apoptóza - Ústav klinické a molekulární patologie lf up a...

Apoptóza

Veronika Žižková Ústav klinické a molekulární patologie a

Laboratoř molekulární patologie

Apoptóza

Úvod

Apoptóza vs nekróza

Role apoptózy v organismu

Mechanismus apoptózy

Metody detekce

Úvod - apoptóza

Aktivní proces sebedestrukce, který je závislý na energii a vyžadující čas (12-24 h), byl definovaný morfologicky v roce 1972, geneticky v 80. letech

Charakterizována:

morfologicky jako karyorhexe, karyopyknóza

degradací cytoskeletu + následnou změnou tvaru cytoplasmatické membrány (tzv. blebbing)

kondenzací chromatinu

fragmentací DNA (na 180 bp úseky)

rozpadem buňky na apoptotická tělíska

Úvod - apoptóza

Apoptotická tělíska jsou fagocytována (okolními buňkami a makrofágy) a nedochází k zánětlivé reakci

Geneticky regulovaný proces, při kterém dochází k aktivaci specifických proteas a nukleas

Signály pro indukci apoptózy mohou být:

• vnější (hormonální impuls, nutriční deficience)

• vnitřní (fyzikální nebo chemické poškození DNA či endoplasmatického retikula – UV, volné radikály, cytostatika, hypoxie,…)

Nekróza

Patologický a spontánní proces, který vyvolává zánětlivé odpovědi a je významný během mikrobiálních infekcí

Příčiny vzniku mohou být např. mechanické, termické, elektrické, rentgenové, chemické,…

Chakterizována:

jako rychlý proces (několik hodin), který je nezávislý na energii

není geneticky regulována

rychlým praskáním buněčné membrány

atypickým tvarem jádra

Apoptóza vs nekróza

Kerr JF, Winterford CM, Harmon BV (1994): Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73(12): 3108

Apoptóza vs nekróza

Apoptóza Nekróza

Děj fyziologický i patologický Děj vždy patologický

Aktivní proces vyžadující E Děj nezavislý na E

Nástup je pomalý (hodiny) Nástup je rychlý (sekundy, minuty)

Nevyvolává zánět Způsobuje zánět okolí

Aktivace kaspas Bez aktivace kaspas

Buňka se smršťuje Zvětšování objemu buněk

Apoptóza vs nekróza

Normální buňka (a); Nekrotická buňka (b); Apoptotická buňka (c)

Apoptóza vs nekróza

www.wikipedie.org

Syndaktylie – porucha apoptózy

Nekróza

Role apoptózy v organismu

Ontogeneze, tvorba orgánů (a); kontrola počtu buněk (c); odstraňování některých orgánů (ztráta ocásku u žab, slinné žlázy u housenek) (b) a poškozených buněk (d)

1. Fyziologická funkce

Baehrecke EH (2002): How death shapes life during development. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3; 779-787

Role apoptózy v organismu

Nadměrná apoptóza

•Degenerativní neurologické choroby (Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba)

•ischemické poruchy (infarkt myokardu)

•Toxické poškození jater

•AIDS

•Některé vývojové vady

Nedostatečná apoptóza

•Nádorová onemocnění (karcinomy s mutací p53)

•Imunitní abnormality (alergie)

•Autoimunitní choroby (revmatoidní

artritida)

•Infekce – bakterie –TBC, poxviry,

herpesviry

•Některé vývojové vady

2. Patologická funkce

Mechanismus apoptózy

Cytochrom C Receptory smrti modulátory

efektory Kaspasa 9

Kaspasa 8

Smrt buňky Smrt buňky

Proteiny, DNA Proteiny, DNA

VNITŘNÍ (mitochondriální)

VNĚJŠÍ (receptorová)

substrát

výsledek

Mechanismus apoptózy

• Kaspasy (Cysteinyl aspartate-specific protease)

• Neaktivní prekurzory jsou prokaspázy

• Aktivní forma vzniká proteolytickým štěpením prokaspas (v místě Asp)

• Prokaspasy se aktivují návzájem - kaskáda

• Mají specifické substráty

Pro

kaspasa 8

Pro

kaspasa 8

Kaspasa 8

Mechanismus apoptózy

• Proteiny rodiny Bcl-2 (klíčové regulátory apoptózy)

• Klasifikace dle počtu společných domén s Bcl-2 (BH: Bcl-2 homology)

• Podle aktivity se člení na antiapoptotické a proapoptotické

• Bcl-2 – první nalezený člen této rodiny, antiapoptotický efekt

• Bax – objeven na základě asociace s Bcl-2, proapoptotický efekt

Mechanismus apoptózy

• Proteiny rodiny Bcl-2 (klíčové regulátory apoptózy)

Metody detekce apoptózy

• Světelná, fluorescenční a elektronová mikroskopie

• Zaměřená na detekci morfologických změn - apoptotická tělíska, kondenzace chromatinu, puchýřkování membrány

Metody detekce apoptózy

• Využití substrátů kaspas

• Detekce štěpení např. keratinu 18 (protilátka M30 proti štěpenému fragmentu), laminu B

