m1に 塩 化 カ ル シ ウ

ム92mg,塩 化 マ グ ネ シ ウ ム104.5mgを 加 え た も

の)で20倍 希 釈 した も の を約5×107CFU/mlの 菌

液 とし た.

6.抗 菌 薬 の 最 小 発 育 阻 止 濃 度(MIC)測 定

無 処 理 抗 菌 薬 お よ び 吸 着 剤 処 理 後 の 抗 菌 薬 の

MICを 日本 化 学 療 法 学 会 標 準 法 に準 じて 微 量 液

体 希 釈 法20)で 測 定 した.PBSお よ びTSBで0.64

mg/mlに 調 製 し た 抗 菌 薬 お よ び 吸 着 剤 処 理 後 の

抗 菌 薬 をCAMHBで10倍 希 釈 し た もの を最 高 濃

度(64μg/ml)と し,さ らに,CAMHBで2倍 段

階 希 釈 した.こ の 希 釈 液100μlに 約5×107CFU/ml

に 調 製 し た 菌 液1μlをMIC-2000 Inoculator

(Dynatech)を 用 い て 接 種 し,35℃ で20時 間培 養 し

た.肉 眼 的 に菌 の発 育 の み られ な い 最 小 薬 剤 濃 度

をMIC(μg/ml)と した.

成 績

1.TAK-751SのStx吸 着 特 異 性 の検 討

1)溶 解 液 の 影 響

Chromosorb Pを 対 照 に し てTAK-751Sの

Stx1お よ びStx2の 吸 着 性 に つ い て 溶 解 液 と して

PBSお よ びTSBを 用 い て 検 討 し た 結 果,Fig.

2a)お よ びb)に 示 す とお り,無 機 塩 を主 体 に した

PBS中 で はChromosorb PもTAK-751Sと 同 様

にStx1お よびStx2を 吸 着 した.一 方,夾 雑 物 が 多

いTSB中 で はChromosorb Pは 全 く毒 素 吸着 が

な く,TAK-751Sの み がStxを 吸 着 し,本 剤 の 吸

着 特 異性 が 明 らか と な っ た.

Fig. 2 Specific neutralization of Stxl and Stx2 by

TAK-751S

A 50mg of TAK-751S or Chromosorb P was

immersed in 1ml of phosphate buffered saline

(PBS) or tryptic soy broth (TSB) containing 25

ng of purified Stxl or Stx2, and incubated at 37•Ž

for 1hr on an end-over-end rotator (48rpm). The

supernatant of the mixture at indicated dilutions

was then filter-sterilized and submitted to the

cytotoxic assay using ACHN cells (105) to mea-

sure the residual Stx in the filtrate. After 3 day

incubation in a CO2 incubator, viable cells were

measured by adding neutral red and the optical

density at 540nm was read. Chromosorb P was an

inert matrix control.

平成10年9月20日

928　 竹田 多恵 他

2)健 康 成 人 糞 便 の 添 加 の影 響

TAK-751Sま た はChromosorb P50mg,Stx1

また はStx2 25ngお よ び健 康 成 人 糞 便 約0.2mlを

PBS 1ml中 に添 加 し,対 照 とし てPBSの み,ヒ

ト糞 便 とPBSの 群 を設 け,上 記 と同 様 に 毒 素 吸

着 性 を検 討 した 結 果,Fig.3に 示 す よ う に ヒ ト糞

便 存 在 下 に お い て もTAK-751Sは 特 異 的 な 毒 素

吸 着 性 を 示 した.基 材 で あ るChrornosorb Pに は

上 記1)のTSBの 場 合 と同 様 に毒 素 吸 着 は 認 め ら

れ な か っ た.

2.E.coli O157培 養 液 の添 加

Stx以 外 のTAK-751Sが 吸 着 で き な いACHN

細 胞 毒 性 因 子 の 有 無 を検 討 す る た めE.coli O157

:H7 V-425株 の培 養 菌 液 を 添 加 し,上 記1)と 同

様 な条 件 でTAK-751Sの 吸 着 性 を検 討 し た 結 果,

Fig.4に 示 す よ う にTAK-751Sは 培 養 上 清 中 の

Stxを 吸 着 し,ま た,TAK-751S処 理 後 の培 養 上

清 中 に はStx以 外 のACHN細 胞 毒 性 因 子 が な い

こ とが 確 認 され た.

Fig. 3 Stability of TAK-751S in neutralizing

activities of Stx1 and Stx2 in the stool sample ofa healthy adultA 50mg of TAK-751S or Chromosorb P was

suspended in 1ml of PBS containing 20% (v/v)stool sample from a healthy adult and 25ng of

purified Stxl or Stx2. Neutralizing activity ofTAK-751S was measured as described in Fig . 2.Stool alone and Stx alone in PBS were tested ascontrols.

