יוספזון אוהד מעבדתו של ד"ר עאזם חדר 624, בניין שרמן...

יוספזון אוהד

מעבדתו של ד"ר עאזם

, בניין שרמן624חדר

iosefson@post.tau.ac.il

:3תרגול מס'

קינטיקה אנזימטית

E + S ES EP E + P

את מקטלזים שונים מאורגניזמים אנזימים שני הריאקציות לשתי כי צפוי ריאקציה. אותה

המקוטלזות אנזימטית יהיה את התכונה הבאה:

אופטימלי לריאקציה. pHא( אותו ב( אותה טמפרטורה אופטימלית לריאקציה.

.Kmג( אותו ד( אותו קבוע שווי משקל.

.Vmaxה( אותם ערכי

הריאקציה ע"י הקטנת קצבאנזימים יגבירו את אנרגיית האקטיבציה,

של הריאקציה! שיווי המשקל ישפיעו על לאאבל

מאיזה חץ ניתן לחלץ את קבוע קצב המהירות של הריאקציה בהעדר אנזים.

.Aא( .Bב( .Cג( .Dד( .Eה(

מאיזה חץ ניתן לחלץ את קבוע קצב המהירות של הריאקציה בנוכחות אנזים.

.Aא( .Bב( .Cג( .Dד(

ה( כל התשובות אינן נכונות.

††/G RTkTK e

h

איך אנזימים מורידים את אנרגיית האקטיבציה ?

סידור מחדש של קשרים קוולנטיים במהלך הריאקציה האנזימטית. ע"י .1 למשל:

קבוצות פונקציונליות באנזים יכולות להקשר קוולנטית לסובסטרט באופן זמני, ובכך לאקטב אותו •להמשך הריאקציה.

. קבוצות יכולות לעבור זמנית מהסובסטרט אל האנזים לקבלת תוצר ביניים בעל אנרגיה נמוכה יותר•מספקות לסובסטרט האנזים בין אלו אינטראקציות

. יותר נמוכה אנרגיה בעל חלופי ריאקציה מסלול

101044 – – 101077אנזימים יכולים להגביר את קצב הריאקציה פי אנזימים יכולים להגביר את קצב הריאקציה פי

ע"י הקטנת אנרגיית האקטיבציהע"י הקטנת אנרגיית האקטיבציה

. בעזרת אנרגיית הקישור בין האנזים לסובסטרט.2

אנרגית הקישור, שמקורה אינטראקציות לא קוולנטיות, ספציפיות, בין הסובסטרט לקבוצות פונקציונאליות של האנזים, מהווה את המקור העיקרי לאנרגיה החופשית המשמשת את האנזים להורדת אנרגיית

האקטיבציה של הריאקציה.

האינטראקציה האופטימלית בין האנזים לסובסטרטמתרחשת רק במצב המעבר.

התיאוריה של מיכאליס-מנטןהתיאוריה של מיכאליס-מנטן

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

k-2

:הנחות המודל

בתחילת הריאקציה כמות התוצר זניחה(.) זניח V0 k-2היות ונמדדת המהירות ההתחלתית 1.

כמות הסובסטרט שקשור [S[>>]E]היות והמדידות נערכות בתנאים התחלתיים בהם 2.לאנזים זניחה ביחס לריכוז הסובסטרט הכללי.

הוא השלב האיטי )מגביל את קצב הריאקציה( הוא שלב קובע P ו-E ל-ESפירוק הקומפלקס 3.]V0 = k2]ES המהירות

)מהירות יצירת הקומפלקס ES של הקומפלקס (steady state kinetics)הנחת המצב העמיד 4.(. אינו משתנהESריכוז שווה למהירות פירוקו

Init

ial

0

קבוע !!![E]עבור

SKm

SVV

max0

kkk

Km

1

21

משוואת מיכאליס-מנטןמשוואת מיכאליס-מנטן

SKm

SVV

max0

[ קטן ...[ קטן ...SSכאשר ]כאשר ]

קיימת תלות לינארית בין ריכוז הסובסטרט קיימת תלות לינארית בין ריכוז הסובסטרט למהירות ההתחלתית של הריאקציה.למהירות ההתחלתית של הריאקציה.

KM: אנזים עם משמעות ביולוגיתגבוה יחסית לריכוזים

לא ,הפיזיולוגיים של הסובסטרט ,יהיה בדרך כלל רווי בסובסטרט

והפעילות הקטליטית שלו תשתנה בהתאם לשינוי בריכוז

הסובסטרט. קצב הופעת התוצר יהיה תלוי בזמינות של

הסובסטרט בתא.

