实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
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实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
主讲:肖贵榜
实验目的:
掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的一般原理和方法。
熟悉血清蛋白组分定量方法,并确定血清中清蛋白与球蛋白的比值。
实验实验试剂:试剂:1 、巴比妥 - 巴比妥钠缓冲液 (pH=8.6,离子强度 0.075):称取 2.768g巴比妥和 15.458g巴比妥
钠 , 置于大烧杯中,加蒸馏水约 600ml,稍加 热溶解,冷却后用蒸馏水定溶至 1000ml。置 4 ℃ 保存,备用。2 、氨基黑 10B:氨基黑 10B 0.5克 , 甲醇 50ml,冰乙酸 10ml ,蒸馏水 40ml 。
3 、漂洗液:取无水乙醇 45ml,冰乙酸 5ml和蒸馏 水 50ml,混匀置塞试剂瓶内贮存。3 、 0.4N氢氧化钠:称取氢氧化钠 16.0g,蒸馏水 加至 1000ml
氨基黑 10B
• 氨基黑 10B , 苯胺蓝黑,酸性黑 1, 萘酚蓝黑,酸性黑 10B , Acid Black 1
实验器材:实验器材:
1. 电泳仪:为电泳提供直流电源。2. 电泳槽:为电泳提供场所。多用有机玻璃制成,电极用铂丝。3. 血清加样器 :可用盖玻片或 X 胶片或微量加样器。4. 醋酸纤维素薄膜: 2cm×8cm5. 其它: 培养皿(直径 9-10cm)、滤纸、玻璃板、镊子等。
DYY-5 型稳压稳流电泳仪
DYY-Ⅲ型电泳槽
一、电泳的原理
•电泳:带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。
实验原理:
•以蛋白质为例:
Pr
COO-
NH2
Pr
COO-
NH3+
Pr
COOH
NH3+
pH>pI pH=pI pH<pI
H + H +
OH - OH -
蛋白质兼性离子 蛋白质阳离子蛋白质阴离子(等电点)
人血清中几种主要蛋白组分血清蛋白质
等电点 分子量 占总蛋白的%
清蛋白
4.64 69,000 57 ~ 72
α1 -球蛋白
5.06 200,000 2 ~ 5
α2 -球蛋白
5.06 300,000 4 ~ 9
β -球蛋白
5.12 90,000 ~ 150,000
6.5 ~ 12
γ -球蛋白
6.85 ~ 7.3 156,000 ~ 950,000 12 ~ 20
缓冲液 pH=8.6 pI < pH
血清蛋白带负电荷 , 在电场中向正极移动。
醋酸纤维素薄膜电泳 它是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电
泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成,具有均一的泡沫样的结构,厚度仅 120mm 。
优点:强渗透性,对分子移动阻力很弱,简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰和没有吸附现象。
•电泳速度 : 带电粒子在电场中运动时,单位电场强度内粒子运动的速度,以 u 表示,即 V Q
u= =X 6πrη
V— 粒子运动的速度 X— 电场强度Q— 粒子所带电荷 r— 粒子的半径η— 介质的粘度
影响电泳速度的主要因素
1. 样品本身 :
分子带电量: Q 越多, u 越大; 分子大小 : 分子小, r 越小, u 越大; 分子形状: 形状越小,与支持物介质摩擦 越小, u 越大。
球形分子 > 纤维状分子
2. 缓冲溶液: A.pH值: (pH-pI)越大, Q 越多, u越大B. 离子强度 (I) :
离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力,也就是全部的离子效应,它取决于离子电荷的总数,而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高,带电质点的泳动速度越慢;离子强度越低,质点泳动的速度越快。
选择离子强度时要两者兼顾,一般离子强度的选择范围在 0.02 ~ 0.2 之间。
3. 电场强度 (X):
电场强度:电泳支持物上每厘米的电位降,也称电势梯度。
