drojdiile.pdf
Post on 04-Jun-2018
230 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
1/32
1. Drojdiile ca ageni biotehnologici
Introducere
Microorganismele incluznd bacteriile, drojdiile, fungii filamentoi i algele
unicelulare au fost folosite n culturi submerse pentru obinerea diferitelor produse printre
care i biomasa proteic. De la nceputurile produciei pe scar larg de penicilin,
streptomicin i de alte antibiotice i pn la conversia steroizilor de ctre o varietate de
microorganisme, s-au dezvoltat i o serie de ecipamente pentru culturile submerse dintre
care, mai utilizate sunt dou tipuri! bioreactorul cu agitare mecanic, cu diferite variante de
agitatoare i sisteme de spargere a spumei,fermentatorul airliftcare poate fi considerat un
ibrid ntre fermentatorul clasic cu agitare mecanic i tipul cu draft al fermentatorului airlift.
"actorii limitativi ai dezvoltrii celulare n astfel de ecipamente de fermentaie sunt
transferul de cldur i transferul de mas, ultimul influennd folosirea nutrienilor, n special
a o#igenului de ctre celule precum i cantitatea produilor de metabolism.$n jurul acestui subiect s-a dezvoltat o bogat literatur de specialitate, care descrie
efectul acestor factori asupra dezvoltrii culturilor submerse microbiene, cu punerea n
eviden a factorului limitativ pentru producia de mas celular i de metabolii primari sau
secundari. %&'
$n Figura 1sunt prezentate principalele aplicaii industriale tradiionale i moderne ale
drojdiilor bazate pe e#ploatarea dezvoltrii drojdiilor i pe procesele metabolice specifice
acestora la nivel industrial %('.
&&
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
2/32
Figura 1. )iotenologii tradiionale i moderne bazate pe drojdii.
*ccentul este pus pe relaia dintre fiziologia celulelor de drojdie i biotenologie pe de
o parte i *D+ recombinant i tenologiile de fermentaie pe de alt parte. rivitor la drojdiile
non Saccharomyces, creterea importanei lor industriale este n particular datorat produciei
masive de substane i preparate biofarmaceutice. De asemenea a fost evideniat importana
drojdiilor ca modele e#perimentale n studiile fundamentale ale tiinelor biomedicale %'.
1.1. Aspecte privind biologia drojdiilor
Drojdiile sunt benefice pentru omenire, deoarece n cea mai mare msur sunt utilizate
pentru producerea de alimente, vin, bere, substane bioterapeutice i produse farmaceutice. $n
prezent au fost recunoscute apro#imativ apte sute de specii de drojdie. Deoarece drojdiile
sunt adesea utilizate n biotenologia tradiional i modern, descoperirea de noi specii este
legat i de noile tenologii.
entru descrierea domeniului drojdiilor au fost utilizate mai multe definiii. $n
conformitate cu uilliermond /&0&(1 i 2odder /&0341 %&&' drojdiile sunt fungi unicelulari cu
reproducere prin nmugurire ori fisiune. $n acest sens, s-a recunoscut c drojdiile sunt fungi
unicelulari adevrai, dar n realitate, majoritatea speciilor de drojdii sunt dimorfice i produc
pseudoife i ife, pe lng dezvoltarea unicelular. 5imilar, majoritatea fungilor ifali sunt
dimorfici i, n mod uzual, acetia au fost denumii 6east 7 li8e.
9dentificarea, numirea i plasarea drojdiilor n propiul lor cadru evolutiv sunt
importante pentru multe domenii ale tiinei care includ agricultura, medicina, tiinele
biologice, biotenologia, industria alimentar.
9nvestigaii comparative care includ morfologia, fiziologia, genetica, biocimia,
ecologia i genetica molecular, au mbogit ta#onomia drojdiilor.
rima perioad n sistematica drojdiilor care se situeaz pn la nivelul anilor &0:4,
este caracterizat prin studii aprofundate de morfologie, fiziologie nutriional comparat igenetic convenional.
9niial pentru utilizri ta#onomice se foloseau teste care se refereau la numrul
atomilor de carbon asimilai i la folosirea compuilor azotului. ;ic8erman /&0
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
3/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
5tudiile genetice relev prezena diferitelor stadii se#uale. =iclul se#ual la ascomicete
poate fi aplontic, diplontic ori diploaplontic. 5peciile de drojdii pot fi omotalice,
eterotalice, sau o combinaie a acestora. %&4'
* doua perioad n sistematica drojdiilor este considerat de la &0:4 pn n prezent,
i este caracterizat printr-o aprofundare a studiului caracterelor morfologice datorit
introducerii microscopiei electronice, a aplicrii criteriilor biocimice i a introducerii
studiilor de genetic molecular. Microscopia cu transmisie de electroni a relevat diferene
ntre drojdiile ascomicete i bazidiomicete. Drojdiile ascomicete au pereii celulari
transpareni la electroni i conin n majoritate - glucani, ptura e#tern fiind format din -
manani. Drojdiile bazidiomicete au pereii celulari cu o structur lamelar netransparent la
electroni i formai n majoritate din - glucani. "ormarea mugurelui este de asemenea
diferit la cele dou grupuri de drojdii. Drojdiile ascomicete prezint o nmugurire
oloblastic, care const n participarea ntregului perete celular, la formarea noului perete, a
mugurelui pe cnd la drojdiile bazidiomicete care au o nmugurire enteroblastic, particip
numai stratul interior al peretelui celular.
>ltrastructura septului arat diferene importante ntre cele dou clase de drojdii.
