các phương pháp phát hiện e. coli trong thực phẩm.doc

[Type text] [Type text] [Type text]

Trường Đại Học Kỹ Thuật – Công Nghệ TP.HCM

Khoa Công Nghê Thực Phẩm

Đề tài:

-Tp.HCM tháng 11/2011-

[Type text]


Mục lụcChương 1 : Tổng quan................................................................................................4

I. Sơ lược về vi khuẩn E.coli.......................................................................................4

1. Đặc điểm sinh học...................................................................................................4

1.1 Hình thái..................................................................................................................4

1.2 Tính chất nuôi cấy...................................................................................................4

1.3 Tính chất hóa sinh...................................................................................................5

1.4 Kháng nguyên.........................................................................................................6

1.5 Phân loại..................................................................................................................6

2. Khả năng gây bệnh.................................................................................................7

3. Chẩn đoán vi sinh vật.............................................................................................12

3.1 Chẩn đoán trực tiếp.................................................................................................12

3.2 Chẩn đoán gián tiếp.................................................................................................12

4. Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh........................................................................13

4.1 Điều trị....................................................................................................................13

4.2 Phòng bệnh..............................................................................................................13

Chương II : Các phương pháp phát hiện E.coli.......................................................14

I. Phương pháp truyền thống.....................................................................................14

1. Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN.........................................................14

1.1 Nguyên tắc..............................................................................................................14

1.2 Quy trình phân tích..................................................................................................14

1.3 Cách đọc kết quả.....................................................................................................15

2. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.........................................15

2.1 Nguyên tắc..............................................................................................................15

2.2 Môi trường và hóa chất...........................................................................................15

2.3 Quy hoạch phân tích................................................................................................16

2.4 Cách tính kết quả.....................................................................................................16

3. Phương pháp làm giàu vi khuẩn............................................................................17

3.1 Nguyên lý................................................................................................................17

3.2 Thiết bị và đồ thủy tinh...........................................................................................17

3.3 Môi trường và thuốc thử.........................................................................................17

[Type text]


3.4 Cách làm..................................................................................................................17

II. Phương pháp hiện đại...............................................................................................22

1. Phương pháp PCR..................................................................................................22

1.1 Nguyên tắc..............................................................................................................22

1.2 Môi trường tăng sinh...............................................................................................22

1.3 Môi trường phân lập................................................................................................22

1.4 Trích ly DNA..........................................................................................................22

1.5 Qui trình multiplex-PCR.........................................................................................24

1.6 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR..............................................................24

2. Phương pháp ELISA...............................................................................................25

2.1 Nguyên tắc..............................................................................................................25

2.2 Các phương pháp ELISA........................................................................................26

2.3 Phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa................................................29

2.4 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157:H7.......................30

2.5 Ưu điểm của phương pháp E.lisa............................................................................30

3. Phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang..................30

Kết Luận......................................................................................................................34

Phụ Lục........................................................................................................................35

Tài liệu tham khảo......................................................................................................47

[Type text]

http://www.vast.ac.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=969&catid=37%3Atin-khcn-trong-nc-&Itemid=34&lang=vi


Chương I: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

I. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E.COLI)

Escherichia coli do Theodore Escherich (1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo, phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột. Trong các loài thuộc chi này, E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò quan trọng nhất trong y học.

E.coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu.

E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung. E.coli K12 là vi khuẩn được sử dụng làm mô hình nghiên cứu nhiều nhất. nhiều thành tựu về di truyền học, hóa sinh học đã được thu trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này. Ngày nay E.coli cũng được sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học.

Mặc dù E.coli là loài vi khuẩn được nghiên cứu sâu nhất, cho đến nay nó vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu, với rất nhiều phát hiện mới ở tầm phân tử, đặc biệt cơ chế bệnh sinh của các type gây bệnh (pathotype).

1. Đặc điểm sinh học1.1 Hình thái

E.coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động.

1.2. Tính chất nuôi cấy

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tùy ý. Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-400C. Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C.

Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã

[Type text]

Hình 1.1: Hình chụp vi khuẩn E.coli dưới kính hiển vi với kích


làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có váng mỏng. Những ngày sau, dưới đáy ống có thể thấy lắng cặn. E.coli không mọc trên canh thang Selenit.

Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm. Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặp dạng R, hoặc M. Trên môi trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên thạch lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey). Không mọc được trên môi trường SS.

Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sàng lọc nhanh, như EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton.

1.3. Tính chất hóa sinh

E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E.coli đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc lên men rất chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là coliform.

E.coli có khả năng sinh indole. Không sinh H2S. Không sử dụng được nguồn carbon của citrate trong môi trường Simmons. Có decarboxylase, vì vậy có khả năng khử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Betagalactosidase dương tính. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có thể dương tính.

Bảng 1.1: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia

Thử nghiệm

Các loàiE.coli (bình

thường)

E.coli (inactive

)

E.blattae

E.fergusonii

E.hermannii

E.vulneris

E.albertii

CNPG + T - T + + -Indole + T - + + - -Đỏ methyl + + + + + + ?Voges-Proskauer - - - - - - -

Citrate (Simmons) - - T T - - -

Lysine decarboxylase T T + + - T +

Arginine dihydrolase T - - - - T -

[Type text]


Ornithine decarboxylase T T + + + - +

Di động + - - + + + -D-Glucose acid + + + + + + +D-Glucose sinh hơi + - + + + + +

Lactose + T - - T T -Sucrose T T - - T - -D-Mannitol + + - + + + +Adonitol - - - + - - -Cellobiose - - - + + + -D-Sorbitol + T - - - - -D-Arabitol - - - - - - -L-Ramnose T T + + + + +Sinh sắc tố vàng - - - - + T -

ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside

+: >90% dương tính -: < 10% dương tính.

T: 10-90% dương tính

1.4. Kháng nguyên

Kháng nguyên O: người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E.coli.

Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và được chia thành ba loại: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ kính hiển vi điện tử.

Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định.

1.5 Phân loại

Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các type huyết thanh. Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau. Mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B).

Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E.coli) hay E.coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli).

- Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:

[Type text]


EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột

ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột

EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột

EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột

DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán

EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột

- Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:

MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não

UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

2. Khả năng gây bệnh

E.coli là thành viên thuộc nhóm vi hệ bình thường của đường tiêu hóa, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%). Tuy nhiên, E.coli cũng là 1 vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E.coli là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Theo báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp (1988-1994) thì E.coli đứng thứ hai (sau S.aureus) về tỷ lệ phân lập được (tính chung tất cả các loại bệnh phẩm) ở nước ta.

Những type huyết thanh có khả năng gây bệnh thường gặp trên lâm sàng là: O111B4, O86B7, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O26B6, O25B15, O128B12.

Cơ chế gây bệnh của E.coli khác nhau tùy loại:

ETEC-E.coli sinh độc tố ruột

Hai yếu tố động lực quyết định khả năng gây bệnh của ETEC là: khả năng bám dính vào niêm mac ruột và sản xuất độc tố. Khả năng bám dính và cư trú trên tế bào biểu mô ruột non là điều kiện đầu tiên để có thể gây bệnh. Khả năng này có vai trò của kháng nguyên CFA (clonisation factor antigen) đã được mã hóa bởi gen trên plasmid.

Quyết định khả năng gây tiêu chảy của ETEC là độc tố ruột. Có hai loại độc tố ruột: loại không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) và loại chịu nhiệt ST (heat stable toxin). Một chủng E.coli có thể sinh một trong hai hoặc cả hai độc tố đó.

[Type text]


Độc tố ruột LT là ngoại độc tố, gồm hai loại LT I được mã hóa bởi gen trên plasmid và LT II được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể. LT I và LT II có cấu trúc và cơ chế tác động giống nhau và giống với độc tố ruột của vi khuẩn tả. Cấu tạo của LT gồm 1 tiểu phần A (active) với phân tử lượng 25.000 Dalton và năm tiển phần B (binding) với phân tử lượng 11.500 Dalton. LT bám vào thụ thể GM1 của tế bào biểu mô ruột non nhờ tiểu phần B. Tiều phần A được đẩy vào tế bào biểu mô hoạt hóa enzyme adenylate cyclase làm tăng AMP vòng (cAMP-cyclic adenosine monophosphate), dẫn đến làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl-. Hậu quả của quá trình này là áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng, nước được kéo từ tế bào ra lòng ruột gây tiêu chảy.

Độc tố chịu nhiệt ST có trọng lượng phân tử xấp xỉ 5000 Dalton. ST tác động lên ruột bằng sự hoạt hóa enzyme guanylate cyclase làm tăng GMP vòng (cGMP-cyclic guanosine monophosphate). GMP vòng gây rối loạn chuyển hóa nước và điện giải giống như AMP vòng. ST còn làm mất hoặc làm teo một phần nhung mao của tế bào biểu mô ruột. Người ta đã nói đến ST-I và ST-II. ST-I gồm ST-Ia và ST-Ib. Hầu hết các chủng sản xuất ra ST-Ib phân lập được từ người, còn ST-Ia thì hầu hết từ động vật hoặc các thức ăn có nguồn gốc động vật. Chưa gặp các chủng sinh ST-II gây tiêu chảy ở người.

