BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Nguyễn Khánh Hoàng Việt

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VÀ VAI TRÒ CỦA

MỘT SỐ MODULE TRONG CẤU TRÚC ENZYME THỦY

PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG DẠ

CỎ CỦA DÊ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9.42.02.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2020

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: GS. TS. Trƣơng Nam Hải

Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Đỗ Thị Huyền

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ

cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi …

giờ..., ngày … tháng … năm 2020.

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng có ý nghĩa thực

tiễn vô cùng to lớn đối với loài người thông qua các ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực như là y học, nông nghiệp, công nghiệp, xử lý ô

nhiễm môi trường. Do đó, các nghiên cứu về sự đa dạng các trình tự

từ vi sinh vật nhằm phát hiện những gen mới để khai thác và ứng

dụng chúng vào phục vụ cuộc sống luôn là chủ đề quan trọng được

các nhà sinh học đặc biệt quan tâm. Mặc dù vậy, các phát hiện gần

đây cho thấy phần lớn (khoảng 99%) các loài vi sinh vật trong môi

trường là chưa nuôi cấy được. Do vậy, nghiên cứu dựa vào phương

pháp nuôi cấy thông thường sẽ không thể khai thác được toàn bộ

nguồn gen có tiềm năng của vi sinh vật. Trong giai đoạn gần đây,

thông qua kỹ thuật Metagenomics giải trình tự toàn bộ hệ gen của tất

cả các vi sinh vật được thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường, các gen

từ vi sinh vật, kể cả vi sinh vật không nuôi cấy đã được nghiên cứu,

đánh giá một cách tổng thể.

Tại nước ta, cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp

với qui mô sản xuất ngày càng lớn và tập trung như hiện nay, các

phụ phẩm nông nghiệp mà trong đó nguồn sinh khối lignocellulose

chiếm phần lớn đang chủ yếu bị đốt bỏ gây lãng phí và ảnh hưởng

xấu đến môi trường. Trong khi đó, nhân loại đang phải đối mặt với

tình trạng suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch cũng như các hệ quả

nghiêm trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính. Việc nghiên cứu sử

dụng nguồn năng lượng carbonhydrate từ nguyên liệu có khả năng

tái tạo với trữ lượng khổng lồ như lignocellulose là hết sức cấp thiết

2

để tạo ra các sản phẩm thay thế các nhiên liệu được sản xuất từ

nguyên liệu hóa thạch.

Lignocellulose nói chung hay cellulose nói riêng là sinh khối

có cấu trúc vững chắc, được chuyển hóa theo nhiều bước để tạo

thành sản phẩm cuối cùng mà trong đó giai đoạn đường hóa đóng vai

trò then chốt. Trong quá trình này, cellulase được xác định là nhân tố

chính quyết định tới hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm.

Do vậy, trong những năm gần đây trên thế giới có rất nhiều công

trình nghiên cứu tìm kiếm nguồn cellulase mới có hoạt tính cao, có ái

lực mạnh với cơ chất để chuyển hóa hiệu quả cellulose. Khác với

enzyme khác, phần lớn các cellulase có cấu trúc module, có nghĩa là

ngoài vùng có chức năng xúc tác, enzyme còn chứa thêm một số

module khác có cấu trúc độc lập và ít được nghiên cứu, điển hình

như module FN3, Ig, CBM. Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu về vai

trò của các module chưa biết chức năng đến hoạt tính xúc tác của

cellulase chưa được công bố nhiều. Nhiều giả thiết cho rằng, chúng

không chỉ tồn tại như một vùng nối liên kết các vùng hoạt tính mà

chúng còn thể hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng khác như ổn

định cấu trúc, làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất. Vì vậy, nghiên

cứu làm rõ vai trò sinh học của các module này trong cấu trúc của

cellulase là hết sức có ý nghĩa cho việc lựa chọn hoặc thiết kế các

enzyme để nâng cao hiệu quả thủy phân nguồn sinh khối cellulose.

Từ năm 2014 đến năm 2017, bằng nguồn kinh phí của Đề tài

độc lập cấp Nhà nước (Mã số: ĐTĐLCN.15/14), phòng Kỹ thuật di

truyền (Viện CNSH, Viện HLKH&CNVN) đã giải mã DNA đa hệ

gen của hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê chăn thả tự nhiên trên núi tại tỉnh

Ninh Bình và Thanh Hóa. Kết quả từ 8,6 Gb dữ liệu, đề tài đã khai

3

thác được 816 trình tự mã hóa cho cellulase. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi hướng tới việc đánh giá đa dạng các trình tự cellulase có

cấu trúc module, tìm ra cấu trúc module đặc thù mới cho nghiên cứu

vai trò của module đến hoạt tính của enzyme. Do đó, chúng tôi đã

thực hiện Luận án: “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của

một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu

hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu đánh giá đa dạng cellulase và cellulase có cấu

trúc module từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ dê bằng kỹ thuật

Metagenomics;

- Nghiên cứu vai trò của module chưa rõ chức năng (FN3

hoặc Ig) lên hoạt tính của cellulase.

3. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã thực hiện các

nội dung nghiên cứu chính sau:

1. Phân tích, đánh giá đa dạng họ GH, nguồn gốc cellulase

và các cellulase có cấu trúc module được mã hóa từ các khung đọc

mở (ORF) trong dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật

dạ cỏ dê tại Việt Nam.

