235

บทท 9

การตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหาร

การตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหาร

การตรวจหาเชอจลนทรยในอาหารมความสาคญและจาเปนอยางมากในอตสาหกรรมอาหาร โดยมวตถประสงคหลก คอ

1. ตรวจสอบผลตภณฑอาหารตามขอกาหนดของกฎหมาย (conformity to regulations) ซงถอวาเปนเหตผลหลกของการตรวจหาจลนทรยในอาหาร

2. วเคราะหหาจลนทรยททาใหเกดโรคอาหารเปนพษ (food poisoning) เพอสรางความปลอดภยในการบรโภคอาหาร

3. ประเมนคณภาพในกระบวนการผลตอาหาร เปนการตรวจหาจลนทรยเพอใชเปนขอมลในการประเมนหรอควบคมกระบวนการผลตอาหารเพอใหไดผลตภณฑอาหารทปลอดภย

การตรวจวเคราะหปรมาณจลนทรยในอาหารนน สามารถทาไดกบวตถดบในการแปรรปอาหาร ตวอยางอาหารจากสายการผลต และในผลตภณฑสดทาย เชน การตรวจหาเชอจลนทรยทงหมดทมอยในอาหาร การเหลอรอดของจลนทรย ปรมาณของจลนทรยดชน ปรมาณของจลนทรยกอโรค เปนตน การตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหารม 2 ลกษณะ (บษกร อตรภชาต, 2545, หนา 360 – 361) คอ

1. การตรวจจาแนกชนดของจลนทรยกอโรคทอาจปนเปอนมากบนาและอาหาร เชน Staphylococcus aureus Salmonella Shigella และ Vibrio parahaemolyticus

2. การตรวจวเคราะหหาจลนทรยดชนและจลนทรยอนใดทชวยบงชคณภาพของอาหาร สามารถวเคราะหถงสาเหตของการปนเปอนและการวางแผนปองกน เชน การตรวจวเคราะหจานวนจลนทรยทงหมด (standard plate count หรอ total viable count) การตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหารในหองปฏบตการตองอาศยผเชยวชาญเฉพาะดาน และมหลายปจจยททาใหผลการตรวจวเคราะหมความถกตองแมนยา และใชเปนตวแทนผลการตรวจสอบทงรนการผลตได เชน แผนการสมตวอยาง การนาสงตวอยาง การเตรยมตวอยาง และวธการตรวจวเคราะห เปนตน

236

แผนการสมตวอยาง (sampling plans)

ธรพร กงบงเกด (2546, หนา 192 - 195) และบษกร อตรภชาต (2545, หนา 365 – 367) กลาวถงแผนการสมตวอยางตามมาตรฐานของ International Commission on the Microbiological Specifications for Foods (ICMSF) แบงไวดงน

1. Two-class plan

เปนแผนการสมตวอยางทใชประเมนผลคณภาพผลตภณฑเปน 2 ระดบ คอ ยอมรบ (accept) หรอปฏเสธ (reject) โดยพจารณาจากการปรากฏหรอไมปรากฏของจลนทรยในกรณทใชการตรวจสอบแบบพบหรอไมพบเชอ (positive/negative test) หรอพจารณาจากปรมาณจลนทรยทมในตวอยางอาหารในกรณทใชการตรวจสอบแบบนบจานวน (count test) แผนการสมตวอยางอาหารมดงน n หมายถง จานวนตวอยางทใชทดสอบ

m หมายถง ปรมาณจลนทรยสงสดทยอมรบใหมไดในตวอยางอาหาร กรณท เกณฑการยอมรบเปนแบบตรวจพบเชอ หรอ ไมพบเชอ คา m = 0

c หมายถง จานวนสงสดของตวอยางอาหารทยอมใหมปรมาณจลนทรยสงกวา คา m

ตวอยางท 1 ในเนอปสกแชเยอกแขง มาตรฐานไดกาหนดปรมาณของเชอ Staphylococcus aureus ไวดงน n = 5 c = 0 และ m = 103/กรม จากการสมตวอยางเนอปสกแชเยอกแขง จานวน 5 ตวอยาง เพอตรวจหาเชอ S. aureus ดวยวธนบจานวนไดผลการทดลองดงน

กรณท 1 ตวอยางเนอปสกแชเยอกแขงทง 5 ตวอยางไดผลการวเคราะหปรมาณของ S. aureus

เปน 103/กรม จะถอวาการผลตเนอปสกแชเยอกแขงครงนผานเกณฑคณภาพหรอยอมรบ เนองจากทกตวอยางมปรมาณเชอตากวาเกณฑมาตรฐานทกาหนดคาปรมาณจลนทรยสงสดทยอมรบได (m) ไวท 103 /กรม

กรณท 2 ตวอยางเนอปสกแชเยอกแขง 1 ตวอยาง ใหผลการตรวจสอบปรมาณของ S. aureus เปน > 103/กรม จะถอวาการผลตเนอปสกแชเยอกแขงครงนไมผานเกณฑคณภาพหรอปฏเสธ

237

เนองจากมจานวนตวอยางทพบเชอสงกวาคาสงสดทยอมรบไดจานวน 1 ตวอยางซงสงกวาทมาตรฐานกาหนดไวคอ c = 0 ซงหมายถงตองไมมตวอยางทพบเชอสงกวาคา m (103 / กรม)

ตวอยางท 2 ในเนอปสกแชเยอกแขง มาตรฐานไดกาหนดปรมาณของเชอ Salmonella ไวดงน n = 10 c = 0 และ m = 0 จากการสมตวอยางเนอปสกแชเยอกแขง จานวน 10 ตวอยาง เพอตรวจหาเชอ Salmonella ดวยวธ positive/negative test กรณทผลการตรวจสอบพบเชอในตวอยางอาหารแมเพยงตวอยางเดยวใน 10 ตวอยางจะถอวาไมผานหรอไมยอมรบ เนองจากมาตรฐานกาหนดตองตรวจไมพบเชอ Salmonella (m = 0) และไมยอมใหมตวอยางอาหารตรวจพบเชอได (c = 0) แผนการสมตวอยางแบบ two-class plan มกใชกบจลนทรยกอโรคสาคญในอาหาร ซงสามารถแบงเปนกลมตามความอนตรายของเชอได 3 กลม ดงตารางท 9.1

238

ตารางท 9.1 ชนดของจลนทรยกอโรคแบงตามระดบความรนแรงในการกอโรค

ระดบความรนแรง ชนดของจลนทรย 1. อนตราย Clostridium botulinum Salmonella typhi Salmonella paratyphi Shigella dysenteriae Brucella melitensis Clostridium perfringens type C Mycobacterium tuberculosis (bovis) Vibrio cholera ไวรสตบอกเสบชนดเอ 2. อนตรายปานกลางและมกระบาดในวงกวาง Salmonella typhimurium Salmonella ซโรไทปอนๆ Shigella sonne และ flexnerii Vibrio parahaemolyticus Escherichia coli (enteropathogenic) Beta hemolytic streptococcus 3. อนตรายปานกลางและระบาดในวงจากด Bacillus cereus Clostridium perfringens Brucella abortus Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Campyrobacter jejuni ทมา: (ธรพร กงบงเกด, 2546, หนา 194)

239

2. Three-class plan

เปนแผนการสมตวอยางทใชประเมนผลคณภาพผลตภณฑเปน 3 ระดบ ขนอยกบปรมาณจลนทรยทปรากฏในตวอยางอาหาร แผนการสมตวอยางแบบนมกใชกบจลนทรยททาใหอาหารเสอมเสย จลนทรยดชนกลมแบคทเรยโคลฟอรม และ E. coli รวมทงจลนทรยกอโรคทมอนตรายปานกลางและระบาดในวงจากดหรอไมระบาด แผนการสมตวอยางอาหารมดงน n หมายถง จานวนตวอยางทใชทดสอบ c หมายถง จานวนสงสดของตวอยางอาหารทยอมใหมปรมาณจลนทรยอย ระหวางคา m และ M m หมายถง ปรมาณจลนทรยสงสดทยอมรบใหมไดในตวอยางอาหาร M หมายถง ปรมาณจลนทรยทสงกวาคาทกาหนด เปนปรมาณทไมยอมรบ

ตวอยาง มาตรฐานกาหนดปรมาณของเชอ aerobic plate count ในกงสกชบแปงทอดดงน n = 5 c = 2 m = 5 X 105 /กรม และ M = 107 /กรม จากการสมตวอยางกงสกชบแปงทอด จานวน 5 ตวอยาง เพอตรวจหาเชอ aerobic plate count ไดผลการทดสอบและการแปลผลแสดงในตารางท 9.2

240

ตารางท 9.2 การประเมนผลการสมตวอยางแบบ Three-class plan

รนการผลต

ตวอยาง aerobic plate count (CFU/g)

การประเมนผล

1 1 4.0 X 104 ตวอยางกงสกชบแปงทอดทง 5 ตวอยางมปรมาณ เชอ aerobic plate count ตากวาคา m คอ 5.0 X 105) ดงนนการผลตในครงนไดรบการยอมรบหรอผานเกณฑมาตรฐาน

2 3.2 X 104 3 4.2 X 104 4 9.6 X 104 5 4.9 X 104 2 1 6.5 X 106 มตวอยางกงสกชบแปงทอด 2 ตวอยางตรวจ

พบ aerobic plate count สงกวาคา m แตยงไมถงคา M และยงอยในเกณฑของคา c ทยอมใหมตวอยางทมปรมาณเชอสงกวาคา m อย 2 ตวอยาง ดงนนการผลตในครงนไดรบการยอมรบหรอผานเกณฑมาตรฐาน

2 4.2 X 104 3 3.4 X 104 4 7.2 X 104 5 5.5 X 105

3 1 4.0 X 104 มตวอยางกงสกชบแปงทอด 1 ตวอยางตรวจพบ aerobic plate count สงกวาคา M ดงนนการผลตในครงนไมไดรบยอมรบ หรอไมผานเกณฑมาตรฐาน

2 3.2 X 104 3 2.0 X 107 4 9.6 X 104 5 4.9 X 104

ทมา: (ธรพร กงบงเกด, 2546, หนา 195) อาหารเลยงเชอจลนทรย (culture media)

อาหารเลยงเชอ หมายถง สารทใชเปนแหลงอาหารสาหรบการเจรญและทวจานวนของจลนทรย ใชสาหรบเพาะเลยงเชอจลนทรยในหองปฏบตการ มทงในรปแบบอาหารเหลว (broth) และอาหารแขงหรออาหารวน (agar) หรอกงแขง (semi-solid) ซงเปนอาหารเลยงเชอทมผงวนเปนสวนประกอบ โดยปกตจะใชผงวนในอตรา 1.5 เปอรเซนต เพอทาใหอาหารเลยงเชอแขงตว หรอใชในปรมาณนอยกวานเมอตองการอาหารเลยงเชอแบบกงแขง ผงวนทใชเตมลงในอาหารเลยงเชอชวยใหอาหารเลยงเชอแขงตวโดยมขอดดงน

241

1. ไมมผลในการยบยงการเจรญของเชอจลนทรย เนองจากไมทาใหคา water activity ลดตาลง

2. สารละลายเชอสามารถแผกระจายบนผวหนาของอาหารวนทแขงพอเหมาะได และทาใหไดโคโลนของเชอบรสทธ

