ACQUITY UPLC SEC カラム

Waters ACQUITY UPLC® テクノロジーは従来の LC 分離をはるかに超え、ラボの

生産性を大幅に向上します。現在までに報告された 6800以上の ACQUITY UPLC参照文献により、本テクノロジーがバイオ医薬品を含む幅広いアプリケーション

で効果的であることを裏付けています。

Diol 基を結合した、独自のエチレン架橋型ハイブリッド（BEH）パーティクルテクノロジーが実現する ACQUITY UPLC SEC（サイズ排除

クロマトグラフィー）システムソリューションは、タンパク質やペプチドのモノマーをその凝集体から迅速に分離し、正確に定量を

行えるという理由から、大手バイオ医薬品のお客様方に採用されています。

■　従来の粒子径 5μm のカラムを用いた HPLC ベースの SEC 分析に比べて、モノクローナル抗体医薬品の凝集解析にかかる時間を最大

　 1/10まで短縮

■　タンパク質 /ペプチドと充てん剤表面との間のイオン性二次相互作用を低減するため、高塩濃度移動相を使用する必要性を低減

■　タンパク質で QCバッチ試験を行うことでゲルバッチ間性能の一貫性を確実にし、バリデートされたメソッドの信頼性を向上

BEH Technology

1999年、ウォーターズは特許取得済の第一世代ハイブリッド

パーティクルテクノロジー（HPT）を採用した XTerra®カラム

ファミリーを発売しました。HPTにより、XTerraはウォーターズ

の歴史の中で最も成功したカラム製品の 1つとなりました。

HPTは無機（シリカ）と有機（ポリマー）充てん剤の利点を組

み合わせることで、卓越した機械的強度、カラム効率、高 pH耐久性、塩基性化合物のピーク形状をもたらします。

XTerraカラムの第一世代メチルハイブリッドパーティクルは

UPLCテクノロジーのスピード、感度、分離度を十分に実現す

るのに必要な機械的強度やカラム効率をもたないため、耐圧

性の高い新規パーティクルを開発する必要がありました。こう

して開発された第二世代ハイブリッド充てん剤にはエチレン

架橋型ハイブリッド（BEH）構造が採用されています。XTerraカラムの第一世代メチルハイブリッドと比べて、ACQUITY UPLC

BEHカラムの BEHパーティクルはカラム効率、強度、使用 pH範囲が向上しています。さらに、BEHベースの SECパーティク

ルでは、独自の Diol基結合プロセスにより充てん剤表面の

望ましくないチャージを最小限に抑えています。この組み合

わせによって、BEH SECカラムケミストリーは、短時間での卓

越した分離度を実現し、お客様の厳しい規制要求への対応を

支援しています。

BEH パーティクル：UPLCテクノロジーを実現するキーテクノロジーの１つ

Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788

Tetraethoxysilane(TEOS)

Polyethoxysilane(BPEOS)

Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)

+4

S i

E tO

EtO O EtE tO

S i

E tOE tO

EtO

S i

O Et

O Et

O Et

S i

E tO

O

C H2 CH2

CH2CH2

S i O S i

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O

OE t

S i

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S iOO

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O

OO

E t

E t E t n

*Patent No. 6,686,035 B2

2

ACQUITY UPLC SEC システムソリューション

Waters ACQUITY UPLCとそのカラムは、短時間でより多くの情報

を分析者にもたらし、生産性を高めながら、データの品質を向上

させることができる価値のある資産だと証明されています。バイ

オ医薬品やバイオシミラーなどの分析用として、アプリケーション

に最適な UPLC SEC カラム（ポアサイズ 450Å、200Å、125Å）

を選択いただけます。

ACQUITY UPLC BEH450、BEH200、BEH125 SEC, 1.7 μmカラムの校正曲線

ACQUITY UPLC BEH450、BEH200、BEH125 SEC, 1.7μmカラムでのタンパク質 /ペプチドスタンダードの分離

Protein standards; 温度: 30°C; 溶離液: 100mM sodium phosphate, pH=6.8

MW

100

1000

1,000,000

100,000

10,000

Normalized Retention Volume (Vr/VC)