2. Phân tích lựa chọn trình tự có cấu trúc module điển hình

cho nghiên cứu biểu hiện và xác định vai trò của vùng chưa biết chức

năng.

3. Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế enzyme từ trình tự được

lựa chọn (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module (Fn3, XFn3, Egc,

Fn3Egc) dưới dạng dung hợp với SUMO.

4

4. Nghiên cứu vai trò của module chưa biết chức năng đến

khả năng phân giải cellulose của enzyme.

5. Nghiên cứu, đánh giá một số tính chất của enzyme tái tổ

hợp được biểu hiện từ trình tự được lựa chọn có cấu trúc module.

4. Những đóng góp mới của luận án

1. Từ 816 ORF mã hóa cellulase của vi khuẩn dạ cỏ dê Việt

Nam, 243 ORF mã hóa cellulase được xác định có cấu trúc chứa

module chưa rõ chức năng là FN3 hoặc Ig. Trong số các cellulase

hoàn thiện chứa module FN3, 99,2% FN3 đi kèm với module xúc tác

betaglucosidase GH3 và chỉ có một FN3 đi kèm với module xúc tác

endoglucanase GH5. Toàn bộ module Ig đều đi kèm với module xúc

tác endoglucanase GH9. Cấu trúc mã hóa endoglucanase GH5 chứa

module FN3 là cấu trúc mới ít được phát hiện và nghiên cứu.

2. Đã tổng hợp và biểu hiện trình tự mã hóa endoglucanase

GH5 (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module khác nhau (Fn3, XFn3,

Fn3Egc, Egc) trong E. coli để nghiên cứu vai trò của FN3 trong cấu

trúc của enzyme. Module FN3 được xác định có khả năng làm tăng

tính tan và ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh

thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn.

Module FN3 còn làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất tan là CMC.

3. SXFn3Egc hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 4. Enzyme ổn

định và bền ở nhiệt độ dưới 60oC trong 90 phút. Km đạt 1,26 mg/ml

và Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml. Hoạt tính enzyme tăng 2 lần khi

sử dụng 40 mM Mn2+

và giảm khi bổ sung các ion kim loại (Ca2+

,

Mg2+

, Ni2+

, K+, Co

2+, Cu

2+, Zn

2+, Fe

3+), và 6 loại hóa chất (SDS, urea,

2-mercaptoethanol, EDTA, tween 80, triton X-100).

5

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các đơn

phân β-D-glucose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật.

Sử dụng nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo như cellulose trong

một số ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, sản xuất các

nhiên liệu sinh học, hóa chất tinh khiết đang được xem là xu hướng

phát triển bền vững cả về mặt kinh tế và môi trường.

1.2. Cellulase

Cellulase là nhóm enzyme quan trọng, có khả năng cắt mối

liên kết -1,4-glycoside trong phân tử cellulose tạo thành sản cuối

cùng có giá trị là glucose. Cellulase thường được chia thành ba loại

chính (endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase) với cơ chế phân

cắt khác nhau. Cấu trúc của cellulase có thể chỉ gồm module xúc tác

hoặc bao gồm module xúc tác liên kết với module bổ sung như CBM

hoặc module chưa rõ chức năng (FN3, Ig).

1.3. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen

Metagenomics là thuật ngữ bao gồm các kỹ thuật sinh học

phân tử, tin - sinh học cho phép nghiên cứu đa hệ gen của tất cả các

vi sinh vật được thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường mà không

thông qua nuôi cấy. Metagenomics đã được chứng minh là phương

pháp hiệu quả để khai thác các enzyme, hoạt chất sinh học mới cho

nhiều ứng dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ khai thác các

cellulase mới, đặc biệt là cellulase có cấu trúc module (FN3, Ig) từ

bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase. Bộ dữ liệu này được phân

tích từ 164.644 ORF đã được lắp ráp từ 8,46 Gb dữ liệu giải trình tự

DNA đa hệ gen của vi khuẩn trong dạ cỏ dê Việt Nam.

6

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng, vật liệu hóa chất và thiết bị máy móc

Đối tượng nghiên cứu: Bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa

cellulase từ dữ liệu DNA đa hệ gen của vi khuẩn trong dạ cỏ dê.

Các chủng vi sinh vật, plasmid của hãng Invitrogen (Mỹ),

mồi PCR được đặt tổng hợp tại GenScript (Mỹ); hóa chất của Bio-

Lab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức).

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử, vi sinh vật

Biến nạp DNA plasmid vào E. coli (Froger et al., 2007); tách

chiết DNA plasmid từ E. coli và điện di trên gel agarose (Sambrook

et al., 2001); tinh chế DNA từ gel agarose sử dụng bộ kit DNA

Qiagene – QIAquick Gel Extraction Kit; tối ưu mã bộ ba dựa trên

phần mềm trực tuyến của Genscript (Rare Codon Analysis Tool).

2.2.2. Các phương pháp hóa sinh protein

Tinh chế protein bằng cột sắc kí ái lực Ni-NTA (Invitrogen)

và xác định độ sạch bằng Quantity One (Bio-Rad); định lượng

protein bằng Bradford (Bradford, 1976); xác định hoạt tính

endoglucanase trên cơ chất CMC (Miller, 1959) và trên giấy lọc theo

phương pháp của Camassola và cộng sự (2012) với một số cải biển

nhỏ; xác định hoạt tính cellulase trên đĩa thạch agar-CMC (Teather et

al., 1982) và dựa vào phân tích zymogram (Champasri et al., 2015);

đánh giá tác động của enzyme lên bề mặt giấy lọc bằng chụp ảnh trên

kính hiển vi điện tử quét SEM (Kataeva et al., 2002).