Fig. 4 Complete neutralization of cytotoxic activ-

ity produced by enterohemorrhagic E. coli O157:

H7 (Stx1+2) by TAK-751S

E. coli O157: H7 strain V-425 (an outbreak strain

at Sakai city, 1996) was grown in 2ml of TSB at

37•Ž overnight with shaking. The culture susper-

natant was collected by centrifugation and filter-

sterilized. The filtrate was then diluted to attain

toxic activity equivalent to 50ng/ml of Stxl or

Stx2, and mixed with TAK-751S or Chromosorb

P. Neutralizing activity of TAK-751S was mea-

sured as described in Fie. 2.

一 方,対 照 のChromosorb Pに は毒 素 吸 着 は認

め られ なか っ た.

3.TAK-751SのStx吸 着 作 用 に及 ぼ す 食 物 の

影 響

1)加 工 食 品 との混 合

TAK-751Sと 同 時 に 投 与 さ れ る 可 能 性 の あ る

ペ ー ス ト状 の チ ョ コ レー ト,ヨ ー グ ル ト,カ ス タ ー

ドプ リ ン,ベ ビー フー ド(鴨 肉 シチ ュ ー,ビ ー フ

デ ィナ ー)お よ び お粥 を混 合 し た場 合 のStx吸 着

に及 ぼ す 影 響 を検 討 した.

Fig.5に 示 す よ う に各 加 工 食 品 と混 合 し た 場

合 に もTAK-751SはStx1お よ びStx2を 吸 着 し

て い る こ とが 確 認 さ れ た.

2)新 鮮 な野 菜 お よ び果 物 との混 合

新 鮮 な 野 菜 や 果 物 中 にTAK-751Sの 化 学 構 造

の 毒 素 吸 着 に関 与 す る ト リサ ッカ ライ ド部 分 を分

解 す る酵 素 が 含 ま れ て い る可 能 性 が あ る の で,パ

イ ナ ップ ル,グ レー プ フ ル ー ツ,り ん ご,バ ナ ナ,

オ レ ン ジ,パ パ イ ア,い ち ご,人 参,ト マ ト,き ゅ

う り,大 根,レ タ ス,キ ャベ ツ な どの 野 菜 や 果 物

感染症学雑誌 第72巻 第9号

TAK-751Sの 志賀毒素吸着作用　 929

Fig. 5 Stability of TAK-751S in neutralizing activities of Stxl and Stx2 in the

presence of various baby foodsA 50mg of TAK-751S was suspended in 1ml of distilled water containing ca.50% (v/v) baby food, and 25ng of purified Stxl or Stx2. Neutralizing activityof TAK-751S was measured as described in Fig. 2. Baby food alone and badyfood with Stx alone were tested as controls.

類 と混合 した ときのTAK-751SのStx吸 着性 を

1)と 同様 に検討 した.

そ の結 果,Fig.6a)お よびb)に 示 す よ うに

TAK-751SはStx1お よびStx2を いずれ もよく吸

着 し,こ れ らの新鮮な野菜や果物類 には,TAK-

751Sの 毒素吸着に影響 を及ぼす糖分解酵素 など

は存在しない と考えられた.

4.各 種抗菌薬の影響

TAK-751Sに は抗菌活性はな く,EHEC感 染症

の治療には腸炎の適応症を持つ経口抗菌薬が本剤

と併用 され る と考 え られ るのでFOM,KM,

NFLXに ついて併用時の毒素吸着性および抗菌

薬の抗菌力について検討 した.

Fig.7a),b)に 示すようにFOMお よびKMの

存在下では抗菌薬非添加時のStx1,Stx2吸 着性

と比べて同程度の吸着性 を示してお り,混 合によ

るStx吸 着活性の低下はなかった.NFLXの 添加

ではFig.7c)に 示すようにStx1,Stx2に おいて

抗菌薬添加時 にStx吸 着活性がやや低下 してい

るようにも見受 けられるが,こ れはNFLXを 溶

解す る際に用いたNaOHの 影響があった と考 え

られ る.