Tiêu chảy do ETEC thường khởi phát đột ngột, phân toàn nước không có nhày, máu.

EIEC-Ecoli xâm nhập ruột

EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140MDa. Các gen trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa-Invasion plasmid antigen). EIEC cho kết quả (+) tính trong thử nghiệm khả năng gây viêm kết giác mạc chuột lang (thử nghiệm Sereny). EIEC còn có khả năng sản xuất độc tố ruột giống một số Shigela. Gen mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin). Cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. Vì vậy trong y văn hiện nay viết căn nguyên gây bệnh lỵ trực khuẩn (bacillary dysentery) gồm Shigella và EIEC. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào rối mới xâm lấn sang các tế bào khác. Tổn thương nhất chính là viêm loét hoại tử niêm mạc đại tràng. Triệu chứng lâm sàng điển hình là đi ngoài phân ít, có lẫn nhày máu.

EAEC-E.coli bám dính kết tập ruột

EAEC thường gây tiêu chảy kéo dài hoặc mạn tính, nhất là ở trẻ em. Nó cũng là một trong những căn nguyên quan trọng của nhiễm khuẩn đường tiêu hóa ở khách du lịch. Cơ chế bệnh sinh trong tiêu chảy do EAEC vẫn chưa được sáng tỏ hoàn toàn.

[Type text]


Những yếu tố động lực chính của EAEC được nói đến gồm các diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet và độc tố EAST-1 (enteroaggregative heat-stable toxin-1). Diềm bám dính kết tập được cho là yếu tố quyết định độc lực. Ba loại AAF đã được nói đến là AAF/I, AAF/II và AFF/III, trong đó loại I và II có cấu trúc bó, loại III có dạng sợi riêng biệt. Các AFF tạo nên kiểu bám dính hình chồng gạch trên tế bào Hep-2. Yếu tố aggR có vai trò điều hòa sự biểu hiện của các AFF. Protein Pet được tiết qua màng ngoài vi khuẩn, gây tích tụ dịch và gây độc cho biểu mô tiêu hóa. EAST-1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô. Ngoài các yếu tố dộc lực nêu trên EAEC còn tiết ra 1 protein có khả năng làm tan máu và làm mất thăng bằng vận chuyển ion qua màng.

Các yếu tố độc lực nêu trên của EAEC phần lớn được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid có phân tử lượng 60 MDa. Một số yếu tố độc lực đực mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể đang được nghiên cứu.

Khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton, EAEC tạo thành váng đặc trưng. Tính chất này được dùng để sàng lọc nhanh các chủng E.coli thuộc loại EAEC.

Bảng 1.2: Tóm tắt các đặc điểm liên quan đến khả năng gây bệnh của các E.coli gây bệnh đường ruột

Loại E.coli

Gen động lựchoặc yếu tố độc lực Cơ chế gây bệnh Đặc điểm

lâm sàng

EPEC

Plasmid 50-70 MDa (EAF):Mã hóa BFP (bundle-forming pilus), Per (plasmid-encoded regulator) và Ler (LEE-encoded regulator. PAI nhiễm sắc thể (LEE)TTSS gồm: intimin (eaeA), các protein tiết; Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP (mitochondria-associated protein)EAST-1CDT (Cytolethal distending toxin)

Bám dính tại chỗ nhờ BFP

Tổn thương mô A/E

Các tổn thương A/E

Tiêu chảy cấp

ETEC

Các CFA mã hóa bởi plasmid: CFA-I (fimbriae cứng), CFA-III (tạo bó), CFA-II và CFA-IV (fimbriae mềm) và pili dài liên quan với type IV

Độc tố chịu nhiệt LT I và LT II (mã hóa bởi plasmid)

Độc tố vững bền với nhiệt STa và STb

Bám vào niêm mạc ruột non (CFA I-IV) và sản xuất các độc tố ruột LTI, LTII, STa, STb

Hoạt hóa adenylate cyclase- tăng cAMP – giảm hấp thu Na+/tăng tiết Cl- - tiêu chảyHoạt hóa guanylate

Tiêu chảy cấp, phân thường toàn nước không có nhầy máu

[Type text]


ETEC

(mã hóa bởi plasmid và transposon) cyclase- tăng cGMP – tiết chloride và/hoặc giảm hấp thu NaCl – tiêu chảy

EIEC

Các gen trên plasmid 140 MDa mã hóa các kháng nguyên xâm nhập (invasion plasmid antigen) IPaA – IpaD

Vi khuẩn bám và xâm nhập vào biểu mô đại tràng, nhân lên gây viêm loét hoại tử niêm mạc đại tràng

Hội chứng lỵ trực khuẩn

EAEC

Điểm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae)

Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggrProtein pet

Độc tố EAST-1 (enteroaggregative heat-stable toxin-1)Protein làm tan máu và mất thăng bằng vận chuyển ion qua màng

AAF tạo nên kiểu bám dính hình chồng gạchaggR điều hòa sự biểu hiện của AAFgây tích tụ dịch và gây độc tố cho biểu mô tiêu hóaEAST-1 phá hủy tế bào biểu môProtein làm tan máu và làm mất thăng bằng vận chuyển ion qua màng

Tiêu chảy kéo dài

EHEC/ VTEC

Plasmid 60 MDa mã hóa heamolysin, LCT, EspP

PAI nhiễm sắc thể

Độc tố Shiga (Stx1, Stx2, Stx2v) mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể

Độc tố Shiga:- Hủy hoại các vi nhung mao hấp thu cả tế bào biểu mô ruột.- ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào biểu mô đại tràng, dẫn đến làm chết tế bào,- gây hội chứng HUS

Tiêu chảy ra máu (do xuất huyết đại tràng)

DAEC

Các yếu tố bám dính Afa/Dr (AIDA)EAST-1

Các geb set (enterotoxin)Có thể có TTSS với esc

Afa/Dr gây bám dính phân tánEAST-1 phá hủy tế bào biểu mô

Tiêu chảy phân thường không có máu

EHEC còn được gọi là E.coli sinh độc tố Shiga. Yếu tố động lực chính của EHEC là độc tố Stx (Shiga toxin) hay độc tố gây độc đối với tế bào Vero VT (veroccytotoxin) vì vậy loại này thuộc nhóm có tên là VTEC – Verocytotoxin E.coli. Hiện nay, có ba loại Stx do EHEC sinh ra đã được xác định là Stx1, Stx2 và Stx2v. Các độc tố này được mã hóa bởi các gen prophage thích hợp trên nhiễm sắc thể.

[Type text]


Độc tố Shiga hủy hoại chọn lọc các vi nhung mao hất thu của tế bào biểu mô ruột. Nó cũng xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein dẫn đến làm chết tế bào. Hậu quả là viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân như máu. Những trường hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột.

Stx còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu (HUS-haemorrhagic uremic syndrome). Stx vào máu đến thận gây tổn thương tế bào biểu mô tiểu cầu thân, làm hẹp và tắc mao mạch tiểu cầu thận. Hậu quả của quá trình này là mức lọc của thận suy giảm, bệnh nhân bị suy thận cấp.

EPEC – E.coli gây bệnh đường ruột

EPEC được bắt đầu nghiên cứu rất sớm, từ những năm 1940. EPEC bám dính vào niêm mạc ruột gây tổn thương đặc trưng là sự phá hủy vi nhung mao ở riềm bàn chải của niêm mạc ruột. Loại vi khuẩn này có vai trò rất quan trọng trong viêm dạ dày ruột gây tiêu chảy ở trẻ em.

DAEC – E.coli bám dính phân tán

DAEC là type gây bệnh được mô tả tương đối gần đây. Nó được xác định là một type gây bệnh riêng vì không có các gen độc lực đặc trưng của các type khác đã được mô tả trước.

Khác với E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC), các E.coli gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC) là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội khi “lạc chỗ”. Chúng có thể là thành viên của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng khi vào máu, vào dịch tủy não, vào đường tiết niệu thì trở nên gây bệnh, nhất là ở những người có cơ chế đề kháng bị suy giảm. Tuy nhiên đã xác định được những gen độc lực của ExPEC thường gặp trong các nhiễm trùng ngoài đường ruột.

MAEC có kháng nguyên vỏ có liên quan về mặt hóa học và miễn dịch với polysaccharide nhóm B của Neisseria meningitides. Cho đến nay, hiểu biết về sự nhạy cảm của trẻ sơ sinh với loại E.coli này chưa đầy đủ. Nhiều tác giả cho rằng có sự liên quan chủ yếu đến cơ địa của trẻ. Theo kết quả của nhiều nghiên cứu, tới 80% các trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh do E.coli.