3. วนสามารถเกดเจลแขงไดทอณหภม 32 - 39 องศาเซลเซยส และหลงจากทแขงตวแลวจะไมละลายถาอณหภมไมสงเกนกวา 85 องศาเซลเซยส ทาใหอาหารเลยงเชอยงคงสภาพของแขงตลอดระยะเวลาการบมเพาะเชอในตบม

4. การเพาะเชอในอาหารวนทมอณหภม 40 – 45 องศาเซลเซยส ไมมผลกระทบตอเชอจลนทรยโดยสวนใหญ

อาหารเลยงเชอทดควรมสารอาหารและความเขมขนเหมาะสมกบชนดของจลนทรย ม คาพเอชทเหมาะสมกบจลนทรยทเพาะเลยง โดยทวไปมกมคาประมาณ 6.5 - 7.5 มความชนพอเหมาะและปราศจากสารมพษและจลนทรยอน (ธรพร กงบงเกด, 2546, หนา 56; บญญต, 2522, หนา 166)

ชนดของอาหารเลยงเชอแบงตามสวนประกอบของอาหาร

1. Synthetic media เปนอาหารเลยงเชอททราบสวนประกอบทางเคมแนนอน นยมใชในหองปฏบตการทางจลชววทยา เพอศกษาการใชสารเคมตางๆ ททราบปรมาณอยแลว เพอเปรยบเทยบการเจรญ เชน อาหารเลยงเชอ Minimal agar มสวนประกอบและประโยชนตอการเจรญของจลนทรยดงแสดงในตารางท 9.3 (บญญต, 2522, หนา 166 - 167) ตารางท 9.3 สวนประกอบและประโยชนของอาหารเลยงเชอ Minimal agar

สวนประกอบ จานวน ประโยชน กลโคส 2.0 กรม แหลงของคารบอนและพลงงาน (NH4)2SO4 1.0 กรม แหลงของไนโตรเจน K2HPO4 7.0 กรม แหลงของฟอสฟอรส MgSO4 0.5 กรม แหลงของกามะถน ผงวน 15.0 กรม ชวยอาหารเลยงเชอแขงตว นากลน 1000 มลลลตร ตวทาละลาย ทมา: (บญญต, 2522, หนา 167)

242

2. Non-synthetic media เปนอาหารเลยงเชอทไมทราบสวนประกอบและปรมาณทางเคมทแนนอน เปนอาหารเลยงเชอทประกอบดวยเนอเยอพชและสตว จงมสวนประกอบเปนสารอนทรยอยมากมายหลายชนด เชน อาหารเลยงเชอ Nutrient broth มสวนประกอบและประโยชนตอการเจรญของจลนทรยดงแสดงในตารางท 9.4 (บญญต, 2522, หนา 167 - 168) ตารางท 9.4 สวนประกอบและประโยชนของอาหารเลยงเชอ Nutrient broth

สวนประกอบ จานวน ประโยชน สารสกดจากเนอ (beef extract) 3.0 กรม แหลงวตามนและเกลอแร เปปโตน (peptone) 5.0 กรม แหลงของไนโตรเจน นากลน 1000 มลลลตร ตวทาละลาย ทมา: (บญญต, 2522, หนา 168) ชนดของอาหารเลยงเชอจาแนกตามวตถประสงคของการใชงานหรอประโยชนทใช (ธรพร กงบงเกด, 2546, หนา 58 – 61)

1. General purpose media หรอ non-selective media มปรมาณสารอาหารทพอเพยงสาหรบการเจรญของแบคทเรย ยสต และรา มกมองคประกอบทซบซอน เตรยมจากวตถดบธรรมชาต เชน สารสกดจากเนอสตว (beef extract) ยสต (yeast extract) ผกสกด และสารทไดจากการยอยสลายโปรตน นยมใชอาหารเลยงเชอนในการเกบรกษาจลนทรยและวเคราะหหาปรมาณจลนทรยทงหมด เชน อาหารเลยงเชอ Nutrient agar Plate count agar Potato dextrose agar และ Malt extract agar

2. Selective media เปนอาหารเลยงเชอทมองคประกอบทสามารถยบยงการเจรญของเชอจลนทรยบางชนดและยอมใหจลนทรยทตองการเจรญได ทาไดโดยการเตมสารเคมบางชนดลงในอาหารเลยงเชอเพอใชคดเลอกจลนทรยเฉพาะชนด เชน

2.1 การปรบคาพเอชของอาหารเลยงเชอ เชน การเตมกรดทารทารกลงในอาหารเลยงเชอ เพอยบยงการเจรญของแบคทเรยและคดเลอกใหเฉพาะเชอราเจรญ

2.2 การปรบคา water activity โดยการเตมเกลอหรอนาตาลลงในอาหารเลยงเชอเพอคดเลอกจลนทรยกลมฮาโลไฟลหรอออสโมไฟล

2.3 การจากดปรมาณของสารอาหาร เชน ใชเพยงไนเตรทเปนแหลงของไนโตรเจน ในการคดเลอกจลนทรยทสามารถรดวสไนเตรทไปเปนแอมโมเนยได

243

2.4 การเตมสารรดวซ เชน เมตาไบซลไฟต ในการคดเลอกจลนทรยทไมตองการออกซเจน

2.5 การเตมสารยบยงกระบวนการเมตาบอลซมหรอทาลายเซลลเมมเบรน เชน โซเดยมเอไซด ทลลสอะซเตต ลเธยมคลอไรด และโปแตสเซยมทลลไรต ทใชยบยงการเจรญของแบคทเรยแกรมลบ และครสตลไวโอเลตไบลซอลต (crystal violet bile salts) และสารลดแรงตงผวบางชนดทใชยบยงการเจรญของแบคทเรยแกรมบวก

2.6 การเ ตมสารปฏช วนะและสารเคมบางชน ด เช น ออกซ เตตราไซคลน (oxytetracycline) ยบยงการเจรญของแบคทเรยในอาหารเลยงเชอคดเลอกเชอรา และโพลมยซน (polymycin) ในอาหารเลยงเชอคดเลอกเชอแบคทเรยแกรมบวก รปรางแทง การเตมสารสอโอซนในอาหารเลยงเชอ Eosin methylene blue (EMB) agar ยบยงการเจรญของแบคทเรยแกรมบวกและคดเลอกแบคทเรยแกรมลบ

3. Enrichment media หรอ selective enrichment media เปนอาหารเลยงเชอชนดเหลว ประกอบดวยสารเคมทชวยสงเสรมการเจรญและทวจานวนของจลนทรย และมสารเคมทชวยกระตนการเจรญของจลนทรยทตองการและยบยงการเจรญของจลนทรยทไมตองการ ใชแยกจลนทรยชนดใดชนดหนงทเจรญปะปนอยกบจลนทรยอนๆ เชน การตรวจหาเชอ Salmonella ในอาหาร ใชอาหารเลยงเชอ Lactose broth และ Trypticase soy broth เปน enrichment broth และใชอาหารเลยงเชอ Selenite cystine broth เปน selective enrichment media เนองจากมองคประกอบของโซเดยมซลไนตซงมสมบตในการยบยงการเจรญของแบคทเรยลาไสอนๆ แตกระตนให Salmonella เจรญไดด

4. Differential media เปนอาหารเลยงเชอทใชแยกจลนทรยทเจรญโดยอาศยความแตกตางของจลนทรยแตละชนดขณะเจรญในอาหารเลยงเชอ ประกอบดวยสารเคมทใชเปนดชน จะเกดการเปลยนแปลงเนองจากเมตาบอลซมของจลนทรย ซงการเปลยนแปลงนสามารถมองเหนชดเจนในจานเพาะเชอ ในหลอดอาหาร หรอในอาหารเหลวทจลนทรยเจรญ ทาใหสามารถแยกความแตกตางระหวางชนดหรอกลมของจลนทรยแตละชนดได สารเคมทเตมในอาหารเลยงเชอเพอทาใหเกดความแตกตางของจลนทรยทเจรญมหลายประเภท ไดแก

4.1 สารตงตน (substrates) ทใชทดสอบความสามารถในการสรางเอนไซมของแบคทเรย เชน เลซตเนส โปรตเนส ฮโมไลซน และดเอนเนส

4.2 นาตาลชนดตางๆ และเตมอนดเคเตอรเพอบงชใหเหนถงการเปลยนแปลงคา พเอช เชน บรอโมครซอลเพอรเพล ฟนอลเรด และเมทลเรด

244

4.3 กรดอะมโน และเตมอนดเคเตอรเพอบงชใหเหนถงความเปนดางทเกดจากการยอยสลายกรดอะมโน

4.4 สารเคมทถกรดวซจากกระบวนการเมตาบอลซมของจลนทรย เชน โปแทสเซยมเทลลไรตถกรดวซไปเปนสารเทลลเรยมซงมสดา หรอปฏกรยารดวซสารไตรเฟนลเตตระโซเลยมคลอไรด (triphenyl tetrazolium chloride; TTC) ไปเปนสารฟอรมาซาน (formazan) ซงมสแดง

4.5 การเตมเกลอของเหลก เพอตรวจไฮโดรเจนซลไฟดทสรางจากจลนทรย ทาใหไดสารสดาของไอรอนซลไฟด

การเปลยนแปลงของอาหารเลยงเชอทเกดจากกจกรรมของจลนทรยและสงเกตเหนดวยสายตามหลายลกษณะ เชน การเปลยนแปลงความขนของอาหารเลยงเชอ และการเปลยนแปลงสของอาหารเลยงเชอเนองจากมคาพเอชเปลยนไป เชน อาหารเลยงเชอ Brilliant-green phenol-red lactose sucrose (BPLS) agar ใชแยกแบคทเรยทไมสามารถเฟอรเมนตนาตาลแลกโตส เชน Salmonella ออกจากแบคทเรยกลมทสามารถเฟอรเมนตนาตาลแลกโตส เชน E. coli อาหารเลยงเชอชนดนมสวนประกอบเปนนาตาลแลกโตสและซโครส มส brilliant green ชวยยบยงการเจรญของแบคทเรยในลาไสชนดอน และมสฟนอลเรดเปน อนดเคเตอร โดยแบคทเรยทเฟอรเมนตนาตาลแลกโตสไดจะทาใหอาหารเลยงเชอมคาพเอชลดลงจงทาใหโคโลนมสเหลอง-เขยวและมสเหลอง-เขยวรอบโคโลน ขณะทโคโลนของแบคทเรยทไมสามารถเฟอรเมนตนาตาลแลกโตสจะมสขาวขน-ชมพและรอบโคโลนมสแดงสกใส (นนทนา อรณฤกษ, 2537, หนา 80 - 81) (ภาพท 9.1)

(ก) อาหาร BP

ภาพท 9.1 (Salmonellaเชอ Brilliantทมา: (Depa

การแลวทาใหโคโdesoxycholเกลอของเหลทาใหโคโลนมเฟอรเมนตนาเปนอนดเคเตแบคทเรยหม(Departmen

PLS กอนการเพ

ลกษณะโคโลa) และแบคท-green Phen

artment of Ve

รใชสารเคมทโลนหรออาหาat (XLD) agลกเปนองคปรมสดา (ภาพาตาลแลกโตสตอร แบคทเ มกนาตาลแลกnt of Veterina

พาะเชอ (ข) โค

ลนทแตกตางกทเรยกลมทสาnol-red Lacteterinary Dis

ททาปฏกรยาารเลยงเชอมgar เปนอาหะกอบและจะพท 9.2ง) นสออกจากกลมเรยทหมกนาตกโตสไมได ary Disease

245

คโลนสขาวขนข

กนระหวางแบามารถเฟอรเมtose Sucrosesease Biolog

กบสารทเกดสเปลยนแปลหารเลยงเชอททาปฏกรยากนอกจากนในอมทสามารถเฟตาลแลกโตสไเชน Shigel

e Biology, 20

5

ของ Salmonell

บคทเรยทไมสมนตนาตาลแe agar gy, 2011)

ดจากกระบวลงไป เชน ทใชคดแยกเชกบไฮโดรเจนซอาหาร XLDฟอรเมนตนาตได เชน E.lla และ S011) (ภาพท

la (ค) โคโล

สามารถเฟอรแลกโตส (E.

