蛋白样本制备与 western blot
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蛋白样本制备与 Western Blot
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主要内容
蛋白样本制备的目的1
蛋白样本制备总体原则和策略2
案例分析—细胞总蛋白的提取3
成功的 Western Blot6
蛋白提取产品选择指南4
蛋白定量方法的选择5
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一 蛋白样本制备 --- 成功蛋白分析的基础
蛋白样本
蛋白样本
activity assays
protein microarrays
SDS-PAGE /IEF
immunoblotting mass spectrometry
2-DE2-DE
EMSA
ELISA
蛋白样本制备的目的 : 后续应用
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二 蛋白样本制备的原则
蛋白样本制备原则
方法应具备标准化，具有重现性 、可靠性、简便性；
尽量抽提完全；
应使所有蛋白全部处于溶解状态
防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性
防止在抽提过程中发生化学修饰
如做 2D 则需去除高丰度蛋白或无关蛋白
必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
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二 蛋白样本制备的策略
制备蛋白的目的活性分析
免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀
1D 2D EMSA CHIP 等实验材料
细胞 组织 固定组织或石蜡包埋组织 微生物 酵母 植物 提取RNA 后的剩余的蛋白
样本等
目的蛋白的结性质与分布
分布于胞桨 / 胞核 /膜 可溶 / 不可溶
含量多少 分子量大小 四级结构特征 磷
酸化等修饰……
方法的选择 1 自行配制抽提试剂 ,根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒 ,
按其说明书的方法提取
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三 案例分析 -- 细胞中总蛋白的制备
高速离心收集高速离心收集上清即得全蛋上清即得全蛋白样本白样本
细胞加入裂解细胞加入裂解液冰上放置液冰上放置10-1510-15 分钟分钟
蛋白定量和蛋白定量和SDS-PAGESDS-PAGE检测检测
裂解样品 离心收集 定量检测
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细胞裂解液 -RIPA Buffer 的配方分析及技术要点
表面活性剂缓冲液
蛋白酶抑制剂
磷酸酶抑制剂
其它： H2O 、 NaCl 、等
还原剂
RIPA Buffer
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细胞裂解液 -RIPA Buffer 的配方分析及技术要点
缓冲液Tris-HCl （ pH7.5), 提供 pH 环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。
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细胞裂解液 -RIPA Buffer 的配方分析及技术要点
表面活表面活性剂性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）分为离子型（如 SDS 、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如 NP-40 、 Triton-100 、 tween 系列等）。
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各类表面活性剂特点
1 阴离子型 : SDS 脱氧胆酸盐
2 阳离子型 : CPB 和 CTAB
3 双性离子型 : CHAPS Zwittergent 系列
4 非离子型 : Brij 系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等
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选用表面活性剂考虑的因素
参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂
选用表面活性剂考虑的因素
选用表面活性剂考虑的因素
工作条件下表面活性剂的溶解性
使用分子生物学级的表面活性剂 , 无核酸酶蛋白酶等
根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类
考虑表面活性剂的去除方法
表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量
保护蛋白活性时 , 不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度
尽量使用毒性较低的表面活性剂
因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离
使用非表面活性剂 NDSB 结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析 ,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解 , 而另一种表面活性剂取代进行蛋白的后续分析
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去除未结合的表面活性剂
1疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption
2
透析法 Dialysis
3
凝胶层析法 Gel
Chromatography
4
离子交换层析Ion-exchange
Chromatography
根椐表面活性剂的疏水性 ,CMC, 凝聚数目 , 和电荷等性质来去除 .
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细胞裂解液 -RIPA Buffer 的配方分析及技术要点
蛋白酶抑制剂
抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入
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蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒
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细胞裂解液 -RIPA Buffer 的配方分析及技术要点
磷酸酶抑制剂
抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入。
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磷酸酶抑制剂选择
磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸 / 苏氨酸磷酸酶（例如：PP1, PP2A, PP2B ） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如： PTP ）。
常规的抑制剂主要包括： 试剂名称 抑制作用氟化钠 酸性磷酸酶，丝氨酸 / 苏氨酸磷酸酶正钒酸钠 碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠 丝氨酸 - 苏氨酸磷酸
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细胞裂解液 -RIPA Buffer 的配方分析及技术要点
还原剂还原剂防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。 DTT 、 β－巯基乙醇等。 .
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细胞裂解液 -RIPA Buffer 的配方分析及技术要点
其它其它水；溶剂NaCl ：
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全蛋白抽提时注意事项
可以适量加入甘油 , 稳定蛋白
注意事项
可以适量加入Benzonase /DNase I 等核酸酶 , 去除 DNA,充分提取蛋白 ,降低提取的粘度 .