UPEC là nguyên nhân chủ yếu của nhiễm trùng đường tiết niệu. yếu tố độc lực quan trọng của UPEC là P-pili. Nhờ Pili này, E.coli có thể gắn đặc hiệu vào kháng nguyên P, là một trong các kháng nguyên nhóm máu. Ngoài ra nó coàn có một số yếu tố độc lực khác cũng tham gia vào cơ chế gây bệnh. v\các nhóm huyết thanh hay gặp là O1, O2, O4, O6, O7 và O75. Các chủng có kháng nguyên K1, K2, K3, K5, K12,K13 là hay gặp nhất. những vi khuẩn này thường có các gen mã hóa cho các yếu tố độc lực như yếu tố bám dính, vỏ, các độc tố.

[Type text]


3. Chẩn đoán vi sinh vật

3.1. Chẩn đoán trực tiếp

Bệnh phẩm khác nhau tùy bệnh: là phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu, máu nếu là nhiễm khuẩn máu…

Qui trình chuẩn đoán trực tiếp E.coli cơ bản gống với qui trình chuẩn đoán các vi khuẩn đường ruột.

Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp đối với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước tiểu hoặc nước não tủy.

Đối với viêm màng não mủ có thể phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn bằng phản ứng ngưng kết latex. Dễ làm, cho kết quả rất nhanh và độ tin cậy rất cao. Nguyên lý của phản ứng này như sau: các hạt latex có gắn kháng thể kháng E.coli gây bệnh được trộn dịch nảo tủy, nếu trong bệnh phẩm có kháng nguyên đặc hiệu của E.coli thì phản ứng sẽ dương tính. Đó là phản ứng ngưng kết thụ động.

Phương pháp chuẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập. Bệnh phẩm phân được nuôi cấy trên môi trường phân lập có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên môi trường đặc, trước đây thường sử dụng thạch thường, hiện nay có môi trường uriselect vừa có giá trị cấy đếm, vừa có khả năng định danh. Tiến hành cấy máu khi nghi có nhiễm khuẩn máu.

Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa học và định tên bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh mẫu.

Để xác định các E.coli sinh độc tố người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp quai ruột, phương pháp thử nghiệm trên tế bào nuôi, phương pháp đồng ngưng kết, ELISA…

Kỹ thuật khuếch đại gen PCR cũng đã được áp dụng trong chẩn đoán E.coli. Ở nước ta hiện nay chủ yếu mới sử dụng PCR trong định danh khi vi khuẩn đã được phân lập thuần nhất. Các kỹ thuật PCR xác định E.coli trực tiếp từ bệnh phẩm đang được nghiên cứu phát triển.

3.2. Chẩn đoán gián tiếp

Trên thực tế phương pháp huyết thanh học không được sử dụng để chẩn đoán các nhiễm khuẩn do E.coli.

[Type text]


4. Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh

4.1 Điều trị

E.coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là các chủng phân lập được từ nước tiểu, vì vậy cần phải làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp.

Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị trong điều trị như bồi phụ nước, điện giải trong trường hơp ỉa chảy (việc này nhiều khi có vai trò quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết các cản trở trên đường tiết niệu, rút ống thông sớm nếu có thể được.

4.2. Phòng bệnh

Hiện nay chưa có phương pháp nào phòng bệnh đặc hiệu. Để đề phòng nhiễm khuẩn đường tiêu hóa do E.coli, thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác.

Thực hiện các biện pháp ngăn ngừa nhiễm trùng bệnh viên vì E.coli là một trong các vi khuẩn gây bệnh cơ hội quan trọng.

Để phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu do E.coli: thực hiện vệ sinh vùng hậu môn và bộ phận sinh dục ngoài, thực hiện nghiêm túc nguyên tắc vô trùng khi phải tiến hành thăm dò hoặc đặt thông đường tiết niệu. Điều trị loại trừ các yếu tố nguy cơ khác.

[Type text]


Chương II: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E.COLI

I. Phương pháp truyền thống1. Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN1.1 Nguyên tắc

Số lương E.coli trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp có thể được xác định bằng phương pháp MPN ( Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và được vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.

Môi trường và hóa chất :- Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate)- Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL)- Môi trường lỏng E.coli (E.coli medium, canh EC)

Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham.

- Môi trường thạch đĩa EMP- Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate)- Canh MR-PV- Thuốc thử Methyl Read- Thuốc thử α-napthol.

I.2 Quy trình phân tích

Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng 10 -1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng vi sinh vật trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37 0C trong 48 giờ. Ghi nhận ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng.

[Type text]


Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,20C trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng.

Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ông (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa MBN. Ủ các đĩa này ở 370C trong 24 giờ để tìm khuẩn lạc E.coli giả định (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC. Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + - - chính là E.coli. Ống nghiệm cho kết quả trong môi trường EC và khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E.coli (+). Thực hiện tương tự cho tất cả các ông nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.

1.3 Cách đọc kết quả

Ở tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ông nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 x 3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.

2. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc2.1 Nguyên tắc

Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 440C trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms. Khẳng định khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC.

2.2 Môi trường và hóa chất- Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường Violet Red Bile

Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 450C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng.

- Môi trường canh Escherichia coli broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham. Các ống EC này được bảo quản ở 2 – 80C.

- Môi trường canh Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth (LST Broth) được chuẩn bị tương tự môi trường canh EC.

- Môi trường canh Tryptone Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng.

[Type text]


- Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng, để nguội và bảo quản ở 2-80C cho đến khi sử dụng.

- Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng có màu xanh lục.

- Thuốc thử Kovac’s.2.3 Quy trình phân tíchMẫu được đồng nhất hóa bằng cách đối với mẫu rắn xay nhuyễn mẫu trong điều

kiện vô trùng rồi cân chính xác 10g (hoặc 25g), đối với mẫu lỏng hút 10ml (hoặc 25ml), bổ sung vào trong bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được hấp khử trùng. Lắc đều trong một thời gian nhất định (ít nhất là 2 phút đối với mẫu rắn). Sau khi được làm đồng nhất bằng cách trên, dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu.

Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng. Dung dịch này có độ pha loãng 10-2, sau đó tiếp tục chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung dịch pha loăng ta sẽ thu được dịch mẫu có độ pha loãng 10-3. Tiếp tục thực hiện để được các độ pha loãng thập phân tiếp theo sao cho chứa <100 tế bào E.coli trong 1ml dung dịch pha loãng.

Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt 450C. Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần để trộn dịch mẫu với môi trường. Để nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổng thương.

Bổ sung vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 ± 10C trong 24 – 48 giờ. Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng.

Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5 mm), dung que cấy vòng chuyền sang môi trường canh EC, ủ ở 44 ± 0,50C trong 24 giờ.

Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dung que cấy vòng chuyền sang các môi trường sau: canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường trên ở 44 ± 0,50C trong 24 giờ

Thử nghiệm Indol, Methyl Read, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( IMViC là + + - -).

2.4 Cách tính kết quảDựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ khẳng định, tính mật độ của E.coli theo

công thức sau:A (CFU/mg hay CFU/ml) = x R

[Type text]


N: tổng số khuẩn lạc đếm đượcni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãngV: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩafi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếmR: tỷ lệ khẳng định

3. Phương pháp làm giàu vi khuẩn

3.1 Nguyên lý

Phương pháp này dựa vào làm giàu vi khuẩn trước trong canh thang dinh dưỡng và MacConkey, rồi làm giàu trong canh thang LST và EE sau đó ria lên thạch L-EMB. Những khuẩn lạc khả nghi được kiểm tra về đặc tính sinh hóa và huyết thanh của EEC.

3.2 Thiết bị và đồ thủy tinh

1. Chậu nước 440C và 41,50C2. Tủ ấm 350C3. Máy pha trộn4. Ống nghiệm, pipet, đĩa Petri

3.3 Môi trường và thuốc thử

1. Môi trường lên men (carbohydrate fermentation medium) (mt 46)2. Thạch L-EMB (Levine’s methylene blue agar) (mt 76)3. Canh thang EE (Enteric enrichement broth) (mt 14)4. Môi trường indole và thuốc thử (mt 44, mt 98)5. Canh thang LST (Lauryl sulphate tryptose broth) (mt28)6. Thạch MacConkey (mt 80)7. Canh thang MacConkey (mt 17)8. Canh thang nitrate (Nitrate broth) (mt 19)9. Canh thang dinh dưỡng (Nutrient broth) (mt 6)10. Canh thang KCN (Potassium cyanide broth) (mt 3)11. Thạch TSI (Triple sugar iron agar) (mt 86)12. Canh thang urê (các thành phần là thạch urê nhưng không có agar) (mt 93)13. Môi trường V.P (Voges Proskauer medium) (mt 54)14. Kháng huyết thanh E.Coli

[Type text]


3.4 Cách làm

1. Chuẩn bị mẫu:Cân 25g mẫu bằng thao tác vô khuẩn rồi cho vào 225ml canh thang MacConkey và 225ml canh thang dinh dưỡng trong blender vô khuẩn và làm đồng nhất trong 30 giây (1:10)

2. Ria thẳngRia từ canh thang dinh dưỡng đồng nhất lên thạch L-EMB, thạch MacConkey. Ủ ấm 350C trong 24h.

3. Làm giàu vi khuẩn :ủ ấm canh thang MacConkey ở 350C trong 20h , chuyển một quai cấy sang 30ml canh thang LST. Ủ ấm 440C trong 20h. Ủ ấm canh thang dinh dưỡng 350C trong 6h, Chuyển một quai cấy sang 30ml canh thang EE. Ủ ấm 41,50C trong 18h.

