1

บทที่ 1

บทนํ า

บทนํ าตนเรื่อง

ยางพารา (Hevea brasiliensis Muell. Arg) เปนพืชเศรษฐกิจที่สํ าคัญของประเทศไทย ในแตละปประเทศไทยสงออกยางพาราในรูปของยางแปรรูป, ผลิตภัณฑยาง รวมทั้งการสงออกผลิตภัณฑจากไมยางพาราในรูปของเฟอรนิเจอร ทํ าใหอาชีพสวนยางทํ ารายไดที่แนนอนและไดแพรหลายไปในทุกจังหวัดของภาคใต ปจจุบันก็ไดแพรหลายไปยังภาคตะวันออกและบางจังหวัดของภาคอิสาน โรคของยางพาราที่เกิดขึ้นรุนแรงในประเทศไทย คือโรคใบรวงและโรคเสนดํ า ซึ่งเปนโรคที่มีความสํ าคัญทางเศรษฐกิจของอุตสาหกรรมยางธรรมชาติและเปนอันตรายแกตนยางมากที่สุดโรคหนึ่งในประเทศไทย เพราะทํ าใหผลผลิตยางลดลงประมาณรอยละ 30-50 ซึง่เกิดจากเชื้อราในกลุมไฟท็อปทอรา (Phytophthora) โดยที่เชื้อรา Phytophthora palmivora ก็เปนราสายพันธุหนึ่งที่กอใหเกิดโรคดังกลาว (สถาบันวิจัยยาง, 2542)

จากการที่ชาวสวนสามารถกรีดเอานํ้ ายางมาใชประโยชนไดเมื่อตนยางมีอายุประมาณ 5-6 ป ดงันั้นการเลือกตนออนไปปลูกตองคํ านึงถึงผลผลิตที่ไดเปนหลัก ยางพนัธุดทีี่ใหผลผลิตสูงและนิยมปลูกกันมากคือพันธุ RRIM600 แตบางพื้นที่ที่มีความชื้นสงูท ําใหตนยางติดเชื้อราไดงาย จึงตองเลือกปลูกพันธุยางที่มีความตานทานโรคสูงดวย การใชสารเคมีสามารถควบคุมเชื้อราไดในระยะสั้นเทานั้นและสงผลเสียตอระบบนิเวศนดวย วิธีควบคุมในระยะยาวคือการคัดเลือกยางพันธุดีที่มีความตานทานโรคสูงมาปลูกทดแทน จากหนังสือแนะนํ าพันธุยางป 2542 รายงานวายางพันธุชั้น 1 ที่มีระดับความตานทานดีและดีมากตอเชื้อราในกลุม Phytophthora (ในระดับ field test) มีเพียง 3 พันธุ คือ KRS156 (ดี), RRIC110 (ดี) และ BPM-24 (ดมีาก) และยางพันธุชั้น 2 ที่มีระดับความตานทานดีมีเพียง 3 พันธุ คือ RRIT226, RRIT250 และ BPM1 สวนระดับดีมากไมมี ซึ่งกวาจะไดขอสรุปวายางพันธุใดใหผลผลิตสูงและสมควรไดรับการสงเสริม

2

อยางแพรหลาย (จัดอันดับเปนพันธุชั้น 1 และ 2) นั้น ตองใชเวลาในการปรับปรุงพันธุยางและตรวจสอบเปนเวลาถึง 30 ป การแกปญหาเรื่องระยะเวลาที่ใชเพื่อจะสรุปใหไดวายางพันธุใดใหผลผลิตสูง สมควรสงเสริมแนะนํ าใหเกษตรกรปลูกนั้น ไดมีนักวิทยาศาสตรพยายามศึกษาคนควาโดยการใชวิธีการตางๆเพื่อหาความสัมพันธระหวางความสามารถในการสังเคราะหยางกับลักษณะอื่นๆ ทีอ่าจตรวจวัดไดงาย เชน การศึกษาความสัมพันธระหวางเอนไซมเอนไซมไฮดรอกซีเมทิลกลูตาริลโคเอนไซมเอ รีดักเทส (HMG-CoA reductase) กับปริมาณนํ้ ายาง (Wititsuwannakul, 1986) และการศึกษาเอนไซมไฮดรอกซีเมทลิกลูตาริลโคเอนไซมเอซนิเทส (HMG-CoA syntase) ในซี-ซีร่ัมกับปริมาณนํ้ ายาง (นงเยาว, 2542) แตวิธีการเหลานี้ ยังจํ าเปนตองมีขอมูลจากวิธีการอ่ืนๆมาประกอบอีก เชน การศึกษาเกี่ยวกับการตอตานการบุกรุกของเชื้อโรค

เปนที่ทราบกันดีวาพืชมีศัตรูมากมาย ไดแก เชือ้รา, เชื้อแบคทีเรีย, เชื้อไวรัส รวมไปถงึไสเดือนฝอย และพืชชนิดหนึ่งก็อาจเกิดโรคไดหลายโรคในเวลาเดียวกัน แตพืชก็มีชวีติอยูได จะเห็นไดวาเมื่อพืชเกิดการติดเชื้อ (infection) พชืบางพันธุจะแสดงความออนแอ บางพันธุแสดงอาการตานทานและบางพันธุไมแสดงอาการใดๆเลยหรือแสดงอาการแตตอมาอาการของโรคลดลง แสดงวาพืชแตละชนิดมีกระบวนการหรือกลไกในการปองกันตัวเองเพื่อตอตานการรุกรานของเชื้อโรคแตกตางกัน เนื่องจากพืชไมมีระบบภูมิคุมกันแตสามารถปรับตัวเพื่อตอตานการบุกรุกของเชื้อโรค โดยปฏิกิริยาการตอบสนองของพืชมีสองลักษณะคือ เมื่อพืชพันธุออนแอ (susceptible) ถูกรุกรานโดยเชื้อโรคที่รุนแรง (virulent pathogen) พืชก็จะตอบสนองดวยการแสดงอาการของโรคหรือเปนโรคนั่นเอง เนือ่งจากมีสภาวะหรือปฏิกิริยาที่เหมาะสม (compatible) และเมื่อพืชพนัธุตานทาน (resistant) ถูกรุกรานโดยเชื้อโรคที่ไมรุนแรง (avirulent pathogen) พืชก็จะตอบสนองดวยการไมแสดงอาการของโรค เพราะเกิดสภาวะหรือปฏิกิริยาที่ไมเหมาะสม (incompatible reaction) แตจะมีกลไกในการปองกันตัวเอง (defense machanism) ซึ่งมีหลายอยางและแตละอยางไมไดแสดงผลในการปองกันโรคโดยล ําพัง แตกระบวนการเหลานี้จะตองสัมพันธกัน (ประสาทพร, 2534) ซึ่งแบงออกไดเปน 2 ประเภทคือ ประเภทแรกเปนความตานทานที่มีอยูแลวในธรรมชาตกอนที่เชื้อจะเขา

3

ทํ าลาย (passive resistance) และความตานทานที่เกิดขึ้นเพื่อตอบโตการเขาทํ าลายของเชื้อโรค (active resistance) (ธรรมศักดิ์, 2529)

ในธรรมชาติพืชจะมีโครงสรางและสวนประกอบที่เหมาะสมสํ าหรับการปองกันตนเองตอเชื้อโรค ซึ่งประกอบดวยสิ่งกีดขวางทางกายภาพ (physical barrier) และสิ่งกีดขวางทางเคมี (chemical barrier) สิ่งกีดขวางทางกายภาพทีมี่อยูในธรรมชาติ ไดแกขี้ผึ้งคลุมใบและผล, ความหนาของคิวตินและความเหนียวของผนังเซลลดานนอก ทํ าใหเชื้อโรคไมสามารถเจาะผานเขาสูพืชได รวมถึงความหนาและความเหนียวของผนงัเซลลเนื้อเยื่อทอลํ าเลียงนํ้ า (xylem) ทอลํ าเลียงอาหาร (phloem) และเนื้อเยื่อที่เปนเซลล สเคลอเรนไคมา (sclerenchyma) นอกจากนี้ลักษณะการเปดปดของปากใบมีบทบาทในการปองกันโรคดวย เชน ในขาวสาลีพันธุตานทานโรคราสนิมเหล็กจะมีปากใบเปดชากวาปกติ ดังนั้นกวาสปอรของเชื้อราสนิมจะงอกเขาไปไดก็ถูกแดดเผาและตายไป สวนสิ่งกีดขวางทางเคมีที่มีอยูในธรรมชาติ ไดแก การขาดธาตุอาหารบางชนิดสํ าหรับการเจริญของเชื้อโรค และการสรางสาร phytoanticipins เปนตน (ธรรมศักดิ์, 2529; ประสาทพร, 2534) เมื่อเชื้อโรคเขาสูพืชโดยการเจาะผานโครงสรางของพืช พืชจะมีปฏิกิริยาโตตอบการเขาทํ าลายของเชื้อโรคซึ่งเกิดขึ้นไดอยางรวดเร็ว (rapid active resistance) และอยางชาๆ (delayed active resistance) ปฏิกิริยาโตตอบที่เกิดขึ้นไดอยางรวดเร็ว ไดแก การสราง cork layers, การเกิด abscission regions, การสราง tyloses และ gum, การโปงออกของเซลล epidermis หรือเกิดปลอกหอหุม (sheath) เสนใยของเชื้อ (ไพโรจน, 2525; ประสาทพร, 2534), การท ําใหเซลลที่กํ าลังติดเชื้อและเซลลที่อยูขางเคียงตายเรียกวา “ hypersensitive cell death ” (Dufrenoy, 1936) โดยสังเกตเห็นเปนรอยไหมสีนํ้ าตาล (necrosis), สรางสารปฏิชีวนะซึ่งสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อโรคได เรียกวา ไฟโตอเล็กซิน (phytoalexin) (Hahlblock, 1989), เกิดกระบวนการ lignification เพื่อกักบริเวณเชื้อโรคไมใหลุกลามตอไปยังเซลลขางเคียง (Friend et al., 1973) และเกิดการซอมแซมผนังเซลลของพืชใหแข็งแรงขึ้น (Bradley et al., 1992) นอกจากนี้ปฏิกิริยาโตตอบที่เกิดขึ้นไดอยางชาๆทางเคมี ไดแกการสรางโปรตีนขึ้นมาทํ าลายเชื้อโรคที่เรียกวา pathogenesis related-proteins

4

(PR-proteins) ไดแก เอนไซมเบตา-1,3-กลคูาเนสและไคติเนส (Linthorst, 1991) และการเกิดกลไกที่เรียกวา systemic acquire resistance (SAR) (Guest and Brown, 1997) เปนตน

ยางพาราเองก็ มีกลไกการตอบสนองต อเชื้อโรคเช นเดียวกับพืชทั่วไป Churngchow and Rattarasarn (2001) พบวาซูโอสปอรของเชื้อรา P. palmivora สามารถกระตุนใหมีการสรางสคอพอลิติน (ไฟโตอเล็กซนิ) ในพันธุตานทานสูงกวาพันธุออนแอ นอกจากนี้พบวานํ้ าเลี้ยงเชื้อรา (culture filtrate) ของเชื้อรา P. palmivora มีความเปนพิษตอใบยางคือทํ าใหเกิดรอยไหม (necrosis) ไดคลายกับสปอร ท็อกซินที่เตรยีมใหบริสุทธิ์จาก culture filtrate เปนโปรตีนขนาดเล็กมีนํ้ าหนักโมเลกุล 10 kDd (Churngchow and Rattarasarn, 2000) ซึ่งโปรตีนดังกลาวมีชื่อเรียกรวมวาอิลิซิติน และเมื่อนํ าอิลิซิตินมากระตุนใบยางพบวาทํ าใหมีการสรางสคอพอลิติน, เอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสและไคติเนส (PR-protiens) และลกินินเพิ่มขึ้น โดยทั้งหมดมีคาแปรผันตรงกับระดับความตานทานของใบยาง ดังนั้นงานวิทยานิพนธฉบับนี้จึงศึกษาปฏิกิริยาการตอบสนองของใบยางพาราพันธุชั้น 1, 2 และ 3 ซึ่งจัดลํ าดับโดยสถาบันวิจัยยาง รวมทั้งเชื้อพันธุ (germplasm) ทีมี่การคัดเลือกเบื้องตนวาใหผลผลิตสูง ที่ถูกเก็บรักษาไวทีศ่นูยวิจัยยางสงขลาและสถานีทดลองยางยะลา ดวยการบมใบยางพาราดวยซูโอส-ปอรและทดสอบดวยอลิซิิตินของเชื้อรา P. palmivora วิธีการนี้ใชเวลาในการศึกษานอยกวาการศึกษาในระดับ field test ของสถาบันวิจัยยาง ทั้งนี้เพื่อคัดเลือกพันธุยางที่ตานทานโรค นํ ามาทดแทนยางพันธุตานทานเดิมที่มีอยูนอยชนิดมาก

5

การตรวจเอกสาร

1.1 ยางพารา ยางพารามีชื่อทางวิทยาศาสตรวา Hevea brasiliensis Muell. Arg ตั้งขึ้นโดย Dr. Jean Mueller นกัพฤษศาสตรชาวสวิตเซอรแลนด สามารถจํ าแนกทางอนุกรมวิธาน (Taxonomic classification) ไดดังนี้ 1.1.1 การจํ าแนกทางอนุกรมวิธาน (Taxonomic classification) Class : Angiospermae Subclass : Dicotyledoneae

