8章 细菌的遗传分析 - wuhan university

第8章 细菌的遗传分析

1.细菌的细胞和基因组2.大肠杆菌的突变型及其筛选3.细菌的接合与染色体作图4.中断杂交与重组作图5.F′因子与性导6.细菌的转化与转导作图7.细菌同源重组的机制8.大肠杆菌的遗传图谱与物理图谱

8.1 细菌的细胞和基因组

8.1.1 细菌的细胞细菌: 细菌（bacteria）如大肠杆菌（Escherchia coli）

古生菌（Archaea）如詹氏甲烷球菌

（Methanococcus jannasch）多种形态存在：球菌（ cocci ）

杆菌（bacilli ）螺旋菌（ sprilla）等

大小： 随种类不同而异

杆菌一般长1～ 5㎛，宽0.5～ 1 ㎛；

球菌以直径大小表示，一般为0.5～ 1 ㎛；

螺旋菌一般长为1～ 50 ㎛ ，直径为0.5～ 1 ㎛

细菌结构简单：其基本结构，包括细胞壁、细胞膜、拟核、

核糖体、细胞质及内含物；

特殊结构 如荚膜和鞭毛

世代时间短，20分钟一代，

容易得到生化突变型。

单细胞，遗传物质

环状核酸分子——基因带/线（genophore）也可称染色体。

单细胞→菌落（clone）/菌株（strain）野生型菌株

原养型 prototroph 营养缺陷型 auxotroph细菌与细菌之间可有遗传物质的交换

细菌染色体不凝缩，没有着丝粒，也没

有纺锤体结构。

细菌繁殖：双链环形DNA分子随着细胞

伸长而采取二分分裂（ binary fission）的方式分开。

8.1.2 细菌的基因组

细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链，没有组蛋白和其他蛋白

质结合，也不形成核小体结构。位于细胞内一个称为“拟核”（ nucleoid）的区域中。这种结构有利于外源DNA的插入。细菌的染色体长度为250～ 35 000μm 不等。细菌的基因组结构如表8-1所示。

（1）拟核结构

电镜观察：拟核结构最显著的特征是其DNA被包裹压缩成一个个有序的

环状结构域(loop domain)

大肠杆菌基因组长4.7×106 bp，在松弛状况：1 300 μm长，是其细

胞长度的1 000倍，必须压缩最少1 000倍后才能装入细胞中。

对拟核成分分析表明:DNA占80％，其余为RNA和蛋白质

大肠杆菌拟核中约有100个结构域，每个相当于40 kb，各个结构域具

有相对的独立性。拟核的结构域是超螺旋结构,是DNA三级结构的一种形

式。

如果用DNA酶处理大肠杆菌拟核，各结构域DNA链将会断裂，超螺

旋结构受到破坏，变为松弛型结构。拟核的中央部分为支架蛋白和RNA。

若用RNA酶处理，拟核中DNA的折叠结构即不能保持，说明RNA和支架

蛋白是保持拟核结构的重要因素

（2）E.coli基因组概况

E.coli的染色体为闭合双链环状DNA，长约1333um.1997年测定完成E.coli K-12 MG1655菌株全基因组:

4,639，221（约4.7×106 ）bp其中： 87.8％编码蛋白质

0.8％编码稳定性RNA0.7%无编码功能的重复序列

11％属调节序列和具有其它功能

在编码蛋白质序列：总共编码4288种已知和未知的蛋白质

（可读框），其中约38％功能不明。

在K-12 MG1655菌株中:

基因的平均长度为950bp

基因之间的平均间隔约为118bp

但是菌株之间可能会有很大的差别

2005年报道了第二个菌株E. coli K-12 W3110基因组的完

整序列。比较K-12 MG1655菌株和K-12 W3110菌株，发现两

者基因组大小并不是一致的。

K-12 W3110基因组大小为4，646，332bp 基因总数为4464个

K-12 W3110 与 K-12 MG1655两者的基因数相差176个

8.2 大肠杆菌的突变型及其筛选

8.2.1 大肠杆菌的突变类型（1）合成代谢功能突变型（anabolic functional mutants）

即：营养缺陷型

野生型品系(能在基本培养基上生长)

营养缺陷型(不能进行某个特定的生化反

应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现) 。营养缺陷型多是条件致死突变（ condition lethalmutation）

，只有通过在基本培养基中添加所需的有机成分才能存活。

（2）分解代谢功能的突变型

在大肠杆菌细胞中一系列降解功能的实现也需要许多有关

基因的表达，例如野生型大肠杆菌能将多糖类转化成葡萄糖或

其他简单糖类，也能将复杂分子，如氨基酸或脂肪酸降解为乙

酸或三羧酸循环的中间物。这些降解功能称为分解代谢功能（

catabolic function）。其中任何一个基因的突变都会影响降解功

能的实现，因此这类突变型称为分解代谢功能的突变型（

catabolic functional mutants）。

如Lac－突变型不能分解乳糖，因此就不能生长在以乳糖为

唯一碳源的基本培养基中，而野生型Lac＋ 细菌都能利用乳糖。

Lac－ 表型可能是因为lac Z＋或lac Y＋ 基因发生突变，分别产生

了基因型为lac Z－ 或lac Y－的突变型菌株。这种菌株显然是条

件致死突变型。

（3）抗性突变型（resistant mutants）细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗生素产生抗

