caracterizaÇÃo do genoma de uma ameba de vida …

ANITA MARZZOCO

CARACTERIZAÇÃO DO GENOMA DE UMA AMEBA DE VIDA LIVRE (Acanthamoeba castellanii)

1974

Tese de Doutoramento

Univetsidade de São Paulo

Instituto de Química

Departamento de Bioquímica

Para Cristina de paiva Mendonça Pereira Antonio Lemos Pereira José Gaspar Marzzoco

fndic.e

P ' . , aglna

I ,

l?T' (.~ .f" F1 (~. j_ o • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • " " " " " " " " • • • • • 1

II • Al) .p ~ v i a t llr [{ s • • " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " ~ • 3

]IT f(( .~8. p;ertte s " " " " " " " " " " " • " " " . " " " " " " " " " " . . " " " " " " .. '-I·

IV • lntroduç ~o

1. Acanthanweb8 casteLLanii .................. 5 2 . Organi zação do r-;enonw PI1I e ll Cêll' i c:tos ....... q

? Caractel'i 7.,ação elo genoma ele A. caste lJ;.8J:!.ii 24

V • Métodos

1. Crescimento ele A. castellanii ••.•.•••••••• 30

2 " En. cis1.~amento""""""" .. """"""""""""" .. """".".. 32 3. Germinação (Excistamcinto) .•..•..•••••••.•• 33 4. I so lamento ele n~cleo s de trofozoito ••••••• 33 5. Controle da pureza das preparaç5es de

, nu-

cleos" •• " ••• " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " • " • " " .35 6 ..

f nosagem ele RNA, DNA e pro!:;e1.na em n~cleos

e homogenata".""""""""""""""""""""""" •• "". 36 7. Ensaio da atividade de RNA . polimerase

(E e C .2.7.7.6) • " " " " • " " " " " " " .#" . " " " " " " " " . " . . . 3 7 8 . Purificação de mi tocônelrias. • • • . . . • . . . . . . • 38

~ ( ~ . Extraçao de DNA........................... 3 J

100 Centrifugação em gradientes de CsCl ••••••• 40

11. Fragmentação de DNA....................... 41

1 2 . Avaliaç ão de peso molecular •.•.••••.•••••• 41

1 3 . Renaturação de DNA........................ 42 lA. Curvas de desnaturação térmica (Determina-

çao de T ) ••• .••.•••.•........••....•..•.•• 14-3 m

VI . Resultados

1. Curva de crescimento...................... 44

2 . Encistamen to induzido .......•...•......•• o

) . I solamento de l1úcleo s ••••••..........•••••

! ~. Composição quími c a de núcleos i so lados ••••

L') . Atividade de RNA polimerase (E . C. 2 07.7.6)

e m n6cle os i so lados .............. . ....•..•

4-6

L{-7

51

51

P; . agU1R

6. Extração de DNÃ ••••••••••.••... ., •••. o........ 53 7. CentrifUgação em gradientes de Cs C1......... 55 8 . Perfil de fus ão do s componentes ' do DNA de

trofozoitos ••.•.................•..... • •• li. 66

9. Rena turação de DNA.............. . ........... 70

VII • Discus são

1. I s olamento de núcleos......... . ........••••

2. Extraç ão de DNA •..•....•......•...•...••••••

3. Caracterização do DNA de trofozoitos

a) DNA total ................... ti ••••••••••••

b) TINA nuclear e c omponente maior •••••••••••

c) mA mitocon dria1 e comp onente menor .•••••

4. Análi s e das condi ç õe s de r enaturação ..••••••

86

87

88

90 91 96

VI I I. Res1lIllo........................................ 99

IX Bi l)] iografia. • . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • • 100

1

I. Prefácio

Este trabalho foi realizado sob a orientação

segura e eficiente do Prof. DI'. Walter Colli e contou

com a colaboração de várias pessoas as quais agradeço

imensamente :

Dro Antonio Sesso - microscopia eletrônica

Aparecido M. 'Pinto - assist~ncia t~cnica

DI'. Bayardo B. Torres - leitura do manuscrito

Carmen M. Pinto - assist~ncia t~cnica

Dra. GláHcia M. Santelli - microscopia de fase

Dra. Godeleine Fonty (Laboratório do DI'. G. Bernadi ,Ins'

titut de Biologie Mol~culaire, Fac. des Science:

de Paris) - ultracentrifugação analítica

Dra. Helena Li Chum - análise da cin~tica de rena turaç ão

Dra. Janne Balsamo - análise da cinética de renatlU'ação

João . Luiz Musa - fotografias

Prof. Dro Jos~ Ferreira Fernandes adaptação

regime de pós-graduação.

Dra. Lor Cury - microscopi"a eletrôni c a

t '. Lucy Bouque ' - graflcos

Dr • . Luiz Longhi - microscopia eletrônica

ao novo

Dra. Marilda Guedes - análise estatistica dos dados

Masuko Yokoyama - particip ação na fase inicial do traba

lho

DI'. Roberto V. Santelli - ensaio de RNA polimerase

Agrade ç o, aino a , ao pessoal do Bloco 10 (t~r

reo e su perior), e spe cialmente aos co legas do nosso la

boratório, sempr e disposto s a prestar qualql1er h .po de àu

x ilio :

2

Bianca Zingales

Clara Carnio l

Júlia M. Alves

Marinei. F. Gonçalves

M1llla C. Andery

Neemias de Castro

Shigueko 8omohara

Os bacteriófagos T7

e fd; foram gentilmente

cedidos pelos Drso M. Oishi e Lo Day, respectivamente.O

inóculo inicial de Acanthamoeba caste llanii, linhagem

Neff, foi uma doação do Dr. M. Rabinovitch.

Este trabalho foi re a lizado com o apolo fi

nanceiro da F~mdação de Amparo à Pesquisa do Estado de

são Paulo e Conselho Nacional de Pesquisas.

.3

11. Abreviaturas

DMA = ácido desoxirribonucleico

GC fração molar de guanina e citosina do ácido nucleic

AT fração molar de adenina e timina do ácido nucleico

T = temperatura de fusão do DNA m

Cot = produto da concentração de DNA (moles de nucleotí

dios.l-l ) pelo tempo (segundos) de incubação

RNA = ácido ribonucleico

rRNA = RNA ribossômico

mRNA RNA mensageiro

rDNA = cistrons complementares a RNA ribossômico

RNase = ribonuclease

DNase = desoxirribonuclease

Tris = tris(hidroximetil) aminometano

EDTA = ácido etileno diamino tetracético

SDS

TCA

PCA =

SSC = ppo =

dodecil sulfato de sódio

ácido tricloroacético

ácido perclórico

NaCl 0,15 M; citrato de sódio 0,015 M, pH 7 2 ,5-difeniloxazol

popop = 1,4-bis-2-(5-feniloxazolil)-benzeno

Pvp' = polivinil pirrolidona

4

111. Re a gentes

Além das drogas relacionadas abaixo, utiliza -

vam-se sempre reagentes de grau analfticoo

DROGA

Proteose-pept ona

Extrato de levedo

Citrato férrico

Silicone

Triton X-lOO

PVP

RNas e

a-amilas e

Ditiotreitol

Actinornicina D

Rifampicina

PPO

POPOP Nonidet P-40

Hidr5xido de hiamina

Tween 80

Fenol

3H- UTP

CsCl (l1 grade Ali)

Pronase

2-desoxi-D-ribose

D-ribose

Albumina sérica bovina

PROCEDÊNCIA

Ox oid Ltd.

Difco Lab.

BDH Chem. Ltd.

CJay-Adams, Inc.

Ga lbiochem

Calbiochem

Sigma Chemo Comp.

Sigma Chem. Comp.

Sigma Chem. Comp.

Calbiochem

Ciba-Geigy

Galbiochem

Ca lbiochem

Shell do Brasil S .A.

Packard Inst. Co., Inc.

BDH Chem. Ltd.

Mallinckrodt Chem. Works

New England Nuclear Co.

Calbiochem

Calbiochem

E. Merck A.G. Darmstadt

E. Merck A.G. Darmstadt

Sigma Chem. Comp.