Order : Euphorbiales Family : Euphorbiaceae

Genus : Hevea Species : brasiliensis Scientific name : Hevea brasiliensis Common name : Para Rubber พืชสกุลนี้มีถิ่นกํ าเนิดในแถบทวีปอเมริกาใตซึ่งรูจักกันดีในนามหุบเขาแหงปาลุมแมนํ้ าอเมซอน มีลักษณะทางดานสัณฐานวิทยาคอนขางแปรปรวน สามารถแพรกระจายพันธุไดในระบบนิเวศนวิทยาที่มีความหลากหลาย บางชนิดพันธุมีคุณลักษณะพิเศษสามารถอาศัยในสภาพภูมิประเทศในวงจํ ากัด บางชนิดพันธุออนแอตอสภาพ แวดลอมแตการผสมขามเปนไปดวยดี บางครั้งเปนไปโดยธรรมชาติเอง หรือโดยมนุษยผสมพันธุ ขึ้นมาซึ่งนับเปนวิวัฒนาการทางดานชนิดพันธุ อยางหนึ่งของธรรมชาติ(http://industrial.riu.ac.th/botany/data_botany/type/108.htm.) ฐานพันธุกรรมเชื้อพันธุพืชเปนปจจัยสํ าคัญอยางยิ่งในการปรับปรุงพันธุและผสมพนัธุใหไดพันธุที่ดีโดยใหผลผลิตสูง เหมาะกับดินฟาอากาศ ตานทานโรคและศตัรูพืช ไมมีผลกระทบตอสิ่งแวดลอม ตลอดจนมีคุณภาพดีเปนที่ตองการของตลาดทั้งภายในและตางประเทศ แตปจจุบันพันธุพืชและเชื้อพันธุพืชตามธรรมชาติไดถูกทํ าลาย

6

จนใกลจะสูญพันธุโดยกิจกรรมของมนุษย หรือจากภัยธรรมชาติ จึงไดมีการรณรงคในการอนุรักษพันธุ พืช ซึ่งกรมวิชาการเกษตรไดมีการรวบรวมและอนุรักษเชื้อพันธุ ยางพาราที่นํ าเขาจากตางประเทศไวจํ านวนมาก ทั้งชนิดและปริมาณไวตามศูนยและสถานทีดลองยางตางๆทั่วประเทศ (สํ านักงานคุมครองพันธุพืชแหงชาติ, 2545)

1.1.2 การปรับปรุงพันธุยาง และคํ าแนะนํ าพันธุยางของสถาบันวิจัยยาง กรมวิชาการเกษตร

สถาบันวิจัยยาง กรมวิชาการเกษตร ทํ าการปรับปรุงพันธุยางโดยการผสมและคดัเลอืกพันธุยางทั้งจากในประเทศ และแลกเปลี่ยนพันธุยางกับตางประเทศ โดยมีวิธีการและแผนการปรับปรุงพันธุยางที่เปนมาตรฐานสากลที่ตองใชระยะเวลาปรับปรุงนานถงึ 30 ป (รูปที่ 1) สํ าหรับพันธุยางที่ผานการคัดเลือกจากแปลงเปรียบเทียบและทดสอบพนัธุยางในสภาพแวดลอมตางๆ จะนํ ามาคัดเลือกพันธุยางที่ดีที่สุด และจัดทํ าเปนคํ าแนะนํ าพันธุยางทุก 4 ป โดยคํ านึงถึงผลผลิต การเจริญเติบโต การตานทานโรค และความเหมาะสมกับสภาพพื้นที่ (ตารางที่ 1) เพือ่ใหเกษตรกรชาวสวนยางสามารถเลือกปลูกไดอยางถูกตองตอไป 1.1.2.1 การผสมพันธุยาง (Hand Pollination)

ยางเปนพืชพวกผสมเปดตามธรรมชาติ (Naturally open-pollination) ปจจยัที่ทํ าใหยางเปนพืชผสมขามคือดอกตัวผูและตัวเมียแยกกันอยูคนละดอกแตตนเดียวกัน จึงสามารถปรับปรุงใหดีขึ้นไดโดยการผสมพันธุ ซึ่งคาดหวังวากรรมพันธุของตนแมและตนพอมารวมกันแลวจะไดลูกผสมที่อาจมีลักษณะเหนือแมพอได ตนแมพอที่ใชในการผสมพันธุจะตองมีดอกบานพรอมกัน การผสมพันธุจะสํ าเร็จไดมากนอยเทาใดขึ้นอยูกับพันธุ อากาศ ฝน และ ความชํ านาญของผูผสมพันธุ ผลสํ าเร็จในการผสมพันธุมีนอยมากประมาณ 3-10% จากการผสมพันธุที่ศูนยวิจัยยางสงขลาโดยใชแมพอพันธุดีไดรับผลสํ าเร็จเพียง 2-3% 1.1.2.2 การเปรียบเทียบพันธุยางขั้นตน (Small Scale Trial) ตนกลาลูกผสมที่ปลูกในถุงพลาสติกเมื่ออายุได 2 เดือนจะยายไปปลกูในแปลงปลูก ศึกษาการเจริญเติบโตในชวงแรกระยะ 2 ป โดยใน 1 ปแรกวัดขนาด

7

ปที่ การผสมพันธุยาง0 Hand Pollination

2 1/2 การคดัเลือกพันธุยาง Screening Progeny Trial

3 คัดเลือกและประเมินพันธุแม-พอ คัดเลือก ตนกลาลักษณะดี Reselection & Parental Screening Elite seeding

evaluation

10 การเปรียบเทียบพันธุยางขั้นตนSmall Scale Trial

การทดสอบพันธุยาง Promotion Trial

13 ประเมินและคัดเลือกพันธุ Evaluation & Selection

แนะน ําพันธุยางชั้น 2Recommend for class 2

15 การเปรยีบเทียบพันธุยางขั้นปลาย Large Scale Clone Trial

20 แนะน ําพันธุยางชั้น 1 Recommend for class 1

24 แนะน ําพันธุยางชั้น 2 Recommend for class 2

30 แนะน ําพันธุยางชั้น 1 Recommend for class 1

รูปที ่1 แผนผังการปรับปรุงพันธุยาง (ที่มา : สถาบนัวจิัยยาง, 2545 ก)

8

เสนรอบวงของลํ าตนตรงจุดสูงจากพื้นดิน 15 เซนติเมตร และเมื่ออายุ 2 ปวัดขนาดเสนรอบวงของลํ าตนสูงจากพื้นดิน 40 เซนติเมตร ศึกษาผลผลิตระยะแรกและศึกษาเกี่ยวกับความตานทานโรค การแตกกิ่ง และทรงพุมของตน ทํ าการคัดเลือกลูกผสม (screening) ที่มีแนวโนมดีไว 10-15% นํ าไปติดตาขยายพันธุไวเพื่อนํ าไปคัดเลือกในแปลงเปรียบเทียบพันธุยางขั้นตนตอไป 1.1.2.3 การเปรียบเทียบพันธุยางขั้นปลาย (Large Scale Trial)

เปนการคัดเลือกพันธุกับพันธุที่คัดเลือกไว จากแปลงเปรียบเทยีบพันธุขั้นตนและพันธุที่คาดวาจะดี (promising clones) ที่ไดรับจากตางประเทศ ใชระยะเวลาปลูกตามปกติที่ใชปลูกในสวนยาง ใชพันธุมาตรฐานเปนพันธุเปรียบเทียบ ทํ าการทดลองกระจายในพื้นที่ตางๆหลายทองที่ เพื่อศึกษาอิทธิพลของสิ่งแวดลอมที่มีตอพนัธุยาง การศึกษามีการเก็บขอมูลตางๆเชนเดียวกับแปลงเปรียบเทียบพันธุยางขั้นตน

การคัดเลือกพันธุยางที่มีลักษณะดีเพื่อแนะนํ าใหเกษตรกรปลูกมีหลักเกณฑคือครัง้ที ่1 เมื่อกรีดหนาที่ 1 ได 3 ป (ปกรีดที่ 3) จะแนะนํ าเปนพันธุยางชั้น 2ครัง้ที ่2 เมื่อกรีดหนาที่ 1 หมด (5 ป) และกรีดหนาที่ 2 ได 1 ป (ปกรีดที่ 6) จะแนะนํ าเปนพันธุยางชั้น 1

รวมเวลาตั้งแตผสมพันธุไปจนถึงแนะนํ าใหเกษตรกรปลูกไดใชเวลา 30 ป (สถาบันวิจัยยาง, 2545 ก) 1.1.3 การศึกษาเกี่ยวกับความตานทานโรค ทางสถาบันวิจัยยางไดทํ าการศึกษาความตานทานโรคของยางพาราซึ่งประกอบดวยโรคตอไปนี้คือ ใบรวงไฟท็อปทอรา, ใบจุดออยเดียม, ใบจุดคอลเลโทตริคลัม, โรคเสนดํ าและโรคราสีชมพู โดยทํ าการประเมินผลดวยสายตาในภาพรวมของยางแตละพันธุ เชน โรคใบรวงที่เกิดจากเชื้อราไฟท็อปทอรา (Phytophthora leaf fall) ทํ าการประเมินโดยสังเกตความโปรงของทรงพุมใบคิดเปนเปอรเซ็นตของพุมใบปกติ หรอืดูจากปริมาณใบรวงบนพื้นดิน และกํ าหนดความรุนแรงของโรคเปน 6 ระดับ ดังนี้

9

0 = ไมแสดงอาการ (no symptom)1 = นอยมาก (very light) มีพุมใบโปรงหรือปริมาณใบรวงบนพื้นดินประมาณ 1-10%2 = นอย (light) มีพุมใบโปรงหรือปริมาณใบรวงบนพื้นดินประมาณ 11-25%3 = ปานกลาง (moderate) มีพุมใบโปรงหรือปริมาณใบรวงบนพื้นดินประ- มาณ 26-50%4 = รุนแรง (severe) มีพุมใบโปรงหรือปริมาณใบรวงบนพื้นดินประมาณ 51- 75%5 = รุนแรงมาก (very severe) มีพุมใบโปรงหรือปริมาณใบรวงบนพื้นดินประ- มาณ 75%และโรคเสนดํ า (black stripe) ที่เกิดจากเชื้อรา Phytophthora botryosa และ P. palmivora ประเมินโดยหาเปอรเซ็นตตนที่เปนโรคกับการตรวจสอบดวยสายตา โดยคิดพื้นที่ที่ถูกทํ าลายเปนเปอรเซ็นตของหนากรีดและกํ าหนดคะแนนความรุนแรงของโรคเปน 6 ระดับ ดังนี้0 = ไมแสดงอาการ (no symptom)1 = นอยมาก (very light) มีพื้นที่ถูกทํ าลาย 1-5% ของหนากรีด2 = นอย (light) มีพื้นที่ถูกทํ าลาย 6-20% ของหนากรีด3 = ปานกลาง (moderate) มีพื้นที่ถูกทํ าลาย 21-40% ของหนากรีด4 = รุนแรง (severe) มีพื้นที่ถูกทํ าลาย 41-60% ของหนากรีด5 = รุนแรงมาก (very severe) มีพื้นที่ถูกทํ าลายมากกวา 60% ของหนากรีด(สถาบันวิจัยยาง, 2544 ก) 1.1.4 คํ าแนะนํ าพันธุยาง ป 2542

เปนของสถาบันวิจัยยาง กรมวิชาการเกษตร พันธุยางที่แนะนํ าจะพิจารณาจากขอมูลที่ไดจากการปรับปรุงพันธุยางภายในประเทศและตางประเทศ การเลือกใชพนัธุยางที่จะปลูกควรพิจารณาทั้งผลผลิต รายละเอียดลักษณะตางๆ และขอจํ ากัดของพนัธุนัน้ๆ พันธุยางที่แนะนํ าใหปลูกแบงออกเปน 3 ชั้น คือ

10

พนัธุยางชั้น 1 เปนพนัธุยางที่แนะนํ าใหปลูกโดยไมจํ ากัดเนื้อที่ปลูก พันธุยางในชั้นนี้ ไดผานการทดลอง และศึกษาลักษณะตางๆ อยางละเอียด พนัธุยางที่

แนะนํ า ไดแก BPM-24, KRS156, PB255, PB260, PR255, RRIC110, RRIM600 และ RRIT251

พนัธุยางชั้น 2 เปนพนัธุยางที่แนะนํ าใหปลูกโดยจํ ากัดเนื้อที่ปลูก ปลกูไดไมเกินรอยละ 30 ของเนื้อที่ปลูกยางที่ถือครอง แตละพันธุควรปลูกไมนอยกวา 7 ไร พนัธุยางชั้นนี้อยูในระหวางการศึกษาลักษณะบางประการเพิ่มเติม พันธุยางที่แนะนํ า ไดแก BPM1, PB-235, RRIC100, RRIC101, RRIT226

และ RRIT250พนัธุยางชั้น 3 เปนพนัธุยางที่แนะนํ าใหปลูกโดยจํ ากัดเนื้อที่ปลูก ปลูกไดไมเกินรอยละ

20 ของเนื้อที่ปลูกยางที่ถือครอง แตละพันธุควรปลูกไมนอยกวา 7 ไร พันธุยางชั้นนี้สวนใหญอยูในระหวางการทดลองและตองศึกษาลักษณะตางๆเพิ่มเติม พันธุยางที่แนะนํ า ไดแก Haiken-2, PR302, PR305, RRIC121, RRIT163, RRIT209, RRIT214, RRIT218 และ RRIT225(สถาบันวิจัยยาง, 2542)

11

ตารางที่ 1 ลักษณะทีส่ํ าคัญบางประการของพันธุยางชั้น 1 และชั้น 2 พันธุยางชั้น 1 พันธุยางชั้น 2