2.2.3. Các phương pháp tin sinh học

Nghiên cứu Pfam của các trình tự dựa trên CSDL PFAM

(http://pfam.janelia.org/search) và vùng bảo thủ sử dụng BLASTP

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.); dự đoán cấu trúc bậc ba của

enzyme sử dụng phần mềm trực tuyến Phyre2 và Swiss model; khả

năng chịu kiềm/acid sử dụng phần mềm AcalPred và khả năng chịu

nhiệt của enzyme sử dụng phần mềm TBI.

2.2.4. Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp thống kê, Microsoft Excel

để tính toán và trình bày kết quả dưới dạng ±SE (Standard Error).

7

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đánh giá sự đa dạng GH và cấu trúc module của cellulase

suy diễn từ 816 khung đọc mở

3.1.1. Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc các họ GH cellulase

Từ 816 ORF mã hóa cellulase đã được chú giải chức năng

thuộc 11 họ GH khác nhau (Bảng 3.1). Trong đó, họ GH3 (400 ORF)

và GH5 (192 ORF) được xác định là họ GH phổ biến nhất chiếm tỷ

lệ lần lượt là 49% và 23,5%. Các trình tự hoàn thiện (297 ORF) được

phát hiện tồn tại ở dạng cấu trúc chỉ chứa vùng xúc tác hoặc chứa

thêm module chưa rõ chức năng (FN3, Ig). Trong đó, các ORF thuộc

họ GH3 có tới 90,9% các trình tự có chứa module FN3; 100% các

ORF họ GH9 chứa module Ig và chỉ 1 module FN3 đi kèm với GH5.

Do đó, các module FN3, Ig không chỉ đơn giản là các vùng nối mà

còn thể hiện một số chức năng sinh học chưa được xác định rõ ràng.

Bảng 3.1. Tổng hợp các trình tự được chú giải mã hóa cho các

enzyme thủy phân cellulose dựa trên cơ sở dữ liệu COG và KEGG

Họ

GH Module

Số

ORF

Họ

GH Module

Số

ORF

GH1 GH1 16 GH16 GH16 33

GH3 GH3 198 GH16-CBM4 2

Fn3-GH3 202 GH44 GH44 2

GH5 GH5 189 GH48 GH48 1

Fn3-GH5 1 GH64 GH64-CBM6 1

GH5-CBM2 1 GH74 GH74 1

GH5-CBM37 1 GH94 GH94 50

GH8 GH8 48 CBM63 CBM63 1

GH9 GH9 11 FN3 FN3 10

GH9-Ig 30 - - 14

GH9-CBM3 2

GH9-CBM37 1

GH9-dockerin 1

8

3.1.2. Đánh giá đa dạng cấu trúc của cellulase hoàn thiện có cấu

trúc module

Trong số 243 ORF mã hóa cellulase chứa cấu trúc module có

148 ORF có cấu trúc hoàn thiện (131 ORF chứa FN3, 17 ORF chứa

Ig). Trong đó, toàn bộ 17 ORF mã hóa endoglucanase GH9 có chứa

module Ig (Ig-GH9); 131 ORF hoàn thiện có chứa module FN3 thì

có 130 ORF (99,2%) mã hóa beta-glucosidase GH3 (GH3-Fn3) và

chỉ duy nhất 1 ORF mã hóa endoglucanase GH5 (Fn3-GH5). Module

FN3 đứng trước vùng xúc tác endoglucanase GH5 ở đầu N là cấu

trúc hiếm gặp cần được nghiên cứu để xác định vai trò của module

này đến hiệu quả thủy phân của enzyme.

3.1.3. Đánh giá đa dạng nguồn gốc các ORF mã hóa cellulase

Để hiểu rõ hơn về cộng đồng vi khuẩn và vai trò của chúng

trong quá trình tiêu hóa cellulose ở dạ cỏ dê Việt Nam, chúng tôi đã

xác định nguồn gốc của 816 ORF mã hóa cellulase. Trong đó, 221

ORF mã hóa cellulase đã được phân loại chủ yếu thuộc ngành

Bacteroidetes (153 ORF) và Firmicutes (53 ORF) với tỷ lệ tương

ứng là 69,2% và 24,0%. Bacteroides uniformis (29 ORF), Prevotella

buccae (25 ORF) được xác định là 2 loài chiếm ưu thế nhất mang các

gen mã hóa cellulase; Ruminococcus flavefaciens (7 ORF) được xác

định là loài điển hình thuộc nhóm vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase

có khả năng phân giải mạnh nguồn sinh khối cellulose.

3.1.4. Đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự axit amin suy

diễn từ ORF được chú giải mã hóa cho cellulase

Dựa trên cả 2 CSDL là NR và CAZy, 297 ORF hoàn thiện

mã hóa cellulase có độ tương đồng dưới 85% (trình tự mới) với tỷ lệ

lần lượt là 80,1% và 77,4%. Trong 148 ORF hoàn thiện mã hóa

cellulase có cấu trúc module có 17 ORF hoàn thiện mã hóa

endoglucanase chứa module Ig đều là trình tự mới; 131 ORF hoàn

thiện mã hóa cellulase chứa module FN3 có 90 trình tự mới chiếm

trên 68% (89 ORF mã hóa beta-glucosidase, 01 ORF mã hóa

9

endoglucanase). Từ bộ dữ liệu này hứa hẹn sẽ khai thác được nhiều

gen mới, đặc biệt là các trình tự hoàn thiện mã hóa cellulase có chứa

module như FN3, Ig.