5eptul la majoritatea ascomicetelor are unul sau mai muli micropori. 5eptul simplu are un
singur por central, pe lng unii perei despritori de la unele bazidiomicete, care au o
structur de tip dolipor, la care porul central este flancat de o membran perforat numit
parentezom.
entru diferenieri ta#onomice au fost utilizate caracteristici biocimice, compoziia n
glucide a pereilor celulari i capsulelor, spectrul de rezisten magnetic a pereilor celulari,
numrul unitilor izoprenice din coenzima ?, citocromii, compoziia n acizi grai i paternul
izoenzimelor. %&('
9ntroducerea studiilor *D+, furnizeaz n principal, un parametru obiectiv n
estimarea distanelor evolutive din punct de vedere ta#onomic. Diferitele metode utilizate
ofer soluii la diferite niveluri ta#onomice. @aloarea ta#onomic a compoziiei n baze a
*D+ /molA B=1 este n special caracteristic ta#onomic de specie. Culpinile fenotipice
care difer au un procent mai mare de ( 7 A n compoziia bazelor, sunt considerate specii
diferite. 2imitele n compoziia de baze a *D+, difer pentru drojdiile ascomicete i
bazidiomicete. =ele mai multe drojdii ascomicete au procentul molar de guanin i citozin
/molA B=1 mai mic de
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
4/32
Tabelul 1. Distribuia molA B= la diferite ascomicete i bazidiomicete
Mol% G+ !rocentajul la drojdiile
asco"icete
!rocentajul la drojdiile
ba#idio"icete(< 7 (4
4 7
< 7 0
4 7
< 7 0
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
5/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
Figura . rocedeele de baz n ingineria genetic la drojdii.
+umeroi vectori plasmidiali au fost construii pentru transformarea genetic a
celulelor de drojdie /Tabelul 1. $n general pentru o transformare ct mai eficient a celulelor
de drojdie, vectorii trebuie s conin!
- secvene de plasmide bacteriene /! coli1, care servesc la producerea clonrii i
amplificrii i care permit ca *D+ s se insereze n celula gazdF
- secven /*G51 care se replic autonomF
- secven centromeric /=H+1 pentru stabilitatea segregrii mitoticeF
- mar8eri selectai corespunztor i avantajosF
- unul sau cteva situsuri pentru enzimele de restricie, care permit inserarea *D+
eterolog. %'
Tabelul . @ectori plasmidiali pentru transformarea celulelor de drojdie
&
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
6/32
Tipuri de vector &'e"ple aracteristici
lasmide deintegrare
lasmidintegrativ dedrojdie /Ilp1
"recvene sczute de integrare n loci cromozomali prinrecombinare omoloag. Ilps sunt integrate n copiisingulare, iar transformanii sunt stabili, ciar nabsena presiunii selective.
lasmide dereplicare
independent
lasmidreplicativ dedrojdie /IGp1
"recvene nalte de transformare /
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
7/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
separat din e#presia genei care controleaz disponibilitatea pentru anumii nutrieni
/galactaza n cazul *2&, fosfatul n cazul N&1 /Tabelul (1.
Tabelul (. Geglarea fiziologic a promotorilor transcripionali n drojdii
!ro"otor )eglare *i#iologic$*2&
N&
MH2&
MHC(GH1 i /591 sunt prionii lui >re(p i respectiv 5upGH1 face
ca celula s se prerepreseze pentru catabolismul azotului, n timp ce /591 ridic eficiena
supresorului *G+ts. *ceeai abordare a dus la identificarea elementului non 7 mendelian
/et-s1 al fungului filamentos #odospora anserina, ca prion al proteinei et 7 s. "orma
prionic a proteinei et-s este cerut pentru incompatibilitatea eterocarionului, o funcie
normal a fungului, ceea ce sugereaz c alte funcii celulare normale pot fi controlate de
prioni. />GH1 i /591 implic o autopropagare i agregarea >re(p i 5up
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
12/32
din cadrul industriei farmaceutice. Saccharomyces cerevisiaeeste un organism cu care se
lucreaz uor, deoarece este nepatogen, i datorit multitudinii de aplicaii aprute de-a lungul
timpului n obinerea de produse consumabile, ca etanolul sau drojdia, a fost clasificat ca
organism G*5 /generall6 regarded as seif S organism considerat sigur, neto#ic1. De
asemenea, fermentaia i procesele tenologice de producie la scar larg cu Saccharomyces
cerevisiae fac ca acest organism sa fie atractiv, la ndemn, pentru cteva scopuri
biotenologice, aa cum va fi ilustrat n continuare. >n alt motiv important pentru a justifica
utilizarea microorganismului Saccharomyces cerevisiaen cadrul biotenologiei l reprezint
susceptibilitile sale la modificrile genetice prin tenologia *D+ recombinant, care a fost
mai departe nlesnite de accesul la secvena genomic complet a Saccharomyces cerevisiae,
publicat n &00: %&:'.
$mbuntirea tulpinilor de drojdie de bere s-a bazat n mod tradiional prin
mutagenez la ntmplare i pe ncrucirile genetice a dou tulpini, urmate de screening, n
funcie de calitile de interes ale mutantelor. Dezvoltrile recente ale unor metode sofisticate
n domeniul tenologiei *D+ recombinant au permis s se manipuleze o anumit cale de
interes i de aici s se mbunteasc celula printr-o abordare mai direct. Cotui, acum este
posibil s se introduc anumite perturbri genetice n sensul de a modifica puterea de iniiere a
unei anumite gene, de a induce deleii asupra genelor sau de a introduce gene ntregi n celul %&E'.
$mbuntirile propietilor celulare obinute prin combinarea analizelor teoretice
bazate pe informaiile de biocimie i pe aplicaiile ingineriei genetice, au fost oferite de
ingineria metabolic %&
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
13/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
1.-.1. 0oi concepte asupra ingineriei "etabolice
Dup cum s-a menionat i n introducere, ingineria metabolic implic o abordare
direct asupra aplicaiei tenologiei *D+ recombinant pentru mbuntirea tulpinilor, i a
fost definit ca Tmbuntirea direct a formrii produsului sau a propietilor celulare prin
modificarea unor reacii biocimice specifice sau introducerea altora noi cu folosirea
tenologiei *D+ recombinantU %&E'. $n acest definiie termenul Treacii biocimiceU trebuie
interpretat n sensul lui mai larg. =eea ce distinge ingineria metabolic de aplicaiile clasice de
biologie molecular este folosirea unei abordri directe. *ceasta presupune cunotine bogate
despre sistemul folosit i, dup cum a fost menionat n introducere, ingineria metabolic
conine dou pri! partea analitic i partea sintetic. *ceast situaie este ilustrat n Figura
. $n anumite cazuri partea sintetic o precede pe cea analitic, dac natura substratului are
nevoie de o e#tindere prin e#presia unei enzime eterogene, dar n toate cazurile este
important ca prile analitic i sintetic s mearg mn n mn.