0.4 1.00.80.6

Uracil (112 Da)Allantoin (158 Da)

Angiotensin frag 1-7 (899 Da)

Aprotinin (6.5 kDa)

RNase A (13.7 kDa)Myoglobin (17 kDa)

Ovalbumin (44 kDa)Conalbumin (75 kDa)

Amylglucosidase (97 kDa)IgG (150 kDa)

Thyroglobulin (669 kDa)

Blue Dextran

IgM (900 kDa)

ACQUITY UPLC BEH450 SEC, 2.5 µm: 100K–1500K Daltons

ACQUITY UPLC BEH200 SEC, 1.7 µm: 10K–450K Daltons

ACQUITY UPLC BEH125 SEC, 1.7 µm: 1K–80K Daltons

0.00

0.04

0.08

0.12

0.00

0.05

0.10

0.15

2 3 4 5 6 7 8 min

1

2

3

4 5

6

7

AUAU

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

1

1

2

2

3

3

4 5

5

67

7

Thyroglobulin dimer(Approx. 1.4 million Daltons)

1. Thyroglobulin (670K)2. BSA (66K)3. Ovalbumin (44K)4. Carbonic Anhydrase (29K)

5. Myoglobin (17K) 6. Angiotensin Frag 1–7 (899)7. Uracil (112)

ACQUITY UPLC BEH125 SEC

ACQUITY UPLC BEH200 SEC

ACQUITY UPLC BEH450 SEC注：4と6はBEH450カラムのテストミックスには含まれていません

カラム ACQUITY UPLC BEH125, 1.7 µmACQUITY UPLC BEH200 1.7 µm

ACQUITY UPLC BEH450, 2.5 µm

カラムサイズ 4.6 x 150 mm

移動相 100 mM Sodium Phosphate Buffer, pH 6.8

弱洗浄溶媒 100% Milli-Q® Water

強洗浄溶媒 100% Milli-Q Water

シール洗浄 90/10 water/methanol

サンプル： 移動相に希釈

Thyroglobulin 0.3 mg/mLBSA 0.3 mg/mL

Ovalbumin 0.3 mg/mLCarbonic Anhydrase 0.3 mg/mL

Myoglobin 0.3 mg/mLAngiotensin Frag. 1–7 0.1 mg/mL

Uracil 0.1 mg/mL

Thyroglobulin 3 mg/mLBSA 5 mg/mL

Ovalbumin 3 mg/mLMyoglobin 2 mg/mLUracil 0.1 mg/mL

注入量 2 µL, Full Loop

流速 0.3 mL/min

カラム温度 Ambient

検出波長 UV @ 220 nm UV @ 280 nm

化合物：

※各分析とも試料として同じスタンダードを使用

3

インシュリンおよびモノクローナル抗体の ACQUITY UPLC SEC 分析SEC は、活性のあるタンパク質やペプチドのモノマーから望ましくない凝集体を分離するためのメソッドとして USP/EPで承認されている

確立された分析法です。下図に示すように Waters UPLC SEC分離では、分析時間と移動の相消費量を低減しながら、分離の改善が可能です。

これらの特性によって、国際的な医薬品規制当局により要求される一貫性を持った製品のいち早い上市をサポートします。

塩基性タンパク質リゾチームの SEC分析における溶離液のイオン強度の影響、100％シリカと BEH SECパーティクルとの比較

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 min14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 min10

Lysozyme, 10 mM

インシュリンキャラクタリゼーションにおける UPLC SECと従来の HPLC SECとの比較

バイオ医薬品キャラクタリゼーションにおける UPLC SECと従来の HPLC SECとの比較

Traditional 100% Silica-based/Diol coated, 4.6 x 300 mm, 4 μm SEC columnMobile phase Ionic Strength