3.1.5. Ước đoán một số tính chất của enzyme suy diễn từ trình tự

Ước đoán nhanh một số điều kiện tối ưu cho enzyme như

khoảng pH, nhiệt độ hoạt động, giá trị pI là công việc cần thiết để

sàng lọc nhanh các gen ứng viên cho nghiên cứu ứng dụng. 243 ORF

mã hóa cho cellulase có cấu trúc module được ước đoán phần lớn

bền ở khoảng nhiệt độ từ 55-65oC (130 ORF), hoạt động ở pH kiềm

(139 ORF) và giá trị pI từ trên 5-6 (146 ORF). Trong 148 trình tự

hoàn thiện chứa module FN3 và Ig xác định được 2 trình tự (1 trình

tự Ig-GH9 và 1 trình tự endoglucanase FN3-GH5) có pI cao hơn 9.

3.2. Nghiên cứu lựa chọn các trình tự có cấu trúc module điển

hình cho nghiên cứu vai trò của module

3.2.1. Khảo sát cấu trúc bậc 3 của trình tự chứa module FN3

Module FN3 trong cấu trúc của endoglucanase GH5 được

phát hiện là cấu trúc hiếm gặp so với cấu trúc phổ biến là module

FN3 trong beta-glucosidase GH3 được lựa chọn để nghiên cứu.

Trình tự gen mã hóa cho endoglucanase trưởng thành có kích thước

1545 nucleotit. Kết quả so sánh tương đồng bằng BLASTN và phân

loại bằng phần mềm MEGAN cho thấy gen có nguồn gốc từ

Ruminococcus bicirculans. Khi so sánh trình tự amino acid của

endoglucanase GH5 bằng BLASTP, trình tự này có độ tương đồng

60% so với endoglucanase mã CDC67342.1 của loài vi khuẩn phổ

biến trong dạ cỏ dê là Ruminococcus sp. CAG:57. Khảo sát vùng bảo

thủ bằng SwissProt cho thấy trình tự có độ tương đồng cao nhất

(49%) so với khuôn của endoglucanase 3pzt.1.A, với độ bao phủ là

53%, có cấu trúc monomer và phối tử là Mn (Hình 3.7). Sử dụng

công cụ Phyre2 cho thấy trình tự có độ tương đồng cao nhất với khuôn

10

c3pzvB endoglucanase (độ tin cậy 100%), có vùng chức năng tách biệt

rõ ràng, vùng đầu N có cấu trúc FN3 tách biệt (Hình 3.8).

3.2.2. Khảo sát giá trị pI, pH của trình tự chứa module FN3

Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 chứa module FN3

được dự đoán hoạt động ở môi trường pH axit, có khả năng bền ở

dưới 55oC và có chỉ số pI tương đồng và luôn ở mức cao ở cả vùng

chưa biết chức năng (X domain, module FN3) và vùng hoạt tính

(Egc). Chỉ số pI trên toàn phân tử enzyme và của các module tương

đồng sẽ giúp cho việc nghiên cứu, biểu hiện và tối ưu một số điều

kiện thủy phân của enzyme trở lên thuận lợi hơn.

3.3. Tách dòng gen XFn3Egc

3.3.1. Phân tích tối ưu mã bộ ba của trình tự XFn3Egc

Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 (gen XFn3Egc)

được tối ưu có tỷ lệ các bộ ba có khả năng sử dụng tốt là 97% so với

46% trước khi tối ưu. Các mã bộ ba được tối ưu có tới 86% trình tự

có mức độ phù hợp từ 91-100% so với trước tối ưu chỉ có 49%.

Trình tự gen trước và sau khi tối ưu để biểu hiện trên E. coli được

mô tả tại Hình 3.10. Gen XFn3Egc sau khi được tối ưu đã được tổng

hợp nhân tạo và đưa vào pET22b(+) tại vị trí NcoI+XhoI. Vector

mang gen được đặt tên là pET22-XFn3Egc.

Hình 3.7. Khảo sát vùng

bảo thủ bằng SwissProt

Hình 3.8. Khảo sát vùng bảo thủ

bằng Phyre2

Mn

11

Hình 3.10. Trình tự gen XFn3Egc trước (A) và sau tối ưu các mã bộ

ba để biểu hiện trong E. coli (B) (vùng màu vàng là trình tự FN3;

vùng màu xanh là vùng hoạt tính; chữ màu đỏ là trình tự được tối ưu)