5

!V li Intl'bduçao

1. Acanthamoeba castellanii

o protozoário em estudo denomina-se Ácantha

moeba castellanii (Douglas; 1930), linhagem Neff e per

tence à família das Hartmannelid~e, que compreende cerca

de trinta espécies provenientes do desmembramento de um

grupo de amebas denominadas anteriormente "limax"(Vicker

man ; 1962). À taxonomia das amebas apresenta inúmeras

dificuldades e a ameba em questão, durante algum tempo;

foi referida ha literatura como Acanthamoeba ~. Segundo

Volkonsky (1931), Adam (1964) e page (1967), várias deno

minações referem-se à mesma espécie: Acanthamoeba caste-

11anii, Àcanthamoeba ~., Hart~annella rhysodes, Hartma

nnella culbertsoni e Hartmannella castellaniio

A. castellanii foi descoberta por Castella

ni (1930), como contaminante de culturas de Cryptococcus

pararoseus e foi assim denominada por Douglas (1930). Po~ teriormente, a ameba foi isolada de diferentes fontes:so

los úmidos (Singh, 1949; Neff, 1957), -água doce (Page,

1967) e culturas de tecidos (Jahnes et aI., 1957; Moore e Hlinka, 1968). Demonstrou-se claramente sua patogenici

dade em macacos e camundongos (Dunnebacke e Williams

1967; Culbertson et aI., 1958, 1,959). Vários autores sugerem que a ameba seja o agente etiológico de várias do

enças respiratórias do homem, além de meningoencef81ites

(Wang e Feldman, 1961; Patras e Anduj ar , 1966; Armstrong

e Pereira, . 1967; Carter, 1968; Cerva e Novak, 1968).

A divisão celular da ameba segue o curso

de uma mitose típica, evidenciando-se a existência de 40

cromossomos (Volkonsky, 1931; Singh., 1952). Todavia, po

de-se induzir experimentalmente a divisão celular sem mi

t ose nuclear (amito s e): o núcleo único interfásico é par~

6

tilhado entre as células filhas que sobrevivem por ape

nas 48 horag (Band et aI., 1970). A ameba é tipicamente

uninucleada (Bowers e Korn, 1968), mas indivíduos mul

tinucleados podem aparecer sob determinadas condições

de cultura (~ames e Byers, 1967; Band et aI., 1970;Band

e Ma chemer, 1963~. Portanto, a divisão citoplasmática

pode ser separada da di visão nuclear mitótica, fazendo

com que a ameba se torne um sistema útil para o estudo

de problemas de divisão celular (Band e MOhrlok,1973 a;

1973 b). Band e Mohrlok (1973 b) demonstraram que as

fases de mitose e síntese de DNA, duravam, respectiva -

mente, 24 e 20 minutos. Resultados semelhantes foram

obtidos em Physarum (Nygaard et aI., 1960) e ouriço do

mar (Hinegardner et aI., 1964).

!. castel1anii pode ser cultivada, sob

condições axênicas, em vários meios líquidos (Neff et

aI., 1958; Band, 1959, 1962), com temperatura ótima o ~ -entre 25 e 30 C. Nessas condiçoes, o tempo de geraçao

varia de 12 a 18 horas (Neff et aI., 1964 b). O cresci~ mente pode ser obtido em meio basal mínimo (Adam, 1959;

Stark, 1966). Cresce também em placas sobre culturas de

bactérias ou fungos, permitindo a obtenção de clones e

reconhecimento de mutantes pela morfologia da colônia

(Jensen e Duhes, 1962; Upadhyay, 1968).

Culturas agitadas ou estacionárias em meio

líquido apresentam curvas de crescimento onde não se

verifica uma fase de "lag". As fases (exponencial e es

tacionária) da curva de crescimento são determinadas

principalmente, pelo nível de oxigênio dissolvido no

meio (Neff et aI., 1958; Band, 1959; Byers etal •• 1969) • . Sob determinadas condições ambientais, a

ameba sofre um processo de diferenciação que cuimina

com a forma ç ão de um novo tipo celular, o cisto. O en

cistamento pode ser espontâneo ou induzido. O encista -

menta espontâneo oCorre em culturas agitadas ou estaci~

nárias, em condições de alta densidade de células. A

indução do encistamento é obtida através do emprego de

t écnic as de substituiç ão de meios, ou seja, as amebas

s ão t rans fe rida s d e um me io nut riente rico par a lOO meio

7

salino, deficiente em font e s de carbono ou nitrog~nio

(Griffiths e Hughes, 1969). O encistamento também po

de ser obtido em placas de agar não nutriente, conten

do taUl' ina e cloreto de magnésio (Raizada e Krishna

Murti, 1971). Encistamento adequado requer oxig~nio ,

presença de {ons cálcio e magnésio e baixa concentra

ção de células (Band, 1963; Griffiths e Hughes, 1968).

As fases do encistamento espontâneo ~ in

duzido são praticamente as mesmas, mas a indução pro

porciona encistamento em massa (ac ima de 95%, após 20.

horas de indução) e sincronizado (Neff et al.,1964 b).

O trofozoito, envolto por uma membrana plasmática(Korn

e Wright, 1973), diferencia-se em uma célula viável e

extremamente resistente (Adam, 1964; Neff et al.,1964

b), protegida por uma parede celular química e

turalmente complexa. A parede, cuja composição

estru-t •

qUllll1:,

ca ainda não foi totalmente e1ucidada, contém, como

elemento predominante, celulose (Tom1inson e Jones,

1962; Neff e Benton, 1962; page, 1967; Tomlinson,1967;

Neff e Neff, 1969), além de proteína (Neff et aI.,

1964 a; Bowers e Korn, 1969) e mucopoliss ,acarídios

(KriShna Murti, 1973).

O eno istamento ocorre em condições onde

a célula não dispõe de qualquer suprimento exogeno e

os componentes da parede não estão presentes no trofo

zoito. Evidências citológicas (Bowers e Korn, 1969) e

bioqu{micas (Neff e Neff,1969;Griffiths e Hughes,1969;

Weisman et alo, 1970) indicam que a celulose é sinteti

zada "de novo", às expensas de glicogênio que consti

tui o material de reserva do trofozoito (Stark, 1966).

A atividade de 8-glicana sin~etase não é detectável

no trofozoito (Potter e Weisman, 1971).

A produção de moléculas exóticas no en-.' - , clstamento e acompanhada pon outras alteraçoes metabo-

licas (Weisman e MooTe,1969; Krishna Murti, 1973) e

morfológicas (Vickerman; 1962; Bowers e Korn, 1969;

Pasternak et al., . 1970); além do término do crescimen

to celular (Neff et aI., 1964 b; Stevens e Pachl.er,

1973 b).

8

As a lte r a ç ões n o n í ve l de macromoléculas

que o c orrem no f im da f a s e logar í t mic a , ant e s do au

me n t o da p rop orç ão de cisto s , p ode m ser c orre l a ciona

d as com evento s ligado s ao enc i stamento. Células em

fa s e e s tacion ária po s suem metade d a quan t idade de DNA

ve r i f icada durant e a f ase logarítmica (Byers et aI.,

1969 ), fenômeno e s se qu e coinc ide' com a diminuição da

v e locidade de síntese de DNA (Rudick , 1971). A que da

de 50% no conteúdo de DNA por célul a p oder ia s er ex- '

plicada; admitindo-s e que a maioria das amebas ,em f a

se logarítmica contive sse a quant idade de DNA d a fas e

G2 e q u e o cic lo de dupli c a ç ão celular f osse inibido . '. . ~

durante a fa s e estaclon a r la, no per lodo G1 , ou na

transiç ão entre o s pe r íOdO S G1 e S . Es s a h i p ótese foi

reforçada pelos tr ab a lhos de ,Neff e Ne f f (1969 ), Ru

dick (1971) e Band e Mohrlok (1973 b), que demonstram

que o períOdO 'G2 cons titui cerca de 80% do ciclo de

divisão celular. Situa ção semelhante foi verificada em

Amoeba proteus .. (Goldstein e Prescott, 1967). A conclu ....

são adicional desses trabalhos é que a indu ção do en

cistamento dependeria da reduç ão da quantidad'e de DNA

por célula e que inibidore s de sínte se de DNA induzi

riam o encistamento. Por outro lado, outros autore s

(Griffiths e HUghes, 1969 ; Rai z ada e Krishna Murti,

1971), verificam inibi ç ão do encistamen t o por e s s es

me smo s agentes . Expe rimen to s recentes (Roti Roti e

Steven s , 1973), demons tram também que , durante o en

cistamento, ocorre degradaç,ão de DNA s i nte ti z ado du

rante a f ase de cre s cimento exponenc ial.

Os dado s r e ferente s à s íntese de RNA du

rante o encistamento são igualme~t e c ontrad itórios.Pa-

ra: algmls autores, o apa recimento de compostos pecu-

liares ao cisto, seria uma indicação da nece s sidade de , c , c slntese de novas mole cuIas de RNA e protelna. Realmen-

te, Rudi'ck e Weisman (1973 a), verificam um aCÚmulo

de RNA durante as primeiras 12 horas após indução.pos

terior mente, a síntese de RNA é interromp i da e 95% do

RNA sintetizado inicialmente é degrad ado . Stevens e

Pachler (1973 a; b) apresentam resultado s opos tos, de

monstrando que um acúmulo de RNA não é i l"1 d i spe.ns ável

9

para a indução e que o RNA d€ gradado é constituído por

espécies sintetizadas ante s do encistamento. Segundo

esses autores, a induç ão da diferenciação estaria inti

mamente relacionada com os eventos moleculares que regu

lam a divisão celular, já que o encistamento (espontâneo

ou indu,zido) ocorre sempre em condições que determinam

a inibição do crescimento.