性（resistant），这类突变型统称为抗性突变型（resistant mutants）。 对噬菌体的抗性突变往往是细菌以某种方式改

变其膜蛋白，从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细

菌上的能力降低。而对抗生素产生抗性的突变则是一个严重

的公害问题，而且细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。

如对链霉素抗性突变的细菌是由于核糖体的30S亚基的

S12蛋白变异，链霉素能和野生型细菌（敏感型）的S12结合

，使翻译过程发生差错或者使翻译过程的启动作用失效。而

抗链霉素突变型的S12不再和链霉素结合，因此抗性突变细

菌可以在链霉素存在的情况下，进行正常的翻译作用和正常

的分裂繁殖。

8.2.2 细菌的培养与突变型筛选

影印培养法

细菌中，大肠杆菌（E.coli）

是最为广泛的遗传学实验材料

细菌的遗传重组可以通过三种途径来实现：

（1）接合（conjugation）：通过供体与受体之间的

接触而传递DNA（2）转化（transformation）：是指游离的细菌DNA

片段被吸收到不同的细菌细胞内（受体）。

（3）转导（transduction）：是指一种细菌的DNA片

段经过温和的或经有缺陷的噬菌体传递

给另一种细菌。

8.3 细菌的接合与染色体作图

细菌接合是经细菌细胞直接的接触，把一个细胞（

供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体），从而实现

遗传重组的一种途径。（图8－3）接合能传递大段的DNA

，在细菌的遗传重组中是效率最高的。

（1）细菌经典的杂交实验

细菌的杂交最初是在E.coli中发现的

1946年 Lederberg & Tatum 利用 E.coli K12 strain

杂交实验 首次证明E.coli的有性生殖和基因重组。

8.3.1 细菌接合现象的发现

菌株A： met- bio- thr+ Len+ tai+

甲硫氨酸 生、苏、 亮、 硫胺

菌株B： met+ bio+ thr- Len- thi-

将A和B混合培养在完全培养基上过夜→

离心 →倒上清（完全培养基）→水洗沉淀

下来的细胞→涂布在基本培养基上

（108 cells/皿）

结果：基本培养基上大约107个亲体细胞就会出

现一个 met+ bio+ thr+ Len+ thi+ 原养型菌落。而分

别培养在基本培养基上的，未经混合的两个亲体品系

作为对照没有产生原养型菌落。

这说明原养型菌落的产生，一定是A菌株的

thr+ Len+ thi+和B菌株 met+ bio+的基因接合在它的

基因组里了。

1×10－7是一个很低的数值，从一千万个细胞中

挑出去一个，在果蝇等遗传实验材料中很难做到这一

点。

问题：

1.这种与亲代不同的能在基本培养基上生长的细菌不一定是基

因型的改变，可能是培养上的互补，即一些物质从一个品系

的细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞所吸收呢？

2.还有另一种可能，是基因型的改变，但不一定是由于两个

品系间的杂交，而是一个品系的DNA片段逸出细胞后，携带

着相应的基因（如met+ bio+）进入另一个品系的细胞，因

为这种转化作用而产生了上述的营养型？

以上问题的解答：

1950年 Davis： U型管实验，有力地

支持了细菌菌株杂交的判断。他用一个U

型管，在底部用一块过滤器隔开，把管分

隔为相等的两臂。滤器的孔很小，细菌不

能通过，只有象DNA这样0.1微米的游离分

子、培养液和营养物质可以通过。

U型管两臂中分别为营养缺陷型品系A和B，使它们繁殖到饱和状态，同时在

U型管的一端交替地吸（suctoin）和压（pressure），使两臂中的培养液充分混

合，但细菌的两个品系的细胞却不会接触。在U型管中培养一些时间后，再从两

端分别取细菌进行培养，没有发现一个细菌能在基本培养基上生长。

结论：要有原养型细胞的形成，两个菌株间的直接接触是必不可少的。

（Requirement for physical contact）

这个解释的实质是：在两个亲本细菌之间，就象真核细

胞的有性过程一样，发生了杂交和遗传物质的交换，产生了

基因重组体。用基因符号图解表示：Strain A met- bio- thr+ Leu+ thi+ met+ bio+ thr+ Leu+ thi+

Strain B met+ bio+ thr- Leu- thi- met- bio- thr- Leu- thi-

(recombinants) ?