12

3.3.2. Tạo vector biểu hiện pETSUMO mang gen Fn3, Egc,

Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc

Các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc được khuếch

đại bằng PCR từ khuôn là pET22-XFn3Egc, sau đó được cắt bằng

cặp enzyme hạn chế NcoI + XhoI và nối vào vector pET22b(+) tạo

vector tái tổ hợp tương ứng. Các gen sau khi được đưa vào vector

biểu hiện đã được giải trình tự để kiểm tra và đưa vào biểu hiện trong

E. coli. Tuy nhiên, lượng protein được biểu hiện quá thấp và chủ yếu

nằm ở pha tủa. Do đó, chúng tôi đã chuyển các gen từ vector

pET22b(+) sang vector pETSUMO bằng enzyme hạn chế NcoI và

XhoI. Sau khi được nối ghép, các vector pET22SUMO-Fn3,

pET22SUMO-Egc, pET22SUMO-Fn3Egc, pET22SUMO-XFn3Egc

và pET22SUMO-XFn3 được biến nạp vào tế bào E. coli DH10B để

tách dòng gen. Các khuẩn lạc biến nạp được nuôi cấy trên môi

trường LBA để chọn các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp. Kết

quả cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn đơn lẻ, các plasmid đã

được cắt mở vòng và khi cắt bằng cặp enzyme giới hạn thì các gen

tương ứng được cắt ra có kích thước như tính toán. Như vậy, các

vector biểu hiện mang gen đã được thiết kế thành công.

3.4. Biểu hiện các gen trong tế bào E. coli

Sau khi khảo sát các điều kiện thích hợp cho biểu hiện,

chúng tôi tiến hành biểu hiện các chủng E. coli BL21 (DE3) mang

các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc trong môi trường LB có

bổ sung Amp, nhiệt độ biểu hiện 25oC, nồng độ chất cảm ứng 0,5

mM IPTD, thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng. Kết quả kiểm tra bằng điện

di trên gel polyacrylamide cho thấy, ở pha tổng số cả 5 loại protein

đều được biểu hiện tốt, đúng kích thước theo tính toán. Các gen có

13

protein được biểu hiện chủ yếu ở pha tan trừ gen Egc không chứa

FN3 chỉ biểu hiện protein nằm ở pha tủa (Hình 3.18).

Kết quả thử hoạt tính cellulase của các protein tái tổ hợp biểu

hiện ở pha tan trên đĩa thạch aga-CMC cho thấy chỉ có dịch pha tan

của SXFn3Egc thể hiện được khả năng thủy phân cơ chất CMC rõ

nhất. Kết quả thử hoạt tính zymogram cho thấy ở bản nhuộm

comassie, cả 4 loại protein (SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3)

mặc dù không được xử lý biến tính và chạy điện di trên gel không

biến tính nhưng đều di chuyển đúng vị trí trên bản gel. Ở bản gel

nhuộm congo red, xuất hiện 1 band sáng tương tự như đối chứng

dương ở vị trí của SXFn3Egc (Hình 3.19). Do đó, gen XFn3Egc biểu

hiện được enzyme đúng kích thước như tính toán và thể hiện hoạt

tính rõ ràng với cơ chất CMC. Module FN3 được xác định có tác

dụng làm tăng tính tan của vùng xúc tác. Vùng X cũng có vai trò

nhất định trong việc hỗ trợ cho vùng xúc tác thể hiện hoạt tính

cellulase mạnh hơn.

Hình 3.18. Điện di đồ protein SFn3, SEgc, SFn3Egc, SXFn3Egc,

SXFn3 ở pha tổng số, pha tan, pha không tan được biểu hiện trong

chủng E. coli BL21 (DE3) trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS.

Đối chứng âm pETSUMO; Marker: protein chuẩn unstained

14

(A) (B)

Hình 3.19. Phân tích protein pha tan bằng điện di không biến tính (A) và zymogram (B); Marker: Thang protein chuẩn unstained

(Thermo scientific); cellulase: Đối chứng dương (Sigma)

3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp tái tổ hợp và xác định hoạt tính

3.5.1. Tinh chế protein tái tổ hợp

Các protein tái tổ hợp được rửa ra hoàn toàn ở đệm thu mẫu

có nồng độ 400 mM imidazole. Kiểm tra bằng điện di đồ các phân

đoạn tinh chế protein cho thấy, trên bản gel chỉ xuất hiện duy nhất

băng có kích thước tương đương với protein đích cần tinh chế. Kết

quả đánh giá độ sạch bằng phần mềm Quantity One cho thấy các

protein tái tổ hợp sau tinh chế đều có độ sạch trên 99%.

Hình 3.20. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn

tinh chế SFn3 (F1-F9)

Hình 3.22. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn

tinh chế SFn3Egc (F1-F7)

15

Hình 3.24. Điện di đồ kiểm tra

sản phẩm trong các phân đoạn

tinh chế SXFn3Egc (F1-F10)

Hình 3.26. Điện di đồ kiểm tra

sản phẩm trong các phân đoạn

tinh chế SXFn3 (F1-F8)

3.5.2. Đánh giá hoạt tính của các protein sau tinh chế

3.5.2.1. Đánh giá hoạt tính riêng rẽ trên cơ chất CMC

Kết quả đánh giá hoạt tính riêng rẽ trên cơ chất CMC của

protein SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 sau tinh chế cho thấy chỉ

có SXFn3Egc và SFn3Egc thể hiện được khả năng thủy phân cơ chất

CMC rõ nhất. Vòng hoạt tính thủy phân cellulose của SXFn3Egc có

kích thước lớn hơn (hoạt tính mạnh hơn) so với SFn3Egc.