นการเมตาบอาหารเลยง

อ Shigella ซลไฟดทเชอ SD ยงใชแยกแตาลไดดวยกา. coli จะม

Salmonella 9.2)

ลนสเหลองของ

รเมนตนาตาลcoli) บนอา

บอลซมของจงเชอ Xylo และ SalmSalmonella แบคทเรยทไมารเตมสารสฟมโคโลนสเหลจะมโคโลนส

E. coli

ลแลกโตส หารเลยง

จลนทรยse-lysin-onella ม สรางขนมสามารถฟนอลเรดองขณะทสชมพแดง

(a)

(c)

ภาพท 9(Salmonอาหารเลทมา: (D

จลนทรยใกลเคยงและเกลอEnterobspp. เจรเชน E. c

แนนอน

(ก) อาห

(ค) โคโล

.2 ลกษณะnella และ Shลยงเชอ Xylos

Department o

5. Selectiveยเฉพาะชนดงของสายพนธอนาด (bile

bacteriaceaeรญได ซงจะมcoli ขณะพว

6. Chemica อาจถกจดเป

หาร XLD-agar

ลนสแดงของเช

โคโลนทแตกhigella) และแse-lysin-desof Veterinary

e/differentialด และทาใหธ เชน อาหาsalts) ยบยง

e คอแบคทเรมสของโคโลนกทหมกนาตา

ally defined ปน general

กอนการเพาะ

ชอ Shigella

ตางกนระหวแบคทเรยกลมsoxycholate y Disease B

l media หเกดความแรเลยงเชอ Maงการเจรญขอรยสกล E. cนแตกตางกน าลแลกโตสไม

media เปนpurpose ห

246

เชอ (ข) โ

(ง) โค

างแบคทเรยทมทสามารถเฟ agar iology, 2011

เปนอาหารเลตกตางกนขอacConkey agองแบคทเรยแcoli Enter โดยพวกทหมได เชน Salm

นอาหารเลยงหรอ selective

คโลนสเหลองข

คโลนสดาของเ

ทไมสามารถเฟอรเมนตนา

1)

ลยงเชอทใชอองจลนทรยกgar มสวนปรแกรมบวก แrobacter Saหมกนาตาลแลmonella โคโ

งเชอททราบปe หรอ diffe

ของเชอ E. coli

เชอ Salmonell

เฟอรเมนตนาตาลแลกโตส

อยางแพรหลากลมเดยวกนระกอบของนาและยอมใหจลalmonella ลกโตสไดจะมโลนไมมส

ปรมาณของอrential med

la

าตาลแลกโตสส (E. coli) บน

ายในการแยกนหรอมความาตาลแลกโตสลนทรยในวงศและ Proteusมโคโลนสแดง

งคประกอบทdia กได เชน

ส น

กมสศ s ง

ทน

247

อาหารเลยงเชอ minerals modified glutamate ทใชในการตรวจวเคราะหหาปรมาณแบคทเรย โคลฟอรมในนา

7. Elective media เปนอาหารเลยงเชอทเตรยมขนเพอใชแยกจลนทรยเฉพาะชนดทตองการสารอาหารพเศษ มการเตมสารเคมบางชนดลงไปในอาหารเลยงเชอเพอใหจลนทรยทตองการคดแยกเจรญไดดยงขนโดยไมมผลยบยงการเจรญของจลนทรยอนๆ ซงแตกตางจาก selective medium ทสารเคมนจะมผลในการยบยงการเจรญของจลนทรยอนดวย เชน อาหารเลยงเชอ Tomato juice agar มนามะเขอเทศเปนสวนประกอบเพอใชเลยงแบคทเรย lactobacilli ในนามะเขอเทศมแมกนเซยมและแมงกานสซงจะชวยกระตนการเจรญของแบคทเรย lactobacilli ไดเปนอยางดและไมมผลยบยงการของจลนทรยอน

8. Living media หมายถงอาหารเลยงเชอทสวนประกอบของเซลลทมชวต เชน ตวออน (embryo) หรอเนอเยอบางชนด ใชในการเพาะเลยงไวรสเนองจากไวรสมคณสมบตเปน obligate parasite คอสามารถเจรญไดในโฮสตเทานน

การเตรยมอาหารเลยงเชอโดยทวไปจะเรมจากการชงสวนผสมตามอตราสวนทกาหนด นามาละลายในนากลน หรออาจตมเดอดเพอใหผงวนละลาย ทาการปรบคาพเอช ปรบปรมาตรสดทายใหไดตามทตองการ และแบงบรรจในภาชนะ เชน ขวดแกว หลอดแกว ขวดฟลาสค นาไปฆาเชอในหมอนงภายใตความดน อณหภม 121 องศาเซลเซยส หรอความดน 15 ปอนด นาน 15 นาท สาหรบอาหารเลยงเชอทมคาพเอชเปนกลาง และฆาเชอทอณหภม 115 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท สาหรบอาหารเลยงเชอทมคาพเอชตาหรอเปนกรด อาหารเลยงเชอบางชนดอาจฆาเชอดวยวธการตมพอเดอดเทานนเพอปองกนการสลายของสารเคมทเปนสวนประกอบของอาหาร และอาจใชวธการกรองผานเมมเบรนเพอกาจดเชอในอาหารเลยงเชอทมองคประกอบทสลายตวไดงายดวยความรอน สาหรบอาหารเลยงเชอทมการเตมสารปฏชวนะมกเตมสารปฏชวนะหลงจากการฆาเชอและปลอยใหอาหารเลยงเชอเยนลงแลว

การสมเกบตวอยางอาหารเพอการตรวจวเคราะหจลนทรย

1. จดเตรยมอปกรณและเครองมอในการสมตวอยางทเหมาะสมกบประเภทตวอยางอาหาร ภาชนะและเครองมอทตองสมผสกบอาหารตองผานการฆาเชออยางเหมาะสมขนกบอปกรณทใช เชน ใชหมอนงความดนไออณหภม 121 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท ในการฆาเชออาหารเลยงเชอ สารละลายเจอจาง และภาชนะพลาสตกทนรอน ใชตอบลมรอนทอณหภม 180

248

องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง ในการฆาเชอเครองแกว เชน จานเพาะเชอและปเปต และการใชกาซเอทธลนออกไซดในการฆาเชอภาชนะพลาสตกทไมทนรอน

2. การเกบตวอยางอาหารตองเปนไปแบบสมและใชเทคนคปลอดเชอ เพอปองกนการปนเปอนของจลนทรยจากแหลงอน

3. การนาสงและการเกบรกษาตวอยางอาหารตองเหมาะสมกบประเภทของตวอยางอาหาร เพอปองกนการเปลยนแปลงทางจลชววทยาระหวางการขนสงหรอการเกบรกษา ควรมการนาสงตวอยางอาหารไปยงหองปฏบตการโดยรวดเรวทสดเทาทจะทาได และทาการตรวจวเคราะหใหเรวทสดเทาททาได (บษกร อตรภชาต, 2545, หนา 362 – 363) การเตรยมตวอยางอาหารเพอการตรวจวเคราะห

1. ปรมาณตวอยางอาหารทใชวเคราะห ตวอยางควรเปนเนอเดยวกนกอนการสม ปรมาณตวอยางทใชในการวเคราะหแตละครง โดยปกตแลวไมควรใชตากวา 10 กรม นยมใชตวอยางอาหาร 25 - 50 กรม (APHA, 1976, p.80)

2. สารละลายสาหรบเจอจาง (diluent) สารละลายสาหรบเจอจางมอยหลายชนดดวยกนขนอยกบชนดของอาหาร วตถประสงค และชนดของจลนทรยททาการตรวจวเคราะห ดงตารางท 9.5 ตารางท 9.5 สารละลายสาหรบเจอจางอาหาร

วตถประสงคการใช นายาสาหรบเจอจาง 1. ตรวจวเคราะหทวไป - บฟเฟอรฟอสเฟต - สารละลายโซเดยมคลอไรด เขมขน 0.85 เปอรเซนต - สารละลายเปปโตน เขมขน 0.1 เปอรเซนต - Quarter-strength Ringer’s solution - สารละลายเปปโตนเขมขน 0.1 เปอรเซนต ผสมโซเดยมคลอไรด

เขมขน 0.85 เปอรเซนต 2. อาหารทมไขมนสง สารละลายเปปโตน เขมขน 0.1 เปอรเซนต ผสมวน 0.15เปอรเซนต 3. ตรวจวเคราะห osmophile สารละลายนาตาลซโครส 20 เปอรเซนต 4. ตรวจวเคราะห halophile สารละลายเกลอ 15 เปอรเซนต ทมา: (Harrigan, 1998, p.156 – 157)

249

3. การเตรยมตวอยางอาหาร กรณทอาหารทเปนชนเลก ใหนามาชงรวมกนใหได 50 กรม ในภาชนะทปลอดเชอ สาหรบอาหารทเปนชนขนาดใหญควรใชกรรไกรปลอดเชอควรตดอาหารจากบรเวณตางๆ ของกอนอาหารแลวนามาชงรวมกนใหได 50 กรม และอาหารแชแขงกอนชงตวอยางอาหารตองละลายนาแขงกอน โดยการเกบอาหารแชแขงในชองแชเยนอณหภม 0 - 4 องศาเซลเซยส เปนเวลาไมเกน 18 ชวโมง แลวตดเปนชนเลกๆ นาไปชงใหไดนาหนก 50 กรม(Harrigan, 1998, p.158)

4. การทาเจอจางอาหาร การเจอจางขนตนนยมทาใหอาหารเจอจาง 1:10 เทา เรยกวา dilution 1:10 สามารถทาได (Harrigan, 1998, p.158 - 159) ดงน

4.1 อาหารทเปนของเหลว ใหเขยาอาหารแรงๆ อยางนอย 25 ครง ใชปเปตดดตวอยางอาหาร 10 มลลลตร ใสในขวดทมนายาสาหรบเจอจางอย 90 มลลลตร โดยเปาตวอยางอาหารในปเปตลงในนายาสาหรบเจอจางใหหมดแลวดดนายาสาหรบเจอจางกลบขนมาใหม ทาเชนน 2-3 ครง เพอลางตวอยางอาหารทตดอยขางปเปต เขยาขนลงอยางแรง 25 ครง

4.2 อาหารทเปนของแขง ชงตวอยางอาหาร 50 กรม ใสในเครองปน หรอถงตปน เทสารละลายสาหรบเจอจาง 450 มลลลตร ลงในเครองปนหรอถงตปน ปน หรอนาเขาเครอง stomacher ตปนอาหารนาน 2 นาท เพอใหจลนทรยหลดออกจากชนอาหารมาอยในสารละลาย