Finalmente, o AMP cíclico parece estar re-

lacionado com a indução do encistamento (Raizada e

Krishna Murti, 1972 a)~ O AMP mimetiza a ação de tauri

na e cloreto de magnésio (Raizada e Krishna Murti, 1972

b), que ativariam lma adenil ciclase ligada à ~embrrula. O aumento resultante da concentração intracelular de

AMP cíclico, causaria a ativação das enzimas de síntese

de celulose e mucopolissacarídios da parede do cisto

(Krishna Murti, 1973).

Os cistos, quando transferidos para meio

de crescimento, podem germinar (Griffiths e Hughes,1968)

A ameba sai por um dos ostíolos presentes na parede do

cisto e, a não ser pela formação desse pequeno orifício,

a superfície do cisto permanece inalterada após o excis

tamento (page, 1967; Chambers e Thompson, 1972). O ex-

cistamento parecle não ser sincrônico e a extrusão da

ameba é inibida por actinomicina D e cicloheximida, en-

quanto que inibidores de síntese de DNA não afetam O'

processo (Mattar e Byers, 1971)0

2. Orgamização do genoma .em eucariotos

DNA, cuidadosamente isolado de células ou.

tecidos, é constituído por moléculas bicat~nárias, deno

minadas "nativas". A dupla hélice da molécula nativa po

de dar origem a fitap separadas, com estrutura desordena

da, através da ação de agentes químicos ou físicos que

determinam o rompimento das forças que mantêm a dupla

hélice. Esse proces'so de dissociaç~o (ou desnaturação)é

acompanhado por mudanças nas propriedades físicas do

DNA: viscosidade, hipocromicidade, rotação óptica, den-

10

sidade etc. A transição entre o estado nativo e desna

turado é abrupta, semelhante à fusão de um cristal,. o

que det erminou a caracterização do processo pela tem ....

perat1..1ra média da transição (Tm). A largura da transi

ção depende da origem do DNA, ou seja, DNA de vírus,

bactérias e vertebrados, apresentam intervalos de tran

sição crescentes . Sob condi ç ões adequadas·, as fi tas

complementares dissociadas podem formar moléculas es

táveis com e s trutura helicoidal semelhante à nativa

por um processo denominado renaturação àu reàssociação

(Marmur e Doty, 1961). t pos s ível também verificar in

teração entre fitas de RNA e DNA, desde que existam

sequências de bases complementares nos dois ácidos nu

cleicos, permitindo a formação de híbridos RNA-DNA.

A velocidade de renaturação depende da

colisão de sequências de nucleotídios complementares e

a r eação obedece cinética de segunda ordem em concen

tr aç ão de DNA (Marmur et aI., 1963; Britten e Kohne,

1967; Thrower e Peacocke, 1968; Wetmur e Davidson,

1968). O processo de renaturação pode ser acompanhado

de diversas mane~ras, sempre dependendo de alguma di

ferença físicE\. fiÍ cilmente detectável entre o DNA des

naturado e renaturado. Assim, é possível acompanhar a

reassociação de DNA pela determinação da queda de ab

sorbância a 260 nm durante a reação (Wetmur e David-

son, · 1968), pela recombinação de fragmentos de DNA

desnaturado com DNA de alto peso molecular fisicamente

imobilizado em agar (Bolton, 1966) ou pela fração de

DNA reassociado que se liga a colunas de fosfato de

cálcio (hidroxiapatita) em diferentes tempos de rea

ção (Britten e Kohne, 1967).

A velocidade da , reação ' de renaturação

determinada pe la concentração das sequências de

, e ,

nu-

cleotídios presentes . Cons iderando-se diversos orga

nismos, o DNA daquele com genoma maior, certamente

conterá um número maior de sequências de nucleotídios

diferentes. Assim sendo, a velocidade de reassocia

ção fornece uma medida do tamanho do genoma de um or

ganismo, desde que se jam mantidos constantes todos os

demais fatores que inf luem na reação (temperatura , for-

11

ça iônica, pH, viscosidade do solvente, tamanho dos frag

mentos e teor de GC do DNA). -Realmente, o tempo necessário para a obtenção de 50% de renaturação é inversamente proporcional ao tamanho do genoma (conteúdo haplóide de

, f i) " . ( DNA por celula ou partlculade Vlrus de bacterlas e V1-

rus (Britten e Kohne, 1967)0 No caso dos organismos superiores, imaginou-se, inicialmente, que o tamanho do _ geno~

ma levaria a uma grande diluição das sequências individuais de nuc1eotídios e haveria, portanto, grande redução na velocidade de reassociação, quando comparada com a velocidade característica de DNA de bactérias. De fato,

experiencias iniciais não conseguiram evidenciar renaturação de DNA de timo de boi (Marmur ' 'e Doty, 1961). Posteriormente, através do ,emprego da técnica DNA-agar, verificou-se que DNA de organismos superioresreassociava ef~ tivamente, formando moléculas duplas específicas ( Hoyer et a1., 1964). A explicação mais plausível para esse fato, até então inesperado, deveria se relacionar com a concentração de sequências capazes de, renaturar, ou seja., o genoma de organismos superiores conteria populac:;ões desequências de n'ucleotídios semelhantes ou idêntieas (sequências repetidas ou reiteradas). Todos os organismos superiores analisados até hoje, contêm DNA -repe,ti

do em proporções que variam, por exemplo, de 20% em ouri

çO ' do mar a 80% em salmão e trigo (cf. Britten, 1970). Alista de organismos que possuem DNA reiterado aumenta mui to'; se forem considerados os trabalhos realizados inici -almente, que utilizavam condições de ,reassociação ( tempo de incubação e concentração -de DNA) que permitiam somen

te a renaturação de DNA repetido. A renaturação do -DNA de organismos mais sim

ple's como por exemplo Eseherichia 'coli, segue cinética ideal de , se'gunda ordem, obtendo-se -uma curva hiperbólica

com o decurso do tempo. A renaturação ,de DNA de organis -mos superiores apresenta ,uma -curva muito alargada, indicando a existência de componentes com velocidades de renat'ur,ação diferentes o Uma fração do DNA de organismos superiores (DNA "Único"), renatura com a velocidade previs- '

~ ta segundo o tamanho do genoma, por exemplo, em mam1feros, cerca de 600 vezes menor que a do DNA de E. coli. Assim'

12

sendo, para DNA de bactérias e vírus e a fração de DNA

"Único " de organismos superiores , a complexidade cinéti

ca é igual i complexidade de sequ~ncia, ou seja , a quan

tidade de sequências diferentes em uma determinada amos~ tra de. DN,A. • . É geralmente expressa em nv.mero de pares de

nucleot1dios ou nÚmero de daltons e corre sponde ao ter

mo li complexidade " , definido p or We tmur e Davidson (1968). A complexidade cinética traduz, portanto , o tamanho do

genoma de um organismo e mostra uma -relação linear com

a velocidade de reassociação (Britten -e Kohne, 1967; Wetmur e Davidson, 1968). A determinação da complexidade

cinética do DNA Único é prejudicada pela delimitação in

certa da fração Única e repetida de um DNA, que depende

do critério de prAcisão de pareamento estabelecido du

rante a medida da velocirtade de reassociação (Britten,

1971). Apesar da maior parte do genoma bacteriano

ser cons tit u:tda por se quenc ias que não se repetem (se

quências "únicas "), foi demonstrada a exis tência de uma

pequena fraç ão de DNA com baixa frequência de reiteração,

responsável pela síntese de rRNA (Kohne, 1969), além de

cópias múltiplas de DNÁ epissômico (Chiscon e Kohne,

1970) . A definição de eucariotos e procariotos,ba

seada principalmente na existência ou não de um núcleo

verdadeiro; delimitado por uma membrana nuclear, p ode

a partir do estudo da- reassoc iação de ácidos nucleicos,

ser formulada em outrôs termos: o DNA de procariotos é

do tipo não repetit,:i!vo (exceto por peguenasquantidades

de DNA ribossômico e epissômico), enquanto que o DNA de

eucariotos é constituído por sequências repetidas e se

quencias "Únicas".

Uma famflia de DNA reiterado pode ser ca

racte rizada pelo nÚmero de membros (frequência de rei

teração), grau -de semelhança entre os elementos compo

nentes e pe la complexidade cinética.

A v e locidade de reassociação das famílias

de sequências repetidas e s tudadas varia de 30 (DNA de

ouriço do mar, Britten et a I., 1972 ) a 107 vezes (DNA

de cobaia , Southern, 1970) maior que a ve lo c idade de

13

reassociação de um DNA único. Esses da.dos ilustram a di .... versidade de frequências de reiteração encontradas hos organismos áuperiores.