SKm

SVV

max0

[ גדול ...[ גדול ...SSוכאשר ]וכאשר ]

VV00 = V = Vmaxmax

KM: אנזים עם משמעות ביולוגיתנמוך יחסית לריכוזים

,הפיזיולוגיים של הסובסטרט ,יהיה בדרך כלל רווי בסובסטרט

בקצב ,ויקטלז פחות או יותרקבוע מבלי להתחשב בשינויים

בריכוז הסובסטרט בטווח הפיזיולוגי

Init

ial

0

]VV00=1/2V=1/2Vmaxmax Km = ]S[Km = ]Sכאשר כאשר

KmKmכאשר ריכוז הסובסטרט שווה ל- כאשר ריכוז הסובסטרט שווה ל-

אזי מהירות הריאקציה שווה למחצית המהירות המקסימליתאזי מהירות הריאקציה שווה למחצית המהירות המקסימלית

KmKmמשמעות משמעות

: k-1>>k2 שבו למעט מקרה פרטי

,Kd = Kmרק במקרה זה, שבו

Kmיהווה מדד לאפיניות בין האנזים לסובסטרט

Kd.גדול אפיניות נמוכה

Kd.קטן אפיניות גבוהה

E + S ES E + P

k1

k-1

k2E + S ES E + P

k1

k-1

k2

kk

1

1

kkk

Km

1

21

]k1]E נשאר קבוע ESבהתבסס על הנחת המצב העמיד, על פיו ריכוז הקומפלקס ]S[ = k-1]ES[

K ESd

kk

1

1

ESSE

של אנזים דומה Kmבמקרים רבים

לריכוז התאי של הסובסטרט שלו )עובדה ניסויית(.

כמדד לאפיניות בין האנזים לסובסטרט. אבל ברוב המקרים יש Kmלהתייחס ל :טעות נפוצה רק כריכוז הסובסטרט הדרוש להגיע לחצי מהמהירות המקסימלית. Kmלהתייחס ל-

[ קבוע[ קבועEEעבור ]עבור ]

תצוגה גרפית של תצוגה גרפית של קינטיקה אנזימטיתקינטיקה אנזימטית

VVmaxmax – – המהירות המקסימאלית, בה מתרחשת המהירות המקסימאלית, בה מתרחשתהתגובה בנוכחות אנזיםהתגובה בנוכחות אנזים

KKmm – – -ריכוז הסובסטרט הדרוש כדי להגיע ל- ריכוז הסובסטרט הדרוש כדי להגיע לVVmaxmax/2/2

בריאקצית מיכאליס מנטן החלק המתאר את מהירות הריאקציה הוא:

Aׁ(k1)[Et] - [ES]([S].

B( k-1[ES] + k2[ES].

C( k2[ES].

D( k-1[ES].

E( k1)[Et] - [ES](.

E ל-ESפירוק הקומפלקס הוא השלב האיטי Pו-

)מגביל את קצב הריאקציה( הוא שלב קובע המהירות

V0 = k2]ES[

E S ES E P K1

K-1

K2

. באיזה ריכוז סובסטרט מהירות Km=0.005 Mלאנזים יש ערך הריאקציה ההתחלתית תהיה רבע ממהירות הריאקציה

המכסימלית.

. M 0.00167א( . M 0.0025ב( . M 0.000167ג( . M 0.005ד( . M 0.00125ה(

0 max0.25

0.005m

V V

K M

max0

m

V SV

K S

maxmax0.25

0.005

V SV

S

0.25 0.005

0.00125 0.75

0.001250.001667

0.75

S S

S

S

קבוע ריאקציה כללי המתאר את השלב קובע המהירות ברוויה.

בריאקציית מיכאליס מנטן -

- Turn Over NumberTurn Over Number והוא מוגדר גם כ- 1/זמןהן kcatהיחידות של

מספר מולקולות סובסטרט ההופכות לתוצר ביח' זמן ע"י מולקולת אנזים אחת, כאשר האנזים רווי בסובסטרט.

Specificity ConstantSpecificity Constant היחס( היחס( kkcatcat/k/kmm:):)

הינו מדד ישיר ליעילות האנזים והספציפיות שלו .

מדפייזים S ו-E שנובע מהקצב שבו M-1sec-1 108-109)קיים גבול עליון ליחס זה ) בתמיסה מימית.