4. Xét nghiệm sơ bộ về huyết thanh :Trung hòa canh thang LST và EE với 10% NaHCO3, nhỏ một giọt canh thang của mỗi thứ lên trên phiến kính sạch và cho thêm một giọt huyết thanh đa giá OB và một giọt nước muối 0,5%. Trộn các giọt trên và xem ngưng kết.

5. Xác nhận tính chất sinh vật hóa học :Ria từ canh thang LST dương tính lên thạch L-EMB và EE dương tính lên

thạch MacConkey và thạch L-EMB. Ủ ấm ở 350C trong 24h.5.1 Chọn những khuẩn lạc điển hình và cấy vào môi trường TSI, VP, indole,

urease, KCN, citrate và adonitol. Đồng thời cấy lên mặt thạch nghiêng PCA cùng một khuẩn lạc dùng để kiểm tra huyết thanh.

Đặc tính sinh vật hóa học của E.Coli

TSI + acid

(H2S) V.P. +

Indole -

Urease +

KCN -

Adonitol -

Cytochrome oxidase -

5.2 Nhận diện huyết thanh E.Coli gây bệnh đường ruột

- Thạch EMB

[Type text]


Thạch Eosin methylene thạch màu xanh, có chứa thuốc nhuộm eosin và xanh methylene. EMB agar chọn lọc bởi vì thuốc nhuộm anilin trong phương tiện truyền thông tím ức chế sự phát triển của sinh vật Gram dương. Lactose men chuyển hóa đường lactose trong các phương tiện truyền thông và sản xuất các sản phẩm phụ axit, gây ra một sự thay đổi màu sắc trên môi trường. Vì vậy, EMB cũng là một phương tiện khác biệt . Sản xuất axit mạnh mẽ bởi các sinh vật như E.coli kết quả trong một ánh xanh kim loại. Yếu hơn quá trình lên men kết quả lactose trong môi trường với một màu hơi hồng tím . Thuộc địa của men nonlactose vẫn không màu, hoặc ít nhất không đậm hơn so với màu sắc của các phương tiện truyền thông

ư

[Type text]

Hình 2.1: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch EMB

Hình 2.3: Thử nghiệm Indole

Ống 1: E.coli cho kết quả dương tính

Ống 2: E.coli cho kết quả âm tính

(1) (2)(a) (b)


[Type text]

Hình 2.4: Thử nghiệm Urease

(1): E.coli (-) ; (2): E.coli (+)

Hình 2.5: Thử nghiệm Cytochrome oxidase với vi khuẩn E.coli

(A) Cho kết quả (-)

(B) Cho kết quả (+)

Hình 2.6: Thử nghiệm VP

(a): E.coli (+); (b): E.coli (-)

(A) (B)

(1) (2)

(a) (b)


[Type text]

Hình 2.7: Thử nghiệm MR

(a): E.coli (+); (b): E.coli (-)

Hình2.8. : Thử nghiệm Citrate với vi khuẩn E.coli

(a): E.coli (+)

(b): E.coli (-)


II. Phương pháp hiện đại1. Phương pháp PCR (polymerase Chain Reaction)1.1 Nguyên tắc

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.

1.2 Môi trường tăng sinh

Do số lượng E.coli nhóm STEC, đặc biệt là E.coli gây bệnh hiện diện trong thực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập cần sử dụng môi trường tăng sinh pepton đệm có bổ sung kháng sinh cefiximw (0,0125mg/l) và vancomycin (8mg/l) để ức chế các vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn sống hoại sinh khác.

1.3 Môi trường phân lập

Môi trường phân lập là môi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey (SMAC), Sorbitol MacConkey (CT-SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime (0,05mg/l) và tellurite (2,5mg/l). Khoảng 90% E.coli đều lên men đường lactose, trên môi trường MAC, E.coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ, trên môi trường SMAC và CT-SMAC, E.coli không lên men đường sorbitol nên cho khuẩn lạc màu trắng, những dòng E.coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng.

Trên từng loại môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC chọn ngẫu nhiên 6-10 khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhóm hình thái, cấy từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống thạch nghiêng NA. Làm thử nghiệm sinh hóa IMViC cho từng khuẩn lac riêng lẻ thuộc nhóm đó để xác định E.coli.

1.4 Trích ly DNA

Việc trích ly DNA được thực hiện như sau: thu khoảng 6-10 khhuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC, hoặc CT-SMAC) cho vào eppendorf đựng sẵn 0,4-0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vào tủ âm -700C giữ trong 10 phút. Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm).

[Type text]


Sơ đồ 1: Qui trình phân lập, định tính và phát hiện gen độc lực E. coli

[Type text]

Mẫu

MAC

(370C/24 giờ)

SMAC

(370C/24 giờ)

Pepton (vancomycin, cefixime) (370C/24 giờ)

CT-SMAC

(370C/24 giờ)

Chọn 6-10 khuẩn lạc theo từng nhóm riêng: trắng hoặc

đỏ hoặc cả hai

Chọn 6-10 khuẩn lạc đỏ hồng

Cấy từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống thạch nghiêng NA (370C/24 giờ)

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã chọn theo từng nhóm riêng và mỗi nhóm cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4-0,5 ml H2O cất khử ion 2 lần

Thử IMViC (+ + - -)

Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc)

Multiplex-PCR (+)(-) Ly trích DNA riêng theo từng ống NA

Loại bỏ ống NA đã giữ Multiplex-PCR


1.5 Qui trình multiplex-PCR

1.5.1 Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong Multiplex-PCR

Mồi (primer) Trình tự oligonucleotide (5’3’)

Kích cỡ DNAđược khuếchđại (bp)

Eae-FEae-REhxA-FEhxA-RStx1-FStx1-RStx2-FStx2-RUid-FUid-R

ATTACCATCCACACAGACGGT

ACAGCGTGGTTGGATCAACCT

GTTTATTCTGGGGCAGGCTC

CTTCACGTCACCATACATATCAGTTAATGTGGTGGCGAAGGCACCAGACAATGTAACCGCTGATCCTATTCCCGGGAGTTTACGGCGTCATCGTATACACAGGAGCGCGAAAACTGTGGAATTGGGTGATGCTCCATCACTTCCTG

397

158

348

584

252

1.5.2. Các thành phần của phản ứng PCR:Mỗi phản ứng là 25µl, gồm các thành phần sau : PCR buffer 1,1 X; MgCl2 3mM;

mỗi dNTP 200µM; mỗi loại primer 7,5 pmol; Taq 2,5 µl; DNA 2µl; và nước cất vừa đủ 25µl.

1.5.3. Chu kỳ nhiệt- Tiền biến tính 950C/5 phút- Biến tính 940C/1 phút- Ủ bắt cặp 610C/1 phút- Kéo dài 720C/1 phút- kéo dài chuỗi 720C/7 phút- Điện di, đọc kết quả

Lấy 10µl sản phẩm PCR cùng với 2µl loading dye được điện di trên gel agarrose 1,6% trong TBE. Thang chuẩn (ladder) cũng được điện di đồng thời. thời gian điện di 30-35 phút ở 90V và 250 mA.

Sau khi điện di, gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp gel. Các sản

[Type text]


phẩm PCR được xác định bằng cách so với các băng băng của đối chứng dương và thang ledder 100bp.

1.6. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR Ưu điểm:

- Thời gian cho kết quả nhanh- Có thể phát hiện được nhưng vi sinh vật khó nuôi cấy. việc tăng sinh là đơi giản

hơn và đôi khi không cần thiết- Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp

huyết thanh học. không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường.- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các

vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhược điểm:

- Sự ức chế Taq DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc chiết tách và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường khi thực hiện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế.- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên

trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.- Phương pháp này không phân biệt được tế báo sống với tế bào chết, do vậy có

thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. ngược lại phương pháp

này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh vật

gây bệnh hoặc gây ngộ độc.

2. Phương pháp ELISA

2.1 Nguyên tắc

Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.