Lederberg和Tatum根据实验作解释，认为上述原养型是

两个亲本品系基因的重组体。在E.coli中基因重组经一系列步骤

进行：

（1）细胞融合；

（2）亲本细胞的遗传物质经过融合形成二倍体合子；

（3）遗传物质发生交换的合子经过减数分裂产生了

带有重组基因的子代细菌。

（2）（E.coli）遗传物质的单方向（one-way）转移

上述的解释似乎比较正确，但其中有一点却被Hayes的一个意外发现所否定。Lederbery和Tatum认为两个亲本

细菌在基因重组过程中起着同等作用－E.coli的性系统是

同宗配合（homothallic）。

Hayes则证明：E.coli遗传物质的传递方式与具有典

型减数分裂的生物不同。

即：两个亲本类型对后代的遗传贡献并不相等

有些亲本基因的组合会在后代出现，有一些则不会出现，

而且所有后代中出现的基因都是连锁的，因此，E.coli的有

性过程应该是异宗配合的（heterothallic）。

Hayes做了一个杂交实验，用的品系与

Lederbery和Tatum用的相似，即：

品系A： met- thr+ Leu+ thi+品系B： met+ thr- Leu- thi-

在杂交前，将品系A用高剂量的链霉素处理（链霉素并不立即

杀死它们，只是阻碍细胞的分裂）

① Streptomycin 处理 A × B基本培养基 （MM）

原养型重组体

② 对照 A × B ③ A × streptomycin处理BMM MM

原养型重组体 无原养型重组体产生处理

Hayes 认为：

E.coli遗传物质的重组不是交互进行的，而是一种单向

转移的结果，其中品系A作为遗传物质的供体（Donor），

品系B则是遗传物质的受体（Recepter）。当两个亲本细

胞接触后，供体品系A的遗传物质进入受体品系B的细胞中

，紧接着A和B品系遗传重组现象就在受体品系B的细胞中

发生。

供体品系相当于雄性，受体品系则相当于雌性。

1953年， Hayes获得证据:E.coli的遗传交换仅 供体细胞→受体细胞。

提出在E.coli两个品系间遗传物质的转移是通过一个Sexfactor F (a fertility factor，致育因子) 因子介导实行的。

供 体 细胞有F因子 → F＋

受体细胞缺乏F因子 → F－

现在已经证实F因子是一种质粒（plasmid），是能够自

我复制的环状DNA分子，作用象一个微型染色体（mini –chromosome），包含约接近100个基因

8.3.2 F因子及其转移

(1) F因子的重要性质：

① F因子能够复制它的DNA，使它能够保持在正在分裂

的细胞群体中（a）② 携带F因子的细胞产生伞毛（pili）——微小的蛋白

质表面管（minuteness proteinaceous tubules），使

F＋细胞能与其他细胞吸附，并且保持它们的接触（b）。

③ F＋细胞能够转移新合成的环状F基因组拷贝到受体细胞

（F-）中去（C）。注意一个拷贝的F因子仍留在供体细

胞中。一旦一个供细胞转移一个拷贝的F因子到F－细胞

中，受体细胞也变为F＋细胞，因为这时受体细胞也包含

了一个环状的F因子基因组。 F＋ × F－ →F＋

④ F＋细胞通常阻止与另一个F＋细胞接触，并且通常不转移F基因组到F＋细胞。

⑤ 偶尔，F因子将自己整合进宿主细菌染色体上（a）。出现这

种情况后，F因子也能与它自己的DNA一起转移宿主染色体基

因（标记）到受体细胞（图b）

图二

⑥ 偶尔，整合的F也能离开细菌染色体回到细胞质中，少数

情况下，脱离染色体时，可以携带下寄主的少数基因，形成

环状的F。这种含有细菌染色体基因的F因子叫做F’（F prime

）因子，带有lac基因的F’叫做F’(lac)。 8.2

要把F＋细菌变为F－ 即 F＋细菌→ F－细菌，最有效的方法

是用吖黄素（acriflavine）处理。调节吖黄素的浓度，使该浓

度不妨碍细菌的增殖，但可选择性地阻碍F因子的复制，这含有

吖黄素的培养液中培养F＋细菌，所有的细菌都成为F－。

(2) 高频重组（high frequency of recombination,Hfr）在E.coli F因子整合进细菌染色体的雄性细胞，当F因子促进与

雌性细胞（F－）接合时，雄性细菌的基因以高频率地转移到雌性细

胞中，叫高频重组。

带有一个整合的F因子的细胞叫做高频重组细胞(8.2)/(8.3)

Cavalli (1951年)和Hayes (1954年)先后从能育的A品系中分离

出了两个新的品系，它们和菌株B（F－）杂交时，出现的重组体频

率很高，通常比AF＋ × BF－杂交组合高出一千倍，这个新菌株叫

做Hfr菌株。

已知在F＋ × F－杂交中，几乎所有F－细菌变为F＋，

而在Hfr × F－杂交中，尽管出现高频重组，但F－细菌很少转

变为F＋细菌的。这个问题使遗传学家感到迷惑不解。

8.3.3 细菌重组的特点

由于在接合期间，Hfr细胞和F-细胞之间的接合管常会自

发断裂，进入的Hfr染色体也随之断裂，通常很少有整条Hfr染色体转入F-细胞的。

Hfr F+的染色体进入F－的细胞中，接着就发生基因的交

换。在真核细胞中，交换是在两个交配亲本的整套基因组间

进行的，但原核生物的交换却不一样，由于接合交配过程全

中断，所以受体细胞往往只得到供体细胞基因的一部分，得

到全部基因组是很偶然而极个别的。

这种含有一个亲本全部基因组和另一个亲本一部分基因

组的合子叫做部分合子

（merozygote）或

部分二倍体（partial diploid）

部分合子或部分二倍体

完整的基因组称作F－内基因子（endogenote）不完整的基因组称作供体外基因子（exogenote）

在部分二倍体间发生单交换是不能成活的（即无用的），

因为环断裂后，只能产生不平衡的部分二倍体线性染色体（

DNA复制无法进行）。

F－染色体与部分Hfr染色体间发生偶数的交换，才能

产生有活性的重组子和线形片段。线形片段是部分基因组，

大都在以后的细胞分裂中丢失。所以在细菌的重组中，有

两个特点：

（1）只有偶数交换才能产生平衡的重组子

（2）相反的重组子（reciprocal recombinant）不出现，所以在选择培养基上只出现一种重组子。

（图8-7）

Hfr thr+ Leu+ azir tonr Lac+ gal+ strs

×

F- thr- Leu- azis tons Lac- gal- strr

azi:叠氮化钠 ton:噬菌体T1 str:链霉素

Lac:乳糖 gal:半乳糖

(图8.4)x

8.4.1 中断杂交实验原理

Wollman 和Jacob想了解Hfr品系在杂交时，什么时候把它

的基因转入F－细胞，进行了一些实验，其中中断杂交实验

（Interrupted-mating experiment）对E.coli的遗传研究作出

了重大的突破。

8.4 中断杂交与重组作图

两种菌株→混合通气培养(Hfr细菌与F－细菌开始接触)→

形成接受管→(每隔一定时间)取样

→(菌液在搅拌器内)搅拌(断开接合管,使配对的细菌分开 )→稀释菌液(防止再度配对) → 涂布在含有链霉素，但不

含有苏氨酸和亮氨酸的培养基上，只有thr+和Leu+的Hfr菌和带strr的F－菌的重组子可以生长。重组子thr+ Leu+ strr

的菌落影印培养在若干不同的选择培养基（selective media）上，分析Hfr染色体上其它非选择性标记基因进入

F－细菌的顺序和所需时间（分钟）绘制出连锁图。(图8.5)