בערך זה נדע שהאנזים יעיל עד כדי כך שמה שמגביל אותו זה קצב הדיפוזיה .( catalytic perfection)בלבד

KKcatcat:)הקבוע הקטליטי(: )הקבוע הקטליטי(

1

V0

Km

Vmax

1

[S]= +

1

Vmax

1/S=0

1

V0

=1

Vmax

Slope = Km/Vmax

1/[S]

1/V0

-1/Km

1/Vmax

1/V0=0

Km

Vmax

1

[S]=

1

Vmax

-

Km

1

[S]=

1-

Lineweaver-Burk equationLineweaver-Burk equation maxmax0

111

VSV

Km

V

bXay

עבור ריאקציה אנזימטית הכוללת סובסטרט יחיד S/1 כתלות ב- V/1נקבעו העקומות המייצגות את

. איזה מבין שלושה ריכוזי אנזים שוניםשל התרשימים הבאים נצפה לקבל? )כל צבע מייצג

ריכוז אנזים שונה(

A CB

max 2 TV k E Km הוא קבוע מהותי של .האנזים ואינו תלוי בריכוזו

[S ]mMV0 mmol/min 00132546.587126.2

32שאלה מס' ( של אנזים מסוים בריכוזי V0נמדדו מהירויות יצירת התוצר )

סובסטרט שונים. האם אנזים זה מתנהג לפי מיכאליס-מנטן? אם כן )או לא( איזה הסבר יש לתופעה?

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 2 4 6 8 10 12 14]S[

V0

[S]V0

00

13

25

46.5

87

126.2

' מס 32שאלה

הסובסטרט ריכוז של כפונקציה הריאקציה של התחלתית מהירות

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.21/]S[

1/V0

[ S ]/ 11/V0

10.333333

0.50.2

0.250.153846

0.1250.142857

0.0833330.16129

[S ]MV0 mmol/minV0 mmol/min1 x 10-515082

2x10-52561501x10-46004503x10-47706705x10-4818750

turn over number אנזים מה ה mmol 2 אם נתון שבתערובת הריאקציה יש של האנזים ?

33שאלה מס'

ומאנוז Bאנזים אחד מקטלז את הריאקציה שבה נהפך גלוקוז לתרכובת . נתונה טבלה של ריכוז k+2 <<<< k-1. בשתי הריאקציות Cלתרכובת

, וקבוע Vmax, Km מה תוכל להסיק לגבי V0הסובסטרט כנגדהדיסוסיאציה של שתי התרכובות עם האנזים.

ומכאן K2 גבוה בהרבה מ-K-1בשאלה זו נתון ש- יהווה מדד לאפיניות בין האנזים KMשבמקרה זה,

לסובסטרט

' מס 33שאלה

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006

-0.002

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

-50000 0 50000 100000 150000

1/Vmax = 0.0011;

]Et = [2 mmol

Vmax = 909 mmol/min

T.O.N = 909/2 = 454 min-1

Km1 = 9.9x10-5 M

Km2 = 5x10-5 M

y = 1.1*10-7x + 1.1x10-3

y = 5.6*10-8x + 1.1x10-3

אנזימים אלוסטרייםאנזימים אלוסטריים

חלבון אלוסטרי : חלבון בו קישור של אפקטור או סובסטרט משפיע על תכונות הקישור .”Allos = “other” stereos = “shapeבאותו חלבון.

אנזים אלוסטרי מורכב ברוב המקרים משתי תת יחידות או יותר. • אופייניתעקומה סיגמואידית[ מתקבלת S ל-]V בגרף • הליגנד שניקשר מתנהג כאקטיבטור או כמעכב• יותר טוב.Sגורם לאנזים לקשור את :אקטיבטור אלוסטרי פחות טוב.Sגורם לאנזים לקשור את :מעכב אלוסטרי

+Activator

+Inhibitor

No Activator or Inhibitor

סוגי מעכבים לריאקציות אנזימתיות

חומרים המאיטים או העוצרים לחלוטין ריאקציות אנזימתיות. רבים מחומרים אלו משמשים כתרופות.

מעכב בלתי הפיך1.

מעכב הפיך2.

מעכב הפיך תחרותי

Uncompetitive מעכב הפיך לא תחרותי

Mix מעכב הפיך לא תחרותי Noncompetitive

V0

V0

]I[

]I[

מעכב בלתי הפיך

קישור קוולנטי )נפוץ( או אסוציאציה לא קוולנטית חזקה במיוחד של •המעכב לאנזים הגורמים להרס קבוצה פונקציונלית החיונית

לפעילותו של האנזים.

מהווים כלי חשוב בלימוד מנגנוני ריאקציות )חא' באתר פעיל(.•

•suicide inactivators מעכבים בלתי הפיכים, הפעיל רק לאחר – שנקשרו לאתר הפעיל של אנזים ספציפי תרופות עם מעט

. תופעות לוואי

maxV

'mK

'max

V

'max

V

Km'

max

V

Noncompetitive )Ki=K’i(

mK

מיקרומול של סובסטרטXקשור ל- TLCK מיקרומול שעבר ביקוע בדקה

0 8.10.2 6.20.4 4.30.6 2.40.7 1.40.8 0.49

(I )TLCK: הנו .Xא( מעכב תחרותי של

.Xב( מעכב לא תחרותי של . Xג( מעכב לא הפיך של

ד( כל התשובות לא נכונות(II המשקל המולקולרי של השרשרת הפוליפפטידית של )X:הינו

דלטון.8235א( דלטון.16470ב( דלטון.32940ג( דלטון.25000ד( III -ה )Turnover number של X:הנו

.min-1 9.5 א( .min-1 1950 ב( min-1 9500ג(

ד( כל התשובות לא נכונות.