(inverzní průkazy) a transglutaminasy

www.roche-applied-science.com

Metody detekce apoptózy

• Změny DNA a změny na cytoplasmatické membráně

• Využití DNA žebříku nebo expozice fosfatidylserinu a vazby annexinu V

www.abcam.com

Aditivní materiály

• http://www.youtube.com/watch?v=J0u_PS2JqSY

• http://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death

• Patobiochemie buňky – J. Masopust a kol., 2003 UK Praha

• Molekulární patologie – Zdeněk Kolář a kol., Epava 2003

• Článek Vesmír - http://vesmir.cz/clanky/clanek/id/3704

Genová terapie

Genová terapie

• Genová terapie somatická – genom nemocného je pozměněn, ale změna není přenášená do další generace

• Genová terapie zárodečná – genom je změněn přímo ve vajíčku nebo spermii a změna je přenášená do dalších generací, zatím neprobíhá u vyšších obratlovců ani u člověka (celosvětové moratorium)

Genová terapie

• V současné době se většina úsilí orientuje na získané choroby, především na zhoubné nádory

Genová terapie v léčbě nádorů:

je jednodušší buňku zničit, než ji opravit (př. vyvoláním apoptózy)

vzhledem k povaze onemocnění jsou pacienti ochotni podstoupit i nové postupy

Genová terapie

• Změna v jednom genu – jednobodové mutace, např. srpkovitá anémie

• Multigenové poruchy – mutace ve více genech, často se uplatňuje i vliv prostředí, např. cukrovka, rakovina

• Mitochondriální poruchy – mutace v mitochondriální DNA je letální, např. poruchy řady orgánů

• Chromozomální abnormality – ztráta či zmnožení celých či částí chromosomů, např. Downův syndrom

Metody doručení genu do tkáně

Virální vektory Nevirální systémy

Adenoviry Injekce čisté DNA přímo

do nádoru

Retroviry Elektroporace

Lentiviry Heat-shock

Herpes simplex virus Lipofekce

Hybridní systémy

Metody doručení genu do tkáně

www.willey.co.uk/genmed/clinical

Nemoci léčené genovou terapií

Onemocnění Defekt Cílové buňky Četnost

Těžká imunodeficience

(SCID)

adenin deaminasa buňky kostní dřeně 1:1 000 000

Hemofilie krevní faktor VIII

a IX

játra, svaly ♂ 1:1 000 000

Cystická fibrosa transmembránový

regulátor CF

plicní alveoly 1:2 500

Deficience na alfa

antitrypsin

rozedma plic plicní alveoly 1:3 500

Rakovina nespecifický mnoho 1:4

Neurologické nemoci degradace neuronů neurony v mozku 1:250

Kardiovaskulární

onemocnění

arterosklerosa cévní endotel 1:2

Těžká imunodeficience (SCID)

• SCID (severe combined immunodeficiency)

• Jedna z forem se projevuje nedostatkem aktivního enzymu adenosin deaminasy (ADA) a to vede ke zpomalení dělení rychle proliferujících buněk (např. T-lymfocyty)

• U pacientů je omezena funkce imunitního systému

• „Bubble boy“ – David Vetter

(1971-1984)

www.wired.com

Těžká imunodeficience (SCID)

• Od 80.let se léčí transplantací kostní dřeně

• 1986 – injekce hovězí ADA stabilizované PEG intramaskulárně (PEG-ADA, nutno opakovat každé 2 týdny), často končí hemofilií

• 1990 – první pokus genové terapie na člověku – 4 letá Ashanti DeSilva, její

T-lymfocyty byly upraveny

ex-vivo normálním ADA

s využitím vektoru

bio3400.nicerweb.com

Těžká imunodeficience (SCID)

• 2002 – dalších 6 chlapců podstoupilo genovou terapii ex-vivo, u 4 z nich se stav výrazně zlepšil, u 2 z nich však propukla leukémie

• Pokusy jsou dnes pozastaveny a zdokonaluje se metodika, kdy transgen se zabudovává do genomu T-lymfocytu do blízkosti onkogenu

Hemofilie

• Je geneticky podmíněná choroba projevující se poruchou srážlivostí krve

• Existují 2 typy – A (absence faktoru srážlivosti VIII; ♂ 1:10 000) a B (absence faktoru srážlivosti IX; ♂ 1:70 000)

• 2011 – šesti mužům trpícím hemofilií typu B byl injikován adeno-asociovaný virus nesoucí transgen F9. Čtyři z nich mohli injekce se srážecími faktory vysadit úplně, u 2 došlo alespoň k prodloužení aplikace injekcí

Cystická fibróza

• 1989 – objeven gen CFTR, jehož poškození vyvolává CF + objevena i 1. konkrétní mutace (dnes je známo asi 1 500 různých typů)

• Chorobu vyvolává porucha iontového kanálu, který zajišťuje transport chloridových iontů přes epitely

• U lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru nesoucího trangen CFTR do nosu

Rizika genové terapie

• 1999 – první případ úmrtí po genové terapii – Jesse Gelsinger (1981-1999) trpěl deficiencí ornitin transkarbamylasy (OTC)

• 50 % dětí s OTC umírá do 1 měsíce po porodu

• J.G. měl lehčí formu OTC,

kterou lze léčit medikamenty

a dietou

www.jesse-gelsinger.com

Děkuji za pozornost!