3.5.2.2. Đánh giá khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính của

enzyme trên CMC

Khi phối trộn các protein chưa biết chức năng (SFn3,

SXFn3) và enzyme chứa vùng hoạt tính, khả năng thủy phân cơ chất

CMC của hỗn hợp đều tăng. Phối trộn SFn3 và SXFn3 với SFn3Egc

đều làm tăng hoạt tính lên lần lượt là 74,5% và 49,9%. Phối trộn

SXFn3 và SFn3 với SXFn3Egc hoạt tính đều tăng khoảng 27%

(Hình 3.29). Kết quả cho thấy, module FN3 khi phối trộn có tác dụng

làm tăng hoạt tính của enzyme trên cơ chất CMC lên đáng kể so với

thử nghiệm chỉ với enzyme riêng rẽ. Từ kết quả này có thể đưa ra giả

thuyết là do module FN3 có khả năng phản ứng với CMC, làm tăng

ái lực của enzyme với cơ chất.

16

Hình 3.29. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein tái

tổ hợp sau tinh chế trên cơ chất CMC; ĐC +: Cellulase (Sigma)

3.5.2.3. Đánh giá khả năng của SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính

enzyme trên giấy lọc

Trên cơ chất giấy lọc, SFn3 và SXFn3 có khả năng làm cho

hoạt tính của SXFn3Egc tăng lên tương ứng là 86,8% và 13,6% so

với khi thử nghiệm riêng rẽ chỉ có SXFn3Egc. SFn3Egc khi phối

trộn với SFn3 và SXFn3 cũng đều có hoạt tính tăng so với khi thử

nghiệm phản ứng chỉ có SFn3Egc nhưng sự sai khác không có ý

nghĩa thống kê. Kết quả này chứng tỏ, SFn3 và SXFn3 khi được phối

trộn đã có tác dụng làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose của

enzyme trên cơ chất giấy lọc. Vì SFn3 và SXFn3 không thể hiện

được hoạt tính cellulase nên các protein này chỉ có tác dụng hỗ trợ

giúp enzyme SXFn3Egc, SFn3Egc tăng khả năng thủy phân cơ chất.

Khả năng làm tăng hoạt tính enzyme trên cơ chất giấy lọc

của protein chứa module FN3 có thể do hai giả thiết sau: (1) module

FN3 có khả năng làm nới lỏng cấu trúc cellulose tinh thể của giấy

lọc, giúp enzyme tiếp cận dễ dàng hơn với sợi cellulose để thực hiện

17

phản ứng thủy phân; (2) module FN3 làm tăng ái lực với cellulose,

giúp enzyme bám dính tốt với cơ chất.

Hình 3.30. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein

sau tinh chế trên cơ chất giấy lọc; ĐC +: Cellulase (Sigma)

3.5.3. Đánh giá khả năng FN3 tăng ái lực của enzyme với cơ chất

3.5.3.1. Cơ chất CMC

Hoạt tính cellulase của SXFn3Egc, SFn3Egc đều tăng trên

cơ chất CMC được xử lý hấp phụ trước với SFn3 và SXFn3 (Hình

3.31).Trên cơ chất được hấp phụ với SFn3 hoặc SXFn3, hoạt tính

của SXFn3Egc đều tăng mạnh hơn so với SFn3Egc. Hoạt tính của

SXFn3Egc và SFn3Egc trên cơ chất CMC được phản ứng hấp phụ

trước SFn3 tăng lần lượt là 31,5% và 23,8%. Tuy nhiên, hoạt tính

của 2 enzyme này trên cơ chất CMC được hấp phụ với SXFn3 chỉ

tăng lần lượt là 7,3% và 5,9%. Như vậy, SFn3 và SXFn3 có khả năng

thúc đẩy phản ứng của enzyme với cơ chất lên rõ rệt thông qua việc

làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất CMC.

Quan sát hình dạng của các băng protein trên bản gel không

biến tính sau phản ứng có cơ chất CMC, SFn3 và SXFn3 đều thể

hiện khả năng liên kết, phản ứng với cơ chất CMC. SFn3 và SXFn3

có khả năng làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất, làm cho phản

18

ứng diễn ra mạnh hơn so với phản ứng chỉ có enzyme. SXFn3Egc

khi phối trộn với SFn3 hầu như đã phản ứng hết với cơ chất CMC và

không còn quan sát được rõ trên bản gel so với khi được phối trộn

với SXFn3 (Hình 3.32). Điều này có thể giải thích lý do enzyme

được phối trộn với SFn3 thường cho có hiệu quả thủy phân cơ chất

tốt hơn so với khi được phối trộn với SXFn3.

Hình 3.31. Đánh giá vai trò của SFn3 và SXFn3 khi hấp phụ trên cơ

chất CMC đến hoạt tính của SFn3Egc và SXFn3Egc

Hình 3.32. Kiểm tra khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng ái lực của

enzyme với cơ chất CMC; M: Thang protein chuẩn (Thermo

Scientific)

19

3.5.3.2. Cơ chất giấy lọc

Kết quả đánh giá khả năng hấp phụ của SFn3 và SXFn3 làm

tăng ái lực của enzyme trên cơ chất giấy lọc cho thấy hoạt tính của

SXFn3Egc cũng đều tăng trên cơ chất được hấp phụ trước với SFn3

và SXFn3. Khi thử nghiệm hấp phụ SFn3 với giấy lọc, SXFn3Egc có

hoạt tính mạnh hơn so với khi được xử lý hấp phụ trước với SXFn3

(Hình 3.33). Tuy nhiên, hoạt tính của SFn3Egc trên giấy lọc được

hấp phụ SFn3 và SXFn3 không khác nhiều so với trên giấy lọc

không được xử lý hấp phụ. Từ kết quả này cho thấy, SFn3 và SXFn3

đã có quá trình hấp phụ trên bề mặt giấy lọc (đặc biệt là SFn3) làm

tăng hoạt tính của SXFn3Egc.