ลักษณะ RRIT251

KRS156

BPM24

PB255

PB260

PR255

RRIC110

RRIM600

RRIT226

RRIT250

BPM1

PB 235

RRIC100

RRIC101

การเจริญเติบโต 1/

- ระยะกอนเปดกรีด- ระยะระหวางกรีด

24

33

33

12

21

33

13

33

23

33

22

13

13

23

ความหนาของเปลือก 2/

- เปลือกเดิม- เปลือกงอกใหม

33

33

13

22

34

42

44

43

42

43

32

34

34

34

ผลผลิต 1/

- ระยะ 2 ปแรก- ระยะ 3-10 ป- ผลผลิตลดลงใน ชวงผลัดใบ- ผลผลิตเมื่อใชสาร เคมีเรงนํ้ ายาง

112

-

111

3

113

4

113

3

112

3

122

3

112

3

112

3

123

-

112

4

112

2

113

4

112

-

122

-

1/ 1 = ดี 2 = คอนขางดี 3 = ปานกลาง 4 = คอนขางตํ่ า 5 = ตํ่ า2/ 1 = หนา 2 = คอนขางหนา 3 = ปานกลาง 4 = คอนขางบาง 5 = บาง , - = ยังไมมีขอมูล

12

ตารางที่ 1 (ตอ) พันธุยางชั้น 1 พันธุยางชั้น 2

ลักษณะ RRIT251

KRS156

BPM24

PB255

PB260

PR255

RRIC110

RRIM600

RRIT226

RRIT250

BPM1

PB 235

RRIC100

RRIC101

ความตานทานโรค 3/

- ใบรวงไฟท็อปทอรา- ใบจุดออยเดียม- ใบจุดคอลเลโทตริกัม- โรคเสนดํ า- โรคราสีชมพู

33323

24434

13323

43434

33332

33533

23333

53354

23334

23334

23323

34432

32233

32323

อาการเปลือกแหง4/ 2 3 3 3 4 2 3 2 3 4 3 4 3 4ความตานทานลม3/ 3 3 3 2 2 2 4 3 3 3 2 2 2 2การปลูกในพื้นที่จํ ากัด- ลาดชัน- หนาดินตื้น- ระดับนํ้ าใตดินสูง

NNN

NGN

GGG

GGG

GGG

NGG

NNN

GNN

---

---

---

NNN

NNN

---

3/ 1 = ดี 2 = คอนขางดี 3 = ปานกลาง 4 = คอนขางออนแอ 5 = ออนแอ4/ 1 = นอย 2 = คอนขางนอย 3 = ปานกลาง 4 = คอนขางมาก 5 = มาก, - = ยังไมมีขอมูล, N = ไมแนะนํ า, G = ได (ที่มา : ดัดแปลงจากสถาบันวิจัยยาง, 2542)

13

1.2 เช้ือราไฟท็อปทอรา (Phytophthora) ไฟท็อปทอราเปนเชื้อราในกลุมโอโอไมซิส (oomycetes) มีทั้งอาศัยอยูในนํ้ าและในดนิ มีลักษณะเปนเสนใยสีขาวแตกกิ่งกานสรางสปอรแรงเจียม (sporangium) บน สปอรแรงจิโอฟอร (sporangiophore) ภายหลังที่เจริญเปนสปอรแรงเจียมแลวสปอรแรงจิโอฟอรจะเจริญใหสปอรแรงจิโอฟอรใหมจากปลายอันเดิม และดันสปอรแรงเจียมไปดานขางของสปอรแรงจิโอฟอร โดยสวนที่เปนสปอรแรงจิโอฟอรนั้นจะมีลักษณะบวมพองกวาเสนใยปกติ สปอรแรงเจียมมีรูปรางคลายผลมะนาวใหกํ าเนิดซูโอสปอร(zoospore) ที่อุณหภูมิระหวาง 12-15 องศาเซลเซียส และอาจงอกเปนทอ (germ tube) เขาทํ าลายพืชไดโดยตรงที่อุณหภูมิสูงกวา 15 องศาเซลเซียส สํ าหรับซโูอสปอรจะดันออกทางปลายสปอรแรงเจียมดานที่มีปุม (papilla)(รูปที่ 2) ไฟทอ็ปทอรามีการขยายพันธุทั้งแบบอาศัยเพศและไมอาศัยเพศ โดยแบบอาศัยเพศจะมีการผลิตซโูอสปอรแรงเจีย (zoosporangia) ซึ่งจะมีการปลดปลอย zoospores ทีเ่คลื่อนที่โดย biflagella หลงัจากวายนํ้ าระยะหนึ่งแลวจึงเขาเกราะ (encyst) และงอกเปนทอหรือสรางซโูอสปอรขึ้นอีก สวนการขยายพันธุแบบใชเพศนั้นสายราเพศผู (male hypha) จะเจริญเปนแอนเทอรเิดียม และสายราเพศเมีย (female hypha) จะเจริญเปนโอโอโกเนียม (oogonium) แลวใหกํ าเนิดโอโอสปอร (oospore) (ประสาทพร, 2534) ซึง่จะงอกเปนทอและเจริญเปนเสนใยหรือเจริญเปนสปอรแรงเจียมตอไป การขยายพันธุแบบไมอาศัยเพศของเชื้อรา P. palmivora สามารถผลิตสปอรได 2 ชนิดคือ zoospore และ chlamydospores แตถาเปนแบบอาศัยเพศผลิตสปอรชนิด oospore (www.botany.unimelb.eolu.au/…/duriansite/ phytophthora.htm/) (รูปที่ 3) เสนใยของราเจริญอยูในเซลลพืชและอยูระหวางเซลลพืชซึ่งจะแทง haustorium เขาไปในเซลลพืช เชนเชื้อ P. infestans ทีท่ ําใหเกิดโรคใบไหมของมันฝรั่งและมะเขือเทศ ดังแสดงในรูปที่ 4 ซึ่งมีวงจรชีวิตดังนี้ คือ เชื้อรา P. infestans สามารถอยูขามฤดูในลกัษณะทีเ่ปนเสนใยติดมากับหัวมันฝรั่ง เสนใยจะเจริญเขาไปในหัว ตาและหนอของมันฝรัง่ เมือ่นํ าไปขยายพันธุราจะเจริญเขาสูสวนของลํ าตนและสวนตางๆเหนือดิน จากนัน้จะเกิดสปอรแรงจิโอฟอรแทงออกมาทางปากใบ (stomata) และมีสปอรแรงเจียมที่

14

รูปที่ 2 โครงสรางสปอรแรงเจียม (sporangium) ของ Phytophthora palmivora โดยที่ตํ าแหนงกลางภาพมีการปลดปลอยซูโอสปอร (zoospores) ออกจากดานที่มี papilla ของสปอร-แรงเจียม (ที่มา : http://ag.arizona.edu/classes/plp427L/sporan.ipg)

รูปที ่3 วงจรชีวิตของเชื้อราในกลุม Phytophthora (ทีม่า : www.botany.unimelb.eolu.au/…/duriansite/phytophthora.htm/ )

papillasporangium

zoospores

15

ปลาย เมื่อแกเต็มที่จะหลุดไปกับฝน เมื่อตกลงบนใบหรือตนที่มีนํ้ าเพียงพอก็จะงอกเขาไปทํ าลายพืชและทํ าใหเกิดโรคได (ประสาทพร, 2534)

รูปที ่4 วงจรโรคใบไหมของมะเขือเทศและมันฝร่ังที่เกิดจาก Phytophthora infestans (ทีม่า : www.cals-ncsu.edu/…/Faculty/ristaino/graphics/fig1.gif)

16

ไฟทอ็ปทอราทํ าใหเกิดโรคกับพืชหลายชนิด เชน ผัก, ไมดอกไมประดับ, พชืลมลุกตางๆ รวมทั้งพืชยืนตน เชน มะละกอ, มะเขือเทศ, ยาสูบ, มันฝรัง่และยางพารา เปนตน (ประสาทพร, 2534; Erwin and Reberio, 1996 ) สวนมากทํ าใหเกิดอาการรากเนา, โรคเนาระดับดิน, โรคเนาของลํ าตนและหัว บางชนิดจะทํ าใหเกิดอาการใบไหมหรอืท ําลายกิ่งออนและผล บางชนิดมีพืชอาศัยที่จํ ากัดสามารถเขาทํ าลายพืชไดเพียงหนึง่หรือสองชนิดเทานั้น แตบางชนิดมีพืชอาศัยที่กวางขวาง ตัวอยางเชื้อไฟท็อปทอราทีเ่ปนสาเหตุของโรค เชน P. parasitica var nicotianae สาเหตุโรคแขงดํ าของยาสูบ, P. parasitica สาเหตุโรคโคนเนา, รากเนาของสม, โรครากเนาและยอดเนาของสับปะรด, โรคเนาดํ าของกลวยไม, โรคผลเนาของมะเขือยาว, โรคโคนเนาระดับดินและผลเนาของมะเขือเทศ และ P. palmivora สาเหตุโรครากเนาและโคนเนาของทุเรียน รวมทั้งโรคใบรวงและเสนดํ าของยางพาราดวย เชื้อราในกลุม Phytophthora ซึ่งกอใหเกิดโรคใบรวง (Phytophthora leaf fall)และเสนดํ า (black stripe) ในยางพาราพบแพรกระจายในหลายๆประเทศมีหลายสปชีสไดแก P. palmivora, P. botryosa, P. hevea, P. meadii และ P. parasitica แตในประเทศไทยสปชสีที่ตรวจพบมากเมื่อมีการระบาดของโรคดังกลาวคือ P. palmivoraและ P. botryosa ตนยางที่เปนโรคใบรวงจากเชื้อราดังกลาวจะไมผลิใบยางออกมาใหมในปนั้นๆซึ่งเปนลักษณะอาการที่แตกตางจากตนยางที่ใบรวงโดยเชื้อราสาเหตุอ่ืนๆ เชน Oidium spp. และ Colletotrichum spp. (พงษเทพ, 2522) ใบยางที่รวงจะมีทั้งสีเขียวสดหรือสีเหลือง ลักษณะที่ปรากฏเดนชัดคือมีรอยชํ้ าดํ าอยูบริเวณกานใบและที่จุดกึ่งกลางของรอยชํ้ ามีหยดนํ้ ายางเกาะติดอยู เมื่อนํ าใบยางเปนโรคมาสะบัดไปมาเบาๆ ใบยอยจะหลุดทันที ซึ่งตางกับใบยางที่รวงหลนตามธรรมชาติเมื่อนํ ามาสะบัดใบยอยจะไมรวง ลักษณะแผนใบบางครั้งจะเปนแผลที่มีลักษณะชํ้ าฉํ่ านํ้ า ขนาดแผลไมแนนอน (สถาบันวิจัยยาง, 2544 ข) (รูปที่ 5ก) สวนโรคเสนดํ าเปนโรคที่มีความสํ าคัญทางเศรษฐกิจของอุตสาหกรรมยางธรรมชาติและเปนอันตรายแกตนยางมากที่สุดโรคหนึง่ในประเทศไทย โรคนี้แพรระบาดอยางกวางขวางในพื้นที่ปลูกยางทั่วไปโดยเฉพาะอยางยิ่งในทองที่ที่เกิดโรคใบรวงและฝกเนาระบาดเปนประจํ าทุกป ลักษณะอาการของ

17

โรคในระยะแรกจะสังเกตเห็นบริเวณเปนโรคมีลักษณะเปนรอยชํ้ าเหนือรอยกรีดโดยมีสีผดิปกต ิ ระยะตอมาจะกลายเปนรอยบุมสีดํ าหรือนํ้ าตาลดํ า เปนเสนขยายขึ้นลงตามแนวขนานกับลํ าตน เมื่อเฉือนเปลือกออกจะเห็นรอยบุมสีดํ าเปนลายเสนดํ าบนเนื้อไม อาการขั้นรุนแรงเปลือกหนากรีดบริเวณที่เปนโรคปริเนา, มีนํ้ ายางไหล และเปลือกจะเนาหลดุออกมา เปลือกที่งอกใหมจะเสียหายจนทํ าการกรีดยางซํ้ าบนหนาที่เปนเปลือกงอกใหมไมได ทํ าใหตนยางมีระยะเวลาที่ใหผลผลิตสั้นลงเปนเวลา 8-16 ป ถาการเขาท ําลายของเชื้อไมรุนแรงเปลือกจะเปนปุมปม (รูปที่ 5ข) (พงษเทพ, 2522; สถาบันวิจัยยาง, 2544 ข)

ก

ข

รูปที่ 5 โรคที่เกิดจากเชื้อรา Phytophthora palmivora และ Phytophthora botryosa ก. โรคใบรวงที่เกิดจากเชื้อราในกลุมไฟท็อปทอรา (Phytophthora leaf fall)

ข. โรคเสนดํ า (back stripe) (ทีม่า : สถาบนัวิจัยยาง, 2544 ข)