*cest lucru este foarte bine ilustrat prin ncercrile de a e#tinde natura substratului.
*ici, n mod clar, primii pai sunt de a introduce gene eteroloage care activeaz
metabolismul substratului de interes, iar n acest scop este important s lum n consideraie
dou strategii diferite!
a. introducerea unei gene ce codific o protein de legtur a membranei, care transport
un anumit substrat n celul n combinaie cu o gen ce codific o protein
responsabil pentru scindarea substratuluiF
b. introducerea unei gene ce codific o protein secretat n mediul e#tracelular, unde
substratul de interes este transformat sau scindat n substraturi care ar putea fi
asimilate direct de organismul gazd.
(
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
14/32
Figura . Aspecte variate ale ingineriei metabolice mprite n partea analitic i partea sintetic.
9ndiferent de strategia aleas, este important s se asigure c genele eterogene
sunt e#primate suficient n noul sistem gazd. *ceasta poate implica luarea n considerare a
unor posibile modificri postranslaionale, care pot diminua sau elimina activitatea enzimei de
interes, iar aceasta necesit analize atente ale tulpinii recombinante. Dup obinerea unuiorganism recombinant ce poate folosi un anumit substrat, deseori se obin rate sczute i
(
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
15/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
producii n general mici ale produsului din substratul respectiv. entru a identifica problema
cea mai important i a direciona urmtorul pas sintetic este necesar s se detvolte o analiz
detaliat a fiziologiei celulei. *ceasta poate fi ilustrat n mod clar n ncercarea de a
transforma #iloza la etanol prin fermentaii anaerobe cu Saccharomyces cerevisiae. *stfel,
ingineria metabolic aproape ntotdeauna va implica o strns interaciune ntre prile
analitic i sintetic, de obicei fiind necesare mai multe tipuri de construcii de tulpini, nainte
de obinerea unei tulpini recombinante optime.
$n ingineria metabolic la Saccharomyces cerevisiae, partea sintetic este relativ
devansat de partea analitic. *ceasta se datoreaz comple#itii metabolismului celular, ce
poate interaciona cu e#primarea genelor, ce poate determina niveluri metabolice prin
concentraia de enzime. $n multe cazuri sunt necesare multiple modificri, iar pentru fiecare
modificare, pot aprea scimbri neateptate ale metabolismului celular. artea analitic se
refer n mod clasic la fiziologie, n ultimii ani numeroase tenici avansate fiind utilizate
pentru o analiz mult mai elaborat a fiziologiei celulare. *ceasta include tenici ale *D+
pentru analiza transcriptoamelor /cuantificarea simultan a tuturor genelor transcrise ntr-o
celul1, gel bidimensional de electroforez pentru analiza proteoamelor /cuantificarea
simultan a unui numr mare de proteine ntr-o celul1, gaz cromatografie cu sprectrometria
de mas /= 7 M51 i licid cromatografie cu spectrometrie de mas /2= 7 M51, pentru
analiza nivelurilor metabolice intracelulare, e#perimente cu =& pentru analiza reelei
metabolice, studii avansate de fermentaie cu monitorizare on ( linea variabilelor de cultivare
mai importante i bioinformatica /modele matematice pentru analiza structurii cilor i
structurii flu#urilor1.
1.-.1.1. Anali#a transcriptoa"elor i proteoa"elor
*naliza metodologiei *D+ n domeniul transcriptoamelor este o tenic nc nou n
prezent nefiind e#emple despre modul cum a fost folosit tenica n ramurile inginerieimetabolice. Deoarece multe provocri n ingineria metabolic implic scimbri genetice
multiple, analiza transcriptoamelor va fi foarte important pentru ingineria metabolic n
viitor, deoarece aceast analiz permite studierea scemei e#primrii multor gene.
=a i analiza transcriptoamelor, analiza proteoamelor este important n ingineria
metabolic. Deseori cile de activitate sunt corelate direct cu concentraia proteinelor, i cnd
e#primarea genelor iJsau interaciunile protein 7 protein sunt supuse unei regularizri
metabolice, este important s se cuantifice concentraia proteinelor n diferite tulpinirecombinante. $n mod clar, o analiz detaliat a proteomului poate fi valoroas, deseori fiind
(
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
16/32
suficient stabilirea concentraiei de proteine implicate n cile studiate i uneori msurarea
unor proteine reglatorii ce afecteaz e#primarea genelor relevante.
1.-.1..$ile de anali#$
=ile de analiz sunt folosite deseori pentru a descrie aplicaia analizei flu#ului
metabolic /M"*1 i analiza controlului metabolic. =ile de analiz s-au dovedit a fi un
succes, ca instrument ajuttor pentru partea analitic a ingineriei metabolice. M"* este o
abordare global a celulei, unde se ia n calcul reeaua complet a reaciilor intracelulare, unde
sunt cuantificate flu#urile, prin ramurile individuale ale reelei. "lu#urile metabolice pot fi
estimate din balanele i msurtorile de metabolii ale ctorva ci, prin introducerea
substraturilor marcate cu =&, urmate de msurtorile distribuiei acestora n metaboliii
intracelulari. $n acest caz spectroscopia de rezonan magnetic nuclear sau = 7 M5 poate
fi folosit pentru a msura tiparul metaboliilor precursori marcai. *plicarea de substraturi
marcate permite determinri de flu# ale reaciilor reversibile i cuantificarea raiilor de flu#
ntre cile biosintetice ce duc la acelai metabolit. =ompararea distribuiilor flu#ului obinute
n diferite condiii fiziologice poate da informaii de pre despre interaciile dintre diferite ci
sau poate ajuta la identificarea unor posibile reacii biocimice, care nu au fost descoperite n
prealabil ntr-un anumit microorganism %(4'. Cotui, M"* poate fi folosit n alegerea unei
strategii bune pentru ingineria metabolic, dar, poate fi folosit i ca un instrument pentru
caracterizarea fiziologic a unei tulpini, ce a fost manipulat n vederea introducerii unei
propieti noi sau modificate. >n domeniu n care M"* este interesat este mbuntirea
productivitii. *cest lucru este ilustrat n "igura (, n care se prezint o cale foarte simpl, n
care substratul * este convertit n produsul ), cu formarea produsului =. 5ubstratul * poate fi
glucoza, produsul ) poate fi etanolul i produsul = poate fi glicerolul. Depirea obinerii
produsului de substrat este determinat de raia flu#urilor V) i V*, unde productivitatea este
dat de flu#ul V). 9ntermediarul 9 nu se poate acumula n interiorul celulei, flu#ul acestuimetabolit va fi egal cu flu#ul ce iese din polul metabolitului. /Figura -1.