また,TAK-751Sが 抗 菌 薬 を非 特 異 的 に吸 着 し

た り,分 解 させ る場 合 に は抗 菌 薬 そ れ 自体 の 抗 菌

力(MIC値)が 低 下 す る と考 え られ る が,S.aur-

eus FDA209P 6.3×105CFU/ml,E.coli NIHJ

JC-25.6×105CFU/mlの 接 種 菌 量 を 用 い た 条 件

下 で は,Table1に 示 す よ う にPBSとTSBの い

ず れ の 場 合 で もTAK-751S処 理 後 のMIC値 は 非

処 理 時 の それ と比 較 し てE.coli NIHJ JC-2で は

全 く変 化 が な か っ た.S.aureusで はTAK-751S

処 理 時 と非 処 理 時 のMIC値 に や や 変 化 が 見 ら

れ,PBSでNFLXで は2倍 高 く,ま た,KMで は

PBSとTSBの い ず れ の 場 合 で も逆 に1/2と な っ

た.し か し な が ら,こ れ らの 変 化 は小 さ く,か つ,

TSBで はTAK-751S処 理 時 のMIC値 は非 処 理

時 の そ れ と比 べ て 高 くな る変 化 は見 られ な か っ

た.

した が っ て,TAK-751Sと 上 記 抗 菌 薬 とを併 用

投 与 して も抗 菌 薬 の 活 性 低 下 は な い もの と考 え ら

れ た.

平成10年9月20日

930　 竹 田 多恵 他

Fig. 6 Stability of TAK-751S in neutralizing activities of Stxl and Stx2 in the

presence of various fresh fruits and vegetablesGrated retail fresh fruits and vegetables (lettuce and cabbage were ground)were diluted 4 times with E-MEM and tested as described in Fig. 5. Fruits orvegetables alone and fruits or vegetables with Stx alone in E-MEM were tested

as controls

考 察

腸管出血性大腸菌感染症は,1996年7月 に大阪

府堺市 において記録的な集団発生があり,12人 の

犠牲者があったことは記憶に新 しい.こ の感染症

の原因である大腸菌の血清型は,0157:H7が 約

90%を 占め,最 近では026,0111等 による集団発

生 も起 こっている.こ れ らの大腸菌 はいずれ も

Stxを 産生し,少 ない菌量(約100個)に おいても

感染症が発症する.こ のStxは,宿 主の受容体で

あるグロボ トリオシルセラミド(Gb3)と 結合 して

細胞毒性 を発揮する.既 に我々は,薄 層免疫染色

法によ りStx1がGb3の みに結合することを確認

している21).

今回の検討の対象であるTAK-751Sは,二 酸化

珪素の基材に8-カ ルバモイルオクチル基をスペー

サー として組み込み,そ の末端に トリサッカライ

ドを結合 させる ことによ りGb3の 類似 の化学構

造 をもたせ るように合成 されている.開 発したカ

ナダのSBI社 における検討か ら,本 剤は生体内の

pHに よる分解および消化管内の酵素的な分解に

も抵抗 し,体 内に吸収されず13),腸管出血性大腸菌

感染症の発症初期 に腸管内にある毒素を吸着 して

糞便 とともに体外 に排泄させる効果が期待 されて

いる.

感染症学雑誌 第72巻 第9号

TAK-751Sの 志賀毒素吸着作用　 931

Fig. 7 Stability of TAK-751S in neutralizing activities of Stxl and Stx2 in the presence of

antibiotics, FOM, KM and NFLX

A 50mg TAK-751S, 0.64mg of each antibiotic and 25ng of Stxl or Stx2 in TSB were

incubated at 37•Ž for 60min on an end-over-end rotator (48rpm). The mixture was filter-

sterilized through Millipore filter (0.22ƒÊm) to measure viable ACHN cells by the same

manner described in the footnote of Fig. 2. TSB alone and antibiotics or Stx or both in TSB

were tested as controls.

Dilution Dilution

Dilution

今回,本 剤の基礎的特徴を可能な限 り明 らかに

し,得 られた知見を臨床 に反映させるとともに,

その結果が確認で きることを期待 して検討を行 っ

た.本 剤のStx吸 着作用の検討では,簡 便性 と迅

速性を考慮 し,カ ナダの研究者たちが実施 してい

るようなStx産 生性 の大腸菌 をその都度培養す

る方法 は採 らずに,精 製 したStx1お よびStx2を

今回,本 剤の基礎的特徴を可能な限 り明 らかに

し,得 られた知見を臨床 に反映させるとともに,

その結果が確認で きることを期待 して検討を行 っ

た.本 剤のStx吸 着作用の検討では,簡 便性 と迅

速性を考慮 し,カ ナダの研究者たちが実施 してい

るようなStx産 生性 の大腸菌 をその都度培養す

る方法 は採 らずに,精 製 したStx1お よびStx2を

用い,ま た,Vero細 胞 と同程度のStx感 受性 を示

す ヒトの尿細管腫瘍細胞(ACHN)を 用いた改変

ニュー トラ ル レッド法(毒 素 定 量 限 界1pg/

ml)19)22)を用いることにより短期間に多数の条件

を高感度で,か つ,特 異的に検討することができ,

臨床材料中のStxの 定量に も応用できる可能性

が高まった.