18

1.3 ปฏิสัมพันธระหวางพืชและเชื้อกอโรค (plant-pathogen interaction) พชืสามารถตอบสนองตอเชื้อกอโรคได 2 ปฏิกิริยาคือ ตอบสนองดวยการแสดงอาการเกิดโรค (compatible reaction) และตอบสนองดวยการไมแสดงอาการของโรค (incompatible reaction) ในปฏิกิริยา compatible เกิดขึ้นเมื่อพืชพันธุออนแอ (susceptible) ถูกรุกรานดวยเชื้อโรคที่รุนแรง (virulent pathogen) และปฏิกิริยา icompatible เกดิขึ้นในพืชพันธุตานทาน (resistant) ที่ถูกรุกรานโดยเชื้อโรคที่ไมรุนแรง (avirulent pathogen) พชืจะตอบสนองดวยการไมแสดงอาการของโรค แตจะมีกลไกในการปองกันตัวเอง (defense mechanism) (ประสาทพร, 2534) ซึ่งแบงออกเปน 2 แบบคือ ชนิดแรกเปนความตานทานที่มีอยู แลวตามธรรมชาติกอนที่เชื้อจะเขาทํ าลาย (passive resistance) เชน ขี้ผึ้ง, คิวตินและผนงัเซลลที่หนา ยากตอการเขาทํ าลายของเชื้อและชนิดที่สองเปนความตานทานที่เกิดขึ้นเพื่อตอบโตตอการเขาทํ าลายของเชื้อโรค (active resistance) ซึง่แบงออกเปน 2 ประเภทคือ ความตานทานที่เกิดขึ้นอยางรวดเร็ว (rapid active defense) เชน การเกิด cork, tylose, gum, ปฏิกิริยา hypersensitivity, การสรางสารพิษ (phytoalexin) และการสรางลกินิน เปนตน และความตานทานที่ตองใชเวลานานจึงจะเกิดขึ้น (delay active defense) เชน PR-proteins และ systemic acquired resistance (SAR) เปนตน (ธรรมศักดิ์, 2529; Oku, 1994; Guest and Brown, 1997)

1.4 ความตานทานที่มีอยูตามธรรมชาติกอนที่เช้ือจะเขาทํ าลาย (passive resistance)

เปนลักษณะความตานทานที่มีอยู ตามธรรมชาติในพืชซึ่งจะขัดขวางการเขาทํ าลายและแพรกระจายของเชื้อโรค ซึ่งเมื่อเชื้อโรคเขาไปในใบพืชแลวจะเจริญเติบโตท ําลายพืช อาจทํ าลายที่ใดที่หนึ่งเฉพาะบริเวณที่เชื้อเขาไป (localized infection) หรือไปเจริญในทอนํ้ าทออาหาร (vascular bundle) แลวทํ าใหอาการของพืชไปแสดงที่อ่ืนดวย (systemic infection) ลักษณะและการเปลี่ยนแปลงดังกลาวขึ้นอยูกับชนิดของพืชและเชื้อโรค

19

1.4.1 โครงสรางปองกันเชื้อโรคทํ าลายพืช (preexisting defense structure) โครงสรางปองกันเชื้อโรคเขาทํ าลายพืชประกอบดวยหลายสวนดังนี้คือผิว

เปนสวนแรกของพืชที่เปนเกราะปองกันการเจาะผานของเชื้อ ลักษณะของโครงสรางคุณสมบัติและส วนประกอบที่คลุมใบและผลจึงมีลักษณะเป นไฮโดรโฟบิก (hydrophobic) เพื่อปองกันหยดนํ้ าเกาะติดผิวพืช ทํ าใหสปอรของเชื้อราที่อยูบนผิวพืชไมสามารถงอกได, ขนของผิวพืชที่หนาแนนทํ าใหหยดนํ้ าไมเกาะติดผิวหรืออยูไมไดนานในสภาพที่ไมเหมาะตอการเขาทํ าลายของเชื้อ, ความหนาของคิวติเคิล (cuticle) ซึ่งประกอบดวยคิวติน และขี้ผึ้งที่ปกคลุมอยูบนผนังดานนอกเซลลมีการแสดงออกทางกายภาพและทางเคมี เมื่อถูกรบกวนดวยเชื้อโรค, ความหนา (thickness) และความเหนียว (toughness) ของเซลลอิพเิดอรมิส (epidermis) ทํ าใหเชื้อราเจาะผานเขาพืชทางตรงไมได, การสรางลิกนินในผนังดานนอกเซลลซึ่งเปนสิ่งสํ าคัญมากของพืชตานทานโรคบางชนิด เชนโรคใบรวงของขาวที่เกิดจากเชื้อรา Pyricularia grisea (oryzae)พบวาที่ผนังดานนอกของเซลลสวนใหญบางและมี pectin มากกวา lignin, ความหนาและความหนืดของผนังเซลลเนื้อเยื่อทอลํ าเลียงนํ้ า (xylem) และอาหาร (phloem) หรือเนือ้เยื่อที่เปนเซลล sclerenchyma จะกดีกันการลุกลามของเชื้อรา แบคทีเรีย และไสเดอืนบางชนิด เชน การเจริญของเชื้อราสาเหตุโรคราสนิมบนกิ่ง, กาน และ ลํ าตนของธญัพชื นอกจากนี้รวมทั้งชนิดและโครงสรางของปากใบ (stomata) ปากใบที่มีชองแคบอาจทํ าใหพืชตานทานตอโรคที่เกิดจากแบคทีเรียและเชื้อราที่เจาะผานพืชทางปากใบดีขึน้ ตลอดจนเวลาการปดเปดของปากใบก็มีสวนเกี่ยวของ ตัวอยางที่เห็นไดคือขาวสาลีพันธุตานทานบางพันธุ ปากใบจะเปดสายมากเปนสาเหตุใหสปอรที่อยูในหยดนํ้ าใกลปากใบซึ่งงอกตั้งแตเชาถูกแดดเผาตายไป เพราะเมื่อสปอรงอกแลวไมสามารถเขาไปในพืชได หรือในโรค ergot ของขาวสาลีหรือขาวบาเลยที่เกิดจากเชื้อ Claviceps purpurea พบวาในพันธุที่ตานทานมีกลีบดอกปดตลอดเวลาจะเปดเฉพาะในตอนเชาชวงผสมเกสรเทานั้นจึงยากตอการเขาทํ าลายของเชื้อรา (ธรรมศักดิ์, 2529) ความตานทานทีพ่ชืสรางขึ้นเพื่อโตตอบการทํ าลายของเชื้อโรค แบงออกเปน 2 ประเภทคือ

20

1.5 ความตานทานที่พืชสรางขึ้นเพื่อโตตอบการทํ าลายของเชื้อโรค (active resistance) เปนลักษณะของความตานทานที่พืชสรางขึ้น เพื่อตอบโตการเขาทํ าลายของเชื้อโรคเพื่อปองกันการเจริญลุกลามของเชื้อโรคออกไป ปฏิกิริยาดังกลาวมีดังนี้ 1.5.1 ความตานทานที่พืชสรางขึ้นเพื่อโตตอบการทํ าลายของเชื้อโรคอยาง

รวดเร็ว (rapid active resistance) 1.5.1.1 การปองกันทางโครงสรางที่เกิดจากเนื้อเยื่อ (histological defense structures) 1.5.1.1.1 เนือ้เยือ่ประกอบดวยเซลลเจริญเปนชั้น cork (cork layers) การเจรญิเปนชั้นของเซลลมักเกิดจากหลายๆชั้นเรียงซอนทับเนื่องจากเซลลของพชืไดรับการกระตุนจากสารที่พืชขับถายออกมาทางเนื้อเยื่อ เกิดกับบริเวณที่พืชติดเชื้อหรอืแผลพืช ชั้นที่เกิดขึ้นนี้ชวยยับยั้งไมใหเชื้อและสารพิษออกมาขยายวงกวางออกไป ระงบัการไหลเวียนของนํ้ าและอาหารของพืช จากเนื้อเยื่อปกติไปยังเนื้อเยื่อที่เปนโรคทํ าใหเชื้อและเนื้อเยื่อพืชที่ตายแลวอยูในขอบเขตที่เห็นเปนจุดหรือพองนูนแยกสวนออกมาจากเนื้อเยื่อปกติ (รูปที่ 6) (ไพโรจน, 2534; Guest and Brown, 1997)

21

รูปที ่6 การเจริญของเซลลเปนชั้น cork กั้นระหวางเนื้อเยื่อที่เปนโรคและเนื้อเยื่อปกติ ก. ใบ

ข. หัวมันฝร่ัง (ทีม่า : Agrios, 1978)

ก

ข

22

1.5.1.1.2 เนื้อเยื่อแตกปริออก (abscission regions หรือ zone) การแตกของเนื้อเยื่อเปนชองวางระหวางเซลลที่เปนชั้นทัง้สองขางรอบบริเวณติดเชื้อของเนื้อเยื่อพืช (protective layers) การเกิดพบในใบออนของไมผลบางชนิด ทํ าใหใบรวง เชน ใบทอที่ยับยั้งการเขาทํ าลายของแบคทีเรีย Xanthomonas arboricola pv. pruni หรือเชื้อรา Clasterosporium carpophilum (Mehrotra and Aggarwal, 2003) พบวามิดเดิล ลาเมลลา (middle lamella) ของเซลลที่อยูระหวางชั้นทั้งสองนั้นถูกยอยตลอดตามความหนาของใบทํ าใหเนื้อเยื่อดีถูกตดัออกจากบริเวณตัวเชื้อหรือแผลที่เปนโรค ปองกันไมใหเชื้อโรคและสารที่เชื้อสรางขึ้นลกุลามไปยังเนื้อเยื่อปกติ (รูปที่ 7) (ธรรมศักดิ์, 2529;ไพโรจน, 2534)

รูปที ่7 การเกิดเนื้อเยื่อแตกปริเปนชองวางรอบจุดที่เปนโรค (abscission layer) (ทีม่า : Agrios, 1978)

1.5.1.1.3 การเกิด tylose ในทอ xylem (tylosis) การเกิด tylose เปนการเจริญของโปรโตพลาส (protoplasm) ของเซลลพาเรนไคมา (parenchyma) ที่อยูติดกับทอ xylem โดยเจรญิเขาไปภายในทอ xylem มีขนาดใหญและจํ านวนมากจนทํ าใหทออุดตัน (Guest and Brown, 1997) การเกดิจะเปนในระหวางที่เชื้อโรคเขาทํ าลายทางกลุมทอลํ าเลียงเปนสวนมาก ในพืชพันธุที่ตานทานตอโรคจะเกิด tylose ไดมากมายอยางรวดเร็วกอนที่

23

เชือ้จะลกุลามไป หากเปนพันธุที่ออนแอเชื้อจะเจริญไปถึงกอนแลวจึงเกิด tylose ภายหลงัท ําใหสามารถกีดกันการลุกลามของเชื้อไดพืชจึงเปนโรครุนแรง (รูปที่ 8) เชนโรคเหี่ยวของมันเทศ (Sweet potato wilt) ทีมี่สาเหตุมาจากเชื้อรา Fusarium oxysporum f.sp. batatas Blackhurst และ Wood (1963) รายงานวาพบเปอรเซ็นตของการอุดตนัในทอลํ าเลียงเนื่องจากการเกิด tylose ภายหลังจากการบมเชื้อ Verticillium albo-atrum บนใบมะเขือเทศผานไป 19 วันพบวามีการเกิด tylose 36% ในพันธุตานทาน (Loran Blood) มากกวาในพันธุออนแอ (Ailsa Craig) พบเพียง 23% (Mehrotra and Aggarwal, 2003)

รูปที่ 8 การเกิด tylose ในทอ xylem ก. ตัดตามยาว และ ข. ตัดตามขวาง : ภาพซายมือเปนพืช ปกต ิ ภาพกลางเริ่มเกิด tylose และขวามือสุดทอถูกอุดตันดวย tylose, v = ทอ xylem, xp = xylem parenchyma cell, T = tylose และ pp = ผนังกั้น (ทีม่า : Agrios, 1978)

1.5.1.1.4 การสะสมยางเหนียว (gum) ของเนื้อเยื่อพืช สรางยางเหนียวขึ้นรอบบริเวณแผล ซึ่งอาจเปนแผลที่เกิดขึ้นจากเชื้อโรคหรือสาเหตุอ่ืนๆโดยยางจะถูกสะสมอยูในชองวางระหวางเซลลหรือภายในเซลล การสะสมของยางไดรวดเร็ว

ก

ข

24

รอบบริเวณเนื้อเยื่อที่ถูกเชื้อเขาทํ าลายนั้น สามารถทํ าใหเชื้อบางชนิดชะงักการเจริญ และขยายขอบเขตออกไปอีกไมไดเชื้อจะถูกจํ ากัดอยูเฉพาะในแผล อัตราการสะสมยางมีความแตกตางกันแลวแตชนิดและพันธุพืช (ประสาทพร, 2534) เชนพบการสะสม gum ในขาวพันธุตานทานตอโรคใบไหม (Blast) จากเชื้อ Piricularia oryzae และโรคใบจุด จากเชื้อ Helminthosporium oryzae (Mehrotra and Aggarwal, 2003) 1.5.1.2 การปองกันที่เกิดจากโครงสรางของเซลล

(cellular defense structures) โครงสรางปองกันที่เกิดจากเซลลขึ้นอยูกับการเปลี่ยนแปลงทางสณัฐานของผนังเซลล ในระหวางที่เซลลถูกเชื้อทํ าลายซึ่งมีกลไกที่มีขอบเขตจํ ากัด พบในโรคทีเ่กิดจากเชื้อรา 2 แบบคือ เกิดจากการโปงออกของเซลลอิพิเดอรมิสและเซลลที่อยูใตอิพิเดอรมิส ในระหวางที่เชื้อแทงผานพืชโดยตรงซึ่งอาจยับยั้งการแทงผานและการตัง้รกรากของเชื้อ และการเกิดเปนปลอกหอหุมเสนใยของเชื้อที่เร่ิมแทงผานเซลล (รูปที่ 9) (ไพโรจน, 2525; ประสาทพร, 2534; Mehrotra and Aggarwal, 2003) เชนพบการเกิดปลอกหุม haustoria ในใบกาแฟพันธุตานทาน (C. arabica และ C. congensis) หลังจากถูกกระตุนดวยเชื้อรา H. vastatrix (Silva et al., 2002 a).