Kháng nguyên (Antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng nguyên bao gồm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và poli saccarit. Cấu trúc kháng nguyên:

[Type text]

Hình2.9: Đĩa giếng (microplate)


E.coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O ( kháng nguyên thân), K (Kháng nguyên bề mặt) và H (kháng nguyên lông).

Kháng thể ( Antibody ) là protein إل - globulin được sinh ra bởi tế bào lympo tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên

Đĩa giếng ( microplate) là một tấm phẳng với

nhiều "giếng" được sử dụng như ống nghiệm nhỏ. Microplate đã trở thành một công cụ tiêu chuẩn

trong nghiên cứu phân tích và phòng thí nghiệm thử nghiệm lâm sàng chẩn đoán. Một sử dụng rất phổ biến trong các khảo nghiệm miễn dịch liên kết enzyme ( ELISA), các cơ sở xét nghiệm chẩn đoán y tế hiện đại nhất ở người và động vật.

Elisa đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit). Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106CFU/ml(một số báo cáo cho rằng giới hạn này có thể đạt được 104)

II.2 Các phương pháp Elisa :

2.2.1 Nguyên tắc

Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.

Kháng nguyên ( Antigen ) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng nguyên bao gốm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và poli saccarit. Cấu trúc kháng nguyên:

E.coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O ( kháng nguyên thân), K (Kháng nguyên bề mặt) và H (kháng nguyên lông).

Kháng thể ( Antibody ) là protein إل - globulin được sinh ra bởi tế lympo tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên

[Type text]

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=vi&prev=/search%3Fq%3Dmicroplate%26hl%3Dvi%26biw%3D1173%26bih%3D582%26prmd%3Dimvns&rurl=translate.google.com.vn&sl=en&twu=1&u=http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA&usg=ALkJrhiqa3LYUlXhW0JACyenDNtr9FQahg


Elisa đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit). Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106CFU/ml(một số báo cáo cho rằng giới hạn này có thể đạt được 104).

2.2.2 Các phương pháp Elisa :

2.2.2.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:

- Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.

- Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn.

- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.

- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh.

- Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme).

- Rửa đĩa, các kháng thể gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.

- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).

Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KN (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này.

2.2.2.2 Sandwich ELISA:

Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):

(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT

(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt.

(3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định

(4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi

[Type text]


(5) Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán

(6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở bước 5)

(7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi.

(8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện.

(9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT.

Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được.

2.2.2.3. ELISA cạnh tranh:

(1) "Ủ" KT không được đánh dấu với KN.

(2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN.

(3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng KN càng lớn, lượng KT gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".

(4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với enzym.

(5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu.

Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu.

Một số trường hợp, enzym được gắn với KN chứ không phải KT.

[Type text]

Hình 2.10: Các bước tiến hành trong Sanwich ELISA


2.3. Phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa:

2.3.1. Phản ứng Elisa gián tiếp:

a. Nguyên liệu:

- Microplate

- Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ,conjugate (chất gắn kết) có gắn enzym

peroxidase, bub trate (chất tạo màu phản ứng, thường là TMBZ (3,3’ 5,5’

tetramethybenzodine)), PBS,PBS-Tween, Sữa tách bơ(casein).

- Máy đọc phản ứng.

b. Trình tự phản ứng:

- Bước 1. Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích hợp được gắn trưc tiếp vào đĩa microplate. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2h. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô.

- Bước 2. Phủ đĩa bằng 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô.

- Bước 3. Gắn kháng thể : 100µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng dung dịch PBS-sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37oC, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô.

- Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài : 100µl conjugate pha loãng bằng PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 5 lần, và đập khô.

- Bước 5. Cơ chất tạo màu : 100µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1M, lúc này phàn ứng có màu vàng.

- Bước 6. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.

- Kháng nguyên thu hoạch như trên, đươc đo nồng độ protein và giữa ở nhiệt độ -200C.

[Type text]


2.4 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157:H7

o E.coli O157:H7 có hai loại kháng ngyên có ý nghĩa trong chuẩn đoán là kháng nguyên O157 và H7. Vì vậy, kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitop của hai loại kháng nguyên này thường sử dụng để xác định vi khuẩn trong các hệ thống chuẩn đoán huyết thanh.

o Kháng thể đơn dòng đặc hiệu MAB 46E9-9 nhận biết đặc hiệu kháng nguyên lông H7 của loài E.coli .

o Kháng thể MAB 13C4 nhận biết theo hướng nhận biết kháng nguyên độc tố Stx1 của E.coli O157:H7.

2.5 Ưu điểm của phương pháp Elisa Ưu điểm:- Nhanh chóng và thuận tiện .- Kháng nguyên của nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể được phát hiện kể từ

khi bắt giữ kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể .Nhược điểm:- Thời gian xét nghiệm lâu.- Chỉ có các kháng thể đơn dòng có thể được sử dụng như cặp phù hợp.- Kháng thể đơn dòng có thể chi phí nhiều hơn so với các kháng thể đa dòng.- Enzyme / chất nền phản ứng trong microwells phải được đọc càng sớm càng tốt

3. Phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang

Trong số các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, E.coli O157:H7 được xem là rất nguy hiểm với liều gây độc thấp (10-100 tế bào). Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện chúng như: đếm tế bào dưới kính hiển vi, đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, miễn dịch học bằng enzym, đầu dò enzym, ELISA, kít chuẩn PCR. Phương pháp phát hiện E.coli O157:H7 trong thực phẩm mang tính pháp lý ở Việt Nam là sử dụng kỹ thuật làm giầu, xác định khuẩn lạc nghi ngờ E.coli O157:H7 trên đĩa thạch SMAC sau khi ủ ấm ở 37oC trong 24 giờ. Từ những khuẩn lạc nghi ngờ, tiến hành kiểm tra các tính chất sinh hóa và ngưng kết đặc hiệu để khẳng định là E.coli O157:H7. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp nêu trên đều không thể phát hiện chính xác số lượng vi khuẩn ở nồng độ thấp. Để khắc phục nhược điểm nêu trên, người ta đã và đang ứng dụng các loại vật liệu nano phát quang như hạt silica chứa tâm màu hay chấm lượng tử QD chứa các nhóm chức năng sinh học trên bề mặt như một chất đánh dấu huỳnh quang để phát hiện nhanh và chính xác số lượng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Khâu cốt lõi của kỹ thuật sử dụng hạt nano silica chứa tâm màu là việc chế tạo ra được phức hợp giữa kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích với hạt silica phát quang bền vững.

[Type text]

http://www.vast.ac.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=969&catid=37%3Atin-khcn-trong-nc-&Itemid=34&lang=vi


Phức hợp hạt nano silica + kháng thể đặc hiệu có thể được tạo ra bởi nhiều cơ chế khác nhau, hiện nay có 5 cách để tạo ra phức hợp này là: gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine–carboxylic; sử dụng SMCC làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine; gắn kết trực tiếp thông qua các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể; gắn kết các peptide được gắn histidine hoặc các kháng thể lên các chấm lượng tử được Ni-NIA hóa; gắn kết không hóa trị của hạt nano silica được bọc streptavidin với các kháng thể được biotin hóa biotinylated. Mỗi kiểu gắn kết có những ưu điểm và hạn chế riêng. Nhưng nhìn chung, càng nhiều cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano chứa tâm màu phát quang càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn. Sau khi tạo được phức hợp kháng thể đặc hiệu + hạt nano silica, tiến hành kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích. Có nhiều cách phát hiện vi khuẩn đích như: quan sát và đếm trực tiếp các tế bào vi khuẩn phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang; xác định số lượng vi khuẩn (VK) đích bằng đường chuẩn giữa cường độ phát quang của VK gắn hạt nano và số lượng VK trong dung dịch chuẩn. Cường độ phát huỳnh quang là hàm số f của số lượng tế bào vi khuẩn đích trong mẫu.

Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã chế tạo thành công công thức phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích + hạt nano silica băng cách găn trực tiếp các phân tử kháng thể lên bề mặt hạt silica thông qua liên kết amine-carbonxylic với sự có mặt của chất xúc tác EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) trong các điều kiện sau: EDAC/1 phản ứng là 0,9mg; tỉ lệ kháng thể với hạt silica là 40/1; thơi gian phản ứng hợp sinh 3 giờ có lắc ngang , nhiệt độ ủ ở 300C.

Phức hợp kháng thể và hạt silica được tạo thành này có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích E. coli O157:H7 trong vòng 20 phút, tỉ lệ vi khuẩn đích gắn phức hợp và phát quang đạt > 60% và sau 3 ngày vẫn phức hợp vẫn giữ nguyên hoạt tính. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật này đối vối vi khuẩn đích là 102 CFU/ml, thời gian phát hiện nhanh hơn các phương pháp thông thường nhiều lần.