A precisão do pareamento entre sequências repetidas reflete o grl;lu de homologia existente entre as sequências e pode ser medida pela estabilidade t~rmica do par reassociado. Verifica-se um largo espectro de estabiiidades t~rmicas, incluindo valores de T de 1

· m a400 C abaixo do T~ de um DNA perfeitamente pareado. O grau 'de -precisão de pareamento ·das sequências ' reiteradas -é fundamentalmente determinado pelas condições de incubação: temperatura mais alta e força iônica mais baixa requerem .maior 'precisão no pareamento, que re .... sulta na formação de uma molécula dupla mais estável (Britten e Kohne; 1968; Rice e paul; _ 1972). Nas reações

entre TINAs de espécies diferentes, qu~do se pret~nde e~ tudar homologias .entre fami1ias de mA reiterado, há maior discriminação _em températuras mais elevadas ( Martin e Hoyer, 1966).

A complexidade das familias de DNA reiterado pode -ser avaliada a partir da sua velocidade de reas-

; so ciação. -A complexidade cin~tica é -uma medida operacio~ nal -que pode ser -obtida por comparação com a renaturação de :-um DNA. -padrão" como 0 de ·E. coli, com tamanho de geno ma -bem estabt-lecido ' (Cairns, 1963) e fornece uma medi-... dado comprimento da sequencia que foi originàlmente re-pliéada para -for~ar ' a familia deDNA ·reiterado. Entretan to, há uma certa imprecisãe na interpretação da complexi dade cinética de -uma famllia de DNA reiterado, em vir~ude - do_ efeito do graU de semelhança entre os . membros componentes, sobre a velocidade de reassocl.ação.Britten. e Bonner (1971-) verificaram que o pareamento imperfeito, devido a presença de bases não complementares, reduz. a velocidade de reassociação, pode:q.do afetar significativa mente a int-erpretação de medidas de frequência de . repetição ou grau de homologia entre espécies. Estudos paralelos -de· Southern (1970) e Sutton e McCallum (, 1971 ) ) demonstrar-am -igualmente, guea velocidade de reassociapão ' de sequências -Se'IDelhantes - mas· não idênticas forn:e-y . , ,

ce uma medida superestimada do comprimento r eal da uni~

14

dade de repetição. Na maioria dos eucariotos estudados, pode-se

distinguir duas classes de DNA reiterado (Britten e Kohne, 1968): DNA altamente repetido ou de "seqúência-simples " (Walker, - 1971) e DNA de repetição "média" ou "intermediá ... -ria" •

Os TINAs satéli tes são, provávelmente, ~s melhores exemplos de famílias de sequências de nucleotídios altamente repetidos. O satélite de camumdongo foi descri -to em 1961 por Kit (1961) e Szybalski (citado em Walker, 1971); independentemente; como um componente menor, que se separa da banda principal do DNA em gradientes de clo-reto de césio; em virtude de diferenças no conteúdo de GC. ~ encontrado em todos os tecidos,inclusivé em células em -cultura de tecido de várias linhagens de camundongo (Kit, 1961); representando 10% do genoma. Renatura com velocidade muito grande (Waring e Britten, 1966) e a CUTva de - renaturação se superpõe -à uma curva ideal de segunda ordem, com uma inclinação qUe indica ausência de heterogeneidade interna. O DNA satélite nativo apresenta uma banda _unimodal e estreita em gradientes de CsCl, indicando que ocorre em longos segmentos de DNA, cada um contendo um gr~de número de ele~entos repetidos semelhantes (Walker, 1971). Baseados na relação linear entre o inverso do tamanho do genoma e a velocidade de reassociação, Waring e Britten (1966), propuseram que o saté1it-e -deveria ser oons

f 6,. t 1 t -ti tUldo por cerca de 10 coplas extremamen e - seme han es de um segmento de aproximadamente--300 nucleotídios de comprimento. Por -outro lado, Southern (citado em Br itten; 1971), através da análise parcial -da sequ~ncia de bases, sugeriu que osatél-±te de -oamundongo poderia ser _ formado por uma unidade - de repetição- muito pequena, da ordem de

10 a -12 -nucl-ebtídios, extremamente modificada ao longo da evoluçã~. Britten -(197l), analisando os -dados obtidos por Southern, concluiu que se a -repetição interna de um frag -mento - curto .realmente eJÇis tiu, -ela não -é mais detectável cineticamente, podendo evidenciar-se- apenas a repetição principal do DNA satélite. Todavia, a i.nt-erpretação desses result ados torna-se cada -vez mais difícil, levando-se em cons ideração a de-scoberta de- outros satélites em mamíferos

15

(Southern, . 1970) e Drosophila (Peacock et al.~ 19 73

Gall et aI.; . 1973) que, segundo a análise da estrutura

primária e ação de enzimas de restrição (Southern e

Roizes, 1973), parecem ser constituídos pela repetição . t t

de .segmentos contendo 5 a 7 nucleotldlOS. Portanto, a

sequência original dos DNAs satélites parece ser muito

pequena, -mas a introdução de mutações ne s.sa sequencia,

faz com que ela se comporte,durante a reassociação,co

mo se f6sse muito mais lon~a.

O DNA satélite de vários eucariotos parece

estar sempre associado ~ fração heterocromática (Yasmi

neh e Yunes, 1970). O emprego da técnica de hibridiza -

ç ão de -ácidosnucleicos "in situ" (Jone s , 1970;Pardue

e Gall, L969), permitiu demonstrar DNA altamente repe

tido associado aos centrômeros de cromossomos metafási

cos, nucléolos e grânulos de cromatina de núcleos in

terfásicos. As sequências satélites são geralmente en-. ~ , .

contradas nas regloes heterocromatlcas dos cromos somos,

com exce ç ã o do cromossomo Y de camunciongo (Pardue e

G~11, . 1970) e de algumas esp~cies de Drosophila (Hennig,

1972). Rudkin (1969) demonstrou que, durante a forma

ção de núcleos poli tênicos, há uma sub-replicação da he

terocromatina 'em relação ~ replicação de regiões eucro

máticas . ConBequentemente, o DNA satélite não é replic~

do durante a formação dos cromossomos pOlitênicos, ou,

pelo menos, não ~ r eplicado proporcionalmente ao res

to dO ' genoma (Gall et aI., 1973). Em células de camun

dongo, com divisão sincronizadaj o satélite é sintetiz~

do na fase S tardia, enquanto que as frações do genoma

ricas em GC, são repli c adas logo no início. Esses da

dos concordam com a localização heterocromática das se

quências satélites, já que a heterocromatina é . replica

da t ardiamente durante a fase S (Walker, 1971)0

A simplicidade de sequência dos DNAs saté

lites., sugere que elE;:s não possam funcionar como genes

estruturais, apesar de Skinner e Kerr (1971) terem pro

p osto que o satélite AT de caranguejo · fôsse . o responsá

vel pela s íntese de uma proteína específica. O satélite

de c amundongo não"é transcrito (Flamm et aI., 1969) e

a anál i se da sequencia de bases do satélite a de co-

l6

baia ( Southern, 1 970), mostra que vários dos possíveis

co dons são "non-s ense " , tornando pouco provável que

es sas sequêll'cias se j am traduzidas em proteína.

Em vários organismos s uperiore s', exis te uma

fração do DNA altamente reiterado que mimetiza o compor-

tamento de moléculas bicatenárias, a p ós incubação em

condiçõe s que não permitem reassoçiação por colisão bi

molecular (Davidson et al., 1973). Es se tipo de DNA com

renaturaç ão "instantânea" (ou "espontânea"), possui me

tade de s uas -bases pareadas e encontra-se - dis tribuido

ao longo do genoma, mostrando 11ma certa dependência na

composição de bases das regiões adjacentes (Bonner,1973).

Ex i stem evidências de que se relacionem topogràficamente

com DNA reiterado, pois ocorre m com alta frequência no

satélite de camundongo (Flamm et al., 1969 ). A- renatura

Çãb espontânea poderia resultar da exis t ência de "cross-

1inking" (A1berts e Doty, 1968 ; Mulder e Doty, 1968) ou

de sequências parcialmente complementares ao longo da

mesma fita de DNA (Flamm et al., 1969 ; Britten e Smith,

1970; Bonner, 1973).

O segundo tipo de DNA reiterado encontrado

nos eucariotos; é definido por critérios cinéticos e,ex

'ceto alglIDs caso B especiais (Corneo et aI., 1970), só

pode ser isolado como Uma fração de DNA reassociado.Essa

fração renatura mais lentamente que as sequências sat~...,..

lites, mas mai s depres s a que s equências que ocorrem uma

ou poucas vezes no genoma. O DNA de "repetição interme -

diár'ia" ( ou DNA Uin termediário "), contém as sequencias

que hibridizam com RNA em experimentos que empr8gam bai

xa concentração de ácido s nucleicos. De fato, as expe

riência s de hibridização r e alizadas inicialmente, devi

do - às condições de incubação empregadas, mediam somen

te à homologi-a entre sequências de RNA e s equências de

DNA repetido (Me11i e Bishop, 1969; Britten, 1970 ).