รูปที ่9 การเกดิปลอกหอหุมรอบเสนใยที่แทงผานผนังเซลล CW = ผนังเซลล, H = เสนใย, A = appressorium, AH = เสนใยทีแ่ทงผานผนังเซลลซึ่งมีปลอกหอหุม, S = ปลอกหอหุม, HC = เสนใยใน cytoplasm (ที่มา : Agrios, 1978)

25

1.5.1.3 การปองกันที่เกิดจากปฏิกิริยาในไซโทพลาสซึม (cytoplasm) cytoplasmไปคลมุกลุมของเสนใย โดยนิวเคลียสของพืชจะเคลื่อน

ตามไปดวย แลวโปรโตพลาสม (protoplasm) จะเริ่มจางหายในขณะที่เสนใยของเชื้อเจรญิมากขึ้น บางครั้งเซลลที่เชื้อเขาทํ าลาย cytoplasm และ nucleus จะขยายใหญขึ้นท ําให cytoplasm กลายเปนเมล็ดเดนชัด เสนใยของเชื้อสลายตัวเห็นเปนสวนๆ แลวการเขาทํ าลายก็หยุดลง (ไพโรจน, 2525; Mehrotra and Aggarwal, 2003)

1.5.1.4 รอยไหม (necrosis) และการตายอยางวองไวของเซลล (hypersensitive cell death) การเกิดรอยไหมเปนลักษณะที่เกิดจากการตายของเซลลตรงตํ าแหนงที่ถูกบุกรุกโดยเชื้อโรคหรือสารพิษตางๆ โดยสังเกตเห็นเปนรอยไหมสีนํ้ าตาล มักเปนแบบแหง หรือมีแผลเปนหยอมๆ ถาพืชเกิดรอยไหมอยางวองไวเมื่อถูกบุกรุกจากเชื้อกอโรคจะเรียกการตอบสนองนี้วา “ hypersensitive ” (Guest and Brown, 1997) (รูปที่ 10) อาการรอยไหมพบทั่วไปตามบริเวณสวนของพืชที่เปนโรค ไดแก ขน ใบ ตน โคน ราก หัว ฝก ผล ฯลฯ ขนาดของรอยไหมจะมีขอบเขตกวางหรือแคบ เกิดเร็วหรือชาขึ้นอยูกับองคประกอบหลายอยาง เชน สวนของพืช, ชนิดของพืชที่ถูกอาศัย, เชื้อที่บกุรุก, สภาพอากาศและสิ่งแวดลอมตางๆ อาการของรอยไหมที่พบทั่วไป เชน อาการแบบเปนจุด (spot) มักเกิดบนใบหรือผล ตามปกติมีขนาดแผลประมาณ 1 หรือ 2 มิลลเิมตรจนถึง 1 เซนติเมตรขึ้นไป (ไพโรจน, 2525) มีรูปรางกลม เนื้อเยื่อตรงกลางแผลซึง่ตายแลวจะทํ าใหเห็นโซนรอบๆแผล อาจเปนสีแดงหรือเหลือง เชน โรคใบจุดนูน (Colletotrichum leaf spot) หรอืลกัษณะรอยไหมที่เปนจุดนูนสีนํ้ าตาล ขอบแผลสีเหลอืงลกัษณะคลายรอยไหม แผลมีขนาดเสนผาศูนยกลาง 1–2 เซนติเมตรซึ่งเกิดจากเชื้อ Colletotrichum gloeosporioides หรือบางโรคอาจจะมีลักษณะเปนรอยขีด (streak) ตามความยาวของใบ เสนใบและลํ าตน หรือไมอาจมีลักษณะรอยไหมเปนจุดกลมและเปนลายกางปลาบนใบออนและใบแกเพราะเกิดการลุกลามไปตามเสนใบ เปนอาการของโรคใบจุดกางปลา (Corynespora leaf disease) ที่เกิดจากเชื้อรา Corynespora cassiicola (สถาบันวิจัยยาง, 2544 ข)

26

รูปที ่10 แสดงลักษณะการเกิดปฏิกิริยาการตอบสนองแบบ hypersensitive cell death ของใบไม เมือ่ถูกบุกรุกจากเชื้อกอโรค ก. ลักษณะ hypersensitive cell death เมื่อเชื้อกอโรคแทงเขาไปในเซลลพืชโดยตรง ข. ลักษณะ hypersensitive cell death เมื่อเชื้อกอโรคแทงผานเขาไปในเซลลใบไมโดย

ผานบริเวณปากใบ(ทีม่า : Guest and Brown, 1997)

Breton และคณะ (1997 a) ไดนํ าเชื้อรา C. cassiicola มาบมบนใบยางพาราพบวา หลังจากบมเชื้อผานไป 24 ชั่วโมง นีโครซีสทีเ่กิดขึ้นจากการเขาทํ าลายใบยางดวยสปอร มีความแตกตางกันอยางชัดเจนระหวางใบยางพันธุตานทาน (พันธุ GT1) กับพันธุออนแอ (PB260) โดยที่นโีครซีสในใบยางพันธุตานทาน มีขนาดเลก็เปนจุดๆซึ่งแสดงถึงการเกิด hypersensitive reaction ซึ่งตรงกันขามกับนีโครซีสในใบยางพันธุออนแอที่พบวามีขนาดใหญ และเมื่อเวลาผานไป 48 ชั่วโมงนีโครซีสจะแผกวางออกไปเรื่อยๆ จนทํ าใหเกิดรอยดาง (discolor) บริเวณเสนใบที่อยูรอบๆบาดแผลซึง่แสดงถึงการเกิดโรคกางปลา (fish bone) ทั้งนี้เนื่องจากใบยางพันธุตานทานแสดงถึงความสามารถในการกักบริเวณเชื้อราไมใหแพรกระจายไปยังเซลลขางเคียง สวนพนัธุออนแอการที่พบขนาดของนีโครซิสใหญและแผกวางแสดงถึงการเกิดโรค คือเกิดปฏิกิริยา compatible ซึ่งเปนปฏิกิริยาระหวางเชื้อกอโรคกับพืชพันธุออนแอ สวนปฏกิิริยาระหวางเชื้อกอโรคกับพืชพันธุตานทาน เรียกวา ปฏิกิริยา incompatible แต

กข

27

ถามีการเพิ่มปริมาณของเชื้อกอโรคปฏิกิริยานี้ก็สามารถเปลี่ยนเปน compatible ไดเชนกัน ดังนั้นลักษณะของนีโครซีสที่เกิดจากการตอบสนองของใบยางตอเชื้อกอโรคสามารถบอกระดับความตานทานโรคได และท็อกซินจากเชื้อรา C. cassiicola สามารถทํ าใหใบยางเกิดนีโครซีสไดและใหผลการทดลองเชนเดียวกับการบมเชื้อลงบนใบยางดวยสปอรโดยตรง นอกจากนี้การบมใบยางพาราดวย palmivorein ซึ่งเปนอิลิซิเตอรที่มีขนาด 10 กิโลดาลตันของเชื้อรา P. palmivora ในใบยางพาราพันธุ BPM-24, (ตานทาน) และ RRIM600 (ออนแอ) ทํ าใหเกิดนีโครซีสแตกตางกันคือพันธุที่ตานทานพบนีโครซีสที่มีขอบเขตชัดเจนสีดํ าตามลักษณะของ hypersensitive cell death สวนพันธุออนแอพบรอยไหมเปนสีนํ้ าตาลและแผกวางออกไป ซึ่งเปนลักษณะของการเกิดโรค ทํ าใหสามารถนํ าท็อกซินของเชื้อราไปใชประโยชนในการคัดเลือกพันธุยางได (นลิุบล, 2545) 1.5.1.5 ไฟโตอเล็กซิน (phytoalexin) เปนปฏชิีวนะสารที่พืชสรางขึ้นและมีพิษตอเชื้อรา (antimicrobial) มีมวลโมเลกุลตํ่ า และมีธาตุคารบอน, ไฮโดรเจนและออกซิเจนเปนองคประกอบที่พบสะสมเฉพาะในพืชที่ไดรับการกระตุนจากการเขาทํ าลายของเชื้อโรคหรือถูกกระตุน (stress) จากอิลิซิเตอรชนิดตางๆทั้งไบโอตกิ (biotic) และอไบโอติก(abiotic) พบในตํ าแหนงที่มีการบุกรุกซึ่งสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อราและแบคทีเรีย (Darvill and Albersheim, 1984; Kuc’, 1985) เชน จากการบมดอกทานตะวันดวยเชื้อรา Helminthosporium carbonum มีการสราง ayapin และ scopoletin ซึง่เปนไฟโต อเล็กซินชนดิหนึ่งที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา H. carbonum ได (Tal and Robeson, 1986) 1.5.1.5.1 คณุสมบัติของไฟโตอเล็กซิน

เปนสารที่มีคุณสมบัติเฉพาะขึ้นอยูกับพืชที่สรางขึ้นจากการกระตุนของเชื้อ โดยไมเฉพาะเจาะจงกับเชื้อราชนิดใดชนิดหนึ่ง ซึ่งปฏิกิริยาเกิดในเนือ้เยือ่ที่มีปรสิตอยูและในเนื้อเยื่อของเซลลขางเคียง อัตราการเกิดไฟโตอเล็กซินขึ้นอยูกบัพนัธกุรรมของพืช และกํ าเนิดในเซลลพืชที่มีชีวิตเทานั้น (ไพโรจน, 2525) รวมทั้งเชื้อ

28

ราที่เปนสาเหตุโรคจะกระตุนใหพืชสรางไฟโตอเล็กซินไดในอัตราความเขมขนตํ่ ากวาเชือ้ทีไ่มไดเปนสาเหตุโรค ไฟโตอเล็กซินที่พืชอาศัยสรางจะมีพิษตอเชื้อที่เปนสาเหตุของโรคนั้นนอยกวาเชื้อราอื่นๆที่ไมใชสาเหตุโรค เชน จากการศึกษาการสะสมไฟโตอเล็กซิน บริเวณอีพิเดอรมิสของใบถั่วเหลืองโดยเปรียบเทียบกันระหวางเชื้อรา Botrytis fabae ที่กอใหเกิดโรคและเชื้อราที่ไมใชสาเหตุโรคคือ Botrytis cinerea พบวาถาเปนเชื้อที่กอโรคเสนใยของเชื้อราจะเจาะผานเขาไปในผนังเซลลไดเร็วและเกิดการตายของเซลลพืชกอนที่จะมีการสะสมไฟโตอเล็กซินไดมากพอเพื่อใชในการตานทาน แตเชื้อราที่ไมไดทํ าใหเกิดโรคถูกหยุดการเจริญเติบโตทันทีเพราะมีการสะสมไฟโตอเล็กซินจํ านวนมาก (Darvill and Albersheim, 1984) และนอกจากนี้เชื้อราที่แตกตางกันจะมีปฏิกิริยาในระดบัทีแ่ตกตางกัน ในพืชพันธุตานทานโรค หรือพืชที่เปนโรคงายมีการเกิดไฟโตอเล็กซินคลายกันแตแตกตางกันที่อัตราการเกิดเทานั้น อยางเชนที่พบในการปลูกเชื้อ Ceratocystis fimbriata f.sp. platani บนใบ plane tree ที่เปนพันธุตานทาน (platanus occidentalis) และพันธุออนแอ (platanus acerifolia) สามารถชักนํ าใหเกิดนีโครซีสและการสะสมไฟโตอเล็กซินไดสองชนิดคือ scopoletin และ umbelliferone โดยขนาดของนีโครซีสขยายกวางและมีการสะสมไฟโตอเล็กซินไดเร็วในปฏิกิริยา incompatible (พันธุตานทาน) ซึ่งมากกวาในปฏิกิริยา compatible (ออนแอ) ประมาณ 30 เทาจากการหยดบนหลังใบ และประมาณ 120 เทาในการสะสมภายในเนื้อเยื่อของเซลล (Modafar, 1995)

ไฟโตอเล็กซินสามารถแยกออกมาจาก ลํ าตน, ราก, ใบและผล ที่เกิดจากการติดเชื้อ มีโครงสรางที่แตกตางกันมากกวา 350 แบบจากพืช 30 ชนิดซึ่งมากกวา 130 แบบมาจากพืชวงศ Leguminosae พบทั้งในพืชใบเลี้ยงเดี่ยว (monocotyledons) และพืชใบเลี้ยงคู (dicotyledons) (Kuc’, 1995) และมีชื่อเฉพาะที่แตกตางกันไป เชน ipomeamarone และ scopoletin พบในมันเทศ, orchinol พบในกลวยไมตางๆ, pisatin พบในถั่วลันเตา, phaseolin พบในถั่วเมล็ดแบนตางๆและ rishitin ทีพ่บในมันฝรั่ง (รูปที่ 11) (ไพโรจน, 2525)

29

1.5.1.5.2 วถิีการสังเคราะหไฟโตอเล็กซิน การสังเคราะหไฟโตอเล็กซินในพืชทุกชนิดอาศัยวิถีของ shikimate, acetate-malonate และ acetate-mevalonate ซึง่เปนวิถีเมตาบอลิซึมแบบทุติยภูมิ (secondary metabolism pathways) โดยวิถี shikimate ถูกนํ าไปสังเคราะห chlorogenic acid, วิถี acetate-mevalonate ถูกนํ าไปสังเคราะห 6-methoxymellein และ wyerone สวนวิถี acetate-mevalonate ถูกนํ าไปสังเคราะห rishitin และ ipomeamarone สํ าหรับไฟโตอเล็กซินบางชนิดตองอาศัยวิถีการสงัเคราะหรวมกันสองถึงสามวิถี ตัวอยางเชน จากวิถี acetate-mevalonate รวมกับวิถี shikimate ใชสังเคราะห glycinol และ pisatin สวนวิถี acetate-malonate, acetate mevalonate และ shikimate วถิทีั้งสามทํ าใหเกิดการสังเคราะห kievitone, plaseollin และ glyceollin Ι เปนตน (รูปที่ 12) (Kuc’, 1995)