中断杂交实验的基本步骤是：

①接合 采用Hfr菌株为Strs，F-菌株为Strr，接合在完全培养基上进行，

培养基以葡萄糖为碳源，不加链霉素、叠氮化钠和噬菌体T1。②中断接合 在接合处理后的不同时间搅拌和提取样品，从而获得不同

接合时间（min）的细菌样品。

③杀死Hfr 将不同接合时间的细菌样品稀释后接种在含有链霉素的完全

培养基上进行选择，结果对链霉素敏感的Hfr菌株被杀死，只有F-细菌存活

④检查F-细菌所含供体基因 将获得不同接合时间的F-细菌样品都分别

接种在含叠氮化钠，含噬菌体T1，含乳糖而无葡萄糖，含半乳糖而无葡萄

糖的培养基上，结果如图8.4和表8-2所示。

⑤ 作图 根据各基因出现时间先后的顺序将它排列在染色体上，并标明

出现的时间，而各基因出现时间的差数就是它们之间的距离，这种图距是

以时间（min）为单位的，有别于真核生物遗传作图时以厘摩（cM）为单

位［图8-8（c）］。

这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和

时间绘制连锁图的技术，称为中断杂交技术

（Interrupted mating technique）。

营养缺陷型突变基因在杂交试验中有选择

重组型排除亲代型的作用，所以称为被选择的

标记基因。

8.4.2 中断杂交作图

以上的中断杂交实验结果表明，在接合开始后，Hfr的不

同非选择标记可与F-细胞的染色体在不同时间形成重组子（

表8-2）。thr+最先进入F-细胞，接合8 min就出现了重组子，

接着leu+出现，azir 在9 min时出现，最后出现的是gal +基因。

在被选择的thr+leu+strr 的重组子中，其他的供体基因按一定

时间顺序依次地转入F-细胞中去，随着时间的推移，具有某

一基因的菌落逐渐增加，达到一定频率后就不再变动，而且

愈早转入的基因，它所达到的频率也愈高。

结果发现Hfr的未选择性标记基因进入F－所需时间：

分种 转移的Hfr基因

＜9 09 azir11 azir tonr

18 azir tonr Lac+

25 azir tonr Lac+ gal+

图8.4-1

从图8-8中还可以看到，从Hfr菌株的基因在F－细

菌中出现开始，随着时间的推移，具有这一基因的菌落

逐渐增加，直到某一百分数为止；基因出现的时间愈早，

它所达到百分数也愈高。（图8 -8)

例：azir 基因出现最早，24分钟时达到90％的F－菌落

gal+基因出现最迟，60分钟取样，仅30％的菌落属于能

利用型。

这说明上述四个基因在混合后24分钟内，以一定的

顺序和时间间隔，先后从Hfr F＋进入F－的细菌中去。因

为基因位于染色体上，因此，这也就是说：染色体从称为

原点（origin）或O一端开始，以线性方式进入F－细胞中，

基因离开原点越远，进入F－细胞越迟。

根据中断杂交技术，用杂交后Hfr基因最初在受体细菌中出现的时

间作为指标，可以作连锁图。这里距离的单位是分钟，如ton在azi开始

进入F－细胞后2分钟进入，那么azi和ton相隔2单位。

如果让Hfr F+ × F－杂交继续进行，长达二小时，然后使之中断，发

现某些F－受体转变为Hfr F+，这说明Hfr F＋的全部基因已转移完毕，排

在最后的F因子最后转移到受体，使它成为供体，但效率很低，是线性染

色体的最后一个单位，我们可得下图：

（1）大肠杆菌的染色体呈环形

Wollman和Jocob用不同的Hfr菌株进行中断杂交试验，都可

作成连锁图，可是基因转移的顺序、转移起点和转移方向都很不

相同：

Hfr H O thr pro lac pur gal his gly thi F1 O thr thi gly his gal pur lac pro F2 O pro thr thi gly his gal pur lac F3 O pur lac pro thr thi gly his gal F

AB312 O thi thr pro lac pur gal his gly F粗看，都不相同；细看，有规可循：任一行中任何一对相邻

的基因在其他各行中也是邻的，例如：his基因总是一边为gal，另一边为gly。其他基因也是如此。

每个Hfr菌系的

基因排列顺序都是相

同的，所不同的是O

点的位置都有改变，

基因转移的方向不

尽相同，致育因子

（F）最后转移。

根据上述分析和致育因子是最后转移的，推断致

育因子一定在O点的相对一端。

Allan campbell提出一个惊人的假设：

在F＋雄性细胞里，F是一个小的细胞质因子（在接

合后能够方便地转到F－细胞里）。如果F＋雄性细胞的

染色体是一个环状的染色体，因而在恰当的位置和合适

的方向，F因子插入进环状的染色体上都可以产生任何

线性的Hfr染色体。

接着从该假设中得到并证实几个结论：

① F因子的插入方向将决定Hfr染色体的极性

②插入F因子的一端将是origin （原点），从原点Hfr染色体的转

移开始；在F因子的另一端为终止点（terminus）可能并不被转移，

除非整个染色体都被转移。因为在所有的基因被转移之前染色体经

常断裂，并且因为F因子的未端常与育性有关，这样仅一小部分的

受体细胞将被转变成雄性细胞（F+）。

（2）F因子插入染色体的过程

F因子是怎样整合（integrate）或插入（incorports 掺入）染

色体而使F＋细菌转化成Hfr F+的呢？

F因子也是环状的，由三个不同的区域组成：

①原点（基因O），它是染色体转移的起始点

②致育性基因（Fertility Genes）可使F－细胞转化为F＋

③配对区（pairing region），它的核苷酸顺序中有一段或多段

与细菌染色体DNA的某些区段（IS等）是对应的，因此，通过

交换，可以把F质粒整合到染色体上，从而使F＋转变为Hfr F+。

( 8.3-1 )

8.6

即： 在环状的细菌染色体和环状的F因子之间的一个

单交换，可以形成一个较大的环，这种交换的基础是同源重

组，因为F因子含有IS区域，并集中在一起。E.coli染色体上

也多数有IS存在。

(8.3)

所以前述各Hfr菌株染色体的原点和转移方向的不同，可

以认为是F因子整合到细菌染色的不同IS部位的结果。F因子是

质粒（plasmid）的一种，所谓质粒是指染色体外遗传因素，它

可以自律地复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中。

(8.6)