"lu#urile sunt descrise de ecuaia! V* S V) B V=, unul din aceti termeni poate fi
calculat, dac celelalte dou sunt msurate. *cesta este conceptul balanei metaboliilor. N
strategie clar pentru a mbunti obinerea total de V)este de a reduce sau de a elimina
flu#ul V=i astfel n mod direct va ajunge mai mult carbon la produsul V).
Nricum, formarea lui = joac de obicei un rol important n metabolismul celular, iar
eliminarea V= de o deleie a unei gene, va fi letal pentru celul sau va conduce spreau#otrofie. $n unele cazuri flu#urile pot fi determinate de constrngeri adiionale, dac
(:
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
17/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
anumii cofactori ca +*D/1 sunt implicai n diferite ramuri. Modularea distribuiei
flu#ului n jurul punctului metabolic 9, cere bineneles analiza complet a reelei metabolice
i de aceea conceptul de M"* este foarte important. M"* este n general cel mai folositor n
cazurile n care o fraciune relativ mrit a lui = este direcionat spre produs n vederea
obinerii de metabolii primari. +u n ultimul rnd, conceptul de M"* poate, de asemenea, s
contribuie la nelegerea modului n care producerea de metabolii secundari sau proteine
eteroloage este legat de metabolismul central al lui =, prin canalul metaboliilor precursori.
%(&'
M"*, de asemenea joac un rol important n clasificarea ramurilor metabolice. rin
analiza diferitelor mutante este posibil obinerea de informaii despre reglarea diferitelor
flu#uri, dac o anumit locaie a cii metabolice este fle#ibil sau nu. entru o locaie
metabolic rigid, enzimele din jurul punctului metabolic 9 din Figura pot fi reglate prin
regularizarea alosteric. *stfel, implicarea activitii uneia dintre enzime, n cascada de reacii
dintre intermediarul 9 spre produsul ), ar putea s se rezolve printr-o cretere a flu#ului V)i
implicit a randamentului n produs.
Figura -. "lu#ul metabolic V*, V)i V=prin intermediul 9 care este un precursor al metaboliilor ) i =.
*ceasta sugereaz un alt aspect important al cilor de analiz, i anume identificarea
enzimei, care e#ercit controlul flu#ului ntr-o cale metabolic dat. De fapt, problema cu
locul de intire al genomului, pentru a obine o cretere a flu#ului printr-o anume cale, estelegat de toate categoriile de inginerie metabolic menionate n introducere.
(3
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
18/32
Figura . =ile metabolice ale glucozei i #ilulozei.
*naliza controlului flu#ului este o e#aminare a bazelor celulare TlocaleU ce deseori
sunt implicate ntr-o singur cale metabolic, n contrast cu M"*, unde se considera ntreg
metabolismul celular. 5tudierea controlului flu#ului determin efectele perturbrilor n
activitile enzimatice, pentru a identifica cea mai bun int enzimatic pentru manipularea
genetic. 9nteresul general este de a suprae#prima genele specifice de codificare a enzimelor,
care e#ercit cel mai mare control asupra flu#ului dintr-o cale, deoarece suprae#primarea uneici ntregi poate fi foarte laborioas i deseori imposibil. entru e#aminarea controlului
flu#ului printr-o anume cale metabolic, cadrul analizelor de control metabolic poate servi ca
o unealt folositoare. H#ist o varietate de metode pentru determinarea aa 7 numiilor
Tcoeficieni de control al flu#uluiU, care determin un flu# relativ mrit datorit unei oarecare
creteri a activitii enzimelor individuale %&:'. 2a dezvoltarea analizei cilor metabolice este,
de asemenea important s se determine intermediarii ce ar lua parte ntr-un anumit mecanism
metabolic, care ar putea fi to#ici pentru celul n anumite condiii. $n plus, este important s
tim dac o anumit cale intermediar este implicat ntr-o cale de transducie 7 semnal, care
(E
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
19/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
regularizeaz flu#ul prin calea metabolic de interes, prin anumite interaciuni specifice
protein 7 protein sau prin influen la nivel transcripional %(('.
=ea mai bun strategie utilizat n studiile de inginerie metabolic la Saccharomyces
cerevisiaepentru consumul de #iloz a fost introducerea genelor KI2& i KI2( originale din
drojdii capabile s utilizeze #iloza /)andida shehatae, #ichia stipitis1. ena KI2& codific
#iloz-reductaza /KG1 care reduce #iloza la #ilitol cu consum de +*D/1. =onversia
#ilitolului n #iluloz este obinut de gena KI2( care codific #ilitol-deidrogenaza /KD1
/Figura 1.