4.3 อาหารทมลกษณะเปนผง เชน แปง ซปผง หรออาหารทยยเละงาย ใหชง ตวอยางอาหาร 50 กรม ใสในถงตปน เตมสารละลายสาหรบเจอจาง 450 มลลลตร ใชมอบบถงเพอขยใหตวอยางอาหารแตกละเอยดเปนเนอเดยวกน

การทาเจอจางลงตามลาดบ (serial dilution) โดยทวไปนยมทาใหเจอจางลดลงลาดบละ 10 เทา โดยใชปเปตดดตวอยางเจอจาง 1:10 ทเตรยมไดในขนตน 1 มลลลตร ใสในหลอดทบรรจสารละลายสาหรบเจอจาง 9 มลลลตร หรอใชตวอยาง10 มลลลตร ใสในขวดบรรจสารละลายสาหรบเจอจาง 90 มลลลตร เปาตวอยางออกใหหมด ใชปเปตอนใหมดดตวอยางขน-ลง เพอใหเขากนด หรอใชวธเขยาหลอดแทน ตวอยางอาหารทไดในขนนมความเจอจางเปน 1:100 (10-2) เตรยมตวอยางเจอจาง 1:1000 (10-3) 1:10000 (10-4) และอนๆ ตามลาดบโดยวธเดยวกน ควรเปลยนปเปตใหมทกๆ ระดบความเจอจางทเตรยม หลงการเตรยมเจอจางตวอยางอาหารควรทาการเพาะเชอในอาหารเลยงเชอภายในเวลา 15 – 30 นาท (Harrigan, 1998, p.157 -158)

250

วธการตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหาร

1. วธการดงเดม (traditional methods หรอ conventional method)

1.1 วธเพลตเคานต (plate count method) หรอวธสแตนดารดเพลตเคานต (standard plate count method) เปนเทคนคทใชในการวเคราะหปรมาณของแบคทเรยในอาหาร โดยเซลลแบคทเรยทมชวตในอาหารจะสามารถเจรญเพมจานวนบนผวหนาอาหารลยงเชอชนดทเหมาะสมเกดเปนกลมของเซลลหรอโคโลน (colony) ทสามารถมองเหนดวยสายตาและนบจานวนได วธการตรวจวเคราะหเรมตนจากการบดผสมตวอยางอาหารกบสารละลายสาหรบเจอจางใหไดระดบทเหมาะสม จากนนถายสารละลายเจอจางของตวอยางอาหารลงในอาหารเลยงเชอ บมจานเพาะเชอและนบจานวนโคโลนทเกดขนในจานเพาะเชอ โดยอาศยหลกทวาแตละโคโลนทเกดขนไดมาจากการเจรญของแบคทเรยเพยง 1 เซลล คานวณปรมาณของโคโลนทนบไดใหอยในหนวย colony forming units (CFU) (ธรพร กงบงเกด, 2546, หนา 175 – 181) วธนมขอดคอเปนการตรวจนบจานวนแบคทเรยทถกตองเพราะนบเฉพาะเซลลทมชวตเทานน นอกจากนยงทาไดงายและรวดเรว (2 วน) สวนขอเสยกคอแตละโคโลนทเกดขนบางครงอาจไมไดเกดจากเซลลเพยง 1 เซลล จงทาใหจานวนแบคทเรยทนบไดนอยกวาความเปนจรง นอกจากนแบคทเรยบางชนดอาจไมเจรญในอาหารเลยงเชอทใชเพาะเลยง เทคนคการตรวจนบแบคทเรยดวยวธเพลตเคานตทาไดหลายลกษณะ คอ

1.1.1 เทคนคพอรเพลต (pour plate technique) เปนการทาเจอจางตวอยางอาหารใหไดระดบทเหมาะสม จากนนนาสารละลายตวอยางอาหารแตละความเขมขนมา 1 มลลลตรผสมกบอาหารเลยงเชอททาจากวนทหลอมเหลวอณหภมประมาณ 45 องศาเซลเซยส แลวปลอยใหอาหารวนแขงตวในจานเพาะเชอ แบคทเรยทอยในตวอยางอาหารจะถกตรงไวในวน และนาไปบมเพาะทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 2 - 3 วน แบคทเรยทมชวตอยจะแบงตวและสรางโคโลนซงมองเหนไดดวยตาเปลา นาจานเพาะเชอทม 30 – 300 โคโลน มานบจานวนและคานวณหาปรมาณแบคทเรยในหนวย CFU ตอมลลลตรของตวอยาง

1.1.2 เทคนคสเปรดเพลต (spread plate technique) วธการตรวจวเคราะหคลายคลงกบเทคนคพอรเพลต มขอแตกตางตรงทจะเตมสารละลายตวอยางอาหาร 0.1 มลลลตรลงบนผวหนาของอาหารเลยงเชอททาจากวนทเตรยมใหแขงตวไวแลว ใชแทงแกวปลอดเชอเกลย

251

ใหทวผวหนาของอาหารเลยงเชอกอนนาไปบมเพาะเชอและนบจานวนเชอเชนเดยวกบเทคนค พอรเพลต

1.1.3 เทคนคดรอปเพลต (drop plate technique) วธนเปนการยอวธนบจานวนโคโลนบนจานเพาะเชอ (plate colony count) โดยใชจานเพาะเชอเพยงจานเดยวและใชอาหารเลยงเชอทเปนวนเปนสารละลายเพอเจอจาง ในการวเคราะหจะหยดสารละลายวนลงในบนผวหนาของอาหารเลยงเชอ วน 1 หยดจะมปรมาตร 0.1 มลลลตร ในการวเคราะหแตละตวอยางอาหารจะทาเจอจาง 3 ระดบความเขมขน แตละความเขมขนจะหยดวน 5 หยดถอเปนการทาซา 5 ครง บมเพาะเชอในสภาวะเหมาะสมนาน 48 ชวโมง นาจานเพาะเชอทม 5 – 50 โคโลน มานบจานวนและคานวณหาปรมาณแบคทเรยในหนวย CFU ตอมลลลตรของตวอยาง วธนชวยประหยดวสดและเวลาในการตรวจวเคราะหโดยทไดผลดใกลเคยงกบวธการนบจานวนโคโลนบนจานเพาะเชอ (รววรรณ วงษสมทร, 2542, หนา 4) (ภาพท 9.3)

ภาพท 9.3 การตรวจสอบจานวนแบคทเรยดวยเทคนคดรอบเพลต ทมา: (ดดแปลงจาก The Biofilms Hypertextbook, 2006)

1.1.4 เทคนคสไปรลเพลต (spiral plate technique) วธนไมตองทาเจอจางตวอยางอาหาร เพยงแตปรบอตราการไหลของตวจายตวอยาง วธนใชจานเพาะเชอเพยงจานเดยวในขณะทวธเพลตเคานตตองใช 2 – 3 จาน ในการเพาะเชอ แขนของตวจายตวอยางจะปลอยตวอยางลงในจานเพาะเชอทมอาหารเลยงเชอชนดวนทแขงตวอยแลว โดยจะเรมปลอยตวอยางอาหารจากจดศนยกลางของจานเพาะเชอออกไปสขอบจาน โดยทปรมาตรของตวอยางทปลอยจะคอยๆ ลดลงจนถงความเขมขนท 1:10000 ขณะทปลอยตวอยางอาหารนจานเพาะเชอจะหมนไป

ดวย หลหนาแนนการนบจของพนทเปนจานอยางรวดจากภาพหาจานวเวลาทใชกบวธตรเชอและจชวโมง (ร

ภาพท 9ทมา: (In

(MPN) หลกการแบคทเรเจรญ โสงเกตจาหาคา M

ลงจากการบนตรงจดศนยจานวนแบคททของจานเพานวนแบคทเรยดเรวโดยการใพ (image anaวนแบคทเรยไชในการตรวจรวจนบโคโลนจานเพาะเชอรววรรณ วงษ

.4 การตรnterscience,

1.2 เท method เปรทางสถตจากรยในอาหารเ ดยใชตวอยาากจานวนหล

MPN การตรว

มเพาะเชอทยกลางของจาเรยใชเครองมาะเชอกบปรมยตอมลลลตใชเครองนบโalyser) การไดในชวง 500จนบเชอดวยวนบนจานเพาอนอย ไมตองษสมทร, 2542

รวจสอบจานว 2009; US F

คนค multiplปนวธการตรวกความนาจะลยงเชอชนดางอาหารในปลอดทใหเปนบจหาเชอดวย

ทอณหภมเหมานเพาะเชอแมอวดทเรยกวมาตรของตวรของตวอยาคโลนดวยแสใชเทคนคสไป

0 – 300,000วธเพลตเคานะเชอ พบวาไใชปเปต สาม2, หนา 3 – 4

วนแบคทเรยดFood and Dr

e tube meวจหาจานวนเะเปนหรอเปนดเหลวชนดททปรมาณตางๆบวกของแตลวธ MPN สาม

252

มาะสมจะเกและคอยๆ ลดวาเคานตงกรอยางอาหารงอาหาร สวงเลเซอร (lasปรลเพลตรวม โคโลนตอมลนต ไดมการเปไดผลดใกลเคมารถวเคราะห4)

ดวยเทคนคสไrug Adminis

ethod หรอเชอจลนทรยทนการตรวจหาทาใหเหนควๆ กน หรอควละความเขมขมารถทาไดหล

ดโคโลนบนจดลงเมอเขาใรด (countingรทใชเพอทจะวนการนบแบser colony cมกบเครองนบลลลตร และใปรยบเทยบปคยงกน ขอดขหตวอยางอา

ไปรลเพลต tration, 2011

อทเรยกวา Mทมอยนอยในาโอกาส (proามแตกตางเามเขมขนแตขนแลวนาคาทลายวธ เชน

จานเพาะเชอใกลขอบจานg grid) ซงใชคะเปลยนคาทนบบอตโนมตสcount) หรอเคบโคโลนดวยแใชเวลาเพยง ระสทธภาพขของวธนคอใชหารไดถง 50

1)

Most Probabนนาหรออาหาobability) กเมอมจลนทรตกตางกน กาทไดไปเปดตา

อโดยมโคโลนน (ภาพท 9.4ความสมพนธนบไดออกมาสามารถทาไดครองวเคราะหแสงเลเซอรใช 1 ใน 3 ของของวธนเทยบชอาหารเลยง

0 - 60 จานตอ

ble Numbeาร โดยอาศยการเจรญของยเจรญกบไมารประเมนผลารางสถตเพอ

น) ธาดหชงบงอ

r ยงมลอ

253

1.2.1 วธ 9 หลอด (3-3-3) ทาการเจอจางตวอยางอาหาร 3 ระดบ มกทาทระดบ 10-1 10-2 และ 10-3 เพาะเชอในอาหารเลยงเชอชนดทเหมาะสมกบการเจรญของเชอทตองการตรวจวเคราะห ระดบเจอจางละ 3 หลอด บมเชอใหเจรญ อานผลการเจรญของเชอ นาจานวนหลอดทเชอเจรญหรอใหผลเปนบวกไปอานคา MPN ในตารางท 9.6

ตารางท 9.6 คาเอมพเอนตอกรม (MPN/g) ของอาหาร ทระดบความเชอมน 95 เปอรเซนต ใชตวอยางทระดบความเขมขน 10-1 10-2 และ 10-3 ความเขมขนละ 3 หลอด