30

รูปที ่11 ตัวอยางโครงสรางของไฟโตอเล็กซินที่พืชสรางขึ้นเพื่อตอบโตการเขาทํ าลายของเชื้อรา (ทีม่า : ดัดแปลงจาก ไพโรจน, 2525)

Ipomeamarone พบในมันเทศ Scopoletin พบในมันเทศ และยางพารา

Pisatin พบในถั่วลันเตา Orchinol พบในกลวยไมตางๆ

Rishitin พบในมันฝร่ัง

31

รูปที ่12 ตัวอยางวิถีที่นํ าไปสูการสังเคราะหไฟโตอเล็กซิน (ทีม่า : Kuc’, 1995)

สํ าหรับในยางพาราการตอบสนองในการปองกันตัวเองพบเปนครั้งแรกโดย Tan และ Low ในป 1975 โดยพบวาเกิดสารเรืองแสงภายใตแสงอุลตราไวโอเลตซึ่งเปนสารประกอบสีฟาในเนื้อเยื่อใบภายใตการตอบสนองการตานทานตอเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides ตอมา Gieseman และคณะ (1986) พบสคอพอลติิน บนใบยางพาราเมื่อถูกกระตุนดวยเชื้อรา Microcyclus ulei ระดับการ

32

ตานทานสัมพันธกับความเร็วและปริมาณการสะสมสคอพอลตินิ โดยในพันธุที่ตานทานมีการสะสมสคอพอลิตินสงูกวาพันธุออนแอ (Garcia et al., 1995 b) รวมทั้งสรางไดเร็วกวาพันธุออนแอ สคอพอลิตินสามารถยับยั้งการงอกและการเจรญเติบโตของโคนิเดียม (conidium) ซึ่งเปนสปอรของเชื้อรา M. ulei ได เชนเดียวกับที่รายงานโดย Churngchow และ Rattarasarn (2001) โดยการบมเชื้อรา P. palmivora ลงบนใบยาง 4 พันธุไดแก BPM-24, PB-235, RRIT251 และ RRIM600 สามารถบอกความแตกตางของระดับความตานทานโรคโดยอาศัยอัตราเร็วกับปริมาณของสคอพอลิตินที่เกิดขึน้หลังการติดเชื้อซึ่งพบวาพันธุ BPM-24 (ตานทาน) และ PB235 (คอนขางตานทาน) สามารถสังเคราะหปริมาณไฟโตอเล็กซินไดเร็วและมีปริมาณในการสังเคราะหสูงกวาพนัธุ RRIT251 (คอนขางออนแอ) และ RRIM600 (ออนแอ) 1.5.1.6 การสังเคราะหลิกนิน ( lignification ) ผนงัเซลลพชืโดยทั่วไป มี 2 ชนิด คือ ผนังเซลลปฐมภูมิ (primary wall) เกดิขึน้ครั้งแรกขณะที่เซลลมีการเจริญเติบโต เซลลบางชนิด เชน พาเรนไคมา (parenchyma) และคอลเลนไคมา (collenchyma) ประกอบดวยสารเคมีพวกเซลลโูลส, เฮมิเซลลูโลส (hemicellulose), เพคตินและโปรตีน ชนิดที่สองคือผนังเซลลทตุยิภมิู (secondary wall) เกิดขึ้นภายหลังผนังเซลลปฐมภูมิหลังจากที่เซลลหยุดการเจริญแลว โดยจะพอกทับผนังเซลลปฐมภูมิใหผนังเซลลมีความแข็งแรงมากขึ้น ประกอบดวยสารเคมีพวกเซลลูโลส, เฮมิเซลลูโลสและลิกนิน ซึ่งลกินนินัน้เปนสารที่ไมละลายนํ้ า เกิดจากการรวมกันของสารประกอบแอลกอฮอลเชิงซอน แอลกอฮอลที่พบวาเปนสวนประกอบของลกินินมากคือโคนิเฟอริล (conoferyl), ไซนาปล (sinapyl) และคอมาริล (coumaryl) (ลดัดา, 2541) แอลกอฮอลทั้งสามเปลี่ยนแปลงมาจากกรดอะมิโนชื่อฟนิลอะลานนี (phenylalanine) ดวยเอนไซมฟนิลอะลานนี แอมโมเนีย ไลเอส (phenylalanine ammonia lyase) ไดเปนกรดซินนามิก (cinamic acid) หรือจากกรดอะมิโนไทโรซีน (tyrosine) ดวยเอนไซมไทโรซนี แอมโมเนีย ไลเอส (tyrosine ammonia lyase) ไดเปนกรดคอมาริก (coumaric acid) ซึง่กรดดังกลาวจะถูกเปลี่ยนแปลงเปน

33

แอลกอฮอลทั้งสาม (รูปที่ 13) จากนั้นแอลกอฮอลแตละชนิดจะมาเชื่อมตอกันกลายเปนลกินิน พืชจะตอบสนองตอเชื้อโรคโดยการเกิดปฏิกิริยาการสรางลิกนินเพื่อเพิ่มความแข็งแรงใหกับเซลลพืชและกักเชื้อโรคไมใหลุกลามหรือแพรกระจายออกไป Friend และคณะ (1973) พบวาการสรางลกินินในมันฝรั่งสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของสายรา P. infestans ได สวนในยางพารานั้น Garcia และคณะ (1995 a) รายงานไววามีการกักบริเวณไมใหเชื้อ M. ulei ลกุลามไปยังเซลลขางเคียง โดยการสรางลกินนิเปนกลไกสํ าคัญอันหนึ่งในการตานเชื้อราชนิดนี้ ซึ่งการสรางลิกนินบริเวณผนงัเซลลจะแตกตางกันไปตามระดับความตานทานของยางพารา รวมทั้งยังรายงานไวอีกวา เมื่อทํ าการปลูกเชื้อรา M. ulei บนใบยางพาราเปนเวลา 4 วัน ระดับการสรางลิกนนิจะแตกตางกัน กลาวคือใบยางพาราพันธุที่มีความตานทานสูงจะมีการสรางลิกนินเฉพาะบริเวณที่มีการบุกรุกดวยสปอรของเชื้อรา สํ าหรับใบยางพันธุที่มีความตานทาน ปานกลาง และพันธุออนแอมีการสรางลิกนินรอบๆบริเวณรอยแผลที่เกิดจากการลุกลามไปถึงของเชื้อรา โดยที่พันธุยางที่ตานทานปานกลางมีปริมาณการสรางลิกนินมากกวาพันธุออนแอ และไมพบเสนใยราซึ่งเปนที่เกิดของสปอร (conidiophores) รอบๆบริเวณที่มีการสรางลกินนิ แสดงวาการสรางลิกนินสามารถกักบริเวณไมใหเชื้อลุกลามไปยัง เซลล ข างเคียงซึ่ งจะแตกต างจากพันธุ ยางในกลุ มอ อนแอที่ยั งคงพบ coniodiophores ของเชื้อราในบริเวณที่มีการสรางลิกนิน นอกจากนี้พบวาการสังเคราะหเอนไซมเปอรออกซิเดสเพื่อตอตานเชื้อราของใบยางพันธุ ตานทานยังมีปริมาณสูงกวาใบยางพันธุออนแออีกดวย (Breton et al.,1997 b) แสดงวามีการสรางลกินนิเพื่อเพิ่มความแข็งแรงใหกับผนังเซลลพืช

34

รูปที่ 13 วิถีการสังเคราะหลิกนนิโดยสงัเขป (ที่มา : มนตรี และคณะ, 2542)

1.5.2 การตอบสนองที่ตองใชเวลานานจึงจะเกิดขึ้น (delayed active defense)

1.5.2.1 การสังเคราะห pathogenesis–related protein (PR–proteins) PR – protein เปนโปรตีนขนาดเล็กที่มีขนาดมวลโมเลกุล 10,000 – 40,000 ดาลตัน พบภายในพืชโดยทั่วไป โดยในพืชปกติมักพบ PR – proteins นอยมากหรือไมพบเลยแตจะถูกชักนํ าใหสรางขึ้นเพื่อตอตานและยับยั้งการถูกบุกรุกจากเชื้อโรค หรือภายใตสภาวะกดดันอื่นๆอีก เชน การเกิดบาดแผล (wounding) และจากสารเคมี (chemical treatment) (Pierpoint, 1986) บางชนิดเชน ethylene hormone (Boller, 1985) PR–proteins จะถกูสะสมนอกเซลลในขณะที่พืชติดเชื้อ โดยโปรตีนนี้จะทนทานตอ proteolytic degradation ไดดีและโปรตีนนี้มักจะมีคา isoelectric point สูง PR – proteins ทีพ่ชืสรางขึ้นมีคุณสมบัติเปนเอนไซมที่มีผลโดยตรงตอเชื้อราคือเอนไซมไคติเนส (chitinase) และเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนส (β-1,3-glucanase) เอนไซมทั้งสองชนิดนี้ทํ างานรวมกันแบบ synergistic (Mauch et al.,1988b) และพบไดทั้งในพืชใบเลี้ยงคูและพืชใบเลี้ยงเดี่ยวที่มีการติดเชื้อ เชน ใบยาสูบ, ขาวบารเลยและมันฝรั่ง เปนตน เอนไซมไคติเนสทํ าหนาที่กระตุนการยอยสลายไคติน

35

ซึง่เปนสวนประกอบที่สํ าคัญของผนังเซลลของเชื้อรา ไดมีรายงานวา ไคติเนสซึ่งเตรียมไดจากขาวบารเลยสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา Trichoderma reesei, Alternaria alternaria, Phycomyces blakesleesasus และ Neurospora crassa (Robert and Selitrennikoff,1986) สวนเอนไซมเบตา -1,3-กลูคาเนส เปนเอนไซมที่จัดอยูในกลุมเอนไซมไฮโดรเลส คือเรงปฏิกิริยาการสลายดวยนํ้ า จะทํ าหนาที่สลายพนัธะเบตา-1,3-กลแูคน ตัวอยางของเอนไซมในแหลงอื่น เชน Arthrobactor luteus ทีเ่ลีย้งในอาหารเหลวจะสลายพันธะกลแูคนจากผนังยีสต Mauch และคณะ (1988a) พบวาเอนไซมเบตา-1,3-กลูคาเนสที่พบคูกับเอนไซมไคติเนสทํ าใหบริสุทธิ์จากฝกถั่วลันเตาที่ติดเชื้อรา Fusarium solani และ Fusarium phasioli สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา 15 ชนิด จาก 18 ชนดิ ที่ทดสอบ แตถาใชเอนไซมเบตา-1,3 -กลูคาเนสเพียงอยางเดียวจะสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อราไดเพียง 2 ชนิดเทานั้น แสดงวาเบตา-1,3- กลูคาเนสและ ไคติเนสในถั่วสามารถทํ างานรวมแบบเสริมฤทธิ์กัน (synergistic) ในการยับยั้งการเจรญิของเชื้อรา นอกจากจะทํ างานรวมกันแลวยังถูกควบคุมดวยกลไกที่คลายคลึงกันดวย คือเอนไซมทั้งสองสามารถถูกยับยั้งการสรางเมื่อใช auxin และ cytokinin (Shinshi et al., 1987) Martin และคณะ (1991) ไดทํ าบริสุทธิ์เอนไซมไคติเนสจากนํ้ ายางพาราและพบวามีเอนไซมไคติเนสสูงถึง 20 % ของโปรตีนทั้งหมด ในขณะที่พืชทั่วๆไปมีไคตเินสเพียง 1–2 % ของโปรตีนทั้งหมดเทานั้น นอกจากนี้ Churngchow และคณะ (1995) ยังมีการรายงานไวอีกวา เอนไซมเบตา–1,3-กลูคาเนส ก็มีปริมาณสูงเชนเดยีวกนัโดยสูงถึง 15 % ของโปรตีน ทั้งนี้อาจเนื่องมาจากตนยางถูกกรีดเกือบทุกวัน หนายางจะถูกเปดออกทํ าใหเชื้อราผานเขาไปตามทอนํ้ ายางไดงาย ดังนั้นเพื่อปองกันเชือ้รา เอนไซมทั้งสองจึงถูกสรางขึ้นตลอดเวลาโดยไมตองมีการกระตุนใหสรางเพิ่มขึ้นเมือ่มีการติดเชื้อเหมือนในพืชอ่ืนๆ นอกจากนี้การเกิดบาดแผลจากการถูกกรีดบอยๆก็เปนอีกสาเหตุหนึ่งที่ทํ าใหเอนไซมทั้งสองมีปริมาณสูง