1.-.. reterea productivit$ii i produciei
*spectele variate ale ingineriei genetice asupra drojdiei de bere au fost revizuite acum
civa ani. Hste posibil s fie introduse propieti noi n drojdia de bere, printr-o puternic
cone#iune ntre calea analitic a ingineriei metabolice i manipularea genetic a celulei,
pentru a ajuta ca procesul s fie mai profitabil. >nul dintre principalele motive pentru cererea
unei lungi perioade de folosire a berii este conversia nonenzimatic i nceat a -
acetolactatului, la componentul nedorit i fr arom 7 diacetilul, care este convertit enzimatic
la aceton i subsecvenial la (, butan 7 diol. N cale de a evita pierderea aromei, cauzat de
diacetil, este introducerea unei metode alternative de dereglare a - acetolactatului, pentru a
se trece peste formarea acetilului.
Cotui, modificrile genetice asupra drojdiei de bere prin introducerea - acetolactat
decarbo#ilazei eterogen, determin tulpinile transformate s produc acetona direct din -
acetolactat, ceea ce accelereaz procesul de cretere prin diminuarea fazei de lag de la
sptmni la ore /Figura 21. - *cetolactat decarbo#ilaza a fost evideniat cu succes n
drojdii i provine de la "lebsiella terrigena,!nterobacter aerogenes i *cetobacter xilinum.
%(' *lte ncercri de a minimaliza formarea de diacetil n drojdiile de bere au fost ncununatede succes, prin screening pentru anumite mutante i suprae#primarea unor gene specifice, care
codific enzime implicate n procesul de biosintez a valinei.
(0
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
20/32
Figura 2. =ile biocimice ce conduc la glicerol, piruvat i etanol.
rin tenicile de screening pentru mutante rezistente la erbicidul sulfometuron metil i
e#punerea gradat n mediu deficient n valin i izoleucin /izoleucin - i valin-1, s-au
descoperit tulpini cu activitate de sintez a acetolactatului sczut, ce determin un flu# de
carbon sczut, direcionat spre formarea de - acetolactat. +umai jumtate din cantitatea de
diacetil a fost produs de unele din acele tulpini n comparaie cu tulpinile parentale.
N alt strategie de succes a fost cea de cretere a flu#ului, prin calea biosintetic a
valinei, n scopul de a trece peste formarea diacetilului.
Manipularea cii metabolice centrale la Saccharomyces cerevisiae a fost folosit
pentru a se crete productivitatea de etanol. =nd E enzime diferite ale glicolizei au fost
e#primate separat n multivectori, nici una dintre tulpinile transformate nu a determinat o
producere mai mare de etanol dect tulpina de tip slbatic. +ici ciar suprae#primarea
enzimelor ce catalizeaz reaciile ireversibile, ca e#ocinaza, fosfofructocinaza i
4
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
21/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
piruvatcinaza, nu au avut efect asupra producerii de alcool. *ceste rezultate ilustreaz
rigiditatea controlului flu#ului prin metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae.
Nricum, alte studii au raportat c folosirea fosfofructazei a mbuntit productivitatea de
etanol n cazul resturilor celulare imobilizate care cresc doar aerob.
N problem major n legtur cu producerea de etanol prin fermentaia anaerob la
Saccharomyces cerevisiae este formarea substanial de glicerol, ca produs secundar. $n
condiiile de cretere aerob, +*D citosolic format din biomasa poate fi reconvertit la
+*DBprin formarea de glicerol, n concordan cu deidrogenazele +*D mitocondrial
e#tern, codificate de genele +DH& i +DH( i alternativ printr-un sistem necunoscut.
*naerob, o#idarea +*D citosolic se poate produce doar prin formarea de glicerol, deoarece
fosforilarea o#idativ nu funcioneaz n astfel de condiii.
H#ist dou gene, D& i D(, amndou codificnd glicerol - - fosfat
deidrogenaza, care regenereaz +*DBdin +*D, n timp ce convertete diidro#iaceton 7
fosfatul la glicerol - - fosfat, dar izoenzima codificat de gena D( s-a demonstrat ca fiind
cea mai important dintre cele dou, n condiii de anaerobioz. =onversia total a glucozei la
etanol este redo# neutr, deoarece +*D este format de gliceraldeida - - fosfat
-deidrogenaza i deoarece conversia acetaldeidei la etanol include regenerarea +*D- din
+*D /Figura 21 de ctre alcool deidrogenaza 9 /codificat de *D&1 %('. *stfel,
formarea glicerolului este important pentru meninerea ecilibrului redo# din citosol, pentru
a reo#ida +*D format. N posibil strategie pentru a optimiza producia de etanol poate fi
deducerea formrii glicerolului, prin redirecionarea flu#ului de carbon, prin manipularea
metabolismului redo#. =nd o mutant gpd( a fost crescut n condiii de anaerobioz a fost
obinut o producie mai mare de etanol cu EA n concordan cu reducerea de 4A a formrii
glicerolului, dar creterea specific ma#im a fost redus cu
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
22/32
Figura 3. *similarea +Bn Saccharomyces cerevisiae, unde ( - o#oglutaratul i +Bsunt transformate n
glutamat prin dou ci diferite.
$ntr-o alt abordare asupra implicrii ingineriei metabolice n mrirea produciei de
etanol la Saccharomyces cerevisiaes-a intervenit n metabolismul energetic care a fost condus
n sensul scimbrii cerinelor cofactorilor, n asociaie cu asimilarea de amoniac. *similarea
de amoniac la Saccharomyces cerevisiae este descris n Figura 3. *moniacul i ( 7
o#oglutaratul pot fi convertii n glutamat, de diferite izoenzime ale glutamat deidrogenazei,
folosind +*D /d&1 sau +*D/d(1 drept cofactori %(('. *moniacul poate fi asimilat
i de glutamin 7 sintetaza /lu&1, cu formarea de glutamin, care este convertit n glutamat
prin aciunea glutamat 7 sintetazei /lt&1F suma celor dou reacii ale lu& i lt& este artat
n "igura
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
23/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
D, ma#imul ratei specifice de cretere a fost n principal egal cu cel al unei tulpini de tip
slbatic. Nricum scderea observat n formaiunile de glicerol a rezultat nu dintr-o cretere
considerabil a produciei de etanol, ci, mai degrab dintr-o cretere a producerii de biomas.