F质粒可以有两种存在状态：

一种是作为游离的细胞质因子，它的复制和细

胞染色体的复制是彼此独立而又相互协调的，它能

单独地从F＋转入F－细胞中，并使F－变成F＋；另一

方面可以整合到染色体上成为染色体的一个部分而

进行复制和传递，这样的质粒特称为附加体（

episomes）

8.4.3 重组作图

在中断杂交试验中，根据基因转移的先后次序，以时间

为单位求出各基因间的距离－－时间单位法（time-unitmethod）；如果两基因间转移的时间（单位）短，接近两分

钟，那么用中断杂交技术得的基因间距离就不很精确可靠。

这时可用传统的重组作用法（recombination mapping）

例如：根据中断杂交试验（时间单位法），已知lac和ade

这两个基因是紧密连锁的，现在问二者间距离为多少？我们

又知道某些Hfr品系在杂交时，ade基因是最后进入F－细胞。

以下杂交：

Hfr Lac+ ade+ strs × F- Lac- ade- strr

重组子 ade+ strr

在含有链霉素的基本培养基上，Hfr细菌被

杀死 ，因其为strs。

未杂交的F－ Lac－ ade－ strr也死亡，因为

是腺嘌呤缺陷型。

所以选出来的重组子都是ade+ strr 。

因为ade+ 是在Lac+之后进F－细胞，所以我们选出

的F－ ade+ strr，一定是由同时得到Lac+ 和ade+ 的部

分二倍体起源的

Lac＋ ade＋ 外基因子

Lac－ ade－ 内基因子

如果重组体的基因型是F－ Lac+ ade+ ，说明 Lac+ 和ade+ 二基

因间（Lac-ade）没有发生交换。

Lac＋ ade＋

strs

Hfr chromosom Lac- ade-

strr

Lac＋ ade＋ F－ chromosome

strr F－ chromosome①重组子同时含有供体标记基因Lac+,基因型是Lac+ ade+

如果重组体基因型是Lac- ade+，说明这两个基因间发生了交换

Lac＋ ade＋ strs Hfr

Lac- ade- strr

Lac- ade＋ F－

strr F－

②重组子只含有ade＋ ，基因型是Lac- ade+

重组值计算

%20100100)()(

=×=×+

=−+

+−

+++−

+−

adedaelac

adelacadelacadelacadelac

所以，它们的重组率，也可代表基因间的距离：

1、选择在腺甘酸（ade）缺乏的培养基上生长的类型。它们表明ade基因已转入细胞。

2、选出的lac-ade+类型即是重组子，因为ade+已进入，表明lac+也已进入，而lac-ade+表型就是供体受体lac、ade两个基因间发生交换的结果。可用此来计算重组值。