Hình 3.33. Đánh giá vai trò của SFn3 và SXFn3 khi hấp phụ trên cơ

chất giấy lọc đến hoạt tính của các protein SFn3Egc, SXFn3Egc; FP:

Giấy lọc (Whatman No. 1)

3.5.3.3. Đánh giá khả năng nới lỏng cấu trúc tinh thể trên bề mặt

giấy lọc

Trên ảnh chụp bề mặt giấy lọc ở độ phóng đại 500 lần và

1000 lần có thể quan sát thấy các sợi cellulose được nới lỏng và

không còn liên kết chặt chẽ với các sợi lân cận so với đối chứng âm

là mẫu không được xử lý với SFn3 hoặc SXFn3 (Hình 3.34). Ở độ

20

phóng đại 5000 lần, trên mẫu giấy lọc được xử lý với FN3, bề mặt

các sợi cellulose được phát hiện không còn nhẵn, trơn như mẫu

không xử lý. Như vậy, SFn3 và SXFn3 đã có tác động làm nới lỏng

bề mặt giấy lọc giúp cho phản ứng thủy phân cơ chất của enzyme

được thực hiện dễ dàng hơn.

Hình 3.34. Ảnh SEM cấu trúc và bề mặt các sợi cellulose của giấy

lọc (Whatman No. 1) không xử lý bởi SFn3 hoặc SXFn3 (hàng 1),

xử lý với SFn3 (hàng 2), xử lý với SXFn3 (hàng 3) ở các độ phóng

đại 500 lần (dãy A), 1000 lần (dãy B) và 5000 lần (dãy C)

3.5.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên sự hấp phụ của SFn3 và

SXFn3 với cơ chất

Để nghiên cứu tăng khả năng hấp phụ của FN3 lên cơ chất

giấy lọc, qua đó làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose của enzyme,

chúng tôi đánh giá ảnh hưởng của pH, nhiệt độ tới sự hấp phụ. Phản

ứng hấp phụ của SFn3 và SXFn3 với cơ chất giấy lọc được xác định

hiệu quả nhất ở điều kiện pH4, sau đó giảm dần ở pH6 và pH8. Hiệu

quả thủy phân cellulose của SXFn3Egc và SFn3Egc đều mạnh hơn

khi SFn3 và SXFn3 được hấp phụ với cơ chất giấy lọc ở nhiệt độ

40oC và 60

oC so với khi thực hiện ở nhiệt độ 20

oC.

21

3.6. Đánh giá một số tính chất của enzyme SXFn3Egc

3.6.1. Ảnh hưởng của pH

Hoạt tính tối ưu của SXFn3Egc đạt cao nhất ở pH 4. Enzyme

đều thể hiện hoạt tính mạnh khi pH phản ứng nằm trong khoảng từ 3-

5; ở pH 3 và pH 5, hoạt tính của enzyme đạt khoảng 80% so với ở

pH 4. Enzyme này có hoạt tính yếu hơn và giảm dần ở pH từ 7 đến 9.

3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong khoảng nhiệt độ từ 30oC đến 60

oC, enzyme có mức độ

hoạt động khác nhau: Từ 30oC đến 40

oC, hoạt tính của enzyme tăng

dần và đạt cao nhất tại 40oC; ở 45

oC đến 50

oC, enzyme vẫn thể hiện

hoạt tính mạnh (đạt từ 84-88% so với hoạt tính ở nhiệt độ tối ưu).

Tuy nhiên, hoạt tính SXFn3Egc giảm dần ở nhiệt độ 55-60oC.

3.6.3. Đánh giá độ bền nhiệt

SXFn3Egc có hoạt tính còn lại cao nhất sau khi ủ 30 phút và

giảm dần sau 60 phút đến 90 phút ở các khoảng nhiệt độ thử nghiệm

từ 30oC đến 60

oC.

3.6.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại, hóa chất

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số ion kim loại (Ca 2+

,

Mg2+

, Ni2+

, K+, Co

2+, Cu

2+, Mn

2+, Zn

2+, Fe

3+) và 6 loại hóa chất

thường sử dụng là SDS (1%), urea (1 µM), 2-mercaptoethanol (1

µM), EDTA (1 µM), tween 80 (1mM), triton X-100 (1 µM) cho thấy

chỉ có Mn2+

ở nồng độ 10 mM làm tăng hoạt tính của enzyme nhưng

không đáng kể (108%). Khi tăng nồng độ Mn2+

lên 20 mM, 30 mM,

40 mM thì hoạt tính tương đối của enzyme tăng tương ứng so với đối

chứng là 202%, 215%, 222%.

3.6.5. Đặc điểm động học của XFn3Egc

Kết quả động học của enzyme SXFn3Egc được xác định có

giá trị Km đạt 1,26 mg/ml và Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml.