これまで も活性炭などによって消化管内の有害

物質 を吸着す る治療 法が施行 され てい るが,

平成10年9月20日

932　 竹 田 多恵 他

Table 1 Antimicrobial activities of fosfomycin, kanamycin and norfloxacin

in the presence of TAK-751S

a)Antibiotics were coincubated with TAK-751S or Chromosorb P at 37•Ž for 60 min on

an end-over-end rotator (12 rpm) and were filter-sterilized through Millipore filter

(0.22ƒÊm). MIC values of antibiotics untreated or treated with TAK-751S or

Chromosorb P were determined by the microbroth dilution method.

TAK-751SのStx吸 着特異性 の検討で は本剤 の

基材であるChrornosorb Pを 対照 とし,臨 床に近

い条件,す なわち,夾 雑物の多いTSB中 や健康成

人糞便を添加 した条件で はChromosorb Pに は

Stx吸 着 は認められず,Stxの 受容体(Gb3)と 類

似 した構造を もつTAK-751Sの 特異的な毒素吸

着性が確認 された.本 剤のStx吸 着 に関する温度

の影響についての検討結果は,別 に報告23)のとお

り,Stx1で は100℃,10minの 加熱で も影響 はな

かったが,Stx2に ついては80℃以上の加熱により

吸着能がやや低下 し,毒 素吸着の機序に違いがあ

ることが示唆された.

本剤 と混ぜて使用 され る可能性 のある加工食

品,市 販の新鮮な野菜や果物および抗菌薬 との混

合においてもTAK-751SのStx吸 着性 は影響 を

受けず,ま た,混 合 された抗菌薬 を吸着あるいは

分解させることに起因する抗菌活性の低下 も否定

された.従 って,腸 管出血性大腸菌感染症の治療

には,早 期診断 と適切 な抗菌薬 を本剤 と併用する

ことにより腸管内のStxを 速 やかに体外 に排泄

させ うることが期待 される.本 邦 における臨床試

験 においても発症 まもない患者糞便 には多量の

Stxが 存在していても本剤投与翌日には便中の遊

離Stxは 検出限界以下 とな り,患 者便中のTAK-

751Sに はStxが 吸着されていることが明 らか と

なった24).

今回,Stx吸 着剤 を検討 する機会 に恵 まれ,

TAK-751Sのin vitroに おける評価 を行い,有 効

性を示唆する知見が得られた.し かし,腸 管出血

性大腸菌感染症が発症 し,毒 素が血液中に侵入し

た場合には本剤は効力を発揮できないことを留意

して本疾患の早期診断 とそれに続 く早期治療の開

始を図ることが極めて重要であると考える.

文 献

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TAK-751Sの 志賀毒素吸着作用　 933

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International Symposium celebrating the cen-tenary of the discovery of the Shiga's baccillus

(1998.2.27,北 里 研 究 所).

平成10年9月20日

934　 竹 田 多恵 他

In Vitro Specific Binding of Shiga Toxin 1 and 2 by TAK-751S (Gb3 analog)

Tae TAKEDA1), Ken-ichi YOSHINO1), Eriko ADACHP), Kyohko YAMAGATA1),

Hiroshi UCHIDA1), Kenji OKONOGI2) & Yuji IIZAWA2)

1)Department of Infectious Diseases Research, National Children's Medical Research Center

2)Pharmacology Laboratories, Pharmaceutical Research Division, TAKEDA Chemical Industries, Ltd.

TAK-751S is a synthetic trisaccharide coupled to Chromosorb P using a spacer sequence of

8-methoxycarboyloctyl (MCO). Its chemical structure is similar to a human receptor (Gb3) of Stx

produced by enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). In vitro efficacy of TAK-715S was

studied by using ACHN cultured cell assay, which is sensitive and specific for measuring low

level of Stx.

Under various conditions, TAK-751S was mixed with purified Stx1 and Stx2, and residual

free toxins in the solution were measured by using ACHN cells. TAK-715S was demonstrated to

bind specifically to Stx1 and Stx2 under the condition similar to a human intestine while

Chromsorb P did not bind to any Stx. The binding activity was stable in the presence of various

processed foods, fresh vegetables and fruits. Antibiotics such as fosfomycin, kanamycin and

norfloxacin did not disturb its binding capability. Minimum inhibitory concentrations of these

antibiotics against Staphylococcus aureus FDA209P or E. coli NIH J JC-2 neither changed after

incubating with TAK-751S for 60 min at 37•Ž.

These results suggest that TAK-751S can be given orally with various foods and antibiotics

for the elimination of Stx1 and Stx2 in the gut of patients with EHEC infections.

感染症学雑誌 第72巻 第9号