10 mM 25 mM 100 mM

ACQUITY UPLC BEH200, 4.6 x 150mm, 1.7 µm SEC column

2次効果が著しく低減

流速:　　0.3 mL/min 溶離液: 10, 25 or 100 mM 　　　　 sodium phosphate, pH 6.8

高塩濃度の移動相を使用する必要性が低減通常のシリカベース SECカラムでは、シリカ表面と塩基性タンパク質との間の二次効果によってピークテーリングなどの問題が起こる

事があります。従来、シリカ充てん剤表面のチャージの影響を抑えるためには高塩濃度の移動相が使用されてきました。ACQUITY UPLC

BEH SEC パーティクルは、独自の表面ケミストリーにより二次効果が著しく低減するため、塩濃度の低い移動相による分析が可能になり、

結果としてカラムやシステムへの負荷が低減します。

10 2 3 4 5 6 7 8 9 min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 min

カラム： Waters Insulin HMW P SEC, 7.8 x 300 mm, 10 µm製品番号： WAT201549サンプル： Insulin, human recombinant (Sigma I-2643) (4 mg/mL)注入量： 100 µL溶離液： L-arginine (1 gm/liter)/acetic acid/acetonitrile (65/15/20, v/v/v)流速： 0.5 mL/min (isocratic)検出： UV @ 276 nm

カラム： Waters BEH125 SEC, 4.6 x 300 mm, 1.7 µm製品番号： 186006506サンプル： Insulin, human recombinant (Sigma I-2643) (4 mg/mL)注入量： 5 µL溶離液： L-arginine (1 gm/liter)/acetic acid/acetonitrile (65/15/20, v/v/v)流速： 0.4 mL/min (isocratic)検出： UV @ 276 nm

カラム： Traditional 100% silica-based/ Diol coated, 7.8 x 300 mm SEC, 5 μm製品番号： Humanized IgG monoclonal antibody, 3 mg/mL in eluent HPLC システム： Waters Model 2796 HPLC with Model 2487 Dual λ Absorbance detector 溶離液： 25 mM sodium phosphate, pH 6.8 with 0.15 M sodium chloride 流速： 0.4 mL/min 注入量： 20 µL 検出： UV @ 280 nm

カラム： ACQUITY UPLC BEH200 SEC, 4.6 x 300 mm, 1.7 µm製品番号： 186005226 サンプル： Humanized IgG monoclonal antibody, 3 mg/mL in eluent UPLC システム： Waters ACQUITY UPLC with Tunable UV detector 溶離液： 25 mM sodium phosphate, pH 6.8 with 0.15 M sodium chloride 流速： 0.4 mL/min 注入量： 5 µL 検出： UV @ 280 nm

2.26% Aggregate

2.24% Aggregate

HPLC 100% Silica-DiolSEC 250Å,

7.8 x 300 mm, 5 µm

ACQUITY UPLCBEH200 SEC,

4.6 x 300 mm,1.7 µm

2 4 6 8 10 min 5 10 15 20 25 30 min

0.000

0.005

0.010

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0.035AU

0.040

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0.055

0.060

0.065

0.070

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2.26% Aggregate

2.24% Aggregate

HPLC 100% Silica-DiolSEC 250Å,

7.8 x 300 mm, 5 µm

ACQUITY UPLCBEH200 SEC,

4.6 x 300 mm,1.7 µm

2 4 6 8 10 min 5 10 15 20 25 30 min

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0.065

0.070

オーダーインフォメーション

分析種 pI MW1. Thyroglobulin, 3 mg/mL (Sigma P/N T1001) 4.6 669,000

2. IgG, 2 mg/mL 6.7 150,000

3. BSA, 5 mg/mL (Sigma P/N A8022) 4.6 66,400

4. Myoglobin, 2 mg/mL (Sigma P/N M1882) 6.8, 7.2 17,000

5. Uracil, 0.1 mg/mL (Sigma P/N U0750) N/A 112

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 min

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 min

0 1

1

1

1

2

2

2

3

3

3

4

4

4

5

5

5

2 3 4 5 6 7 8 9 10 Min.