抑制蛋白酶及磷酸酶
使用的Detergent 的种类 纯度 浓度 干扰 去除等因素
Temperature 试剂和器皿冰上预冷 , 低温 4℃操作
细胞或组织的样本量
裂解液的用量
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细胞裂解液 -RIPA Buffer 的配方分析及技术要点
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四 蛋白样本制备产品选择指南
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核蛋白样本制备
抽提原理抽提原理低渗裂解细胞膜低渗裂解细胞膜 ,, 释放出胞浆蛋白释放出胞浆蛋白与胞核与胞核 ;;离心分离出胞核离心分离出胞核 ;;高渗破裂胞核高渗破裂胞核 ,, 释放出可溶性核蛋释放出可溶性核蛋白白 ;;加核酸酶降解加核酸酶降解 DNA,DNA, 释放出释放出 DNADNA结合蛋白结合蛋白 (( 组蛋白和转录因子组蛋白和转录因子 ))
实验注意事项实验注意事项试剂和器皿冰上预冷试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量裂解液的用量细胞总量细胞总量抑制蛋白酶抑制蛋白酶
蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂
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膜蛋白样本制备
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膜蛋白的抽提
方法及原理 方法多 直接抽提法 分级抽提法 1: 先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞 , 再用表面活性剂抽提 2: 按溶解性分级抽提 3: 按亚细胞分级抽提
产物 细胞膜蛋白 细胞器质膜蛋白
注意事项 根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同 , 选择不同的产品或表面活性剂变
性剂等 . 抑制蛋白酶 . 样本量
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膜蛋白的直接提取
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蛋白的分级提取
按蛋白溶解度不同进行分级抽提 , 降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的 pellet用裂解液溶解 ,提取高疏水性蛋白 (膜蛋白 )；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11% （ W/W）。
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亚细胞分级抽提
用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。
根椐胞浆 / 胞膜 / 胞核 /骨架蛋白的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解
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四种亚细胞组分分离提取的结果
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线粒体蛋白样本制备
首先用密度梯度离心方法分别分离出线粒体 , 胞质 , 胞核 .
再用线粒体抽提 Buffer 溶解线粒体蛋白 .
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其它蛋白抽提产品
高丰度蛋白去除试剂盒信号蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒
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五 蛋白定量产品选择指南
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BCA 法蛋白定量
BCA （ bicinchoninic acid ）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将 Cu2+ 还原为 Cu+ ， Cu+ 与BCA 试剂形成紫色的络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS ， Triton X-100 ， Tween 不影响检测结果，但螯合剂（ EDTA ， EGTA ）、还原剂（ DTT ，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用 Bradford 法测定蛋白浓度。
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Bradford 法蛋白定量
考马斯亮兰 G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（ lmax ），由 465nm 变为595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、 Triton X-100 、十二烷基硫酸钠（ SDS ）干扰此法的测定。
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Lowery 法蛋白定量
Lowry 法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
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六 成功的 Western Blot
Diagram
通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的 Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至 1 ～ 5ng（最低可到 10 － 100pg ）中等大小的靶蛋白
原理
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六 成功的 Western Blot
二抗孵育
蛋白提取与定量
一抗孵育封闭
转膜
SDS- 聚丙烯酰胺电泳蛋白变性
显影
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蛋白变性
Tris-cl(PH 6.8) Tris-cl(PH 6.8) SDS SDS
Glycerol Glycerol Bromphend-blue Bromphend-blue
β-β- 巯基乙醇 巯基乙醇 DTTDTT
高温变性高温变性 ,, 形成形成蛋白质 -SDS 胶束
加入Sample buffer 沸水浴 5min
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SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳
产物：三维网状结构凝胶
加速剂
催化剂
单体
交联剂
缓冲液缓冲液Tris-ClTris-Cl
四甲基乙二胺（ TEMED）
丙烯酰胺（ Acr）
过硫酸胺或核黄素（ AP ） 甲叉双丙烯酰胺（ Bis ）
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SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳
作用 缓冲液 PH 凝胶浓度浓缩胶 使蛋白样品浓缩 PH6.8Tris-
Cl低， 2-5%
分离胶 使蛋白样品分离 PH8.8Tris-Cl
高，根据蛋白大小
电泳缓冲液： PH8.3Tris-甘氨酸 -SDS系统。
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SDS- 聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围
不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
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聚丙烯酰胺分离胶配方
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SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳
灌制分离胶 隔绝空气灌好后一般室温放置 30 － 40 分钟
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SDS- 聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方
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SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳
灌制积层胶 插入梳子
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SDS-PAGE 胶制备注意事项
过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在 4 度放置 2 － 3天。配制 30％丙烯酰胺储存液要过滤。