Cotui ingineria metabolic care diminueaz formarea de glicerol prin solicitarea unei cantiti
mrite de +*D reo#idat n celul, nu conduce neaprat la o mrire a produciei de etanol.
entru a servi acestui scop, o reducere a surplusului de +*D ar trebui combinat cu un
consum mai mare de *C n formarea biomasei, unde celula compenseaz pentru cererea
energetic mrit, prin creterea flu#ului spre etanol. *cest e#emplu ilustreaz cum un flu#
mbuntit pe una din ci poate fi obinut prin ingineria unei ci complet diferite i arat c
este important ca ntreaga reea metabolic s fie luat n consideraie. $n completarea
e#emplului mai sus amintit, mrirea ratei de conversie a *C la *D poate fi obinut prin
introducerea activitii unei *C-aze unei anumite celule, unde producia unui anumit
component poate fi mbuntit. Gecent, au fost descrise numeroase aplicaii ale acestei
abordri %(:'.
$n contrast cu drojdiile folosite n industria buturilor alcoolice, este de dorit s
direcionm flu#ul de carbon spre glicerol n timpul formrii de etanol la drojdiile
productoare de vin, deoarece glicerolul poate mbuntii calitatea vinului, oferindu-i
consisten.
1.-.(. I"bun$t$irea per*or"anelor procesului
entru a mbunti producia la nivelul produilor biotenologici, este foarte
important s se utilizeze disciplinele de inginerie genetic, care se ocup de designul
bioreactorului i optimizarea tenologiilor fermentative, care poate duce la o mbuntire a
performanelor procesului biotenologic, obinndu-se supraproducii.
roblematica dezvoltrii unor metode optime, pentru mbuntirea anumitor operaii
ale procesului tenic este legat de capacitatea tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae dembuntii performanele procesului.
Saccharomyces cerevisiae care poate suferi o cretere pseudoifal, poate forma
asociaii floculare, proprietate ce este de obicei atribuit drojdiilor de fermentaie %(3'.
N tulpin de drojdie de bere potrivit ar trebui s fie n stare de a produce floculare,
deoarece aceast proprietate este cea mai convenabil de a limpezi berea n comparaie cu
celelalte metode convenionale, cum ar fi filtrarea i centrifugarea %(E'.
+umeroase studii privind flocularea au generat o baz mare de date, dar din nefericire,compararea acestor date este restricionat, datorit diferenelor privitoare la condiiile de
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
24/32
testare i de cretere. Dou mecanisme de floculare complet diferite au fost observate pn
acum! fenotipul +eW"lo, gsit n numeroase tulpini de drojdii de bere, i fenotipul "lo&, gsit
n cele mai multe tulpini floculare de laborator.=ele dou fenotipuri difer remarcabil ciar
prin felul de a flocula. "enotipul "lo& d natere la floculaie n timpul creterii, neinnd
seama de semnalele pe care le primete din mediu, cum ar fi limitarea nutrienilor, n timp ce
flocularea fenotipului +eW"lo se pare a fi lansat la sfritul creterii e#poneniale, cnd i
face apariia lipsa de glucoz. >ltima apariie a floculrii la fenotipul +eW"lo este un avantaj
evident pentru industria buturilor, ajutnd la separarea drojdiilor de butur, dar genetica
fenotipului +eW"lo rmne a fi descoperit. Cotui o continuare a muncii este necesar pentru
a da o imagine complet asupra genelor implicate n fenotipul "lo&, deoarece sunt necesare
mai multe cunotiine genetice, dect pentru fenotipul +eW"lo. "enotipul "lo&, conine una
sau mai multe din genele dominante floculare, din care a fost studiat gena "2N&. *ceasta
codific o protein a suprafeei celulare, care joac rolul principal n procesul de floculare.
roteina "lo& este ancorat n peretele celular unde partea + -terminal este e#pus mediului,
iar n timpul floculrii acest fragment +-terminal se poate ataa de manoproteinele din
peretele celular vecin. ena "2N& a fost integrat cu succes n genomul unei tulpini de
drojdie de bere monoflocular, obinndu-se o tulpin flocular stabil. "locularea prin
fermentare cauzeaz o micorare a numrului de celule, mrind timpul general de fermentaie.
ena "2N& din tulpinile cu fenotipul "lo&, pare a fi legat la nivel transcripional de o
cretere n transcrierea "2N&, corelat cu o cretere a floculrii. "locularea constitutiv a fost
observat n toate stadiile de cretere, dar a fost intensificat n fazele de declin i n faza
staionar a creterii. entru a introduce flocularea ntr-o gazd nefloculant ar fi necesar s se
stabileasc un sistem genetic care s e#prime gena pentru floculare doar spre sfritul
fermentaiei. *stfel, ingineria metabolic ar trebui s se concentreze pentru a determina un
anumit sistem genetic, care conine una sau mai multe gene floculare dominante. 5ubiectul
mecanismului de control care este responsabil pentru apariia floculrii la limitareanutrienilor la tulpinile fenotipului +eW"lo este nc necunoscut %(E, (0'.