用时间单位法测得这两个基因间的距离是1分钟，用重组

法测得的重组值是20％。用重组率（ RF）所测得的基因间距

离与用中断杂交以时间（ T）为单位的基因间距离基本上是一

致的。两个值的比：RF: T约等于20，即它们之间关系大约是

1 min等于20个图距单位（ cM） 。所以大致上是，1个时间单

位（1分钟）相当于20％重组值。

大肠杆菌染色体全长约100 min，含4× 106 核苷酸对，所

以总图距相当于2 000 cM ，故1 cM ≈ 2 000 bp。这种接合重

组作图在短距离内是有效的。如相距2 min以上的就有可能表

现不连锁。同时这种接合重组不产生交互重组类型，所以用这

种方法得出的图距和减数分裂生物中所确定的图距不同。

8.5 F′因子与性导

8.5.1 F′因子

F+与Hfr两种菌株可以相互转变，即F因子既可以插入到

染色体中去，形成Hfr菌株，又可通过规则的交换和剪接，从

染色体上完整地游离下来形成F+菌株［图8-11（a）］，偶尔

也会出现不规则的环出，形成F因子携带一段相邻的细菌染

色体［图8-11（b）］。这种带有插入细菌基因的环状F因子

是一个复制子，这种新的F因子称为F′因子（F prime factor）

F因子在细菌染色体上插入位置不同而构成不同的Hfr品

系，由此也可形成不同的F′因子。它们各自携带细菌的不同

基因，有的F′因子携带若干个基因的一大段细菌的染色体。

F′与λdgal 或λdbio颗粒不同，F′携带细菌的基因并不减少自身

的基因，如果自身的基因丢失，转移就可能停止（详见下节

）。此外，F′因子也不存在蛋白质外壳包装的问题，其长度

不为包装所限制，可以携带不同长度的细菌DNA片段。F′因

子和F+一样是能感染的，并将F′因子转移给F-细胞，同时也

能转移细菌基因，使F-变成F′菌株，并形成部分二倍体［图

8-11（c）］。

F因子将供体细胞的基因导入受体，形成部分二倍体的过

程叫性导或F－导（sexduction）/（F-duction）（图8-11C）

F因子整合进细菌染色体→[Hfr]→F’→与F－接合→产生部

分二倍体。

F’和λ d颗粒不同，它加进了细菌的基因，并不减少本身的

基因。

F’因子也没有蛋白质外壳包装的问题，所以长度不为包装所

限制。

小结：1、F-, F+, Hfr 和 F′细菌的相互转化

F+ F-

HfrF+ F-

F+ F-

结合

吖黄素

高频重组低频重组

整合

F′

F′

重组频率较低

2、 三种致育因子的相互关系

(1) 有F因子的细菌为F+，无F因子为F-，具有致育因子（F, F′或Hfr）的菌株就

是雄性菌株(male strains) 。

(2) F因子可以整合到细菌染色体上，形成Hfr菌株。不同Hfr菌株F因子的整合

位点不同。

(3) F因子又可以从Hfr染色体上剪切下来，产生F因子。如果剪切不准确而带

有一段细菌染色体，则称为F’因子。

(4) F因子很容易转移到F-细胞中， F+ × F-F+，但是供体染色体的转移频率

很低, 重组频率很低。

(5) Hfr能以高频率把细菌染色体基因转移到F-细菌中，却极少使F-变为F+（因

为F因子位于Hfr染色体的最末端）；

(6) F’因子的性质介于F+和Hfr之间，即可转移自身，又可以转移细菌基因。但

频率较低。

8.6.1 细菌的转化与作图（1）细菌的转化作用

Frederick Griffith in 1928 Oswald Avery in 1944

肺炎双球菌光滑型的DNA→粗糙型转化为光滑型

进行转化的一般步骤：

供体菌 →提取DNA、纯化DNA→小的双链DNA片段

→加到受体细菌的培养液中。

供体的DNA片段被受体细胞所接受，同源区发生

重组最后使受体基因型发生变化。

8.6 细菌的转化与转导作图

转化（transformation)没有噬菌体作介导，由DNA直接转入受

体细胞的过程，称为转化。

环状DNA转化： 整体进入整合。

片段DNA转化： 单链进入整合。

© 2003 John Wiley and Sons Publishers

© 2003 John Wiley and Sons Publishers

在实施以上步骤时：

①一般要对受体细胞进行处理：化学处理或用强电场处理

（electroporation，电穿孔）。

目的:是增加受体细胞膜对供体DNA的可透性。

②制备感受态细胞（competent recipient cell）：能吸取

DNA分子而被转化的细菌细胞叫做感受态细胞。在某一细菌群

体中，只有极少数细胞是感受态的，它们具有感受因子

（comptence factor），可能是细胞表面的一种蛋白质或是一

种转化酶（translocase），它参与DNA的吸收。

转化过程包括几个连续的阶段：

①双链DNA分子和细胞表面感受位点可逆性的结合。

②供体DNA片段被吸入受体细胞，并要防止受体DNA酶的破坏。

③侵入受体细胞的供体双链DNA转变成单链形式，其中一条链被

膜结合的外切核酸酶降解。

④未被降解的一条链部分或整个地与受体DNA链进行交换重组，

形成杂合的DNA分子（heteroduplex DNA）。

⑤杂合DNA经复制、分离以后，形成一个受体亲代类型的DNA和

一个供体与受体DNA结合的杂种双链DNA，从而导致基因重组

形成各种类型的转化子（transformant）( 图8.8 )

（2）细菌的转化作图

在转化过程中，DNA小片段→受体

相距很远的二个基因很难同时存在于一个DNA片段中

，若两个基因的二个片段同时进入受体，一般不能同时进

行转化的。按照概率定律，两个片段同时转化的概率是它

们的单独转化的概率的乘积，这种概率是很低的。

两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同

一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体里——共转

化（cotransformation），共转化的基因一般是连锁的。

（8.10）

解：a+基因与b+基因共转化的频率用整个a+转化子数目

以及a+和b+转化子数目的值来计算。

公式：

a+ b+共转化子数307，a+转化子有两种类a+b+（307）和a+b(215)总数是522。

a b+类型与所提问题不相关，因为对于a+来说它们不是转化子，

所以a+和b+共转化的频率是：307/522 × 100％＝58.8%

× 100％

①共转化频率的计算

例： 在一个转化实验中，用a+b+品系的供体DNA，转化基因型

ab的受体品系，得到的转化类型和数目：

a+ b+ 307a+ b 215a b+ 278

转化子的总数是800，（用a+作为选择）问b位点与a位点共转化的频率是多少？

tantstransformaaofnumbertotalmatantscotransforbaofnumber

+

++

② 用共转化确定基因顺序

例如：如果基因p和q常常一起传递到受体，这样两个基

因可能是相对地紧密连锁，同样基因q和基因o也经常一起传

递到受体细胞。这两个基因也是彼此连锁的。

为了确定基因顺序，我们现在需要关于基因p和o的信息

。理论上有两种可能的顺序：p-o-q和p-q-o。若顺序是p-o-q，这样p和O必将共转化,因为它们比P和q靠得更紧密，反过

来若顺序是P－q－O，这样P和O将很少或根本不发生共转化

，因为它们离得相对较远。结果表明没有P和O的共转化，说

明基因顺序肯定是P－q－O。 ( 8.9 )

③基因顺序和图距的计算

例： 用枯草杆菌（Bacullus subtilis）的一个菌株trp2+ his2

+ tyr1+

作供体，提取DNA，向受体trp2- his2

- tyr1-菌株进行了转化，得到

转化子类型如表8-3所示：

问基因间的重组值如何？三个基因的次序如何？

(返回52)

解：在转化体中数目最多的是三个座位同时被转化的类别，这

说明trp2、his2和tyr1三个座位在染色体上靠得很近，需要强调

的是在计算trp2_his2之间的重组值时，trp2

- his2-座位看成没有

机会和带有这两个基因的供体DNA片段相遇的细胞，计算时不

能考虑（按同样道理相反的－－重组子都不能计算在内，即相

反的重组子不存在）。

则：

亲本型＋重组型））和（重组型（ +−−+

−=

22 histrpRF

%3419905/6785)10726004183660118011940(

)10726004183600(

==+++++

+++=

RFtrp2－tyr1 ＝(3660＋685＋2600＋1180) / (11940+3660+685+2600+107+1180)

＝8125 / (12047＋8125) ＝8125/ 20172＝40 % ( p50)

RFhis2－tyr1 ＝ (685+418+107+1180)/ (11940＋3660＋685＋418＋107＋1180)

＝2390/ 17990＝13 % ( p50)

计算表明，三个基因的次序是trp2 his2 tyr1

转化时细菌染色体的重组和接合时的重组一样，相反的重组

体不存在，只有双交换和偶数的多交换才有效。

8.6.2 细菌的转导与作图

（1）细菌转导的发现为了研究病毒的遗传特性，Hershey和Chase采用同位素分别标记DNA和

蛋白质，用电子显微镜跟踪观察，证明噬菌体不仅可吸附在E.coli细胞壁上

，还可注入DNA。

为了验证在沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中是否也存在类似于

大肠杆菌中的接合现象，J.Lederberg和N.Zinder进行了下列杂交试验：

LT22 phe-trp-tyr-his+× LT2 phe+trp+tyr+his-结果：在基本培养基上以10-5频率出现野生型菌株。这似乎和E.coli

中的接合重组情况相似，但是当他们将两个亲本菌株分别置于“Ｕ”型管的两臂时，出乎意外地在LT22的一臂也出现了野生型细菌。显然这种重组是不同于E.coli中接合重组的，因为这种Ｕ型管的中间是用孔径小于0.1 μm的烧结玻璃滤板隔开的，只能允许DNA等大分子以及病毒通过，细菌细胞是不能通过的，所以这两种细菌不能直接接触。

进一步实验证明在两个菌株之间传递遗传物质的因子是

沙门氏菌中的一种温和噬菌体P22，因为①滤板孔径允许某

种过滤因子（filterable agent）通过，而这种因子的大小和质

量与P22相同。②免疫学试验证实这种因子可以被P22抗血清

灭活。③如用LT2的菌株P22抗性品系来代替敏感的LT2，那

么在“Ｕ”型管两端都不出现野生型重组体。④进一步研究

也证明LT22是携带了P22原噬菌体的溶源性细菌，LT2是对

P22敏感的非溶源性细菌。在培养过程中，少数LT22细菌自

溶释放出游离的P22，而这种游离的P22感染并裂解LT2细菌

，在裂解过程中，宿主LT2环状染色体被裂解成小片段，某

些片段在P22噬菌体组装时，偶尔装入头部，形成转导噬菌

体（transducing phage）。

（2）普遍性转导与作图

转导就是以病毒作为载体把遗传信息从一个细菌细胞传到另一个细菌细胞。

转导可分为:普遍性转导（generalized transduction）局限性转导（specialized transduction）

① 烈性噬菌体的感染周期（Lytic Life cycle of a virulent phase）裂性噬菌体（virulent phage）是使宿主菌发生裂解的噬菌体，