配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。
要根据温度调整 TEMED 的使用量。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。插梳子的时候要用力均匀，一次成型。在上样前可 20V恒压预电泳 20 分钟，可去除泳道中的杂质。
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上样及电泳
提前将样品沸水浴 5 分钟， 12000 －14000rpm 离心 5 分钟。
根据自己的设计上样。80V恒压跑浓缩胶。看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为 100V 。当溴酚蓝跑至离胶的下面还有 0.4 －
0.6mm 时停止电泳。
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转膜
蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。
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转膜
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转膜注意事项
PVDF 膜要预先用甲醇活化； NC 膜要预先泡水，除去中间的气泡。然后在转膜也中平衡 20 分钟。
膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上。
转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。 根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。
分子量（ kd ）
转膜条件
<20 200mA恒流 1小时20-100 200mA恒流 2小时100-200 200mA恒流 6小时或 30V恒压过
夜>200 同上，可在转膜液中加 0.1 ％ SDS
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膜的封闭
为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理 , 一般用 5％的脱脂奶粉或者 3％的 BSA室温或 37 度封闭 2小时。
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转好蛋白的膜
Protein Protein
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封闭
Protein ProteinBlocking Agent Blocking AgentBlocking Agent
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一抗孵育
Protein ProteinBlocking Agent Blocking AgentBlocking Agent
Primary Antibody
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二抗孵育
Protein ProteinBlocking Agent Blocking AgentBlocking Agent
EE
EE
Primary Antibody
Secondary Antibody
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显影
Protein ProteinBlocking Agent Blocking AgentBlocking Agent
EE
EE
Primary Antibody
SecondaryAntibody － Enzyme (E)
ss
ss s P
P
PP Substrate
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显色方法 --- HRP 酶促底物直接显色
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显色方法—化学发光
SuperSignal® West Pico化学发光底物
SuperSignal® West Femto 超灵敏型底物
SuperSignal® West Femto 增强型底物
主要优点与 ECL™ 系统相比减半
的价格、双倍的信号
适用于 HRP 检测的最灵敏的化学发光底物
延长的信号持续时间使这种底物用于今天的成像设备最为理想
检测下限 10-12g 10-15g 10-14g
信号持续时间 6-8 小时 8 小时 24 小时
首选检测方法 X 胶片 成像设备或 X 胶片 成像设备或 X 胶片建议一抗稀释度 1:1000-1:5000 1:5,000-1:100,000 1:1000-1:50,000
建议二抗稀释度 1:20,000-1:100,000 1:100,000-1:500,000 1:50,000-1:250,000
产品保存期 室温 1年 4 1℃ 年或室温 6个月 室温 1年
建议印迹膜 硝化纤维 硝化纤维或 PVDF 硝化纤维或 PVDF
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成功的要素
1 质优量足的蛋白样本2 科学的对照3 正确的抗体选择 保存和使用4 细致的实验操作5 步步监测
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科学的对照
蛋白 Marker ：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪
阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性 / 特别是一抗的质量和效率
阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用于检验抗体的特异性
二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性
内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB 实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照
空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
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蛋白 Marker
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WB 常用内参及其技术参数
antibody [AC-15] (ab6276) at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per laneLane 1 : HeLa nuclearLane 2 : HeLa whole cell lysateLane 3 : A431 cell lysateLane 4 : Jurkat cell lysateLane 5 : HEK293 cell lysate.
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正确的抗体选择 保存和使用
一抗的选择 : 1 、 样本的种属
2 、 适用于 WB 实验方法 3 、 单克隆抗体 经亲和纯化的多克隆抗体 二抗的选择 与一抗种属匹配 HRP 标记的
重链＋轻链 全长的、 Fab段的以及 Fc段的 抗体的保存和使用：
1 、按说明书的要求分装保存； 避免反复冻融
2 、工作液现配现用， 4 度不超过 2周 3 、说明书推荐的稀释倍数作参考，
提前一个月预订
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实验细节
电泳 : 变性与还原
SDS 的质量
胶的浓度
上样量
转膜 : 湿式 半干式
蛋白大小与电转液 SDS 和甲醇的比例
膜的种类 PVDF NC 尼龙膜
膜的预处理 :尺寸同胶 充分浸透
杜绝气泡 防止干燥
封闭 脱脂奶粉与 BSA 的选择 以 TBST 配制
封闭液需过滤 封闭 4 1℃ 小时
封闭与洗膜时间
按抗体说明书提示使用的特殊的封闭剂
一抗孵育
抗体释释液 (TBST 或封闭液 ) 及稀释倍数 ,
尽量采用低浓度抗体和较长的孵育时间 ( 过夜 )
孵育温度 :4 ,℃ 轻摇
二抗孵育
抗体释释液 (TBST) 及稀释倍数
室温 1-2 小时 ,轻摇
标记 HPR
底物压片曝光
ECL 试剂盒
压片时间
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步步监测
蛋白样本 定量和 SDS-PAGE 考马斯蓝染色SDS-PAGE 电泳 凝胶铜染监测转膜 丽春红染色监测一抗 阳性对照 阴性对照二抗 二抗对照封闭与洗膜 内参对照 空白对照半定量 内参对照压片 底物直接显色实验体系 内参与阳性对照
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问题分析 1
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问问题题分分析析22
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问题分析 3
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问题分析 4
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