จานวนหลอดทใหผลบวก MPN/g 10-1 10-2 10-3 0 0 0 <3 0 0 1 3 0 1 0 3 1 0 0 4 1 0 1 7 1 1 0 7 1 1 1 11 1 2 0 11 2 0 0 9 2 0 1 14 2 1 0 15 2 1 1 20 2 2 0 21 2 2 1 28 3 0 0 23 3 0 1 39 3 0 2 64 3 1 0 43 3 1 1 75 3 1 2 120 3 2 0 93 3 2 1 150 3 2 2 210 3 3 0 240 3 3 1 460 3 3 2 1,100 3 3 3 >2,400

ทมา: (APHA, 1976, p 161)

254

1.2.2 วธ 15 หลอด (5-5-5) ทาการเจอจางตวอยางอาหาร 3 ระดบ มกทาทระดบ 10-1 10-2 และ 10-3 เพาะเชอในอาหารเลยงเชอชนดทเหมาะสมกบการเจรญของเชอทตองการตรวจวเคราะห ระดบเจอจางละ 5 หลอด บมเชอใหเจรญ อานผลการเจรญของเชอ นาจานวนหลอดทเชอเจรญหรอใหผลเปนบวกไปอานคา MPN ในตารางท 9.7

ตารางท 9.7 คาเอมพเอนตอกรม (MPN/g) ของอาหาร ทระดบความเชอมน 95 เปอรเซนต ใชตวอยางทระดบความเขมขน 10-1 10-2 และ 10-3 ความเขมขนละ 5 หลอด

จานวนหลอดทใหผลบวก MPN/g 10-1 10-2 10-3 0 0 0 <2 0 0 1 2 0 0 2 4 0 1 0 2 0 1 1 4 0 1 2 6 0 2 0 4 0 2 1 6 0 3 0 6 1 0 0 2 1 0 1 4 1 0 2 6 1 0 3 8 1 1 0 4 1 1 1 6 1 1 2 8 1 2 0 6 1 2 1 8 1 2 2 10 1 1 0 8 1 3 1 10 1 4 0 11 2 0 0 5

จานวนหลอดทใหผลบวก MPN/g 10-1 10-2 10-3 2 0 1 7 2 0 2 9 2 0 3 12 2 1 0 7 2 1 1 9 2 1 2 12 2 2 0 9 2 2 1 12 2 2 2 14 2 3 0 12 2 3 1 14 2 4 0 15 3 0 0 8 3 0 1 11 3 0 2 13 3 1 0 11 3 1 1 14 3 1 2 17 3 1 3 20 3 2 0 14 3 2 1 17 3 2 2 20 3 3 0 17

255

จานวนหลอดทใหผลบวก MPN/g 10-1 10-2 10-3 3 3 1 21 3 4 0 21 3 4 1 24 3 5 0 25 4 0 0 13 4 0 1 17 4 0 2 21 4 0 3 25 4 1 0 17 4 1 1 21 4 1 2 26 4 2 0 22 4 2 1 26 4 2 2 32 4 3 0 27 4 3 1 33 4 3 2 39 4 4 0 34 4 4 1 40 4 5 0 41 4 5 1 48 5 0 0 23 5 0 1 31 5 0 2 43 5 0 3 58 5 0 4 76 5 1 0 33

จานวนหลอดทใหผลบวก MPN/g 10-1 10-2 10-3 5 1 1 46 5 1 2 64 5 1 3 84 5 2 0 49 5 2 1 70 5 2 2 94 5 2 3 120 5 2 4 148 5 2 5 177 5 3 0 79 5 3 1 109 5 3 2 141 5 3 3 175 5 3 4 212 5 3 5 253 5 4 0 130 5 4 1 172 5 4 2 221 5 4 3 278 5 4 4 345 5 4 5 436 5 5 0 240 5 5 1 348 5 5 2 542 5 5 3 920 5 5 4 1,600 5 5 5 >1,600

ทมา: (APHA, 1976, p 158 - 160)

256

1.2.3 วธ 10 หลอดๆ ละ 10 มลลลตร ทาการเพาะเชอโดยใชตวอยางอาหาร 10 มลลลตร ในอาหารเลยงเชอชนดทเหมาะสมกบการเจรญของเชอทตองการตรวจวเคราะห จานวน 10 หลอด บมเชอใหเจรญ อานผลการเจรญของเชอ นาจานวนหลอดทเชอเจรญหรอใหผลเปนบวกไปอานคา MPN ในตารางท 9.8

ตารางท 9.8 คาเอมพเอนตอ 100 มลลลตร (MPN/100 ml) ของตวอยาง ทระดบความเชอมน 95 เปอรเซนต

จานวนหลอด ทใหผลบวก

คา MPN/100 ml คาจากดความเชอมน (confidence limits) ระดบตา ระดบสง

0 <1.1 - 3.3 1 1.1 0.05 5.9 2 2.2 0.37 8.1 3 3.6 0.91 9.7 4 5.1 1.6 13 5 6.9 2.5 15 6 9.2 3.3 19 7 12 4.8 24 8 16 5.9 33 9 23 8.1 53 10 >23 12 -

ทมา: (ดดแปลงจาก US Food and Drug Administration, 2010)

1.3 เทคนคการกรองโดยเมมเบรน (membrane filtration) หรอวธไฮโดรโฟบกกรดเมมเบรนฟลเตอร (hydrophobic grid membrane filter; HGMF) เปนวธทนบจานวนแบคทเรยบนแผนกรอง (membrane filter) โดยระบบนประกอบดวยแผนกรองจลนทรยและเครองกรองจลนทรย ในระบบททนสมยจะสามารถตอเชอมเขากบคอมพวเตอร ซงทาใหสามารถอานผลโดยมองเหนแผนกรองทมจลนทรยหลงจากการบมเพาะเชอแลวและสามารถนบจานวนจลนทรยโดยอตโนมต การตรวจวเคราะหทาไดโดยการกรองตวอยางอาหารผานแผนกรองแลวนาแผนกรองไปวางบนแผนทมอาหารเลยงเชอซงอาจเปนชนด general purpose หรอ differential เพอวเคราะห

257

เชอเฉพาะชนด และนบจานวนโคโลนหลงการบมเพาะนาน 1 – 3 วน ขอดของวธนคอลดขนตอนการทาเจอจางตวอยางอาหารซงเปนการลดเวลาในการตรวจวเคราะหและผลวเคราะหทไดดกวาวธกรองปกต (conventional filter) แผน HGMF มลกษณะคลายกบแผนกรองปกตทเปนตาราง สเหลยมแตเคลอบดวยสารทไมชอบนา เชน แวกซ ทาใหแบงแผนกรองไดเปนชองเลกๆ 2,000 – 4,000 ชองขนอยกบขนาดของแผน จานวนแบคทเรยทนบไดตอแผนกรองแผนหนงอยในชวง 10 – 9 x 104 เซลล วธนใชตรวจหาจานวนโคลฟอรมในนานมดบและนมพาสเจอรไรส และในปจจบนมการใชวธนในการตรวจหาจลนทรยทงหมด โคลฟอรม ฟคลโคลฟอรม ยสตและรา E. coli Salmonella Staphylococcus aureus Vibrio parahaemolyticus Clostridium perfringens และ Pseudomonas aeruginosa ขอจากดของวธนคออาหารทนามากรองตองใสและไมควรมชนสวนของเซลลจลนทรยหรอเศษอาหาร ซงจะทาใหแผนเยอเมมเบรนอดตน (รววรรณ วงษสมทร, 2542, หนา 4–5; ธรพร กงบงเกด, 2546, หนา 177) ขอดของการตรวจนบจลนทรยดวยวธ HGMF คอ

1) ใชตรวจวเคราะหตวอยางอาหารทมปรมาณมากแตมปรมาณจลนทรยนอยไดด เชน นาทผานการบาบดมาแลว

2) การเพาะเชอโดยวธนเซลลของจลนทรยไมเสยหายจากการสมผสกบความรอนของอาหารเลยงเชอเหมอนกบวธดงเดม

3) ชวยขจดปญหาการรบกวนของสารยบยงการเจรญเตบโตของจลนทรยทอาจปนเปอนมากบตวอยางอาหาร

4) ลดคาใชจายในการตรวจวเคราะห 5) ลดเวลาในการตรวจวเคราะห เนองจากไมตองทาเจอจางอาหาร

1.4 การตรวจวเคราะหปรมาณจลนทรยโดยตรงดวยกลองจลทรรศน (direct microscopic count) เปนการนบจานวนเซลลโดยใชกลองจลทรรศน โดยใชแผนสไลดแบบ Petroff-Hausser ซงมลกษณะเปนรองสเหลยมคลายตาขาย ทาใหเกดพนทเลกๆ ขนาด 50 X 50 X 20 ไมครอน โดยหยดสารละลายเชอลงบนแผนสไลดปดทบดวย cover slide นาไปตรวจนบจานวนเชอภายใตกลองจลทรรศนแบบ compound microscope โดยการสมพนทเปนจานวน 25 ครง คานวณหาจานวนเชอแบคทเรยตอมลลลตร ขอดของวธนคอสามารถทราบจานวนแบคทเรยไดอยางรวดเรวขณะเดยวกนกสงเกตลกษณะของแบคทเรยทนบไดดวย สวนขอเสยของวธนกคอเปนการนบเซลลแบคทเรยทงหมดทงทมและไมมชวต และไมเหมาะกบงานวเคราะหทม

258

ปรมาณของตวอยางมาก ชนสวนของเซลลจลนทรยทาใหยากตอการนบปรมาณและปรมาณสงสดทสามารถวเคราะหไดไมเกน 105 เซลลตอมลลลตร (ธรพร กงบงเกด, 2546, หนา 180)

1.5 การทดสอบโดยใชสรดอกซ (dye reduction test) เปนวธทอาศยหลกการการเปลยนสของสารดชนการรดวซเมอมจลนทรยเจรญและเกดปฏกรยารดกชน ระยะเวลาในการเปลยนสเปนสดสวนผกผนกบจานวนของแบคทเรย นยมใชในการตรวจสอบคณภาพของนานมดบโดยสารดชนการรดวซทใชคอเมทธลนบลและรซาซรน โดยปกตเมทธลนบลจะมสนาเงนเมอถก รดวซสจะเปลยนเปนสขาว สาหรบรซาซรนโดยปกตมสนาเงนอมเทาเมอถกรดวซสจะเปลยนเปน สชมพขาว (สมณฑา วฒนสนธ, 2549, หนา 345)

2. วธรวดเรว (rapid methods)

วธการตรวจวเคราะหหาจลนทรยโดยทวไปใชวธวเคราะหแบบดงเดม เนองจากเปนวธ มาตรฐาน เปนทยอมรบในระดบสากล ใหผลการวเคราะหทถกตองและแมนยา แตมขอเสยคอตองใชเวลานานในการตรวจวเคราะห ปจจบนจงไดมการพฒนาวธใหมทเรยกวา “วธวเคราะหแบบรวดเรว (rapid methods)” มาใชในการตรวจหาจลนทรยในอาหาร มการใชกนอยางแพรหลายในโรงงานอตสาหกรรมอาหาร เนองจากมขอดหลายประการ คอ ปลอยสนคาออกสตลาดไดรวดเรว ระยะเวลาในการเกบรกษาผลตภณฑอาหารในโกดงสน เมอมการตรวจวเคราะหไดรวดเรวจะสงผลใหโรงงานเพมกาลงการผลตได นอกจากนวธวเคราะหแบบรวดเรวยงสามารถทาไดงายกวาวธดงเดมทตองอาศยการฝกฝนความชานาญและทกษะในการตรวจวเคราะหมากกวาอกดวย วธรวดเรวทใชในการตรวจหาจลนทรยกอโรคนนจะตองมความจาเพาะเจาะจงสง และสามารถตรวจหาเชอในระดบปรมาณทตาๆ ไดด เทคนคทมการใชอยางแพรหลาย (รววรรณ วงษสมทร, 2542, หนา 5 – 10) ไดแก