36

ส ําหรับการทดลองเกี่ยวกับเชื้อรา C. cassiicola พบวาเอนไซม เบตา-1,3-กลูคาเนสและไคติเนสก็ถูกชักนํ าใหสังเคราะหขึ้นเพื่อตอบสนองตอการติดเชื้อ แตปริมาณการสังเคราะหไมสามารถบอกความแตกตางระหวางพันธุได เนื่องจากใบยางทั้งพันธุตานทานและพันธุออนแอถูกชักนํ าใหสรางเอนไซมทั้งสองในปริมาณที่ใกลเคียงกัน (Breton et al., 1997) ตอมา Christopher และคณะ (2000) พบวา เชื้อรา Alternaria solani ทีท่ํ าใหเกิดโรคใบไหม (blight) ในมะเขือเทศ สามารถชักนํ าใหมีการสังเคราะหเอนไซมทั้งสองชนิดขึ้นและสามารถบอกความแตกตางระหวางพันธุทีต่านทานและออนแอได โดยพันธุที่ตานทานสามารถสรางเอนไซมทั้งสองไดเร็วและมากกวาพันธุออนแอ เชนเดียวกับในใบแตงโมที่ถูกกระตุนดวยเชื้อรา Sphaerotheca fusca กลาวคือใบแตงโมของพันธุตานทานสามารถสรางเอนไซม เบตา-1,3-กลูคาเนส ทีมี่ขนาด 33 กิโลดาลตัน ไดมากและเร็วกวาพันธุที่ออนแอ (Rivera et al., 2002) 1.5.2.2 กลไกที่จํ าเปนในการตานทานตอโรค

(systemic acquired resistance, SAR) SAR เปนปฏิสัมพันธที่เกิดขึ้นระหวางพืชและเชื้อกอโรค (plant-pathogen interaction) ซึ่งเชื้อกอโรคดังกลาวคือพวกไวรสั แบคทีเรีย และเชื้อราที่สามารถชักนํ าใหเกิดการตานทานโรคของพืชบางชนิด จากการรุกรานของเชื้อกอโรคที่รุนแรงหรือเกิดขึ้นภายหลังการติดเชื้อ พื้นฐานของ SAR แตกตางจากความจํ าเพาะระหวางแอนติเจน (antigen) และ แอนติบอดี (antibody) ที่เปนตัวกลางในการตอบสนองของระบบภูมิคุมกันในสัตวเลี้ยงลูกดวยนมเพราะการเกิด SAR ไมมีความจํ าเพาะเจาะจงตอเชื้อโรคชนิดใดชนิดหนึ่งและมีชวงเวลาในการแสดงที่สั้นกวาระบบภูมิคุมกัน (Oku, 1993) การเกิด SAR ทํ าใหเกิดการแผขยายออกของนีโครซีสอยางชาๆซึ่งในพืชที่ไดรับการกระตุนใหเกิด SAR ทํ าใหเกิดการตอบสนองในการปองกันตัวเองที่เร็วและมากกวาในพืชที่ไมเคยไดรับการกระตุน ตัวถูกกระตุนดังกลาว เชน salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA) และอิลิซเิตอรอ่ืนๆ รวมทั้งอิลิซิติน (elicitin) (Guest and Brown, 1997)

37

จากการทดลองโดยการบมเชื้อ P. nicotianae บนลํ าตนยาสูบที่ถูกกระตุนจากอิลิซิเตอรมากอนทํ าใหเกิดนีโครซีสที่มีขอบเขตที่จํ ากัดเมื่อเปรียบเทียบกับในชุดควบคุมซึ่งถูกกระตุนดวยนํ้ าแทนอิลิซิเตอร พบวาเชื้อยังคงสามารถลุกลามออกไปได (Ricci et al., 1989) และการบมใบยางดวย tobacco necrosis virus (TNV) บนใบมะเขือเทศใบลางสองใบสามารถชักนํ าใหเกิด SAR บนใบมะเขือเทศใบบน สงผลใหลดการเกิดโรคใบไหมของมะเขือเทศไดเมื่อเปรียบเทียบกับชุดควบคุมที่ใชนํ้ าแทน TNV และสามารถชักนํ าใหเกิด PR-protein ในใบที่ถูกบมเชื้อ (ใบที่ 1 และ 2) และใบที่สามที่อยูบนใบที่ถูกบมเชื้อดวย (Anfoka and Buchenauer, 1997) นอกจากนี้การประยุกตใช chitosan หรือ digandrin ชนดิใดชนิดหนึ่งกับตนมะเขือเทศที่ถูกตัดยอดเพื่อกระตุนใหเกิด SAR ทํ าใหอาการที่รุนแรงของเชื้อ Fusarium ลดลงเมื่อเปรียบเทยีบกับในชุดควบคุม โดย 5 วันหลังจากมีการปลูกเชื้อ Fusarium ไมพบอาการของโรคและจํ านวนบาดแผลที่เกิดบริเวณรากยังลดลงอีกดวย (Benhamou et al., 2001) เชนเดียวกับเมื่อประยุกตใช probenazole (PBZ) และ 1,2-benzisothiadiazole -1,1-dioxide (BIT) บนใบยาสูบใบลางผานไป 7 วันพบวาเมื่อทํ าใหติดเชื้อ tobacco mosaic virus (TMV) ขนาดแผลของใบบนมีขนาดเล็กกวาที่เกิดจากในชุดควบคุมที่กระตุนใบยาสูบดวยนํ้ า (Nakashita et al., 2002) ความสัมพันธระหวางเชื้อที่กอโรคกับการตายของเซลล (cell death) ของยาสูบนั้น พบวาเมื่อเกิดการตายของเซลลจากการบมเชื้อ Thielaviopsis basicola ตองมีการกระตุนใหเกิด SAR ดวย ในขณะที่การชักนํ าใหเกิด SAR จากตัวกระตุนภายนอก เชน SA หรือ 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) ไมเกี่ยวของกับการเกดิ cell death จากเหตุผลเหลานี้ชี้ใหเห็นวาสารประกอบที่กระตุนวิถีการเกิด SAR อยูตํ่ ากวาวิถีที่ทํ าใหเกิด cell death (Hunt et al., 1996)

38

1.6 อิลิซิติน (Elicitin) อิลิซิติน เปนชื่อเรียกโดยรวมของกลุมโปรตีนที่มีโมเลกุลขนาดเล็กพบในสารสกัดผนงัเซลลของเชื้อรา หรือในอาหารเลี้ยงเชื้อ (culture filtrate) ของเชื้อราในกลุมไฟท็อปทอรา (Phytophthora) โดยผลิตออกมานอกเซลล (Huet and Pernollet, 1989) อิลิซิตินจัดเปนอิลิซิเตอรชนิดหนึ่งซึ่งอิลิซิเตอรจะมีอยูสองชนิดคือไบโอติกอิลิซิเตอร (biotic elicitor) และอไบโอติกอิลิซเิตอร (abiotic elicitor) พวกไบโอติกอิลิซเิตอรจะเปนสารที่มาจาก เชื้อรา, เซลลโูลสและโปรตีนจากเชื้อรา ถาจํ าแนกตามสูตรโครงสรางจะมีทั้งที่เปนโพลเีปปไทด (polypeptide), โพลีแซคคาไรด (polysaccharide), ไกลโคโปรตีน(glycoprotein), ไคโตแซน (chitosan) และกรดไขมัน (fatty acid) (Darvill and Albersheim, 1984) สวนชนิดที่สองที่เปนอไบโอติกอิลิซเิตอร เชนแสง, รังสีอุลตราไวโอเล็ตและไอออนจากโลหะหนัก ดังนั้นอิลิซิตินจัดเปนไบโอติกอิลิซิเตอรที่มีโครงสรางเปนโพลีเปปไทด (polypeptide) อิลิซิตินมีชื่อเรียกเฉพาะตามชนิดของเชื้อราเชน cryptogein เปนอิลิซิตินที่ผลิตจาก P. cryptogea (Ricci et al., 1989), cinnamomin ผลิตจาก P. cinnamomi (Billard et al., 1988), capsicien ผลิตจาก P. capsici (Huet and Pernollet, 1989), parasiticein ผลิตจาก P. parasitica (Ricci et al., 1992; Moutom-Perronnet, 1995) Dreβ และ Dreα ผลิตจาก P. drechsleri (Huet et al., 1992), MgMβ และ MgMα ผลิตจาก P. megasperma megasperma (Huet et al., 1993 a.) และ palmivorein ผลิตจาก P. palmivora (Churngchow and Rattarasarn, 2000) และ Devergne และคณะ (1994) ยังพบอีกวาหลังจากบมเชื้อรา P. cryptogea บนยาสูบ(glycoprotein), ไคโตแซน (chitosan) และกรดไขมัน (fatty acid) (Darvill and Albersheim, 1984) สวนชนิดที่สองที่เปนอไบโอติกอิลิซเิตอร เชนแสง, รังสีอุลตราไวโอเล็ตและไอออนจากโลหะหนัก ดังนั้นอิลิซิตินจัดเปนไบโอติกอิลิซิเตอรที่มีโครงสรางเปนโพลีเปปไทด (polypeptide) อิลิซิตินมีชื่อเรียกเฉพาะตามชนิดของเชื้อราเชน cryptogein เปนอิลิซิตินที่ผลิตจาก P. cryptogea (Ricci et al., 1989), cinnamomin ผลิตจาก P. cinnamomi

39

(Billard et al., 1988), capsicien ผลิตจาก P. capsici (Huet and Pernollet, 1989), parasiticein ผลิตจาก P. parasitica (Ricci et al., 1992; Moutom-Perronnet, 1995) Dreβ และ Dreα ผลิตจาก P. drechsleri (Huet et al., 1992), MgMβ และ MgMα ผลิตจาก P. megasperma megasperma (Huet et al., 1993 a.) และ palmivorein ผลิตจาก P. palmivora (Churngchow and Rattarasarn, 2000) และ Devergne และคณะ (1994) ยังพบอีกวาหลังจากบมเชื้อรา P. cryptogea บนยาสูบผานไป 1 และ 2 วัน พบการสราง cryptogein ขึน้บริเวณลํ าตนและใบจากการตรวจวัดดวยวิธี DAS-ELISA อิลิซิตินจากทุกสปชี่สเปนโปรตีนที่ยังไมถูกเติมนํ้ าตาล (non-glycosylated protein) และเปนโปรตีนพิษที่มีขนาดโมเลกุลขนาดเล็กประมาณ 10 kDa โครงสรางปฐมภูมิ (primary structure) ประกอบดวยกรดอะมิโน 98 เรซิดิวส (residue) มีพันธะไดซัลไฟด (disulfide bonds) 3 แหง โครงสรางทุติยภูมิ (secondary structure) เปนเกลียวอัลฟา (α-helix) ประมาณ 50% และเปนแผนพลีทเบตา (β-pleated sheet) นอยมากหรือไมพบเลย (Huet et al., 1992; Nespoulous et al.,1992) ซึ่งอิลิซิตินจากนํ้ าเลี้ยงของเชื้อรากลุม Phytophthora ทุกสปชีสประกอบดวยกรดอะมิโน 98 เรซิดวิสมีนํ้ าหนักโมเลกุลใกลเคียงกันประมาณ 10 kDa แตแตกตางกันที่ลํ าดับกรดอะมโินจึงทํ าใหมีประจุสุทธิแตกตางกัน (Bonnet et al., 1996) เชนที่พบในอิลิซิติน cryptogein, capsicein และ cinnamomin มีการจัดลํ าดับของกรดอะมิโนในโมเลกุลของอิลิซิตินที่มีความอนุรักษ (conserved) และคลายคลึงกันมากกวา 80% โดยเฉพาะสวนกลางของโมเลกุล (central core) สวนที่แตกตางคือการเรียงตัวของกรดอะมิโนบริเวณปลาย NH2 และ ปลาย COOH ของสายเปปไทด (Huet and Pernollet, 1989) เมื่อมีการปลดปลอยอิลิซิตินทีถ่กูสรางขึ้นจากเชื้อราในกลุม Phytophthora พบวาอิลิซิตินอยูในรูป hydrophobic และมีความจํ าเพาะกับสเตอรอล (sterol) ที่อยูบริเวณดานนอกของเยื่อหุมพลาสมาจนเกิดเปนโครงสรางที่ซับซอนระหวางอิลิซิตินและสเตอรอล (elicitin-sterol complex) เกิดเปนปฏิกิริยาไดสองทิศทางคือ ในทิศทางแรกelicitin-sterol complex จับกับตัวรับของพืช (plant receptor) ทีผ่นังดานนอกของเยื่อ

40

หุมพลาสมาและกระตุนใหพืชเกิดการตอบสนองแบบไฮเปอรเซนซิทีฟ (hypersensitive response) และกลไกที่จํ าเปนในการตานทานโรค (systemic acquired resistance, SAR) ขึน้เพือ่ใชปองกันตัวเองของพืชจากการรุกรานของเชื้อกอโรค และในทิศทางที่สองนั้นพบวาอิลิซิตินทีห่ลั่งจากเชื้อราในกลุม Phytophthora จะนํ าพาสเตอรอลจากบริเวณผนังดานนอกของเยื่อหุมพลาสมาของพืชที่ถูกอาศัยไปยังตัวรับของเชื้อราเพื่อใชในการขยายพันธุของเชื้อราตอไป (Blein et al., 2002) (รูปที่ 14) การที่เชื้อราตองนํ าสเตอรอลจากเซลลพืชเพราะเชื้อราในกลุม Phytophthora ไมสามารถสังเคราะหสเตอรอลไดเอง (Hendrix, 1970) 1.6.1 ชนิดของอิลิซิติน

อิลิซิตินสามารถแบงออกได 2 กลุมคือกลุมแอลฟา (α-class) และกลุมเบตา (β-class) โดยอาศัยลํ าดับกรดอะมิโน (amino acid sequence), องคประกอบของ กรดอะมิโน (amino acid composition), จุดไอโซอิเล็กตริค (isoelectric point; pI), ดัชนีไฮโดรพาที (hydropathy index) ซึง่บงชี้ถึงบริเวณที่เปนไฮโดรโฟบิกของโปรตีน โครงสรางทุติยภูมิ (secondary structure) และโครงสรางตติยภูมิ (tertiary structure) ที่สอดคลองกับความวองไวทางชีวภาพ