22

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Từ bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase của hệ vi

khuẩn dạ cỏ dê Việt Nam đã xác định các trình tự thuộc 11 họ GH

khác nhau (GH1, 3, 5, 8, 9, 16, 44, 48, 64, 74, 94) và được chú giải

chủ yếu có hoạt tính beta-glucosidase họ GH3 và endoglucanase họ

GH5, GH8, GH9. Các trình tự được xác định có nguồn gốc chủ yếu

thuộc ngành Bacteroidetes và Firmicutes với 2 loài chiếm ưu thế nhất

là Bacteroides uniformis, Prevotella buccae.

2. Đã xác định được 243 ORF (148 ORF hoàn thiện) mã hóa

cellulase có cấu trúc module, chứa module Ig hoặc FN3. Trong đó,

100% endoglucanase GH9 có chứa module Ig (17 ORF). Trong tổng

số 131 ORF hoàn thiện mã hóa cellulase chứa module FN3 phát hiện

được tới 99,2% module FN3 đi kèm với module xúc tác beta-

glucosidase GH3 và chỉ có một module FN3 đi kèm với

endoglucanase GH5. Cấu trúc endoglucanase GH5 chứa module FN3

là cấu trúc mới ít được phát hiện và nghiên cứu.

3. Đã tổng hợp và biểu hiện trình tự mã hóa cellulase GH5

(XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module khác nhau (Fn3, XFn3,

Fn3Egc, Egc) trong E. coli để nghiên cứu vai trò của module FN3

trong cấu trúc của enzyme. Module FN3 được xác định có khả năng

làm tăng tính tan và ổn định cấu trúc vùng xúc tác của enzyme, nới

lỏng cấu trúc cellulose tinh thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme

tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn làm tăng ái lực của

enzyme lên cơ chất CMC.

23

4. Enzyme SXFn3Egc hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 4.

Enzyme ổn định và bền ở dưới 60oC trong 90 phút. Các thông số

động học của enzyme là Km đạt 1,26 mg/ml và Vmax đạt 148,12

µmol/min/ml.

5. Hoạt tính endoglucanase của SXFn3Egc tăng lên 2 lần

khi sử dụng 40 mM Mn2+

và giảm khi bổ sung các ion Ca2+

, Mg

2+,

Ni2+

, K+, Co

2+, Cu

2+, Zn

2+, Fe

3+ với nồng độ cuối cùng là 10 mM và 6

loại hóa chất thường sử dụng là SDS (1%), urea (1 µM), 2-

mercaptoethanol (1 µM), EDTA (1 µM), tween 80 (1mM), triton X-

100 (1 µM).

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu đánh giá vai trò của các module FN3 và

các module chưa rõ chức năng khác như Ig, X trong cấu trúc của

cellulase có cấu trúc module để tiến tới sản xuất hỗn hợp các enzyme

phù hợp với loại từng loại cơ chất và mục đích sử dụng nhằm ứng

dụng trong xử lý môi trường và sản xuất nhiên liệu sinh học.

24

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải, Xây

dựng probe để khai thác và chọn gen mã hoá cho beta-glucosidase

GH1 từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome dạ cỏ dê, Tạp chí Y

học Việt Nam, 2017, 458, 190-197.

2. Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Nguyễn Thị Minh

Thu, Lưu Hàn Ly, Lê Tùng Lâm, Phùng Thị Lan, Trương Nam

Hải, Khai thác gen mã hóa cho cellobiose phosphorylase GH94 từ

dữ liệu DNA metagenome dạ cỏ dê và biểu hiện gen Celp1 trong E.

coli, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 2018, 23, 75-82.

3. Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Hữu Đức,

Vũ Thị Ly, Trương Nam Hải, Xây dựng probe để khai thác và

chọn gen mã hóa beta-glucosidase GH3 từ dữ liệu DNA

metagenome dạ cỏ dê, Tạp chí KH&CN nhiệt đới, 2018, 15, 50-58.

4. N. K. H. Viet, N. T. Thao, T. N. Hai, D. T. Huyen, Application of

bioinformatic tools for prediction of active pH and temperature

stability of endoglucanases based on coding sequences from

metagenomic DNA data, Biological Forum – An International

Journal, 2019, 11(2), 14-20.

5. N. K. H. Viet, D. T. Khoa, N. H. Duong, N. K. Hai, N. T. Quy, N.

T. Tien, N. T. M. Phuong, T. N. Hai, D. T. Huyen, Some

characters of bacterial cellulases in goat rumen elucidated by

metagenomic DNA analysis and the role of fibronectin 3 module

for endoglucanase function, Asian-Australasian Association of

Animal Sciences, 2020 (SCIE, reviewed).

6. Nguyễn Thị Quý, Nguyễn Hồng Dương, Đào Trọng Khoa, Nguyễn

Khánh Hoàng Việt, Nguyễn Khánh Hải, Trương Nam Hải, Đỗ

Thị Huyền, Lựa chọn điều kiện tinh chế endoglucanase tái tổ hợp

có nguồn gốc từ vi khuẩn dạ cỏ dê ở tế bào Escherichia coli, Tạp

chí Sinh học, 2020, 42 (1): 73-81.

7. Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Hà Thị Thúy Hoa, Trương Nam Hải,

Đỗ Thị Huyền, Đánh giá ảnh hưởng của một số kim loại và hóa

chất đến hoạt tính của endoglucanase GH5 được khai thác từ dữ

liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê, Tạp chí Công nghệ sinh

học, 2020, (Chấp nhận đăng).