2.1 วธอเลกตรคอล (electrical method) ใชหลกการวดคาการขดขวางการเดนทางกระแสไฟฟาสลบ (impedance) ในอาหารเลยงเชอ เมอแบคทเรยเจรญจะเกดการเปลยนแปลงขององคประกอบของอาหารเลยงเชอ โมเลกลทซบซอนและไมมประจ เชน คารโบไฮเดรทหรอไขมนจะถกยอยสลายเปนโมเลกลทเลกกวาและมประจ เชน กรดแลกตก และกรดอะซตก เมอแบคทเรยมการแบงตวเพมปรมาณขนเรอยๆ จะกอใหเกดโมเลกลทมประจจานวนมาก ทาใหคาการขดขวางการเดนทางของกระแสไฟฟาสลบลดลง ซงคา impedance นใชวดการเจรญเตบโตของแบคทเรยไดทางออม เปนวธทรวดเรวสามารถตรวจหาจานวนแบคทเรยไดมากถง 105 –106

259

เซลลตอมลลลตรภายในเวลา 3 - 5 ชวโมง และ 104 – 105 เซลลตอมลลลตรภายในเวลา 5 - 7 ชวโมง ปจจบนมหลายบรษทผลตเครองมอนออกมาจาหนายและไดรบความนยมใชในหองปฏบตการทวโลก สาหรบทมจาหนายในปจจบนผลตจาก 4 บรษท โดยมชอทางการคาทแตกตางกนไดแก BACTOMETER BacTrac Mathus และ RABIT เชอจลนทรยทสามารถใชเครองมอนวเคราะห ไดแก จลนทรยทงหมด coliform E. coli Salmonella Campylobacter และยสตและรา วธนเปนวธทรวดเรว ประหยดอาหารเลยงเชอ ลดคาใชจายในดานผตรวจวเคราะห ลดพนทในการเกบจานเพาะเชอ และสามารถวเคราะหไดหลายตวอยางในเวลาเดยวกน เชน เครอง BACTOMETER ตรวจวเคราะหไดมากถง 512 ตวอยางในคราวเดยวกน

2.2 วธไพรเวต (pyruvate method) เปนการตรวจหาปรมาณของไพรเวต ซงเปนสารทเกดขนในระหวางกระบวนการเมตาบอลซมของแบคทเรย วธนเปนวธทรวดเรว ไมตองเสยคาใชจายมาก ทาเปนระบบอตโนมตได แตใหคาทไมคอยถกตองมากนก เชน การตรวจหาแบคทเรยในนม เปนตน

2.3 วธเรดโอมตร (radiometry method) เปนวธทตรวจวดการเจรญของแบคทเรยในอาหารเลยงเชอโดยการวดปรมาณ 14CO2 ทถกปลอยออกมาจากสารอาหารทไดมการตดฉลาก (label) ดวยกมมนตรงส (radioactive) ในกระบวนการเมตาบอลซม วธนใชเวลาในการตรวจวเคราะห 2 - 24 ชวโมง ขนอยกบจานวนแบคทเรยทมอยในตวอยางอาหาร เวลาทใชในการตรวจสอบปรมาณของ 14CO2 เปนสดสวนกลบกบจานวนแบคทเรยในอาหาร ขอดของวธนคอใชเวลาการตรวจวเคราะหสน บางวธใหผลการวเคราะหนอยกวา 1 ชวโมง มการใชวธนในการตรวจนบจลนทรยในนานมดบ นมในระหวางการแปรรปและผลตภณฑนมสาเรจรป

2.4 วธตรวจสอบการเกดแสง (luminescence method) เปนการตรวจวด ATP bioluminescence ใชหลกการวดการเกดแสงทเกดขนจากปฏกรยาทถกกระตนโดยเอนไซม โดยอาศยหลกการทางปฏกรยาเอนไซมลซเฟอรเรส (luciferase) ซงสามารถใชพลงงานเคมทมอยในโมเลกลทม ATP สง ทาใหเกดปฏกรยา oxidative decarboxylation ของลซเฟอรน (luciferin) และเกดแสงขน ดงสมการ luciferin + luciferase + ATP + O2 oxyluciferin + luciferase + AMP + light

ปรมาณแสงทถกสรางขนเปนอตราสวนกบความเขมขนของ ATP คอ 1 โฟตอน ตอ ATP 1 โมเลกล ตรวจวดแสงทปลอยออกมาดวยเครองวดแสง (photometer) ดงนนการวด ATP ในเซลล

260

ทมชวตจงเปนตวบงชถงการปนเปอนของจลนทรยทดวธหนง วธนใชในการตรวจสอบการปนเปอนของจลนทรยซงเปนทรจกกนมานาน แตไมคอยแพรหลายเนองจากมความแมนยาตา สารทใชเปนรเอเจนทสลายตวไดงาย สารเคมและเครองมอวเคราะหมราคาแพง วธนสวนใหญนาไปใชเปนวธรวดเรวในการตรวจสอบสขลกษณะและความสะอาดของพนททสมผสอาหาร

2.5 ชดทดสอบสาเรจรปทางการคา (commercial test kit) เปนการใชชดวเคราะหสาเรจรปทบรษทตางๆ ผลตออกมาจาหนายทางการคา โดยใชหลกการตรวจสอบสมบตทางชวเคม เชน ชดทดสอบ API test kit และตรวจสอบโดยใชหลกการทางอมมโนโลย เชน ใชวธ อมมโนแมกนตกเทคนค (Immunomagnetic technique) ในการตรวจหาเชอ Listeria monocytogenes ใชวธ Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ในการตรวจวเคราะห Salmonella L. monocytogenes และ E. coli O157:H7 และใชวธ Latex agglutination test ตรวจวเคราะหเชอ Salmonella เปนตน การตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหารดวยวธอมมโนวทยา

วฒนาลย ปานบานเกรด (2538, หนา 7-10) กลาววาเทคนคทางอมมโนวทยา เปนวธการทนาแอนตบอด (antibody; Ab) ทมความจาเพาะเจาะจงตอแอนตเจน (antigen; Ag) มาใชในการตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหาร เมอรางกายไดรบสารกระตนหรอสงแปลกปลอมทมคณสมบตเปนแอนตเจน รางกายจะสรางสารแอนตบอดออกมาอยางจาเพาะเพอทาลายสงแปลกปลอมภายในรางกายโดยอาศยปฏกรยาเอนไซม (enzyme immunoassay) มการใชปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอดมาประยกตใชในการรกษาโรค การวนจฉยโรค การตรวจหาและแยกวเคราะหสารตางๆ โดยอาศยคณสมบตของแอนตบอดทมความจาเพาะเจาะจงสงรวมกบสารอน เชน สารรงส (radiation) เอนไซม (enzyme) หรอสารเรองแสง (fluorescence) เขามาชวยในการตรวจสอบ ทาใหปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอดมความไวสงมากในการตรวจวเคราะหหาสารทมปรมาณนอยๆ ไดอยางมประสทธภาพ การประยกตใชวธทางอมมโนวทยาตรวจหาเชอจลนทรยกอโรคในอาหาร ไดแก

1. วธ Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) เปนวธทางอมมโนวทยาทนยมใชงานมากทสด ปจจบนไดนามาประยกตใชในการตรวจหา

เชอจลนทรยกอโรคในอาหาร เชน Vibrio และ Salmonella เนองจากมความจาเพาะเจาะจงสง และใหผลการตรวจวเคราะหทรวดเรว จงนบเปนวธการตรวจหาเชอแบบรวดเรววธหนง เทคนค

261

ELISA ใชหลกการทางอมมโนวทยาคอปฏกรยาระหวางแอนตบอดและแอนตเจนททาปฏกรยากนอยางจาเพาะเจาะจง มการนาเอาแอนตบอดหรอแอนตเจนมาตดฉลากดวยเอนไซม เรยกวา เอนไซมคอนจเกต (conjugated enzyme) ซงมอยหลายชนด เชน เอนไซมเปอรออกซเดส (peroxidase) อลคาไลนฟอสฟาเตส (alkaline phosphatase) กลโคสออกซเดส (glucose oxidase) เบตากาแลกโตซเดส (beta-D-galactosidase) เปนตน และทาการตรวจสอบปรมาณของเอนไซมคอนจเกตทตดฉลากอยกบแอนตบอดหรอแอนตเจนดวยซบสเตรตทมกใหสหลงจากถกยอยดวยเอนไซม เชน ออรโธเฟนลนไดอะมน (orthophenylenediamine) เปนซบสเตรตของเอนไซมเปอรออกซเดส และพาราไนโตรเฟนลฟอสเฟต (paranitrophenyl phosphate) เปนซบสเตรตของเอนไซมอลคาไลนฟอสฟาเตส ซงจะใหสารผลตภณฑทมสเหลองและมความคงสภาพด วธ ELISA ทใชในการตรวจวเคราะหแบคทเรยกอโรคในอาหาร ไดแก

1.1 วธ Direct Sandwich ELISA เปนวธการตรวจหาชนดของจลนทรยหรอแอนตเจนโดยการเคลอบแอนตบอด (Ab) ททราบชนดกบเฟสของแขง (solid phase) เชน หลอดพลาสตกหรอไมโครเพลต เมอเตมจลนทรยทตองการบงชชนด ซงมสมบตเปนแอนตเจน (Ag) จะเกดปฏกรยาแอนตบอดจบกบแอนตเจนหรอจลนทรยทตองการบงชชนดอยางจาเพาะเจาะจง หลงจากนนเตมแอนตบอดทตดฉลากเอนไซมคอนจเกต (conjugated enzyme antibody) ใหไปจบกบแอนตเจนหรอจลนทรยทตองการบงชชนด ตรวจสอบชนดและปรมาณของแอนตเจนหรอจลนทรยทตองการบงชชนดทถกยดจบไวดวยซบสเตรตของเอนไซมทเชอมตดอยกบแอนตบอด ทาใหเกดสารผลตภณฑทมส (ภาพท 9.5) และวดความเขมของสดวยเครอง spectrophotometer

ภาพท 9.5 กลไกการเกดปฏกรยา Direct Sandwich ELISA method ทมา: (ดดแปลงจาก McCarthy, 2003, p.4)

เคลอบแอนตบอดกบเฟสของแขง

เตมแอนตเจนทตองการตรวจสอบ

เตมแอนตบอดตดฉลากดวยเอนไซม

เตมซบสเตรตของเอนไซม

262

1.2 วธ Competitive ELISA เปนการตรวจหาจลนทรยกอโรคในอาหารอกวธหนง โดยการเคลอบแอนตบอดกบเฟสของแขง เชน หลอดพลาสตกหรอไมโครเพลต จากนนเตมแอนตเจนหรอจลนทรยทตดฉลากดวยเอนไซมคอนจเกต (conjugated enzyme antigen) และจลนทรยทตองการตรวจสอบชนด ซงจะแยงกนเขาจบกบแอนตบอดทเคลอบอยกบไมโครเพลต ตรวจสอบปฏกรยาทเกดขนโดยการเตมซบสเตรตของเอนไซมทเชอมตดอยกบแอนตเจนและทาใหเกดสารสขน วดปรมาณสารสทเกดขนดวยเครอง spectrophotometer ความเขมของสารสทเกดขนจะแปรผกผนกบปรมาณจลนทรยทตองการตรวจสอบนนคอถาความเขมของสารสมากแสดงวามจลนทรยทตองการตรวจสอบนอยและถาความเขมของสารสนอยแสดงวามจลนทรยทตองการตรวจสอบมาก (สนท มกรแกวเกยร และคณะ, 2536, หนา 126-128) (ภาพท 9.6)