它在侵染细菌时，先吸附到菌体表面的特异受体上，由噬菌体所产生酶的作用下，在细菌细胞壁上形成一个微孔，把它的头部中

所含的核酸－遗传物质－注入到细菌内（8.11），噬菌体核酸所带

的遗传信息把宿主的生物合成装置按管过来，停止合成细菌成分，

使细菌的合成装置转为合成更多的噬菌成分，最后细菌细胞裂解

（Lysis），释放出很多子代的噬菌体。(8.12)

温和噬菌体（Temperate phage），如象λ、φ80等，

感染（infect）一个细菌后

可以经过裂解途径或溶源途径（Lysogenic cycle）。

在裂解周期与裂性噬菌体相似。

而在溶源周期中，噬菌体DNA不是单独复制，而是插入寄

主染色体的特定区域，随寄主染色体一道复制。

整合在寄主染色体中噬菌体叫做原噬菌体(prophages），

它一旦遇到物理因子或化学因子的处理可以使其诱导裂解过程的

发生。 图8.13

② 温和噬菌体的感染周期

③ 普遍性转导

在噬菌体的裂解周期接近完成时，病毒DNA被包进

蛋白质外壳。那么转导噬菌体是如何形成的呢？

1965年，K.Ikeda和J.Tomizawa对E.coli的温和噬菌体

P1的一些实验研究阐明了转导噬菌体是如何形成的。他们

发现当一个非溶源性的细菌细胞（供体）被P1裂解时，细

菌的染色体DNA断裂成一些片段，接着在细菌细胞中合成

了噬菌体的外壳蛋白。当复制的噬菌体DNA被包装到蛋白

质外壳时，偶然地也会把纯粹是细菌的DNA片段包装到一

个噬菌体外壳中，形成所谓转导颗粒（transducingparticle）/转导病毒 图8.14

转导病毒（Transduccing phages），其产生的频率非常

低（10－5～10－7）。由于噬菌体外壳蛋白决定噬菌体附着细

胞表面的能力，因此，这种噬菌体颗粒仍然具有侵染性。它感

染细菌细胞，并将其内含物－细菌的DNA片断注入其中。进

入的DNA片段可以和寄主细胞DNA发生重组，形成遗传结构

发生重组的细菌细胞－转导体（transductant）

转导的细菌DNA片段长度大约为一个病毒基因组的大小，

细菌染色体比病毒的染色体大得多，细菌染色体断裂后形成非

常多的片段，到底在转导过程中，被包进病毒外壳蛋白的中是

那个片断，完成是随机的，所以称作普遍性（一般性）转导

④ 共转导频率的计算——确定基因之间的次序和距离

普遍性转导和转化很相似。两个基因同在一起转导就是共

转导（cotranduction）。共转导的频率愈高，表明两个基因

在染色体上的距离愈近，连锁愈密切;相反，如果两个基因的

共转导很低，说明其距离较远，因此，测定两基因的共转导

频率就可以确定基因之间的次序和距离。

A . 两因子转导（two-factor tranduction）计算方法与共转化计算方法类似

B. 三因子转导（three-factor tranduction）

例如 供体的基因型为a+ b+ c+，受体的基因型a－b－c－，在一个

三因子转导杂交实验中，将产生各种不同的转导体。由于两个基

因（a+ b+或b+ c+）共同进入一个转导颗粒的机率和它们之间的距

离成反比。即二基因距离愈近就愈可能被包装到同一个转导子中

并共同转移到同一个受体细胞中，形成一个共转导子a+b+。

The formula for cotransduction frequency for a+ and b+ is：

%100tan

tan ×+

++

tstransducaofnumbertotaltscconeransdubaofnumber

％总转导子数

单个转导子数 100×=abRF

%100×+

=+++

++

bababaRFab

%100×+

=+++

++

baabbaRF ab

当我们选择标记为a+时，公式为：

当我们选择标记为b+时，公式为：

例：

用E.coli trp A+ supc+ pyr F+供体细胞和trp A- sup C- pyr F-作为受体由P1噬菌体媒介转导进行三因子转导杂交实验 结果：

转导型 数目

1、supC+ trp A+ pyrF+ 362、supC+ trp A+ pyrF- 1143、supC+ trp A- pyrF+ 04、supC+ trp A- pyrF- 453

总计： 603问：它们的基因顺序？共转导频率？

解：上述三个基因在遗传图上的顺序可以从第3种转导型

上立即判断出来，因为它的数目最少（等于0）。

三个基因的次序：supC trpA pyrF (图8－15)supC+和trpA+二基因共转导形成第1和第2两种转导型，

,因此，supC—trpA的共转导频率是：

(36+114) / 603 =0.25同理：supC—pyrF的共转导频率是：36/603＝0.06

三基因在遗传图上顺序和间隔距离是：

supC trpA pyrF

共转导频率愈高说明两基因靠得愈紧，反之则愈远。

⑤ 共转导频率与图距的关系式

1966年，T.T Wu (Harvard University)得到了一

个共转导频率与从接合实验中得到的图距相连系的数学

表达式：

Cotransduction frequency ： x=(1－d/L)3

d= the distance between two genes in minutesL= the size of Chromosomal pieces (in minutes)that the phage carries during transduetion(For P1 transductin,this size is approximately 2% of the

bacterial chromosome,which equals 2 minutes)

)X1(Ld 3−=

问二基因间的距离为多少？

解 ：依公式有:

（L=2, p1 phage包装 E.coli染色

体片段的长度在大小上是相等的

，约＝2(minutes））min5.0

25.02/2/175.0

)2/1(42.0)2/1(42.0

3

3

==

−=−=−=

dd

ddd

例：用E.coli arg+ met+ strs供体细胞和arg- met- strr

作受体细胞，由P1噬菌体介导进行转导实验，结果：

3)/1( Ldx −=

（3）局限性转导与作图

由温和噬菌体进行的转导叫做局限性转导。该噬菌体

DNA当整合进细菌染色体中时，都占有一个特定的位置。所

以只转移细菌染色体的特定部分。

例： λ phage。λ 总是通过 attP与E.coli attλ 同源区配对，整

合进大肠杆菌染色体上（K12菌株）。该attλ 附着点一边是gal+，另一边是bio+基因。当在紫外光诱导下，可产生裂解途径，λ 染

色体从寄主染色体上切离下来时，由于少数不规则的交换，产

生转导噬菌体λd gal +（d代表噬菌体缺少defective）。转导噬

菌体约丧失25％的噬菌体基因，却获得了整合位置附近的细菌

基因gal+等。图十五

这是因为在噬菌体染色体上加进很大一段细菌DNA，必然

要减少相应长度的一段噬菌体DNA，才能保持转导颗粒DNA长

度与噬菌体长度相当。

在产生λ dgal+的宿主细胞中， λ dgal+能复制，因为所有

的λ基因仍然存在：一些在噬菌体染色体上，另一些在宿主染色

体上。

噬菌体裂解液可感染gal－的细菌，裂解液中大多数是野生型

的噬菌体，相当少的λ dgal+转导噬菌体，这样的裂解液叫做低

频转导（Low frequency transducing，LFT）裂解液。

LFT裂解液感染gal-细菌产生两种类型的转导子：

第一类:野生型λ在正常的attλ 位点整合，接着λ λdgal+

噬菌体在普通的λ序列通过交换整合，产生一个双重溶

原（double lysogen）。细菌是杂合子gal+/gal-，因此

能发酵半乳糖。

这种类型的转导子（ λ dgal+/gal-）是不稳定的。因

为用紫外线处理这种转导子可以诱导λ溶解。野生型λ有一套完整的基因组可用于病毒的复制，所以它控制自己

和λdgal+的切离和复制，这里野生型病毒作为一个

helper phage。所产生的溶菌产物包含约一半正常的噬

菌体和一半λdgal+转导噬菌体。这种新的溶菌液叫做高

频转导（high frequency transduction,HFT）溶菌液。

图十五

第二类转导子：只有一个λdgal+噬菌体感染一个

细胞， λdgal+与E.coli gal-通过双交换（重组），产

生λdgal－。这样的转导子是稳定的，因为细菌染色

体上只有一种类型的gal+基因，没有噬菌体基因的

整合。

图十五

8.7 细菌同源重组的机制

8.7.1细菌同源重组的特点

细菌的转化、接合和转导重组都属于同源重组(图8-17)，与真核生

物中的同源重组不同，细菌中的重组是发生在一个完整的环状双螺旋DNA

分子与一个单链或双链DNA分子片段之间，而且没有相对应的重组子。

如细菌的转化是供体DNA片段进入受体细胞后，双链DNA解链，只有

一条链进入受体细胞和受体染色体发生重组，另一条链被分解掉，因此

重组是发生在单链DNA片段和完整的双链DNA之间；

大肠杆菌的接合重组是在Hfr细胞与F-细胞之间进行，接合时DNA重

组机制类似转化，但过程更为复杂。

细菌的转导重组则不同于转化与接合重组机制。无论是

普遍性转导还是局限性转导的遗传重组都是在双链DNA片段

和完整DNA分子之间发生，转导DNA以双链形式被注入受体细

胞，然后以双链形式结合进受体染色体中。这一过程很可能

如同两个完整DNA分子重组那样。开始是局部单链侵入和取

代，然后两条链都被牵扯进去，但是要完成重组需要进行两

次双链交换。

8.7.2 细菌同源重组的分子基础

细菌同源重组是在一系列重组修复酶的催化下及相关蛋

白质的参与下协同进行的，包括以下几个重要步骤（详见e8-

3）： ①RecBCD识别chi序列引发重组；

②RecA催化单链同化；

③Ruv系统解离Holliday连接点。

值得注意的是在细菌中进行遗传重组与DNA损伤修复

相关，而且细菌同源重组过程与真核生物减数分裂中基因组

中的重且不完全相同，因此这些结论还不能完全运用到真核

生物中。

8.8 大肠杆菌的遗传图谱与物理图谱

8.8.1 大肠杆菌基因组图谱

根据中断杂交、重组、转化和转导等作图技术，生物学

家于1963年绘制出第一张大肠杆菌遗传图，定位100多个基

因。该图以时间为单位被分为100分钟，即将一个完整的大

肠杆菌染色体从供体转移到受体所需要的时间。其后随着研

究的深入，分别于1990年定位1 400个基因、1997年定位4

288个基因，到2005年定位达到4 464个基因。

根据中断杂交、重组、转

化和转导等作图技术，于1963

年绘制出第一张E.coli 遗传图，

定位100多个基因。该图以时

间为单位被分为100分钟，即

将一个完整的E.coli染色体从供

体转移到受体所需要的时间

年份 准确定位

1963年 100个基因

1990年 1400个基因

1997年 4288 个基因

2005年 4464个基因

8.8 大肠杆菌的遗传图谱与物理图谱

8.8.1 大肠杆菌基因组图谱

8.8.2 大肠杆菌的物理图与遗传图的比较

1997年，由Blattner所领导的小组完成了对E.coli K-12

MG1655菌株的全基因组序列的测定，不仅确知其基因组为4

639 221 bp，即约为4.6 Mb，而且可以让我们对大肠杆菌的物

理图与遗传图进行比较，认清在遗传图中基因的确切位置及

其相应编码序列（详见e8-4）。

本章结束作业：P195-3

p196-6 p197-11 p197-13

谢谢！

8.2 返回

返回

返回2

8.3 返回

返回29＃

返回30＃

返回31

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(8.5)

图8-8 返回

返回

8.6

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8.7返回

8.8

返回

8.10

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(8.9)返回

图8.11 返回

图8.12 （1） 返回

8.13

返回

图8.14 返回

图十五 返回（1）（2）（3）