As s equências com reiteração intermediária, . '. "".' . ao con trarlo das sequencJ_a.s satell tes, parecem estar

dispersas ao longo do ~enoma ( Britten e Smith, 1 970),em

regiões de eucromati na e he_terocromatina (Pardue e Gall,

1969; John et al., 1969 , Jones e Robertson,1970; Hennig

17

et aI., 1970 ), sendo representadas em t e cido s . polit~ni

cos (Gall et aI.; 1971). Os c~strons para rRNA e tRNA

pertencem à fração de DNA "intermediário".

O número de cistrons ribo.ssômicos aumenta

ao longo da escala evolutiva, paralelamente ao aumento

do genoma dos organismos. Valores máximos de multiplici

dade são encontrados em ovócitos de insetos e anfí

bios, como consequ~ncia de processos de amplificação gi

nica (Birnstiel et al.,197l). Os trabalhos iniciais co~

Xenopus (Brown e Gurdon; 1964) e Drosophila (Ritossa e

8piegelman, 1965), serviram de suporte para a identifi

cação do organizador do nucléolo como o locus para os

cistrons ribossômicos redundantes (Gambarini, 1972),

posteriormente confirmada por hibridização "in situ"

(Pardue et aI., 1970). Como os cistrons de rRNA em eu

caridtos são intensamente agrupados e, geralmente, pos

suem alto teor de GC, podem aparecer como satélites em

gradientes de CsCl, facilitando o seu isolamento. Em

bactérias', a obtenção de rDNA é dificultada pela pre

sença de sequ~ncias espaç adoras c om compo s i ç a o de ba

ses median a. Entretanto , Kohne (1969) e Col1i e Oishi

(1970), conseguilram o isolamento de rDNA de ~. coli e

Bacillus subtil~s re s pectivamenteo

Na maioria dos eucariotos e s tudados, os

cistrons para rRNA 188 e 288, são intercalados por se~

qu~ncias reiteradas com alto teor de GC, denominadas se

quências espaç adoras (Birnstiel et aI., 1968; BroWn e

Weber, 1 968). O rDNA contém, adicionalmente, uma fra

ção que é transcrita e posteriormente perdida, duran

te o processamento do rRNA (Loening et aI., 1969). As

sequ~nci?-s espaçadoras não são transcritas (Hallberg e

Brown, 1969) e sua função é desconhecida. ~ ' A

OS genes que codificam para RNA ribossdmi-

e

et

co 58 e RNA de transferência tambem sao relterados

intercalados por sequências espaçadoras (Birnstiel

aI., 1971). Ao contrário dos cistrons de rRNA 188 e

do nucléolo

Wimber, 1971 ;

288, não estão confinados ao organizador

(Wimber e Steffensen, 1970; Steffe:nsen e

Pardue et aI., 1973).

18

A transcriçao de DNA reiterado foi demons

trada em outros casos, onde as sequências repetidas es

tavam r8presentadas em RNA estritamente nuclear (Melli

e Bishop, 1969, 1970; Melli et aI., 1971; Balsamo et

aI., 1973) e em RNA mensageiro de histonas (Kedes e

Birnstiel, 1971). A cinética de renatu:cação em diferent·es

eucariotos demonstra que, em todas as espécies estuda

das, há uma fração considerável de DNA "Único" que con

tém, provàvelmente, a maior parte dos genes estruturais.

Modificaçóes da técnica de hibridização RNA-DNA, per

mitem estudar a expressa0 de sequências"únicas" de DNA

(Melli et aI., 1971; Gelderman et aI., 1972; Firtel et

aI., 1972). Estudos recentes de Paul et aI. (1973), Bi~ shop e Freeman (1973) e Crippa et alo (1973), indicam

que os loci responsáveis pela transcrição de rnRNAs bem

caracterizados (rnRNA de hemoglobina de pato e camundon

go e mRNA de polissomos de nêurula de Xenopus), perten

cem à fração de DNA "único". Além disso, os resultados

sugerem que esses RNAs mensageiros possuem, na extremi

dade 5', sequências rei'te:çadas, transcritas do .DNA in

termediário, al~m do segmento de poli-A na extremidade

3' . Ás experiências de renaturação de DNA de

organismos superiores, empregando fragmentos de dife~·

rentes tamanhos, indicam conclusões gerais sobre o

arranjo das sequências: ao longo da maior parte dd ge-

noma, as sequências únicas se alternam com as

cias repetidas (Davidson et aI., 1973; Graham

1973) .

A

sequen-

et aI.,

Atualmente, a hipótese mais aceita sobre a

organização do DNA cromossômico de eucariotos, propõe

que cada cromossomo contenha uma Única molécula bicate

nária de DNA (cfo Swift, 1973). Os cromômeros, identifi

cados com as bandas dos cromossomos pOlítênicos, ~

sao

considerados como as menores unidades estruturais. várias evidências sugerem que sàmente uma função genéti

ca seja associada a cada bandã que, porém, contém mui

to mais DNA que o necessário para codificar umamolécu-

19

la de prote{na de tamanho médio. Realmente, d núcleo de

muitos organismos superiores parece conter DNA que, apa

rentemente, não é funcional. Em Drosophila, uma fração

razo~vel do crom8mero pa~ece não ser essencial para o

desenvolvimento de um caráter fenotlpico (Sorsa et aI.,

1973). 'l'homas (1970) sugere que a estrutura do

cromômero e o ' problema do excesso de DNA poderiam ser

explicados se se postulasse que os crom8meros f8ssem

constituidos por famllias de repetiç5es ' id~nticas enfi

leiradas, conforme originalmente proposto por Callan

(1967). O suporte experimental para essa hipótese, ori

ginou-se de trabalhos de 'l'homas et aI. (1970), que ob

servaram ao microscópio eletrônico, a formação de cir

culos estáveis após tratamento de DNA nativo com exonu

cle~se, ou depois da renaturação de DNA desnaturado. ( A ,.... ~ • A. ." . '

fOrJ rlaçao de clrculos serla consequencla da eXlstenc19 de

sequências idênticas ao longo da molécula de DNA~ Po s te

riormente, 'l'homas et ~l. (1973), confirmaram a homolo

p.;ia exist ente entre essas sequências , através da verifi

ca ç ã o da grande estabilidade térmica da r egião dupla

que determina a formação do círculo • . Portanto, segundo

eSBa hipótese, cada locus gênico dos eucariotos o ciorre -

rta como uma série linear de sequências id~nticas. Essa

teoria contraria a exist~ncia, cada vez mais comprovada,

de sequ~ncias "únicas" no DNA de eucarioto s . Provàvelmen - ~ ' . '\. , .. te, a formaçao -de clrculos e devlda as sequencias com

repeti çao grande ou intermediária, intercaladas entre

as sequ~ncias únicas • .A produção de circulos não deve

ser considerada como evid~ncia para a exist~ncia de

uma estrutura básica de repetições em todos ' os cromôme -

ros de um cromossomo. Em alguns casos especiais, como

os loci que codificam para histona, podem ocorrer re-

giões de genes e s truturais repetidos, conforme proposto

por 'l'homas (1970). Apesar da quant idade de informações acumu

ladas s obre a e strutura e distribuição das sequências

re i tA r adas , nada se sabe s obre o mecanismo molecular

que .poderia Griar esse tip o de sequ~ncj a, nem s obre s ua

20

possível função biológica. Segundo Walker (1971), a pre

sença de sequências repetidas proporcionaria uma certa

vantagem sel,eti va aos cromossomos, porque há evidências

que, durante a meiose, o comportamentó dos cromoSSomos

seja a.:(etado p e la natureza e quantidade da heterocromati

na adjacente aos centrômeros. Todavia, atualmente, pro

cura-se atribuir um papel de regulação ao DNA reiterado.