Batch “A”

Batch “B”

Batch “C”

結果の信頼性を実現する厳しい製造品質保証

全ての ACQUITY UPLCカラムケミストリーは最新の ISO認定製造

施設で高品質の原材料から製造され、合成プロセス全体に渡って

幅広く QC 試験が行われています。さらに、ACQUITY UPLC BEH

SEC カラムの各バッチは、適切なタンパク質あるいはペプチド

標準品を使用した QC 試験により比類のないバッチ間の一貫性

を確保しており、分析結果の高い信頼性を約束します。

Waters ISO2001製造および試験プロセスによりACQUITY UPLC BEH200 SEC, 1.7μmカラムの卓越したバッチ間再現性が確保されます。同じアプローチがBEH125およびBEH450 SECの一貫した性能確認のために用いられています。

注：サイズ排除クロマトグラフィーでは既存ACQUITY UPLCシステムに変更が必要な可能性があります。具体的な推奨事項につきましては”Size Exclusion and Ion-Exchange Chromatography of Proteins using the ACQUITY UPLC System”(715002147 Rev A) または” Size Exclusion and Ion-Exchange Chromatography of Proteins using the ACQUITY UPLC H-Class System”(715002909 Rev A)をご参照ください。

製品名 粒子径 カラムサイズ 製品番号

ACQUITY UPLC BEH125 SEC column

1.7 μm 4.6 x 150 mm 186006505

ACQUITY UPLC BEH125 SEC column

1.7 μm 4.6 x 300 mm 186006506

ACQUITY UPLC BEH125 SEC guard column kit

1.7 μm 4.6 x 30 mm 186006504

ACQUITY UPLC BEH200 SEC column

1.7 μm 4.6 x 150 mm 186005225

ACQUITY UPLC BEH200 SEC column

1.7 μm 4.6 x 300 mm 186005226

ACQUITY UPLC BEH200 SEC guard column kit

1.7 μm 4.6 x 30 mm 186005793

ACQUITY UPLC BEH450 SEC column

2.5 μm 4.6 x 150 mm 176002996

ACQUITY UPLC BEH450 SEC column

2.5 μm 4.6 x 300 mm 176002997

ACQUITY UPLC BEH450 SEC guard column kit

2.5 μm 4.6 x 30 mm 186006850

ELSD outlet tubing (0.004” id x 6” length) 430001562

0.005 x 1.75” SEC UPLC Connection Tubing, 2/pk 186006613

BEH125 SEC Protein Standard Mix 186006519

BEH200 SEC Protein Standard Mix 186006518

BEH450 SEC Protein Standard Mix 186006842

Waters、ACQUITY UPLC、UPLC および XTerra は Waters Corporation の登録商標です。The Science of What’s Possible は Waters Corporation の商標です。Milli-Q は Millipore Corporation の登録商標です。

©2012 Waters Corporation. Printed in Japan. 2012年11月 720003398JA　PDF

日本ウォーターズ株式会社　www.waters.com東京本社 140-0001 東京都品川区北品川1-3-12 第 5小池ビル　TEL 03-3471-7191 FAX 03-3471-7118大阪支社 532-0011 大阪市淀川区西中島5-14-10 サムティ新大阪フロントビル11F TEL 06-6304-8888 FAX 06-6300-1734ショールーム 東京　大阪テクニカルセンター　 東京　大阪　名古屋　福岡　札幌

適用規格：JISQ9001:2008(ISO9001:2008)登録番号：JMAQA-331 登録日：1999年05月31日審査登録範囲：理科学機器（液体クロマトグラフ・質量分析装置・データ管理システム等）の輸入・販売から保守業務までのトータルサポート及び保守プランの設計・開発

このISO9001認証登録ロゴは、Waters Corporationのものです。