X 越大, u 越快。支持物越短,
X 越大, u 越快。 电场强度越大或支持物越短,电流将随之增加,产热也增加,影响分离效果。 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置,否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。
依次分为清蛋白、 α1 、 α2 、 β、 γ 球蛋白五个区带
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 5 条区带
二 . 定量操作
• 膜条经过氨基黑 10B染色后显出清晰色带。
• 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。
• 可将各色带剪开,分别溶于碱性溶液中。• 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。
实验步骤:
1 .准备与点样:取两条2.5×8cm 的膜条
充分浸透在巴比妥缓冲
液中
取出膜条 滤纸吸去多余的缓
冲液
无光面距一端 1.5cm处作点样线
点样器下端粘上薄层血
清
垂 直
点 样
点样操作示意图
2 .电泳
放 置膜 条 点样端置于阴极
点样面向下 膜条贴紧滤纸,拉直膜条
平衡 5分钟
通电
电压: 160v
时间: 60 min
关闭电源
电泳装置
3 .染色、脱色
通电完毕
取出膜条
浸于染色液(氨基黑10B )中
3min 取出膜条
依次浸于漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
各5min
直至漂净
滤纸吸干薄膜
预试结果图(供参考)
4 . 定量( 两人的膜条共用 )
取试管 6 支,编号 1~6
试管编号
A α1 α2 β γ 0
0.4mol/LNaOH
4.0ml 4.0ml 4.0ml 4.0ml 4.0ml 4.0ml
蛋白条带
清蛋白 α1 球蛋白 α2 球蛋白 β 球蛋白 γ 球蛋白 无蛋白区
充分振荡、脱净染料
比 色、定 量15min
实验结果:
各样品吸光度值
清蛋白 α1 球蛋白 α2 球蛋白 β球蛋白 γ 球蛋白
A1
A2
A3
A
仪器型号: 吸收波长:
仪器编号:650nm
光密度总和 T = A + α1 + α2 + β+ γ
1 .计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。清蛋白%=( A / ∑T)×100 %
α1 球蛋白%=( α1 / ∑T)×100 %
α2 球蛋白%=( α2 / ∑T)×100 %
β球蛋白%=(β/ ∑T)×100 %γ球蛋白%=( γ/ ∑T)×100 %
2 .计算出清蛋白与球蛋白之比值( A/G )
G=α1 + α2 + β+ γ
血清蛋白电泳结果的临床意义可能相关疾病 清蛋白 α1 球蛋白 α2 球蛋白 β 球蛋白 γ 球蛋白
骨髓瘤 ↑*肾病综合症 ↓ ↑* ↑*肾炎 ↑* ↑肝硬化 ↓ ↑*急性肝坏死 ↓* ↑ ↑ ↑ ↑传染性肝炎 ↓ ↑* ↑*急性感染初期 ↑* ↑* ↑*慢性炎症 / 感染后期 ↑*低球蛋白血症 ↓*
临床上还可用 A/G 比来表示清球蛋白的量的关系: 正常人 A/G = 1.5 ~ 2.5
注意事项:
• 1 、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。• 2 、点样时,应将薄膜表面多余的缓冲液用滤
纸吸去,吸水量以不干不湿为宜。• 3 、点样时,动作要轻、稳,用力不能太大,以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
• 4 、点样后膜条的放置:区分电极正负极,膜条点样端接于负极且点样面向下。
• 5 、点样应点在薄膜的毛面上,点样量要适量,不宜过多或过少。
• 6 、应控制染色时间。时间长,薄膜底色不易脱去;时间太短,着色不易区分,或造成条带染色不均匀。
• 1. 电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端? 根据人血清中各蛋白组分的性质,如何估计它们在 pH8.6的巴比妥-巴比妥钠电泳缓冲液中的相对迁移速度?
• 2. 回顾醋酸纤维素薄膜电泳的原理和优点
思考与练习
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