A maioria dos modelos propostos para a or

ganização dos cromossomos de eucariotos enfatiza a ne

cessidade de sítios de contrple adjacentes aos genes es

truturais , tendo em vista a "i~terdispersão" de DNA "úni

co" e J'epetido. Os sítios de controle seriam constituI-

dos por sequências reiteradas o

··Trabalhos de difração de raios X demons-

tram que a estrutura se cundária do DNA varia com a com

posiçao de bases: DNA muito rico em AT parece não ado

tar a configuração B característica para DNA com teor

baixo ou moderado de AT (Bram, 1971). Em Drosophila, sa

téli tes com razões de bases diferentes, são sub-replica

dos diferencialmente durant e a politenizaçao. Gomo a es-

trutura secundária do DNA é uma função da sua composi-

ção de bases, postula-se que os satélites e outras se

quênc ias repetidas apresentariam conformações diferentes

que permitiriam g reconhecimento por proteInas regulado

ras e a não replicação de segmentos específicos do genq

ma (Blumenfeld e Forrest, 1972)0

Britten e Davidson (1969 ) e Georgiev (1969)

s u gerem Que o DNA intermediário seja re s ponsável pela

regulação da dif erenciação. Os primeiTos supõem Que mo

léculas de RNA exclusivamente nuclear seriam o produto

de genes reguládore's que nfão seriam traduzidos. No mode

lo de Georgiev, o RNA nuclear de alto peso molecular cog

teria a informação para a síntese de proteínas regulado

ras, semelhantes aos repressores . bacterianos. A demons

tração da transcriç~iO de sequências intermediárias em

moléculas de RNA exclusivamente nuclear e o comprimento

das se Quências únicas e repetidas intercaladas, sao con

sistentes com o modelo de Britten e Davidson(1969).Crick

(1971), base ado na hipótese formulada por esses autores,

21

elabora um modelo que distingue duas classes de DNA:

DNA globular, com função de controle e uma fração me

nor de DNA ~ibroso, que codificaria a síntese de pro

teínas. Os sítios de controle conteriam regiões não pa

readas, provàvelmente de poli A, que poderiam reagir

com outras regiões semelhantes pertencentes a uma ban

da da mesma cromátide. Essa situação deveria ser encon

trada nas sequências satélites altamente repetidas da

heterocromatina próxima aos centrômeros. Esses sítios

seriam os mediadores do alinhamento das bandas dos cro

mossomos politênicos. Segundo Paul (1972), regiões de

nucleoprotetna --densamente enovelada (correspondentes ao

DNA "globular" de Crick, 1971) se alternariam com re

giões de nucleoproteína menos compacta. Proteínas não

histônicas se ligariam a sitios múltiplos no DNA("adress

sites") e causariam um desdobramento parcial da nucleo

proteína, possibilitando a ligação de RNA polimerase a

sítios promotores adjacentes. Os "adress sites" seriam

formados pelas sequências repetidas.

A análise da reassociação das sequências

de nucleotídios encontradas nos roedores (Flamm et aI., 1969; Hennig e Walker, 1970; Rice, 1971a,b; - Rice e

Straus, 1972) e em outros grupos de animais (Britten e

Kohne, 1967; Brttten e Smith, 1971) e plantas superio -

res (Bolton; 19b6) permite definir afinidades taxonômi

cas através da homologia genética ao nível molecular e

estabelecer possíveis relações evolutivas o Uma fração

do DNA intermediário dos eucariotos é comum a espécies

relacionadas e produz moléculas duplas homólogas ou he

terólogas com baixa estabilidade térmica, sugerindo um

certo grau de divergência entre as sequências repetidas.

O rDNA constitui um grupo muito especi~l

de sequências com repetição intermediária. Ao cont;,rá-

rio do resto do genüma, os cistrons ribossômicos de

bactérias e eucariotos hibridizam com DNA heterólogo

formando m01éculas duplas perfeitamente pareadas(Birns

tiel et al~, 1971). Enquanto essas sequências foram

extremamente conservadas ao longo da evolução, o DNA

e s paç ador, não trans crito, mostra grande divergencia

me s mo em espécies do mesmo gênero, como no caso de Xe

nopus laevis e mulleri -( Brown et aI., 1972).

22

A constância das sequências ribossômicas

contrasta com a granel e variabilidade do s satélites ,

que parecem ser especificos para cada espécie ( Flamm

et aI ., 1969 ; Rerulig ' e Wa lker, 1970; Britten e Smith ,

1 971; Ri c$ e Straus , 1972 ). Saté lites do grupo de

Drosophila virilis (Gall et aI., 1973), ao contrário

do satélite de camundongo e do satélite ;:1 de co-

baia, são muito homogêneos. Os satélites mais recen

tes originaram- se por 'uma única substituição de base

em cada sequência repetida. No , caso dos saté lites, a ~ -. , N

seleçao nao poderla ser r esponsavel pela conservaÇao; .' A. _ ....

Ja que essas sequenclas nao sao, aparentemente, trans-

critas ou traduzidas. Atualmente , propõem-se mecanis

mos para a manutenção da homogene idade dessas sequên-

cias, os quais impediriam o aCÚmulo de mutações e tam

bém explicariam a introdução de mudanças regulares de

bases, conforme verificado nos satélites de algumas es

p~cies de Drosophila (Gal1 et aI., 1 973) .

A formação das famílias de DNA reiterado

é explicada por dois mecanismos. Southern (1970), su

gere que a estrutura atu.al do satélite (l de cobaia po

deria ser resultante ds duplicações sucessivas , de uma

sequência ancestral , e introduç~o posterior de muta

ções. Os satélites do grupo virilis exemplificam o ti

po de sequência postulada como precursora dos satéli

tes de camundongo e de cobaia.

A ocorrência escassa de DNA com baixa

frequência de reiteraç~o sugeriu a Britten e Kohne

(1968 ) que a duplicação ao acaso não poderia produ

zir o padrão de frequê,ncias de repetição encontrado

nos eucariotos. Aparentemente, certas sequências se

riam favorecidas pela duplicação que ocorreria atra

vés de "replicação saltatória". Segundo esse mecanis

mo, uma - sequência original de DNA seria, subitamente,

ao longo da evolução , replicada muitas veze s , forman

do uma famí~ia de sequências idênticas. Os membros '

dessa família sofreriam mutações e translocações para

outros segmentos do cromossomo ou para outros cromos

somos, originando uma família de sequências semelhan

tes, mas não idênticas. Posterior divergência faria

com que n ão fôsse mais. possív.el detectar homologia eg

t r e es sas se'quências que se riam indistinguíveis da

23

sequência original de DNA. O pro cesso de formação de

uma família seria muito rápido em relação à velocida de

de mutação. A idade de uma família pode ser estimada

através da div ergência entre seus membros. Segwldo o

modelo da repli c a ç ão s al t atória, novas famílias esta

riam constantemente s urgindo ao longo da evolução. Fa

mílias originadas recentemente, como os s a t élites, se

riam limitadas sàmente a , uma e s pécie e seus membros se

riam pràticamente iguais. Uma família formada há mui

to tempo; seria encontrada atualmente em e s pécies dis

tàntes e haveria grande divergência entre seus membros.

A razão entre a quantidade d e DNA não homólogo entre

duas e s pé cies e o tempo desde a diver gê nc ia de s s as es

pécies, fo r nece uma medi da da velo ci d ade de introduç ão

de n ov as famílias de DNA repe tido no genoma. Es s a velo-

cidade s e r e fer e s àmente à s famílias que foram fixa-'. '" . das no genoma da especle e nao deve ser lnterpretada cb

mo a velocidade de crescimento do genoma, porque mui- '

tas famílias podem não ter sido fixadas e nada se sabe

sobre a v e locida d e de perda de DNA durante a evoluç ão

d e uma espé c ie • . Outros mecanismos para cres'cimento do

genoma como poliploidia ou politenia, tenderiam a au-

mentar ' a co n tribUição devida a eventos saltatórios

(Kohne, 1971). A reassociaç ão de DNA pode, port,anto, ser

utilizada para e s tudar o grau de ' divergência evolutiva

entre vár ios si s temas biológicos, permitindo e stabele -

cer uma correlação com os dados paleontológicos. Os re

sultado s su~erem que, durante o processo de replicação,

ocorrem alteraç ões gen,éticas (II rep licação saltatória ll)

com v e locida de sufici e n temente g rande par a serem de t e c

tadas contra Um IIbackground" contínuo de mudanç as qu e

envolvem um único p ar de bases (Kohne et aI., 1971)!" ,A análise da sequência de aminoácidos de

p rot e{ n as h omólogas de e s pécie s diferente s , permite a

valiar a ve J...ocidade de s ub s tituiç ão de .aminoácidos. A

comparaç ão .entre a ,velo cida de de evolução de proteínas

e DNA ( La ird et aI.; 1969 ) fo r n e c e : re s ulta do s de di

f í c il i nte r pretaç ã o, p orqu e não s e c OILhe ce a fraç ão do

DNA de orga n i smo s s uperi or e s que codifica para proteí-

24

na. Grande parte do DNA analisado p ode não ter expres s a0

genética e, consequentemente, não ter s ido conservado.

Po r , outro l ado , as proteínas estudadas geralmente têm

funções ce lulares e specíficas, ou seja , são genet icamen

te . importante s e aptas a serem cons ervadas (Kohne et

al., 1971 ).