1.6.1.1 กลุมแอลฟา เปนอิลิซิตินทีมี่สภาพเปนกรด (acidic elicitin) มีคา pI ประมาณ

4.5 (Berre et al., 1994) โดยตํ าแหนงที่ 13 เปนกรดอะมิโนแวลีน (valyl residue) (Donohue et al., 1995) ซึง่ตํ าแหนงที่ 13 นี้สัมพันธกับความวองไวทางชีวภาพของอิลิซิตินมากกวาตํ าแหนงอื่น จากการหาโครงสรางของอิลิซิตนิในสภาพสามมิติโดยอาศัยเทคนิค nuclear magnetic resonance พบวากรดอะมิโนตํ าแหนงที่ 13 เปนตํ าแหนงที่มีบทบาทในการทํ างาน และมีผลตอดัชนีไฮโดรพาทีตอบริเวณที่ทํ างาน (active site) และบริเวณที่ควบคุม (regulatory site) (Huet et al., 1992) ดงันั้นจึงมีผลตอความสามารถในการทํ าปฏิกิริยาระหวางอิลิซิตินและตัวรับ (receptor) บนผิวเซลลเปาหมาย (Donohue et al., 1995) อิลิซิตินในกลุมนี้ไดแก capsicein, parasiticein (Ricci et al., 1992), Dreα (Huet et al., 1992) และ MgMα (Huet et al., 1993 a)

41

รูปที ่14 ความนาจะเปนของการเกิดปฏิกิริยาระหวางพืชกับ oomycete และ พืชกับเชื้อรา โดย เกีย่วของกับ protein - lipid complex และการจดจํ าตัวรับที่จํ าเพาะเจาะจง ปฏิสัมพันธ ระหวางพืชกับเชื้อรา Phytophthora จะมีอิลิซิตินวิง่ไปวิง่มาระหวาง Phytophthora และ เซลลพืช โดยที่ elicitin - sterol complex สามารถจดจํ าทั้ง Phytophthora และเซลลพืช น ําไปสูการตอบสนองทางชีวภาพ (biological responses) (ทีม่า : ดัดแปลงจาก Blein, 2002)

?

Phytophthora sexual andasexual reproduction

Plant responsesHR and SAR

Plasma membrane Protein - lipid complexes Plant receptor Elicitin (inactive state) Sterol Putative oomycete Plant receptor

or fungal receptor (active state)?

42

1.6.1.2 กลุมเบตา เปนอิลิซิตินทีมี่สภาพเปนเบส (basic elicitin) มีคา pI ประมาณ 8.5 (Borre et al., 1994) มีกรดอะมิโนไลซีน (lysyl residue) ที่ตํ าแหนง 13 (Donohue et al., 1995) เชน cryptogein, cinnamomin (Ricci et al., 1992), Dreβ (Huet et al.,1992) และ MgMβ (Huet et al., 1993 a)

ทัง้สองกลุมทํ าใหเกิดรอยไหม (necrosis) บนใบยาสูบไดเหมือนกันแตพบวาเมื่อใชความเขมขนของอิลิซิตินเทากันในการทดสอบใบยาสูบ อิลิซิตินในกลุมเบตา (cryptogein) มีความวองไวในการเกิดรอยไหมมากกวาอิลิซิตินในกลุมแอลฟา (capsicein) ถึง 100 เทา (Zanetti et al., 1992) เชนเดียวกับที่ Nespoulous และคณะ (1992) พบวาอิลิซิตินในกลุมเบตา คือ cryptogein และ cinnamomin ทํ าใหเกิดรอยไหมมากกวาอิลิซิตินในกลุมแอลฟาคือ capsicein และ parasiticein ประมาณ 50-100 เทา และจากการทดลองของ Kamoun และคณะ (1993) ยังยืนยันอีกวาอิลิซิ-ตินในกลุมเบตา (cryptogein) บนใบยาสูบและหัวผักกาด (radish) สามารถทํ าใหเกิด รอยไหมที่ไกลออกไปแบบ distal จากวิธีการดูดอิลิซิตินเขาทางกานมากกวาอิลิซิตินในกลุมแอลฟา (parasiticein) แตการเกิดรอยไหมตรงตํ าแหนงที่สัมผัสอิลิซิตินโดยตรง แบบ local จากวธิีการหยดอิลิซิตินทั้งสองกลุมบนหลังใบมีการเกิดรอยไหมไมแตกตางกัน แสดงใหทราบถึงความวองไวทางชีวภาพที่แตกตางกัน ซึ่งเกิดจากการจัดลํ าดับของกรดอะมิโนภายในโมเลกุลของอิลิซิตินที่แตกตางกัน (Ricci et al., 1989) จากการคนพบของ Donohue และ คณะ (1995) รายงานวาเมื่อทํ าการแทนที่ตํ าแหนงที่ 13 ของ cryptogein จากกรดอะมิโนไลซีนเปนกรดอะมิโนแวลีน ทํ าใหระดับความวองไวทาง ชีวภาพลดลงอยางมีนัยสํ าคัญ เนื่องจากตํ าแหนงที่ 13 ของอิลิซิตินในกลุมแอลฟาเปนกรดอะมิโนแวลีนที่เปนกรดอะมิโนชนิดอะลิฟาติก (aliphatic) แขนงขาง (side chain)จึงไมมีขั้ว (nonpolar) ไมมีการแตกตัวและไมชอบนํ้ า (hydrophobic) แตอิลิซิตินในกลุมเบตาในตํ าแหนงที่ 13 เปนไลซีนทีเ่ปนกรดอะมิโนชนิดเบสกิ แขนงขางจึงมีลักษณะโพลารและแตกตัวได รวมทั้งมีลักษณะที่ชอบนํ้ า (hydrophilic) จากลักษณะดังกลาวท ําใหอิลิซิตินในกลุมเบตามีความเปนพิษมากกวาในกลุมแอลฟา

43

อิลิซิตนิมีคุณสมบัติเปนตัวกระตุน (elicitor) ซึ่งสามารถกระตุนใหเกิดปฏิกิริยาการตอบสนองภายในพืช เชน การเกิดรอยไหม, การสะสมของ PR-proteins การสะสม ไฟโตอเล็กซิน (phytoalexin) และลิกนิน (lignin) เปนตน เมื่อนํ าอิลิซิติน cryptogein มาทํ าการทดสอบกับเซลลแขวนลอยยาสูบพบวา cryptogein สามารถกระตุนใหเกิดการสะสมของเอทิลีน (ethylene) และแคปซิไดออล (capsidiol) ซึ่งเปนไฟโตอเล็กซินชนิดหนึ่งของยาสูบ (Milat et al., 1991) ส ําหรับการทดสอบในใบและตนยาสูบจะเกิดรอยไหมรวมกับการสังเคราะหไฟโตอเล็กซินและการสราง PR-proteins (Huet et al., 1991) นอกจากอิลิซิตินจะสามารถกระตุนใหเกิดปฏิกิริยาตอบสนองในยาสูบแลวยังชักนํ าใหเกิดความตานทานตอ P. parasitica var. nicotiana ดวย สวนในยางพารา Churngchow และ Rattarasarn (2000) พบวาอิลิซิติน (palmivorein) ที่แยกไดจากนํ้ าเลี้ยงของเชื้อรา P. palmivora ทํ าใหใบยางพาราเกิด รอยไหมแบบ distal necrosis คือเกิดอาการเหี่ยวได โดยพบวาในใบยางพาราพันธุออนแอ (RRIM600) จะเกิดอาการเหี่ยวมากกวาใบยางพันธุตานทาน (BPM-24) ซึ่งแสดงวาในใบยางพันธุออนแอไมสามารถตานทานโรคได (compatibility) ในขณะที่ใบยางพันธุตานทานมีการตอบสนองแบบไฮเปอรเซนซิทีฟ (hypersensitive) ที่บงชี้ถึงการตานทานโรค (incompatibility) นอกจากนี้ยังมีการทดสอบอิซิตินดังกลาวกับใบยาสูบดวย ซึ่งพบวามีการแสดงออกแบบ incompatible เนื่องจากยาสูบไมไดเปนพืชอาศัย (non-host) ของเชื้อรา P. palmivora 1.6.2 การเตรียมอิลิซิตินใหบริสุทธิ์จากนํ้ าเล้ียงเชื้อรา โดยอาศัยมาตรฐานทางชีวเคมีนั่นคืออาศัยคุณสมบัติการละลาย, สมบัติทางประจุไฟฟาและขนาดของโมเลกุลของอิลิซิตินในการแยกใหบริสุทธิ์ เร่ิมตนจากนํ านํ้ าเลี้ยงเชื้อรากลุ ม Phytophthora มาตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียซัลเฟต (NH4)2SO4 ทีค่วามเขมขนของเกลือ 90% เพื่อใหไอออนของเกลือที่มากเกินพอแยงจับนํ้ าจากโปรตีน ทํ าใหนํ้ าที่จับอยูกับโปรตีนนอยลง โปรตีนจึงรวมตัวกันและตกตะกอน ซึ่งในตะกอนเหลานั้นจะมีอิลิซิตินรวมอยูดวย จากนั้นนํ าอิลิซิตินที่ไดมาแยกโดยอาศัยเทคนิคโครมาโทกราฟแบบแลกเปลี่ยนไอออน (ion-exchange chromatography) ซึ่ง

44

ภายในคอลัมนบรรจุโพลีเมอรที่มีประจุบวกหรือประจุลบไดแก diethylaminoethyl (DEAE) หรือcarboxymethyl (CM) เปนตน โปรตนีที่ประจุสุทธิตรงกันขามจะจับกับโพลเีมอรภายในคอลัมนไดและถูกชะออกมาเมื่อปรับ pH ใหโปรตีนที่แยกมีประจุสุทธิเปนศนูย หรือเติมเกลือลงในตัวชะ (elute) เพื่อสลายพันธะไอออนิก (ionic bond) ระหวางโปรตีนกับโพลีเมอรภายในคอลัมน ตอจากนั้นนํ าอิลิซิตนิมาแยกโดยเทคนิคเจลฟลเทรชัน (gel filtration) และโพลีอะคลิลาไมดเจลอิเล็กโทรฟอรีซิสแบบเอสดีเอส (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE) โดยอาศัยความแตกตางของขนาดโมเลกุลสํ าหรับวิธี gel filtration เปนคอลัมนโครมาโทกราฟที่มีการบรรจุเจล (gel) ซึ่งเปนอนุภาคที่มีรูเล็กๆ ลักษณะคลายฟองนํ้ าทํ าหนาที่เหมือนตะแกรงแยกสารที่มีขนาดโมเลกุลตางกับโปรตีนที่มีโมเลกุลขนาดใหญจะเขาไปในเนื้อเจลไมไดและถูกชะออกจากหลอดแกวกอนโดยผานไประหวางอนุภาคเจลเทานั้น แตโปรตีนที่มีขนาดโมเลกุลเล็กสามารถเขาไปขางในเนือ้เจลได จงึสามารถแยกโปรตีนที่มีนํ ้าหนักโมเลกุลตางกันได สวนเทคนิคที่ใชอิเล็กโทรฟอรีซีสและ anionic detergent (SDS) ในการแยกโปรตีนขนาดตางๆออกจากกัน โดยการนํ าโปรตีนมาตมกับ SDS detergent ซึง่จะจับกับโปรตีนในลักษณะไมเปนโควาเลนท ทํ าใหโปรตีนมีประจุสุทธิเปนลบ จํ านวนประจุลบจึงเปนสัดสวนกับจํ านวนกรดอะมิโนโปรตีน ในขณะเดียวกันโปรตนีจะเสียสภาพธรรมชาติและเปลี่ยนรูปรางเปนทรงแทง (rod shape) ที่มีความยาวเปนสัดสวนกับจํ านวนกรดอะมิโนเชนกัน ดังนั้นการทํ าอิเล็กโทรฟอรีซีสสามารถใชค ํานวณหานํ้ าหนักโมเลกุลของโปรตีนตัวอยางได โดยเปรียบเทียบกับอัตราการเคลื่อนที่สัมพัทธ (relative mobility) ของโปรตีนกับอัตราการเคลื่อนที่สัมพัทธของโปรตีนมาตรฐาน (Robyt and White, 1987; Huet and Pernollet, 1989; Huet et al., 1992; Huet and Pernollet, 1993; Churngchow and Rattarasarn, 2000)

45

วัตถุประสงค

1. ศกึษาลักษณะและขนาดของรอยไหม (necrosis) ซึ่งเกิดจากการกระตุนใบยางพา - ราดวยซโูอสปอรของเชื้อรา P. palmivora เพื่อจัดลํ าดับความตานทานของยาง พาราพันธุตางๆ2. ศึกษาการสังเคราะหสคอพอลิตินซึ่งเกิดจากการกระตุนใบยางพารา ดวยซูโอสปอร และอลิซิิตินของเชื้อรา P. palmivora เพื่อจัดลํ าดับความตานทานของยางพารา พนัธุตางๆ3. ศึกษาปฏิกิริยาการสรางลกินินที่เกิดจากการกระตุนใบยางพารา ดวยซโูอสปอรและ อิลซิิตินของเชื้อรา P. palmivora4. น ําผลการจัดลํ าดับความตานทานของยางพาราในขอ 1 และ 2 มาใชเปนขอมูลใน การคัดเลือกยางพันธุดีที่มีความตานทานโรคที่เกิดจากเชื้อรา P. palmivora ไดสูง