[Type text]


1. 2. Ảnh 1: TEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt silicaẢnh 2: SEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt silica

Hình ảnh SEM (kính hiển vi quét) và kính hiển vi đồng tiêu của tế bào E.coli O157:H7 được đánh dấu bởi phức hợp kháng thể + hạt nano silica đã chứng minh rằng phức hợp này có thể bao bọc đều hoàn toàn và như nhau lên bề mặt tế bào vi khuẩn. Qua đó có thể khẳng định các hạt nano silica hợp sinh với kháng thể vẫn giữ nguyên tính chất phát quang hiệu quả và các phân tử kháng thể khi gắn với hạt nano silica vẫn giữ được hoạt tính và có khả năng nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích

Ảnh huynh quang: (a) phức hợp hạt nano silica – kháng thể; (b) VK găn với phức hợp kháng thể - Silica; (c) VK găn với phức hợp kháng thể - QDs

Phổ huynh quang của phức hợp hạt silica – kháng thể găn kết với vi khuẩn E. coli O157:H7. Đây là cơ sở để xây dựng đường chuẩn: cường độ phổ - số lượng E.coli O157:H7để phát hiện nhanh, nhậy số lượng vi khuẩn này ở mật độ thấp

[Type text]

Ảnh huynh quang phức hợp Silica – E. coli O157:H7: chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu Nikon C1plus – Ti-E.

Viền màu đỏ bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn là phức hợp hạt silica + kháng thể đặc hiệu


KẾT LUẬN

Hiện nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật.

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do nguyên liệu dùng chế biến hay thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn. Một trong những loại ngộc độc thực phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli.

Trong thực tế cuộc sống, theo dõi khảo sát đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm để hạn chế sự ô nhiễm và tác hại của vi khuẩn trong quá trình thu hoạch các sản phẩm nông nghiệp, chăn nuôi, đánh bắt hải sản đến quá trình ‘bảo quản chế biến và nấu nướng tới tay người tiêu dùng thường rất phức tạp và gặp nhiều khó khăn.

Do đó các phương pháp phát hiện vi khuẩn E.coli có vai trò quan trọng trong nhiệm vụ đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm làm giảm tỷ lệ ngộ độc do vi khuẩn gây nên.

[Type text]


PHỤ LỤC

I. THỬ NGHIỆM SINH HÓA

1. Thử nghiệm sinh indola. Nguyên tắc

Trytophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme trytopanse tạo nên các sản phẩm chúa gốc indol. Phản ứng trung gian chính của phản ứng oxi hóa tryptophan là indolpyruvic acid IPA. Phân tử này sau đó bị biến đổi theo hướng loại nhóm amin (deamination) thành indol hay theo hướng loại nhom1carboxyl (decarboxylation) thành skatol. Trytophanase xúc tác phản ứng loại nhóm amin để tạo thành indol. Viêc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của p-DMABA tạo nên một phức chất dạng quione màu đỏ.

Thử nghiệm này được dùng để phân biệt E.coli (+) với Klebsiella (-), Proteus mirabilis (-) với các loài Proteus khác (+), Bacillus alvei (+) với các Bacillus khác (thường là -). Heamophilus heamoglobinophilus (+) và H.influenzae (-) với các loài Haemophilus khác (thường là -), Pasteurella multocida (+) và P.pneumotropica (+) với P.haemolytica (-) và P.urea (-).

Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus rettgeri, (-) là Serratia marcescens.

[Type text]


b. Phương pháp tiến hành

Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này có thể là nước tryptone, hoặc các môi trường kết hợp như MIU (Motility Indol Urea), SIM (Sulfide Indol Motility)… khi cần kiểm tra cùng lúc nhiều đặc tính sinh hóa cần thiết. hai loại thuốc thử có thể sử dụng cho thử nghiệm này là thuốc thử Kovacs và thuốc thử Erlich. Sinh khối chủng thuần được cấy vào ống môi trường lỏng thuộc một trong các loại nêu trên, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24-48 giờ. Trước khi bổ sung thuốc thử có thể bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ.

c. Đọc kết quảThử nghiệm là (+) khi có sự xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường; là

(-) khi có lớp màu vàng của thuốc thử trên bề mặt môi trường. đôi khi có sự xuất hiện

của màu cam do skatol, là tiền chất methyl hóa của indol, tạo ra.

2. Thử nghiệm KIA, TSI

a. Nguyên tắcMôi trường KIA (Ligler Iron agar) và môi trường TSI (Triple Sugar iron Agar)

được sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S của chủng vi sinh vật

Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa hai loại đường là 1% lactose và 0,1% glucose. Tương tự, môi trường TSI có thành phần như môi trường KIA nhưng có them 1% sucrose (saccharose). Khả năng sử dụng cà hai nguồn đường là glucose và lactose hay chỉ sử dụng glucose để thu lấy năng lượng cần cho tăng trường là tùy thuộc vào di truyền của chủng vi sinh vật và có thể được theo dõi trên ống thạch chứa môi trường KIA. Khi chủng cấy lên môi trường này, có ba trường hợp có thể xảy ra đối với sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật thử nghiệm: chỉ sử dụng glucose, sử dụng các glucose và lactose, không sử dụng cà hai loại đường này. Khả năng này của vi sinh vật có thể được xác định thong qua sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường ở trên bề mặt và bên trong môi trường trong ống thạch nghiêng.

- Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, sau 18-24 giờ nuôi cấy môi trường bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể được giải thích là lượng glucose trong phần bề mặt của môi trường được vi sinh vật oxi hóa hoàn toàn thành H2O và CO2 để thu năng lượng. Để đáp ứng nhu cầu năng lượng cho tăng trưởng, vi sinh vật tiến hành dị hóa pepton trong môi trường qua đó giải phóng NH3 làm phần bể mặt của môi trường mới có pH kiềm. Ngược lại, ở phần sâu trong môi trường mới có điều kiện oxi không đầy đủ, glucose được lên men kỵ khí

[Type text]


sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường. nếu trong môi trường có chất chỉ thị là đỏ phenol thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu có màu vàng.

- Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, sau 18-24 giờ nuôi toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cá glucose và lactose ở bề mặt môi trường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà không cần phải sử dụng đến pepton.

- Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cấn cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa môi trường chỉ diển ra trên phần của bề mặt môi trường và chỉ phần này trở nên có màu đỏ. Trong khi đó, phần môi trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tược đổi màu.

Trong các trường hợp nêu trên, nếu sự lên men được tạo ra các sản phẩm khí thì khí sẽ tích tụ bên trong thành bọt khí hay sẽ làm vỡ thạch.

Trường hợp sử dụng môi trường TSI, các hiện tượng lien quan đến sử dụng nguồn carbon cũng xảy ra tương tự.

Thử nghiệm khả năng sinh H2S có thể thực hiện đồng thời trên hai môi trường này do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thị ferric ammonium citrate hiện diện trong môi trường.

b. Phương pháp tiến hànhMôi trường KIA hay TSI được pha chế, hấp khử trùng và chuyển vào các ống

thạch nghiêng sao cho đỉnh thạch nghiêng cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5cm và phần sâu có chiều cao khoảng 2,5cm. dung que cấy thẳng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần vào phần sâu của ống thạch nghiêng nhưng tránh chạm đáy ống, sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng. Sau khi cấy giống, các ống thạch nghiêng được ủ ở 370C từ 18-24 giờ. Ghi nhận màu, sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng, sự tạo thành màu nâu bởi FeS.

c. Đọc kết quả

- Thử nghiệm khả năng sử dụng đường: xem mục nguyên tắc.- Thử nghiệm sinh H2S: thử nghiệm là (+) nếu xuất hiện tủa màu nâu đen bên trong

môi trường, là (-) nếu không xuất hiện tủa nâu đen.3. Thử nghiệm MR (Methyl Red)

a. Nguyên tắcThử nghiệm MR nhằm phân biện vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng

tạo ra và duy thì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ ion H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này có màu thay đổi khác

[Type text]


nhau tùy dãy pH hay nồng đô ion H+: đỏ khi ph thấp hơn 4,4 màu cam trong vùng pH 5,0 – 5,8, màu vàng khi pH trên 6,0. Hàm lượng ion H+ này phụ thuộc vào tỷ lệ CO2 và H2và con đường chuyển hóa đường của từng loài vi sinh vật.

Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng MR thường được xác định trpong khoảng 18-24 giờ. Tuy nhiên các vi sinh vật này đều tạo acid trong môi trường ngay khi chúng bắt đầu tăng trưởng. khi héo dài thời gian nuôi cấy, các vi sinh vật có phản ứng MR (+) có đặc tính là tích lũy acid trong môi trường ngày càng nhiều hơn và độ pH trong môi trường ngày càng giảm; ngược lại, trường hợp các vi sinh vật cho phản ứng MR(-) sẽ tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm có tính acid đã được tạo ra thành các sản phẩm trung tính làm cho pH trong môi trường chuyển dần về phía trung tính. Thử nghiệm MR phụ thuộc rất nhiều vào thời gian nuôi cấy và thường được tiến hành trong thời gian khoảng 3-5 ngày ở 370C.