3 . Caracterizaç ao do genoma de A. castellanii

o princípio biológico da continuidade ger

minal exclui a po ss i bilidade de que a diferenciação en

volva distr ibuição diferencial de DNA entre tecidos ou

células em diferentes estágio s de diferenciação. Aplica

ções de té cnicas de hibridização RNA-DNA, . permitem iso

lar as sequências de DNA expressas em RNA. O conhecimen-

to da fração de DNA expresso tem s i el.o utilizado para

detectar amplificação gênica em tecidos adultos ou fe

tai s (Kohne e Byers , 1971 ) e os resultados obtidos ex

cluem a existêncla de amplificação, pelo ménos , em lar

ga escala . Além disso, a análise da atividade gênica ao

l ongo da ontogênese demonstra que todas a s sequências de

DNA estão igualmente representadas em todos tecidos adul

tos, embrionários e transformad os de mamíferos (Bolton,

1966 ). Por outro lado , a população de moléculas de RNA

de diferenT.e s órgãos adultos e fetai s diferem na quali

dade e na quantidade. A medida que ocorre a diferencia -

ção de larvas de Xenopus , verifica- se que o RNA produzi

do cada vez mais S6 assemelha ao RNA da larva totalmente

desenvolvida (Bo l ton , 1965) . Esses resultados corrobo

ram a idéia fundamental de que a diferenciação i mplica

na atividade diferenc ial do genoma , através da produç ão

de populaç õe s di st intas de moléculas de RNA (Jacob e

Monod , 1963) . Todavia, em certos organismos como ~-cosciara e S~iara , há evidências de rep licação

cial do genoma (Breuer ' e Pavan , 1955 ; Crouse

1968 ; Meneghini et a l., 1971) . A partir dessas

:iiferen -

e Keyl,

evidên-

~ ia8 , formulou- se a h ipótese de que a a l teraç ã o do po

tencj.a l genético d os seres v i vos , f~cilment e dete c t ada

25

em alguns organismos, poderia constituir um mecanismo

genérico de citodiferenciação (Pavan, 1965)0 Entretan

to, a amplificação gênica, como mecanismo do desenvol

vimento, talvez seja restrita a situações onde grande

quantidade de um produto gênico específico seja neces

sária, como" na ovog~nese de anfíbios (Birnstiel et

aI., 1971) e insetos (Gall et aI., 1969;Lima-de-Faria,

1973), oU ' na "magnificação" de rDNA em mutantes "bo

bbed" de Drosophila (Ritossa, 1972)0 Entretanto, a

descrição de mecanismos sofisticados de citodiferencia

ção mostra que as generalizações devem ser analisadas

criticamente. Em certos organismos, verifica-se elimi

nação seletiva de cromatina (cfo Balsamo, 1972) ou de

DNA altamente repetido, como acontece am Ascaris (Mbdak, 1973)0 Durante a formação do macronúcleo de ci

liados (Prescott e Krishna Murti, 1973), há destrui-

ção de 80% do DNA e as novas moléculas são sintetiza

das a partir de pequenos fragmentos restantes de DNA,

que cont~m todas as informações necess~rias para a ma

nutenção, crescimento e divisão das c~lulas. Trabalhos antigos sobre a diferenciação

de Ao castellanit (Volkonsky, 1931),mostraram que, lo

go no início do encistamento, havia uma expulsão par -

cial de cromatina .periférica para o citopla~ma adjaceg

te ao núcleoo O material foi caracterizado como DNA,de . -

vido à reaçi!o de Feulgen positiva. Em vistos mais ve-

lhos, ' essa zona desaparecia, devido à migração do áci

do nucleico para a membrana externa do cisto o Observa

va-se, também, a saída de grânUlOS basófilos do nucléo .-lo, que se acumulavam inicialmente no nucleoplasma prQ

ximo à membrana nuclear e depois migravam para o cito

plasma, onde desapareciam gradativamente.Posteriormen

te, através de micros copia eletrônica, Bowers e Korn

(1969) verificaram que o volume nuclear diminuia 40%

durante o encistamento: no início do processo, o

cleo tornava-se lobado, formando pequenos botões

, nu-

que

pareciam não conter material nucleolar. Grande parte

dos botões era inco~porada em autolisossomos, caracte

rísticos de células yncistautes. Além disso, parte

do material densamente corado do nue1.éolo, parecia se

d i spersar no nucleoplasm a e seu de stino posterior era

26

difícil de ser -dete rminado morfológicamente • . O decr~s -

cimo nucleolar; igual a 75% durante o encistamento (Ray

e Hayes, 1954), era paralelo à expulsão de cromatina.

Chang e Hume s (1962) isolaram um fator

·transferI vel para células humanas em cultura de tecido,

denominado "lipovl~us". Trabalho s posteriores (Chang

let al., 1966), 'sugeriram que O"lipov:trus': era transpor

tado por uma célula amebóide, capaz de transferI-lo pa

ra célUlas humanas crescendo "in vitro", por um meca

nismo desconhecido que exigia o contato entre as célu

las. O fator trans ferIvel sofria replicação na célula

hospedeira, caus~ndo alterações nucleares ' (degradação

de DNA), produção de antIgenos especificos e lise celu

lar. A injeção intracerebral das células amebóides com

seu fator transferIvel, em macacos, causava encefalite.

As células amebóides foram, então, identificadas como

Hartmannella rhysodes (Acanthamoeba ~.). A observação

direta do efeito patológico ' dessas amebas e a demonstr~ ção, por imunofluorescência, de antIgenos das amebas

~as células hospedeiraé (Liu e Rodina, 1966),sugeriram

que Acanthamoeb~ transportava ·um fator transferivel,de

riatu:r'eza desconJb.ecida. · lto e colaboradores (1969) pos

tularam que o fator trB.nsferIvel poderia ser o respon

s~vel por parte da incorporação citoplasm~tica de timi

dina tritiada verificada ánteriormente (Chang et aI.,

1966). An~lise estrutural fina, através de autoradiog;~ fia em trofozoitos de Acanthamoeba (Ito et alo, 1969)

demonstrou incorporação ativa de .timidina tritiada no

ci toplasma, enquant.ó que a marcação nuclear era relati

vamente limitada: cerca de 32% -da radioatividade era

encontrada no citoplasma é o número de grãos contados

sobre o plasmalema ·era três vezes maior do que sobre

as mitocôndrias. A linhagem de Acanthamoeba utilizada

por Ito et ül. (1969), foi propagada durante anos em

culturas axênicas, tornando, portanto, pouco prov~vel

que os corpúscu.los citoplasm~ticos resultassem da in

trodução de microrganismos exógenos. Em duas linhagens

de Naegleria gruberi, ameba de -solo relacionada taxo

nômicamente 'com A. easte'llanii, foi demonstrada a exis

tência de partícula.s seme lhantes a vIrus ao microscópio-

27

eletrônico~, capazes de infectar células de embrião de

galinha; ocasionando lise e liberação de maior quanti- ' dade de mate'rial ,infectante (Dtumebacke e Schuster, 1971). Em Acanthamoeba, os corpúsculos citoplasmáticos contendo DNA poderiam ser elementos genéticos normais do ·genoma da ameba, endosimbiontes facultativos ou parasita~ intra-celulares como v::trus defec~ivos ou epis-somos (Ito et aI., 1969). A existência provável dess'es elementos serelaclona com a verificação anterior de um fator transfer::tvel .nessa li:nhag·em.

A descrição da expulsão de cromatina e a presença de endósimbiontes citoplasmáticos podem, de alguma maneira, estar relacionadas. Nos estágios iniciais do encistamento, verifica~se o aparecimento de autolisossomos no c'i toplasma, contendo mitocôndrias, grâ

nulos de glicogênio etc. (Bowers e Korn, 1969). Os cistos apresentam agregados de restos citoplasm~ticos

aderidos à camada externa da parede do cisto, sugerindo que o conteúdo dos .autolisossomos seja des.earregado na paredeem .formação (cf. Bowers e Korn, 1969)-. Autó ... lisee . excreção de componentesci toplasmátic.os e nucleares são consistentes com o apar~cimento de prote!nas, ·aminoácidos e ribónucleot::tdeos no meio de cultura

de células encistantes (Griffiths e Hughes, 1968). O material excretado contém; ao microscópio eletrônico , , . partículas semelhantes a vírus (Bowers e Korn, 1969).

Fenômeno semelhante à liberação de CTomatina ·em A. castellanii, foi verificado durante a ovo-

A • A

gene'se de lnsetos do genero Acheta, conforme . trabalhos recentes de Lima-de-Faria e colaboradores (cf. Lima-deFaria·, 1973). Durante a meiose, nesses organismos, há

amplificação ' de certos cromômeros . que liberam as ,

co-pias amplificadas no nucleoplasma. Subsequentemente , esse DNA se dirige para as proximidades do envelope nuclear e força sua passagem para o citoplasma, ficando envolvido .poruma ·parte da membrana nuclear.Através de hibridização "in. situ" , demonstra-se que a maior parte do' material amplific?-do é formado po·r cistrons

ribossômicos. O DNA migra para o citoplasma acompanha -

do por , grande quantidade de RNA. Os dois tipos de áci-

dos nucleicos

mando grandes

transferência

28

permanecem associados no citoplasma, for

particulas de fUnção desconhecida. Essa

de complexos DNA-RNA também foi verifica-

da em outras espécies de insetos (Jaworska, citado em

Lima-de-Far ia, 1973) e rato (Izquierdo e Vial, 1962; Szollo s i, 1965, citados em Lima-de-Faria, 1973).