מ"ג 14. נלקחו דוגמאות שמכילות X מעכב את הפעילות של פרוטאזה TLCK( נמצא שהחומר 34X -וטופלו ב TLCK .)בריכוזים שונים. כמות הסובסטרט שעוברים ביקוע בדקה נמדדה )טבלה

של האנזים. Km מה- 40הניסיון בוצע בריכוז סובסטרט פי * לקרוא בחומר המצורף באתר.

' מס ' שאלה מס 3434שאלה

א.א.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

[I]

Act

ivit

y

0.490.8

1.40.7

2.40.6

4.30.4

6.20.2

8.10

Activity[I]

' מס ' שאלה מס 3434שאלה

ב.ב.

ג.ג.

molgrchainsXEnzyme

molXEnzyme

mol

gr

mol

mg

mol

grWM

n

164701085.0

1014

85.0

14..

85.0

6

3

) )

) )

min1

min

max

5.985.0

1.8..

..

mol

mol

totalcat

NOT

E

VkNOT

בעקומות המוצגות העלאת ריכוז ,לפניכם

המעכב:

VMAXא( תגדיל את

KM / VMAXב( תקטין את

Km / Vmaxג( תגדיל את

KMד( תקטין את

)Enzyme unit )EU or U(Enzyme unit )EU or Uיחידת אנזים – יחידת אנזים –

1EU 1 – כמות האנזים ההופכתµmole.סובסטרט לתוצר בדקה

)Specific activity )SA(Specific activity )SAפעילות ספציפית – פעילות ספציפית –

SA – מספר יחידות האנזים ב – mg.חלבון ( EU/mg protein=Vmax/mg protein)

זהו מדד לניקיון האנזים.•

, בהם כל מולקולות האנזים רוויות בסובסטרט. Vmaxנמדדים בתנאי

דרגת ניקוידרגת ניקוי

פי כמה ניקינו את החלבון מסך תערובת חלבונים.

SA אחרי שלב הניקוי חלקי SA.לפני שלב הניקוי של האנזים

YieldYield% ניצולת - % ניצולת -

מספר יחידות האנזים בתערובת החלבונים לעומת מספר יחידות האנזים בסוף תהליך הניקוי.

%yield = 100 X )EUafter/EUbefore(

Turn over number )T.O.N or TN( KTurn over number )T.O.N or TN( Kcatcat

מקסימום מספר מולקולות סובסטרט שהופכות לתוצר ע"י אנזים אחד ביחידת זמן.

Kcat = Vmax/]E[T

TN = µmole substrat/min=Vmax=Vmaxµmole enzyme n m/MW

1/TN

משך מחזור קטליטי

. בטבלה רשומים שלבי הבידוד, נפח E( בידך מצויה רקמה שממנה עליך לבודד אנזים 44הפרקציה שבה התגלתה פעילות האנזים, פעילות הפרקציה וריכוז החלבון בה. השלם את

העמודות החסרות:

Degree of purification

YieldSpecificActivity U/mg

ActivityU/ml

Proteinmg/ml

Volume )ml)

Preparation

1002.5200Crude extract

2001.2580(NH4)2SO4

precipitate

500120Anion exchange chromatography

150015Cation exchange

20000.33Gel filtration

50000.51Crystallization 250 25% 10,000

400 100%

10040

2.5 umg

16080%4

50050%12.5

1 µg )47 של אנזים נקי (Mw 92, 000 ) מקטלז ריאקציה

בתנאים אופטימליים. µmol.min-1 0.5בקצב של חשב:

א( פעילות ספיציפית ביחידות אנזים למ"ג חלבון.. turnoverב( מספר ה-

protein

....

mg

uEAS

E.uE.u.. הינה כמות האנזים שהופכת – הינה כמות האנזים שהופכת – µmolµmol11 .סובסטרט לתוצר בדקה. סובסטרט לתוצר בדקה

..5.0

5.0 ?

1 ..1

min

min

uE

uE

mol

mol

מכיוון שמדובר על אנזים נקי -מכיוון שמדובר על אנזים נקי -

.. 500101

5.0

protein

....

3AS

mg

uEAS

mgg 31011

4747שאלה מס' שאלה מס'

ב.ב.