ภาพท 9.6 กลไกการเกดปฏกรยาของ Competitive Sandwich ELISA method ทมา: (ดดแปลงจาก สนท มกรแกวเกยร และคณะ, 2536, หนา 128)

- แอนตบอด

- แอนตเจนตดฉลากดวยเอนไซม

- แอนตเจนจลนทรยทตองการบงชชนด

- ซบสเตรท

เคลอบแอนตบอดกบเฟสของแขง

เตมแอนตเจนตดฉลากดวยเอนไซม

เตมแอนตเจนตดฉลากดวยเอนไซมและจลนทรยทตองการตรวจสอบ

เตมซบสเตรตของเอนไซม

เตมซบสเตรตของเอนไซม

263

2. วธ Immunofluorescence (IF) มหลกการเหมอนกบวธ Direct Sandwich ELISA Method แตเปลยนสารทตดฉลากจาก

เอนไซมเปนสารทสามารถเรองแสงไดเมออยภายใตแสงอลตราไวโอเลต เชน สาร fluorescein isothiocyanate (FITC) หรอ tetramethyl rhodamine

3. วธ Radioimmunoassay (RIA) เปนวธทนาเอาสารรงสเขามาใชรวมกบปฏกรยาระหวางแอนตเจน-แอนตบอด ตรวจสอบ

การเกดปฏกรยาดวยเครองมอวดปรมาณรงส สารรงสทนามาใช เชน I25 ทาใหปฏกรยามความไวสงมาก สามารถตรวจหาจลนทรยทมปรมาณนอยได

4. วธ Latex agglutination วธนใชแอนตบอดเคลอบบนอนภาคลาเทกซ (Latex particles) หรออาจเคลอบอนภาค

ลาเทกซดวยแอนตเจนจากจลนทรย สาหรบวธการทา Latex agglutination ไดมชดตรวจสาเรจรปออกมาวางจาหนายแลว เชน Wellcolex Colour Salmonella Test จากบรษท Wellcome Diagnostic ประเทศองกฤษ ซงเปนสารละลายของอนภาคลาเทกซทมการเคลอบดวยแอนตบอดตอ Salmonella วธการทดสอบทาไดโดยการนาสารละลายเชอทตองการตรวจสอบมาตมและนาไปผสมกบสารละลายของอนภาคลาเทกซ ถาม macroscopic agglutination แสดงวาใหการตรวจสอบเปนบวก คอมเชอ Salmonella ในสารละลายเชอ

การตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหารดวยเทคนคทางพนธกรรม

เสาวนย ธรรมสถต (2538, หนา 1-17) กลาววา การทางานของสงมชวตทกชนดถกควบคมดวยสารพนธกรรมทเรยกวา ดเอนเอ (DNA; deoxyribose nucleic acid) การควบคมการทางานของสงมชวตเกดขนผานการสรางเอนไซม ซงเปนปจจยทกอใหเกดขบวนการทางานตางๆ ขบวนการสรางเอนไซมเกดขนจากการทสายดเอนเอจะถกถอดรหส (transcription) ไดเปนสายอารเอนเอ (RNA; ribonucleic acid) ซงจะถกถอดรหส (translation) ใหไดเปนโปรตน มกตรวจหายน (gene) ทควบคมลกษณะเฉพาะหรอความสามารถพเศษเพอใชเปนตวบงชถงการมจลนทรยชนดนนๆ ได ดเอนเอของจลนทรยมลกษณะเปนสายเกลยวค (double helix DNA) ประกอบดวยอนมลฟอสเฟต (phosphate group) นาตาลดออกซไรโบส (deoxyribose) และกลมเบส (base group) คอ ไทมน(thymine; T) อะดนน (adenine; A) ไซโตซน (cytosine; C) และกวนน (guanine; G) โดยคเบสจะจบกนอยางจาเพาะคอไทมนจบกบอะดนนดวยพนธะค (double

264

bond) และไซโตซนจบกบกวนนดวยพนธะสาม (triple bond) เสมอ ดวยความจาเพาะดงกลาวจงถกนามาประยกตใชในการตรวจหายนทควบคมลกษณะจาเพาะเพอบงชถงการมจลนทรยเจาของยนนนๆ

หลกการการตรวจวเคราะหจลนทรยดวยเทคนคทางพนธกรรม โดยทวไปตองมดเอนเอทมความจาเพาะตอจลนทรยทตองการตรวจหาจากตวอยางอาหาร ซงเรยกวา “ดเอนเอโพรบ (DNA probe)” ทมการตดฉลากหรอ labeling ดวยสารเคมหรอรงสเพอใหงายและสะดวกตอการตรวจหา เรมตนการตรวจวเคราะหโดยการทาใหสายคของดเอนเอโพรบแยกใหเปนสายเดยว ขณะเดยวกนกทาการแยกดเอนเอสายคของจลนทรยทตองการตรวจสอบซงเรยกวา “ดเอนเอเปาหมายหรอ ทารเกตดเอนเอ (target DNA)” ใหเปนสายเดยวเชนเดยวกน จากนนนาดเอนเอสายเดยวของ ดเอนเอโพรบและจลนทรยทตองการตรวจสอบมาผสมกนแลวทาใหเกดการจบคกนใหม ซงหาก ดเอนเอเปาหมายของจลนทรยในตวอยางอาหารสามารถจบคกบดเอนเอโพรบไดกหมายถงเปนจลนทรยสายพนธเดยวกนกบจลนทรยเจาของโพรบนนเอง เทคนคนเรยกวา “DNA hybridization” ดเอนเอโพรบ: การตดฉลากและการตรวจหา (labeling and detection)

สงสาคญในการตรวจหาชนดของจลนทรยดวยเทคนค hybridization กคอตองม ดเอนเอโพรบทจาเพาะตอจลนทรยชนดทตองการหา นนคอดเอนเอหรอยนทควบคมลกษณะจาเพาะทจะบงชถงจลนทรยเจาของดเอนเอหรอยนนนๆ ปจจบนมการสรางดเอนเอโพรบขนมามากมายหลายชนด เชน การใชยนทควบคมการสรางสารพษ (toxin gene) ของ enterotoxigenic E. coli เปนโพรบหรอการใชไซโตไลซนยน (cytolysin gene) ของ Listeria monocytogenes และ Vibrio vulnificus เปนโพรบเพอตรวจหาเชอจลนทรยทเปนเจาของดเอนเอทนามาทาเปน probe นนๆ เปนตน ดเอนเอโพรบทใชในการตดตามทารเกตดเอนเอหรอดเอนเอของจลนทรยทตองการตรวจสอบจะทาการตดฉลากไวเพอใชเปนสญญาณวาโพรบไดตรวจพบทารเกตดเอนเอแลว การตดฉลากนนแตเดมมกใชสารรงส ซงทใชกนอยางแพรหลายกคอ 32P เรยกวา radiolabeled DNA probe และจะใช X-ray film เปนตวรบสญญาณ โดยปรากฏเปนจดหรอแถบสดาบนแผนฟลม การตดฉลากโพรบดวยสารรงสมขอเสยหลายประการ คอ รงสเปนสารอนตราย ตองใชความระมดระวงสง และยงไมเสถยรอกดวย ดงนนจงมการนาเอาสารทไมใชสารรงสมาใชตดฉลากแทน เชน เอนไซม และตรวจสอบการเกด DNA hybridization ดวยการเกดสของปฏกรยาเอนไซม

265

เทคนค DNA hybridization

ใชดเอนเอหรออารเอนเอจาเพาะทตองการทดสอบซงทราบชนดอยแลวเปนโพรบหรอ เปนตวตรวจตามหาจลนทรยในอาหาร วธการนใชคณสมบตในการแยกและจบคกนระหวางดเอนเอกบดเอนเอ และอารดเอนเอ (rDNA คอ DNA ทถอดรหสเปน ribosomal RNA (rRNA)) กบ อารอารเอนเอ (rRNA) เนองจากดเอนเอเสนคสามารถแยกจากกนเปนดเอนเอเสนเดยวๆ ไดในภาวะทมอณหภมสง สภาวะทเปนดาง และสารละลายทมเกลอเขมขน เรยกวาดเอนเอเกดการเสยสภาพ (denaturation) และสามารถกลบมาจบคกนไดอกครงในสภาวะทเหมาะสม (renaturation) เมอดเอนเอ ทง 2 สายนนมคเบสทเปนคสมกน (complementary) (ภาพท 9.7) จากคณสมบตดงกลาวจงสามารถตรวจหาชนดของจลนทรยในอาหารไดดวยดเอนเอโพรบจาเพาะททราบแหลงทมา การเตรยมดเอนเอเพอทาการตรวจสอบดวยวธ hybridization ทาไดหลายวธ และวธทนยมใช ไดแก Colony hybridization Dot blot hybridization และ Southern blot hybridization

ภาพท 9.7 กลไกการเกด DNA hybridization ทมา: (ดดแปลงจาก วฒนาลย ปานบานเกรด, 2538)

Renaturation

266

ในการตรวจหาเชอจลนทรยในอาหารดวยเทคนค DNA hybridization นนจะไดผลดเมอมเชออยไมนอยกวา 104-105 เซลล ดงนนในบางกรณทมเชอนอยกวานการตรวจหาชนดของเชอจะใหผลไมถกตอง จงมการพฒนาเทคนค Polymerase Chain Reaction (PCR) ขนมาใชในการตรวจหาเชอจลนทรยในอาหาร

เทคนค Polymerase Chain Reaction (PCR)

หลกการของเทคนค PCR คอ การเพมจานวนสายดเอนเอจาเพาะทตองการตรวจสอบประกอบดวย 3 ขนตอน (ภาพท 9.8) คอ

1. Denaturation การแยกสายดเอนเอค (double strand DNA) ของทารเกตดเอนเอหรอเรยกวาดเอนเอตนแบบ (template DNA) ใหเปนสายเดยว (single strand DNA) โดยใชอณหภมประมาณ 90 - 95 องศาเซลเซยส จะไดดเอนเอสายเดยวของทารเกตดเอนเอ 2 สาย

2. Annealing นาไพรเมอรซงเปนดเอนเอสายสนทมความจาเพาะกบทารเกตดเอน นนคอการมลาดบเบสทเขาคกนมาผสมและทาใหจบคกน (anneal) กนใหมโดยการปรบลดอณหภมลงประมาณ 50 - 60 องศาเซลเซยส

3. Extension เกดการสรางดเอนเอสายใหมตอจากดเอนเอไพรเมอรทเขาจบกบทารเกต ดเอนเอหรอดเอนเอตนแบบโดยการทางานของเอนไซมแทคโพลเมอรเลส (Taq polymerase) ทาใหไดดเอนเอสายใหมทเปนสายคและมลาดบเบสเหมอนกบสายแรก ขนตอนนใชอณหภมประมาณ 70 - 75 องศาเซลเซยส