Dei, introducerea floculrii la drojdiile de bere este o metod convenabil de separare
a drojdiei din mediu se utilizeaz nc filtrarea berii care este o etap tenic important n
industria de buturi. rezena - glucanilor n orz, mpiedic filtrarea datorit vscozitii
mrite, /Saccharomyces cerevisiaenu poate idroliza legturile &, ale - glucanilor1 i de
aceea este necesar adugarea unor enzime comerciale. *lternativ, poate fi introdus in
drojdia de bere o gen eteroloag care codific - gluconaza de +acillus subtilis i
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
25/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
Crichoderma yeesei. >ltima opiune servete ca sarcina pentru ingineria metabolic, deoarece
substratul este mrit pentru a include i - glucanul i n consecin procesul de obinere a
berii poate fi mbuntit. %4'
1.-.. 4"bun$t$irea propiet$ilor celulare
>n efort mrit s-a depus pentru a mbunti propietile e#istente ale Saccharomyces
cerevisiae, legate de e#ploatarea industrial a acestui organism. 9nteresante n acest sens sunt
cercetrile legate de a obine o reducere a represiei glucozei, folosit n consumul de sucroz
i maltoz, care sunt prezente n amestecurile de zar din industrie i care sunt metabolizate
n mod natural de Saccharomyces cerevisiae. Drojdia de bere este produs aerobic din melase,
care conin 4A pn la
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
26/32
fenomen descris ca fiind sub controlul glucozei. *cest mecanism reglator poate avea un efect
costisitor asupra proceselor menionate mai sus, datorit timpului destinat procesului de
control al glucozei. 5istemul reglator care asigur consumarea glucozei naintea altor zaaruri
a fost studiat mai ales la nivel transcripional, la nivelul represiei glucozei. Gepresia glucozei,
nlesnit de proteina Mig&, controleaz e#primarea ambelor gene 5>=( i M*2. Mecanismul
molecular al represiei glucozei cu ajutorul Mig&, este o cascad reglatorie care poate implica
un comple# de proteine ce conine 5sn:, Cup& i Mig&, unde Mig& dirijeaz comple#ul spre
un consens specific, spre promotorii genelor int. enele int ale Mig& sunt limitate nu
numai de genele ce codific proteinele implicate n funciile periferice ale celulei, cum ar fi
gena 5>=(, gena M*2 i gena *2 /ce codific proteinele responsabile de utilizarea
galactozei1 i de genele metabolismului central al carbonului %(, '.
entru a depi represia glucozei e#ercitat de gena 5>=(, deleia M9& ntr-o tulpin
de laborator aploid /;4 7 &a1 s-a dovedit a fi un succes, deoarece s-a observat o cretere
a e#primrii genei 5>=(, ce a fost obinut atunci cnd celulele au crescut pe glucoz. $n
plus, micorarea controlului de glucoz a fost observat la creterea a ( mutante mig& derivate
dintr-o alt tulpin de laborator aploid i o tulpin poliploid industrial, respectiv pe
amestecurile sucroz 7 glucoz. N alt protein recent descoperit, Mig(, contribuie de
asemenea la controlarea e#primrii genei 5>=(. Deleia adiional a M9( ntr-o tulpin
mutant mig& a artat o depreciere continu a e#primrii genei 5>=(. 5tudiile fiziologice ale
deleiilor tulpinilor mig&mig( au indicat c frmiarea lui M9( a condus la o continuare a
micorrii controlului glucozei i o mrire a activitii respiratoriiF mai mult, s-a obinut o
cretere de &(A a ratei specifice de cretere pe glucoz n comparaie cu tipul slbatic. rin
urmare, deleia concomitent a lui M9& i M9( s-a dovedit a fi un succes n producia
drojdiilor de panificaie, deoarece controlul glucozei este micorat cu succes n metabolismul
sucrozei %'.
Gata de consumare a glucozei folosit n procesul industrial poate fi mrit fr aaprea efectul =rabtree, iar rata specific de cretere, care servete ca un important parametru
n producia drojdiilor de panificaie, este mrit prin aceast abordare.
5trategiile de succes pentru metabolismul energetic al genelor M*2 pentru diminuarea
e#tinderii controlului glucozei e#ercitat asupra acestor gene este diferit de strategiile mai
sus amintite. Cransferul genei M9& n tulpina aploid de tip slbatic )(( a micorat ncet
controlul glucozei e#ercitat asupra genelor M*2. Nricum, acest efect nu s-ar fi putut obine
cu mutante mig& derivate din aploida =H+. L&& 7 3D i tulpina poliploid industrialD&(.%
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
27/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
nceput s consume maltoza la niveluri mai sczute de glucoz, cnd au fost cultivate n medii
comple#e cu glucoz 7 maltoz, n comparaie cu tipurile parentale. 5-a concluzionat c
aceasta se datoreaz unei inactivri mai puternice a metaboliilor permeazei maltozei. 5cindri
adiionale ale genei M9( n mutante derivate din tipul slbatic =H+. L&& 7 3D au artat
un fenotip uor mai represat dect mutanta mig&. Desfacerea lui M9& /i M9(1 poate
derepresa anumite proteine implicate n semnalizarea glucozei, iar aceste proteine mediaz
inactivarea permeazei maltozei. Mai multe raporturi arat c inactivarea catabolic a
permeazei maltozei, are un impact major asupra metabolismului maltozei, iar analizele de
control metabolic indic de asemenea, c permeazele maltozei limiteaz metabolismul
maltozei %:'.
$n loc de a inti gene reglatoare ca M9& i M9(, mbuntirea consumului de
maltoz din amestecurile glucoz 7 maltoz au fost obinute prin e#primarea constitutiv a
genelor structurale M*2. H#primarea constitutiv a M*2C i M*25 n mutanta mig&
derivat din tipul slbatic )((, a artat o utilizare simultan a glucozei i maltozei. =nd
M*2C i M*25 au fost suprae#primate n tulpina de tip slbatic, maltoza a fost utilizat n
defavoarea glucozei. Dup ct se poate presupune, suprae#primarea genei M*2C
contracareaz complet efectul de inactivare a catabolismului carbonului n transportorul
maltozei. $n sprijinul micorrii controlului glucozei, suprae#primarea celor dou gene
strcturale M*2 a crescut rata specific de cretere cu 4,4 -& i la glucoz i la maltoz,
comparativ cu cea a tipului slbatic %3'.
Deci, aceast strategie pare s fie atractiv pentru micorarea controlului glucozei n
metabolismul maltozei n cazul drojdiilor de fermentaie, ceea ce reduce timpul de producere
a etanolului. =ontrolul redus al glucozei arat, de asemenea, un timp redus al procesului de
producere a pinii, care este mai departe micorat deoarece aluatul poate crete i mai repede,
ca rezultat al mririi ratei specifice de cretere.