Thử nghiệm này giúp phân biệt E.coli (+) với Klepsiella (-); Enterbacter aerogenes (-) với Enterbacter cloacae (+); Yersinia spp. (+) với các loài Bacillus Gram âm khác không thuộc đường ruột (-); xác định Listeria monocytogenes (+).

Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus rettgeri, (-) là Serratia marcescens.

b. Phương pháp tiến hànhThử nghiệm được tiến hành trong các ống môi trường lỏng Glucose Phosphate

(MR-VP broth). Dung que cấy vòng cấy một lượng nhỏ sinh khối từ khuẩn lạc chủng thuần trên môi trường KIA, ủ ở 370C trong khoảng 2-5 ngày. Them vài giọt thuốc thử methyl red (0,02% trong hỗn hợp cần nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay.

c. Đọc kết quảThử nghiệm MR là (+) khi môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử; là

(-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thục hiện lại thử nghiệm.

4. Thử nghiệm VP (Voges-Prokauer)a. Nguyên tắcỞ vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ glucose qua

con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid. Để khôi phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân, ở các loài vi sinh vật, sau đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa theo các con đường sinh hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác nhau. Họ Enterbacteriaceae có đặc tính chung là lên men sinh hỗn hợp acid như acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhóm không sinh 2,3-butanediol (ví dụ như E.coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ như Klebsiella, Enterobacter). Phân tử 2,3-butanediol có thể chuyển hóa qua lại thành aceton: trong điều kiện có oxi và môi trường có tính kiềm, 2,3-butanediol bị oxi hóa thành aceton

[Type text]


nhờ xúc tác của enzyme 2,3-bute\anediol dehydrogenase; ngược lại, acetoin có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase. Ngoài ra, acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl. Như vậy, khi có oxi và pH kiềm, 2,3-butanediol bị chuyển hóa thành acetion, đến lượt mình acetion bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP. Nhu vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterbacteriaceae dựa trên sự oxi hóa acetion (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetion thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-napthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Trong thuốc thử Koblentz và O’Meara có chứa creatime có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine.

Thử nghiệm VP được dung để phân biệt Klebsiella pneumonia (+) và Enterbacter (+) với E.coli (-), phân biệt một số loài của Klebsiella, để xác định Listeria monocytogenes (+).

Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Serratia marcescens, (-) là Proteus rettgeri.

b. Phương pháp tiến hànhMôi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs

(môi trường MR-VP), có pH 6,(. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối ( trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz như dưới đây thì cấy nhiều sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 370C trong 20-48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết. một số loài như Enterobacter hafniae có kết quả thử nghiệm VP không ổn định ở 370C nhưng cho (+) ở 25-300C. Do vậy, trường hợp nghi ngờ nên tiến hành ủ các ống môi trường song song ở hai điều kiện nhiệt độ. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. có 3 loại thuốc thử VP là:

- Thuốc thử Barrit: gồm dung dịch A là 5% α-napthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH.

- Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-napthol trong cồ 95%, dung dịch B là 0,3% creatine 40% KOH hoặc NaOH.

- Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0,3% creatine 40% KOH hoặc NaOH.

Khi sử dụng các loại thuốc thử có 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. đối với thuốc thử 1 thanh2n phần, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. lắc nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetone. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ.

Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đố chứng như E.coli (VP-) và Enterobacter cloacae (VP+).

c. Đọc kết quả

[Type text]


Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường, là (-) khi bề mặt môi trường không đổi màu.

5. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citratea. Nguyên tắcMột số vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất để

thu lấy năng lượng và vật chất. sự biến dưỡng citrate thường thong qua sự kết hợp với acetylCoA thành oxaloacetate để vào chu trình tricarboxylic acid (chu trình Krebs). Sản phẩm biến dưỡng citrate thay đổi tùy pH của môi tường. khi pH tăng, môi trường chuyển sang kiềm, lượng acetate cà formate tạo thành sẽ tăng trong khi lactate và CO 2

giảm. Ở pH trung tính sản phẩm chủ yếu là COP2 và acetate. Ở pH acid, sản phẩm tạo ra chủ yếu là acetoin và lactate. Như vậy sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Như vậy trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối ammonium, khả năng tăng trưởng của chủng sẽ thể hiện qua khả năng biến dưỡng nguồn carbon citrate và nguồn đạm ammonium làm tăng giá trị pH của môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thỉ bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.

Thử nghiệm này được dùng để phân biết nhóm Klebsiella, Enterbacter (+) với E.coli (-) trong thử nghiệm IMViC, hoặc để phân biệt Edwardsiella (-) với Salmonella (+).

Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus rettgeri, (-) là Staphylococcus epidermidis.

b. Phương pháp tiến hành

Môi trường sử dụng cho thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate là môi trường rắn Simmons Citrate Agar (CSA) hay môi trường Christensens Citrate Sulfide Agar (CCSA).

Môi trường CSA chứa sodium citrate hoặc potassium citrate làm nguồn carbon duy nhất, chỉ thị bromothymol blue, pH 6,9. Chỉ thị này có màu vàng ở pH dưới 6,0 màu xanh lục ở pH trung tính và màu xanh dương ở ph lớn hơn 7,6. Chủng thuần trên môi trường KIA hoặc môi trường thích hợp khác được cấy ria trên bề mặt môi trường CSA rắn trong ống thạch nghiêng. ống thạch được ủ ở 350C trong 24-48 giờ hoặc kéo dài đến 4 ngày khi cần thiết.

Môi trường CCSA chứa nguồn đạm là cystein, chỉ thị màu là phenol red, pH 6,7. Môi trường chưa sử dụng có màu thay đổi từ màu kem đến nâu. Ở pH acid (dưới 6,8), màu chỉ thị trở thành vàng và ở pH kiềm (trên 8,4) trở thành màu đỏ. Chủng vi sinh vật được cấy và ủ trong điều kiện tương tự như trường hợp môi trường CSA.

[Type text]


c. Đọc kết quả- Trường hợp môi trường CSA, thử nghiệm la (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi

trường chuyển sang màu xanh dương; (-) khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục.

- Trường hợp môi trường CCSA, thử nghiệm là (+) khi môi trường chuyển sang màu đỏ; (-) khi môi trường không đổi màu.

II. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ THÔNG DỤNG

1. Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL)Peptone 10 gLactose 10 gMật bò 20 gBrilliant green 0,0133 gNước cất 1 lít

Hòa tan peptone và lactose vào trong 500ml nước cất, mật bò vào trong khoảng 200ml và brilliant green trong khoảng 100ml nước cất. trộn đều 3 dung dịch đạt thể tích cuối là 1 lít; chinh pH môi trường khoảng 7,4. Rót vào mỗi ống nghiệm có chứa ống Durham 10ml môi trường BGBL. Hấp ở 1100C trong 15 phút. pH 7,2 ± 0,2 ở 250C.2. EC Broth ( Canh EC)

Trypticase or tryptose 20 gMuối mật No.3 1,5 gLactose 5 gK2HPO4 4 gKH2PO4 1,5 gNaCl 5 gNước cất 1 lít

Rót môi trường vào ống nghiệm có chứa ống Durham. Hấp ở 1210C trong 15 phút. pH 6,9 ± 0,2.3. Canh thang EE

Peptone 10,0 gGlucose 5,0 gDisodium hydrogen phosphate 8,0 gPotassium dihydrogen phosphate 2,0 gOx bile 20,0 gBrilliant green 0,015 gNước cất 1000,0 mlĐiều chỉnh pH tới 7,2; chia ra bình, cứ mỗi bình 30ml. Tiệt khuẩn 5 phút ở 1210C.