ภาพท 9.8 ทมา : (Unive

การจานวนดเอนขนตอนท 3 ซเมอเพมรอบขน ปจจบนมตองการไดอยยนทมรหส (สรางเปนไพรชนดนนปนเปอาศยเทคนคตวอยางจานใหสามารถต

การเพมจานersity of Flo

เพมปรมาณดนเอขนจากเดมซงจากดเอนเบในการสรางมการพฒนาเยางรวดเรว (code) ควบรเมอร และเมปอนในอาหาค gel electroนวนมาก จงรวจสอบไดจ

นวนทารเกตดเrida, 2006)

ดเอนเอจากขม 1 เปน 2 สเอสายคของทงดเอนเอมากเครองมอเฉพ และมการตรคมปจจยของมอทา PCR แรและเครองดophoresis ซงงมการพฒนาากการวดสห

267

เอนเอดวยเทค

นตอนท 1–3สาย เมอขนทารเกตดเอนเกขนกจะทาใาะสาหรบใชรวจหาจลนทรงเชอททาใหเกแลวพบวาสามดมทตรวจสอบงทาใหตองใชวธการตรวจส

หรอวดพลงงาน

7

คนค PCR

3 นบเปน นรอบท 2 กจเอ 2 สาย จะใหไดดเอนเอทา PCR ซรยดวยเทคนคกดโรคทรนแรมารถเพมจานบ การตรชเวลาเพมมาสอบใหรวดเรนขนอยกบชน

1 รอบ (cyะเรมขนท 1 ะไดเปนดเอนเสายคของทงมระบบปรบค PCR โดยใรง (virulenceนวนดเอนเอไรวจสอบการเพกขน จงไมเหรวขนโดยการ นดของสารทน

ycle) จะสามขางตนและจเอสายค 4 สาารเกตดเอนบอณหภมไปยใชลาดบพนธกe factors) ตไดกแสดงวามพมขนของดเอหมาะกบการตตดฉลากดเอนามาตดฉลา

มารถเพมจบลงดวยาย และเอมากยงระดบทกรรมของตางๆ มามจลนทรยอนเอตองตรวจสอบนเอโพรบาก

268

มาตรฐานวธการตรวจวเคราะหทางจลชววทยา

มาตรฐานวธการตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหารมความแตกตางกนขนอยกบประเทศ ผกาหนดมาตรฐาน ซงไดกาหนดมาตรฐานวธการตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหารเพอควบคมสนคาและผลตภณฑอาหารทนาเขามาจาหนายภายในประเทศ สาหรบประเทศไทย กระทรวงสาธารณสข (2552, หนา 10) ไดกาหนดวธการตรวจวเคราะหจลนทรยททาใหเกดโรค ดงน

1. Bacillus cereus ใชวธการตรวจวเคราะหตามมาตรฐาน Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online US Food and Drug Administration ทเปนปจจบน (updated version) หรอวธทมความถกตองเทยบเทา

2. Clostridium perfringens ใชวธการตรวจวเคราะหตามมาตรฐาน Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online US Food and Drug Administration ทเปนปจจบน หรอวธทมความถกตองเทยบเทา

3. Listeria monocytogenes ใชวธการตรวจวเคราะหตามมาตรฐาน International Standardization and Organization (ISO)11290-1: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal Method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 1: Detection method ทเปนปจจบน หรอวธทมความถกตองเทยบเทา

4. Salmonella ใชวธการตรวจวเคราะหตามมาตรฐาน ISO6579: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal Method for Detection of Salmonella spp. ทเปนปจจบน หรอวธทมความถกตองเทยบเทา เวนแตการตรวจวเคราะหนาและนาแขง ใหใชวธ ISO 6340: Water Quality-Detection of Salmonella species ทเปนปจจบน หรอวธทมความถกตองเทยบเทา

5. Staphylococcus aureus ใชวธการตรวจวเคราะหตามมาตรฐาน Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online U.S. Food and Drug Administration ทเปนปจจบน หรอวธทมความถกตองเทยบเทา เวนแตการตรวจวเคราะหนาและนาแขง ใหใชวธ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater: American Public Health Association (APHA) ทเปนปจจบน หรอวธทมความถกตองเทยบเทา

6. Enterobacter sakazakii ใชวธการตรวจวเคราะหตามมาตรฐาน ISO/TS 22964: Milk and milk products- Detection of Enterobacter sakazakii ทเปนปจจบน หรอวธทมความถกตองเทยบเทา

269

บทสรป

การตรวจหาจลนทรยในอาหารเปนเครองมอหนงในการควบคมคณภาพในกระบวนการผลตอาหาร ทาใหสามารถความคมความปลอดภยใหกบผลตภณฑได นอกจากนยงเปนเงอนไขทางกฎหมายทจาเปนตองมการตรวจสอบเพอใหแนใจไดวาผลตภณฑมความปลอดภยตอผบรโภค ในการตรวจวเคราะหเชอจลนทรยในอาหารมหลายปจจยทตองคานงถงและใหความสาคญเพอใหผลการตรวจวเคราะหทไดสามารถนามาใชประเมนคณภาพของผลตภณฑอาหารไดอยางถกตอง ทงชนดของอาหารเอง ความร ความสามารถและความเชยวชาญของผตรวจวเคราะห รวมทงการเลอกใชวธการตรวจวเคราะหทเหมาะสมและไดมาตรฐานระดบสากล ซงมทงวธมาตรฐานดงเดมและวธรวดเรวใหเลอกใช นอกจากนเงอนไขทางดานเวลา ความตองการความรวดเรวของการตรวจวเคราะหและคาใชจายกเปนอกปจจยหนงทตองคานงถงและนามาใชในการพจารณาเลอกใชงาน

270

คาถามทายบท

1. อธบายความสาคญของการตรวจวเคราะหจลนทรยในอาหาร 2. จงอธบายความแตกตางระหวางการตรวจวเคราะหจลนทรยดวยวธดงเดมกบวธรวดเรว 3. อธบายขอดและขอเสยของวธการตรวจเชอดวยวธดงเดมและวธรวดเรว 4. ใหนกศกษาสบคนอาหารเลยงเชอชนด selective differential พรอมทงอธบายหลกการ

คดแยกและการบงชความแตกตางของจลนทรยทเจรญมาอยางนอย 3 ชนด 5. ใหนกศกษาสบคนวธการตรวจวเคราะหเชอ Bacillus cereus ตามมาตรฐาน

Bacteriological Analytical Manual (BAM) ทเปนปจจบน 6. จงอธบายหลกการตรวจวเคราะห Salmonella ในอาหารดวยวธ ELISA 7. จงอธบายหลกการตรวจวเคราะห Vibrio ในอาหารดวยวธ DNA hybridization

271

เอกสารอางอง

ธรพร กงบงเกด. (2546). จลชววทยาอาหาร. ภาควชาอตสาหกรรมเกษตร คณะเกษตรศาสตร ทรพยากรธรรมชาตและสงแวดลอม มหาวทยาลยนเรศวร พษณโลก.

นนทนา อรณฤกษ. (2537). การจาแนกแบคทเรยกลมแอโรปส. กรงเทพฯ: โอเดยนสโตร. บญญต สขศรงาม. (2522). จลชววทยาทวไป. กรงเทพฯ: โอเดยนสโตร. บษกร อตรภชาต. (2545). จลชววทยาทางอาหาร. การผลตเอกสารและตารามหาวทยาลยทกษณ. รววรรณ วงษสมทร. (2542). การวเคราะหทางจลชววทยา โคลฟอรม ฟคลโคลฟอรม และ

อ. โคไล. เอกสารประกอบการฝกอบรมเชงปฏบตการ, กรมวทยาศาสตรบรการ, กระทรวงวทยาศาสตร เทคโนโลยและสงแวดลอม. สงพมพไมไดจดพมพเผยแพรทวไป.

วฒนาลย ปานบานเกรด. (2538). การตรวจหาเชอ Salmonella และ enterotoxigenic E. coli จากอาหารและ E. coli จากนาดม โดยใช DNA probe และ PCR technique. เอกสารประกอบการประชมเชงปฏบตการ เรอง การตรวจสอบจลนทรยและสารปนเปอนในอาหาร. มหาวทยาลยมหดลรวมกบศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต และกระทรวงวทยาศาสตร เทคโนโลยและสงแวดลอม. สงพมพไมไดจดพมพเผยแพรทวไป.

สนท มกรแกวเกยร เกรยงไกร ประพทธพทยา ปกรณ ไทยานนท สชล สงคศร ศกดชย เดชตรยรตน วชระ กสณฤกษ และ ชชชย ตะยาภวฒนา. (2536). ปฏกรยาแอนตเจน-

แอนตบอดในหลอดทดลอง. ภมคมกนวทยา 311. เชยงใหม: มหาวทยาลยเชยงใหม. สาธารณสข, กระทรวง. กองควบคมอาหาร สานกงานคณะกรรมการอาหารและยา. (2553).

พระราชบญญตอาหาร พ.ศ. 2522 พรอมกฎกระทรวงและประกาศสาธารณสข (ฉบบปรบปรง ป 2553). กรงเทพฯ: ผแตง.

สมณฑา วฒนสนธ. (2549). ตาราจลชววทยาทางอาหาร. กรงเทพมหานคร: จามจรโปรดกท. เสาวนย ธรรมสถต. (2538). เทคนคทางพนธวศวกรรมในการตรวจหาจลนทรยในอาหาร

และเครองดม. เอกสารประกอบการประชมเชงปฏบตการ เรอง การตรวจสอบจลนทรยและสารปนเปอนในอาหาร. มหาวทยาลยมหดลรวมกบศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต และกระทรวงวทยาศาสตร เทคโนโลยและสงแวดลอม. สงพมพไมไดจดพมพเผยแพรทวไป.

American Public Health Association (APHA). (1976). Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods. VA: Springfield.

272

Department of Veterinary Disease Biology. (2011). Food Microbiology. [Online]. Available: http://pictures.life.ku.dk/atlas/microatlas/food. [2012, October 31].

Harrigan, W. F. (1998). Laboratory Methods in Food Microbiology (3rd ed.). London, UK: Academic Press.

ICMSF. (2000). Microorganisms in foods: Microbial ecology of food commodities. Maryland, USA: Aspen Publisher.

Interscience. (2009). Spiral® DS+ automatic bacterial plater. [Online]. Available: http://www.upmarketing.co.th/Interscience%20Spiral%20DS+.html. [2011, October 31].

McCarthy, J. (2003). Immunological techniques: ELISA. In T.A. McMeekin, (Ed.), Detecting pathogens in food (pp. 1-18). Cambridge, UK: Woodhead and CRC Press.

The Biofilms Hypertextbook. (2006). Drop plate method for counting biofilm cells - Instructions

for students. [Online]. Available: http://www.cs.montana.edu/webworks/ projects/stevesbook/contents/chapters/chapter011/section008/blue/page002.html. [2011, November 20].

US Food and Drug Administration. (2010). Bacteriological analytical manual: Appendix 2

most probable number from serial dilutions. [Online]. Available: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm109656.htm. [2012, October 31].

_______. (2011). Bacteriological analytical manual: chapter 3 - aerobic plate count. [Online]. Available: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/Laboratory Methods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm063346.htm. [2011, October 31].

University of Florida. (2006). DNA amplification. [Online]. Available: http://www.flmnh.ufl.edu/cowries/amplify.html. [2011, November 20].