Deleia genelor ce codific proteinele represoare de transcripie sau suprae#primareagenelor ce codific activatorii transcripionali pozitivi, poate fi o strategie de succes pentru
ingineria metabolic, n anumite sisteme metabolice. *ceast strategie poate rezulta din
suprae#primarea mai multor gene, care sunt subiectul controlului transcripional implicnd
proteina represoare de deleie sau proteina represoare.
$n anumite cazuri aceast abordare va fi favorabil n comparaie cu suprae#primarea
genelor ce codific unele sau toate enzimele unei anumite ci metabolice %(('.
1.. !roducerea de proteine heteroloage3
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
28/32
De-a lungul studiilor efectuate asupra comportamentului Saccharomyces cerevisiae, ca
i a importantei capacitii acestei drojdii de a e#prima gene strine n combinaie cu aparatul
ei secretor, face din Saccharomyces cerevisiaeun organism-gazd atractiv pentru producerea
de anumite proteine eterogene.
+umeroase proteine eterogene care au fost folosite n scopul de a diagnostica sau ca
ageni terapeutici umani i vaccinuri au fost produse cu succes de Saccharomyces cerevisiae.
9nterferonul uman a fost prima protein recombinant produs de Saccharomyces
cerevisiaen &0E&, iar n anul urmtor a fost produs primul vaccin obinut prin intermediul
ingineriei genetice %E'. roducia industrial de insulin de ctre Saccharomyces cerevisiae,
acoper aproape jumtate din nevoia de insulin a &
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
29/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
mediaz translocarea cotranslaional /Figura 161 a fuziunii proteinei n eucariote %3'.
reregiunea secvenei leader este separat de o peptidaz 7 semnal, iar n aparatul olgi
endoproteaza Le#( separ preregiune n partea =-terminal a maturrii dibazice Le#(. $nainte
de secreie, peptida spaiatoare a maturrii Le#( de la e#tremitatea =-terminal este nlturat
prin aciunea dipeptidil 7 aminopeptidazei, codificat de gena 5CH& i proteina eterogen
este eliberat n mediul e#tracelular %'.
De-a lungul timpului au fost efectuate studii pentru a mbunti secreia de insulin
prin folosirea factorului prepro 7 leader al Saccharomyces cerevisiaeF ntregul - factor
prepro 7 leader al Saccharomyces cerevisiaea fost folosit pentru studiile iniiale n secreia de
insulin cu o peptid spaiatoare avnd o secven lu 7 *la 7 lu 7 *la, care rezult prin
fuziunea proteinelor artate n "igura &4 %'.
Figura 16. 9lustrarea unui factor prepro-leader fuzionat cu un precursor al insulinei.
$n acest studiu, peptida spaiatoare a fost ndeprtat cu greu de dipeptidil 7 aminopeptidaza,
obinndu-se n principal un precursor al insulinei lu 7 *la 7 lu 7 *la, deci spaiatorul a fost
ndeprtat prin mutageneza direct asupra locului. *ceast modificare a factorului al secvenei
leader a relevat cu succes e#primarea i secreia a numeroi precursori insulinici. *lte studii au
artat avantajul unui spaiator, deoarece poate fi atins o mbuntire a procesrii Le#(p, ceea ce n
cazul insulinei este de preferat deoarece procesarea insuficient a Le#(, poate cauza o
iperglicozilare i o depreciere a produciei de insulin.
=nd spaiatorii potrivii i creai n aa fel nct s poat fi ndeprtai de tripsin sau
de*chromobacter lyticusce cu o proteaz specific 26s&, au fost introdui ntre Le#( dibazic
i precursorul insulinic, producia de precursor al insulinei a fost mbuntit. rezena unui
spaiator nu numai c s-a dovedit a fi un succes pentru secreia secvenei leader a factorului
fuzionat cu precursorul insulinei, dar i glicozilaza + 7 lincat a celor dou pri a -
factorului propeptidglicozilat, localizate aproape de precursorul insulinei, joac un rol de
0
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
30/32
pivot n procesul de secreie, deoarece lipsa acestor dou glicozilaze micoreaz semnificativ
secreia precursorului insulinei %
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
31/32
Drojdiile ca ageni biotehnologici
leader pot activa e#primarea i secreia proteinelor eterogene, ceea ce nu este posibil cu
factorul - prepro 7 leader folosit n mod tradiional.
=onceptele descrise mai sus relateaz cteva e#emple de obinere de tulpini de
Saccharomyces cerevisiae cu propieti noi sau mbuntite prin inginerie genetic imetabolic. 9deea de baz n utilizrile tulpinilor de Saccharomyces cerevisiaeeste aceea de a
satisface din ce n ce mai multe scopuri biotenologice. Deoarece secvena complet
genomic a drojdiei este cunoscut, scimbrile genetice int sunt mai uor de obinut prin
tenologia *D+ recombinant, ceea ce faciliteaz i accelereaz studiile de inginerie
metabolic.. Cotui, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea funciilor ei
metabolice poate limita anumite abordri ale metabolismului ingineresc, acest microorganism
are cu siguran un potenial mrit pentru cile energetice. >n numr de noi aplicaii bazate pe
Saccharomyces cerevisiae vor aprea n viitor, iar acestea, mpreun cu e#emplele
menionate, vor ilustra clar potenialul tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca fabric celular
n procesele biotenologice.
7ibliogra*ie1. 5pencer, 9., 5pencer, D., easts -echnology, 5pringer @erlag, )erlin eidelberg +eW
Ior8, -:nWin,
2ondon, /&0E31.. innen, *., )u#ton, "., =anduri, )., ein, 9., ottinger, C., Me6ac8, )., olig, .,
.ene expression in recombinant micro/organism, *. 5mit, Marcel De88er 9nc., +eWIor8, &(&-&0, /&00L, &3-&E0, /&00&1.
. "aber, L. +., order, ;., *b. ., @ecnuis, M., east, 11, &&-&, /&00
-
8/14/2019 Drojdiile.pdf
32/32
12. offeau, *., )arell, . )., )uss6, )., 2ife 3ith 6000 genes, 5cience, 2,
top related