4. Canh thang dinh dưỡng

[Type text]


Beef extract 3,0 gPeptone 5,0 gNước cất 1000,0 ml

Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C5. Canh thang KCN

Proteose peptone 3,0 gSodium chloride 5,0 gPotassium dihydrogen phosphate 0,225 gNước cất 1000,0 mlĐiều chỉnh pH tới 7,6. Diệt khuẩn 15 phút ở 1210C, để nguội và cho vào tủ lạnh 5-

80C. Bằng cách vô khuẩn và thận trọng, cho thêm 15 ml cyanid 0,5% lạnh (5-80C) lắc nhẹ nhàng và phân ra ống nghiệm , mỗi ống 1 ml, đóng nút bằng nút bần thấm perafin và bảo quản ở 5-60C.6. Canh thang L-ST

Tryptose, tryptone hoặc trypticase 20,0 gLactose 5,0 gDipotassium monohydrogen phosphate 2,75 gPotasssium dihydrogen phosphate 2,75 gSodium chloride 5,0 gSodium lauryl sulphate 0,1 gNước cất 1000,0 ml

Điều chỉnh pH tới 6,8. Phân ra ác ống nghiệm, mỗi ống 10 ml với ống Durham lộn ngược. Tiệt khuẩn 10 phút ở 1210C.7. Canh thang MacConkey

Peptone 20,0 gLactose 10,0 gOx gall 5,0 gBromocresol purple 0,01 gNước cất 1000,0 mlĐiều chỉnh pH tới 7,3; phân vào bình tam giác, mỗi bình 225 ml. Tiệt khuẩn 15

phút ở 1210C.8. Canh thang Nitrate

Meat extract 3,0 gPeptone 5,0 gPotassium nitrate 1,0 gNước cất 1000,0 ml

Điều chỉnh pH tới 7,0; phân ra ống nghiệm. Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C.9. Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate)

Trytose 20 gLactose 5 g

[Type text]


Sodium chloride 5 gK2HPO4 2,75 gKH2PO4 2,75 gLauryl sulphate 0,1 gNước cất 1 lít

Hấp ở 1210C trong 15 phút, pH môi trường là 6,8 ± 0,2.10. Môi trường Indol

Tryptone 10,0 gSodium chloride 5,0 gDL-trytophan 1,0 gNước cất 1000,0 mlĐiều chỉnh pH 7,0 phân ra các ống nghiệm đường kính 16mm, mỗi ống 5 ml. Tiệt

khuẩn 15 phút ở 1210C.11. Môi trường lên men carbohydrate

Meat extract 3,0 gPeptone 10,0 gSodium chlotide 5,0 gChỉ thị 10,0 gNước cất 1000,0 mlĐiều chỉnh pH tới 7,1-7,2; phân ra các ống nghiệm có ống Durham . Tiệt khuẩn 15

phút ở 1210C.Glucose, lactose, sucrose … đậm độ dùng cuối cùng là 1%. Đường cho vào môi

trường cơ bản phải diệt khuẩn trước , trừ disaccharide phải tiệt khuẩn bằng lọc hoặc ở 1210C trong 10 phút và cho vào môi trường cơ bản đã tiệt khuẩn trước.12. Môi trường VP

Peptone 7,0 gGlucose 5,0 gDipotassium hydrogen phosphate 5,0 gNước cất 1000,0 ml

Điều chỉnh pH tới 6,9 và lọc. Tiệt khuẩn 20 phút ở 1150C.13. Simmon Citrate Agar

Sodium citrate 2 gNaCl 5 gK2HPO4 1 gNH4H2PO4 1 gMgSO4 0,2 gBromothylmol blue 0,08 gAgar 15 gNước cất 1 lít

[Type text]


Đun nhẹ và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi 1 – 2 phút cho đến khi hòa tan. Phân phối vào 1/3 ống nghiệm có nắp 1 x 100 hoặc 16 x 150mm. hấp ở 1210C trong 15 phút. Đặt nghiêng ống nghiệm. pH cuối 6,8 ± 0,2.14. Thạch L-EMB

a.Peptone 10,0 gLactose 10,0 gDipotassium hydrogen phosphate 2,0 gAgar 15,0 gNước cất 1000,0 ml

b.Eosin Y 0,4 gMethylen blue 0,0065 g

Pha dung dịch a, điều chỉnh pH tới 7,1-7,2. Chia ra từng bình 100ml.Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C. Đun chảy trước khi dùng, và cứ 100ml cho thêm 2ml dung dịch eosin Y 2% và 4,3 ml dung dịch methylen blue 0,15%15. Thạch MacConkey

Peptone 20,0 gLactose 10,0 gBile salts 1,5 gSodium chloride 5,0 gAgar 15,0 gNeutral red 0,03 gCrystal violet 0,001 gNước cất 1000,0 ml

Điều chỉnh pH tới 7,1. Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C. Rót ra đĩa petri.16. Thạch TCBS

Peptone 10,0 gYeast extract 5,0 gSucrose 20,0 gSodium thiosulphate, pentahydrate 10,0 gTrisodium citrate dihydrate 10,0 gSodium cholate 3,0 gOx-gall 5,0 gSodium chloride (NaCl) 10,0 gFerric citrate 1,0 gBromothymol blue 0,04 gThymol blue 0,04 gAgar 15,0 gNước cất 1000,0 mlpH 8,6 ± 0,2

[Type text]


Hòa tất cả các thành phần trên trong nước cất. Đun nhỏ lửa và khuấy liên tục để cho tan thạch. Nguội tới 500C và rót ra đĩa Petri. Không tiệt khuẩn bằng hấp ướt. Đĩa môi trường để ở 40C dùng trong 24h (ISO 1990).17. Thạch TSI

Meat extract 3,0 gYeast extract 3,0 gPeptone 20,0 gSodium chloride 5,0 gLactose 10,0 gSucrose 10,0 gGlucose 1,0 gFerri citrate 0,3 gSodium thiosulphate 0,3 gPhenol red 0,024 gAgar 12,0 gNước cất 1000,0 mlĐiều chỉnh pH tới 7,4; phân ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml. Tiệt khuẩn 10

phút ở 1210C, để nghiêng phần thạch ở đáy ống cao 2,5 cm.

18. Thạch urêa. Peptone 1,0 g

Glucose 1,0 gSoium chloride 5,0 gPotassium hydrogen phosphate 2,0 gPhenol red 0,012 gAgar 15,0 gNước cất 1000,0 mlTiệt khuẩn trong 2 phút ở 1210C

b. Urea 400,0 gNước cất vừa đủ 1000,0 mlTiệt khuẩn bằng lọc. Cho 50 ml b) vào 950 ml a) ở điều kiện vô khuẩn, điều

chỉnh pH tới 6,8, phân ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml và để nghiêng.19. Trypticase (Tryptic) Soy Agar (TSA)

Trypticase peptone 15 gPhytone peptone 5 gNaCl 5 gAgar 15 gNước cất 1 lít

[Type text]


Đun nóng để hòa tan agar, phân phối vào các erlen. Hấp khử trừng 15 phút ở 1210C. pH cuối 7,3 ± 0,2. Để sử dụng cho các chủng Vibrio spp. Ưa muối, công them NaCl vào để nồng độ cuối đạt 2 – 3%.20. Violet Red Bile Agar (VRBA)

Cao nấm men 3 gPeptone hoặc gelysate 7 gNaCl 5 gMuối mật 1,5 gLactose 10 gNeutral red 0,03 gCrystal violet 0,002 gAgar 15 gNước cất 1 lít

Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh về pH 7,4 ± 0,2. Đun sôi trong 2 phút, không hấp khử trùng. Sử dụng làm trong môi trường đổ đĩa.21. Thuốc thử kovacs

p- Dimethylaminobenzalhehyde (p-DMABA) 10 gIsoamyl alcohol 150 mlHCl đậm đặc 50 ml

Hòa tan p-DMABA trong dung môi, bổ sung và khuấy từng phần nhỏ HCl cho đến khi đủ lượng. thuốc thử được chứa trong chai màu tối tránh ánh sang ở 40C. có thể thay thế isoamyl alcohol bằng amyl alcohol hoặc butanol.22. Thuốc thử methyl red

Methyl red 0,10 gEthanol 95% 300 mlNước cất (đủ) 500 ml

Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol. Them nước cất vào cho đủ thể tích 500ml

[Type text]


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Vi sinh vật thực phẩm, tập Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu dánh giá chất lượng an toàn thực phẩm, NXB Y học.

2. , Trần Linh Thước,Các phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục.

3. Vi khuẩn y học, Bộ y tế, NXB Giáo dục Việt nam, chủ biên PGS. TS Lê Văn Phủng.

4. Khóa luận tốt nghiệp, đề tài: Sử dụng kỹ thuật multilplex PCR để phát hiện các gen độc lực của vk Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò.

5. Cebula T. A., Payne W. L., and Feng P., 1995. Simultaneous Identification of

Strains of Escherichia coli Serotype O157:H7 and Their Shiga – Like toxin

Type by Mismatch Amplification Mutation Assay – Multiplex PCR. J. Clin.

Microbiol. 33: 248 - 250.

6. Leo Heijnen and Gertjan Medema , Journal of water and health 04.04.2006,

Quantitative detection of E. coli, E. coli O157 and other shiga toxin producing E.coli

in water samples using a culture method combined with real-time PCR.

[Type text]


7. Youngsheng He, James, E.Keen, Ralph B.Westama, E.Travis Littledike, Jimmy

Kwang (1996) “Monoclonal Antibodies for Dectiction of the H7 Antigen of

Escherichia Coli”, Applied and enviromental microbiology, Vol-62 No. 9p 3325-3332.

[Type text]

các phương pháp phát hiện e. coli trong thực phẩm.doc

Documents