O encistamento em amebas pode ser consi,de

rado como um processo de diferenciação celular típica,

não complicado por processos sexuais (Neff et aI.,

1964 a). Muitos sistemas biológicos têm sido explorado~, na tentativa de elucidar os eventos metabólicos que

determinam a regulação do crescimento e diferenciação c~

lular. O encistamento pode constituir um sistema útil

para o estudo da morfogênese celular, já que os tipos

celulares envolvidos são distintos estrutural e quimica

mente e o processo pode ser . acompanhado sob condições

experimentais bem definidas. Apesar de representar um exemplo de diferenciação de protozoários, pode servir

como um modelo simples para a compree~são do desenvolvi-

mento de sistemas evolutivos mais complexos, com os

quais compartilha caracteristicas comuns (Krishna Murti,

1971; Stevens e fachler, 1973 a).

Ass~m, .a simplicidade relativa do sistema

de A. castellanii, a facilidade de ser cultivada axêni

camente em larga escala e a possibilidade de ser encis~

tada sincronicamente, motivaram o estudo da diferencia -

ção dessa a meba. Tendo em vista as mudanças nucleares

paralelas ao encistamento, a idéia inicial deste traba

lho era analisar o padrão de sequências de DNA nas duas

fases do ciclo de vida do protozoário. O objetivo era

explorar as interaçbes 'entre os ácidos nucleicos do cis

to e trofozoito, atra~és da homologia entre seus DNAs.

E$peculações como essas poderiam fornecer resultades in

teressantes sobre o papel biológico das diferentes fami

lias de DNA-presentep nos organismos superiores; já que

a diferenciação da ameba envolve, provavelmente, perda

de parte do material genético o A carac~erização do DNA

de trofozoito sugeriu :vários problemas que ' passaram, en

tão, a , ser estudados. PadronizO,u",-'se um método de iso

lamento de núcleos dessa ameba (Marzzocoe Oolli, 1974)

29

e de extração de TINA de trofozoitos e cistos. A análise

do DNA de trofozoitos quanto ao comportamento em gra

diente s de densidade, perfil de desnaturaç ão e renatur~

ção, forneceu resultados que podem se relacionar com

a descrição citológica de dorpúsculos citoplasmáticos

contendo DNA CIto et al.,1969) e com a extrusão de DNA

para o citoplasma CBowers e Korn, 1969). Deste modo,

o trabalho a ser descrito representa a caracterização

parcial do DNA de trofozoito e uma análise preliminar

do DNA de cisto. Os resultados obtidos poderão, futura

mente; servir para o estudo da homologia existente en

tre esses ácidos nucleicos, o que poderia ser útil pa

ra uma melhor compreensão da diversificação gênica du

rante o ciclo de vida de um organismo superior relati

vamente simples.

v. Métodos

1. Cresci~ento de A. caste11anii

a) Meios de crescimento

° crescimento da ameba foi testado em dois

meios de cultura, resultantes de modifica~ões dos meios

descritos por Neff (1957) e Band (19 ~-)9)e A composição

dos meios empregados, denominado s A e B era a seguinte:

Meio A Meio B

proteose-peptona - 0,75% p r ot e oBe-peptona - 1,5%

extrato de levedo - 0,7S% glicose - 1,0%

glicose - 1,5% NaC1 - 2mM

MgS04 - lmM " MgC12 - 0,015mM

CaCl'2 - 0,05mM CaC12 - 0,02mM .\

KH2P04 - 2mM . FeS04 - O,OlmM

citrato férric.o - O,lmM Na2HP04 . - lmM

KH2P04 - lmM

Os dois meios continham ainda, as seguin-

tes vitaminas: tiamina (lmg/l), biotina (0,2mg/l) e vi

tamina B12 (1 )1g/1) •

A preparação dos meios de cultura seguia o

procedimento descrito abaixo, necessário para evitar a

formação de resIduos i~solúveis, ricos em nitrogênio, a

pós a autoclavagem. ·

. 0 meio, com pH igual a 7,0, não contendo gli

cose e vitaminas, era fervido durante 20 minutos. Após

resfriamento, as vitaminas eram adicionadas e o meio

filtrado através de papel de filtro fino. ° lIquido tran§.

parente resultante era distribuído em frascos de cultura

e autoclavado a 1200 C, "lkg/cm2 , durarite 30 minutos. An-

tes do inóculo, glicose 50%, autoclavada à parte, era

31

adicionada assepticamente, no volume adequado~ Em al

guns casos , adi cionava-se 100pg/ml de penicilina e es-

treptomicina, previamente esterilizadas por

em filtros Millipore GS autoclav~dos.

passªgem

b) Tratamento dos frascos de cultura

As amebas aderem firmemente a superf!cies,

o que dificulta a obtenção de dados quantitativos so

bre o crescimento. O uso de vidraria tratada com sili

cone evita esse problema, sem causar nenhum dano às cé

lulas (Neff et aI., 1958). Os frascos de cultura, lim

pos e secos, eram siliconizados com uma solução 5% de

silicone e secos a 2200 C por cerca de 16 horas o

c) MétOdos de cultura

A cultura era sempre feita a 2800, de di~ Versas maneiras:

Culturas estacionárias: as amebas eram

crescidas em cu~turas rasàs, obtidas com erlenmeyers

contendo um v?lUille de mpio igual a 1/5 da capacidade

do frascoo Esse tipó de cultivo era utilizado para ma

nutenção de cul t .uras-estoque.

Culturas agitadas: amebas cultivadas em

erlenrneyers, mantendo a mesma relação de volume (5:1),

eram incubadas em agitadores New Brunswick, com veloci

dade em torno de 100 rpm. O crescimento em pequena es

cala, podia ser obtido por incubação de pequeno volume

de meio (cerca de 2 m1), em tubos inclinados sob agita

çao o

Cultura em larga escala: para a obtenção

de grandes quantidades de ' células, adotaram-se difer.en-

tes processos de cultivo: crescimento em frascos de

12 1, contendo 1 1 de meio, incubados estaticamente

crescimento .3egundo Adam et al~(1969), onde a aeração

era obtida colocando-se frascos ' de 3 a 6 1, contendo

imã, sobre agitadores magnéticos e' cul ti vo em fe rmenta-

32

dor (New Brunswick Sci. Co. Inc.), com uma dorna de

8 1, contendo 5 1 de meio, aeração d~ 2 1 de ar por mi

nuto e agitação de 80 rpm.

d) Determinação da velocidade de crescimen

to '

° crescimento era medido pelo nÚmero de

células por ml de meio, por tempo de cultivo o ° número .

de células era determinado por contagem de amostras tri

plicatas em câmara tipo Neubauer (Resistance, Germ).Al

ternativamente, o crescimento era determinado pela ab

sorbância a 600 nrn, em um espectrofotômetro Coleman Jr.

11, utilizando-se . frascos de cultura com um tubo de en

saio adaptado lateralmente.

e) Manipulaç ão de culturas

As operações, após autoclavagem dos fras

cos, eram realizadas em câmara assepticao ° controle de

contaminação das culturas era realizado por pré-incuba

ção dos frascos estéreis a 37°C, 16 horas; verificação

de crescimento bacteriano por adição' de alíquotas do

meio de crescimento em caldo glicosado, incubado a 0-. . 37 C por 16 horas e coloraçao do melO de creSClmento

estéril pelo método de Gramo

20 Encistamento

° enc~stamento era induzido por remoça0

das células do meio de crescimento, lavagem e transfe

rência para um meio de encistamento semelhante ao des

crito por Neff et aI. ( 1964 b) , com a seguinte

composiç ão: KCI 100 mM; MgS04 8mM; CaC12 0,4mM; NaHC03

ImM e tampão Tris-HCI 20 mM, pH 9,0. ° meio de encista-

mento era autoc]avado nas mesmas condições que o

de cresc imento e todás operaç ões eram realizadas

ticamente o Células de culturas agitadas em f as e

rítmica tardia, eram coletadas por centrifugaç ão

meio ,

assep-

loga

( 800xg,

·~3

10 m1.n.) e lavadas três vezes com meio de encistarnento. ~ ~eguida, as c~lulas eram suspenAas em meio de êhci8~ tt\m~nto. ao nível de 105 cé1ulas/ml e :i.ncubadas â

28°0 ~ob agitação, durante 20 horas. A ~~lgção entre dá pa.oidáde dd frasco e volume de tneio era igual à 5t1, O~ cistos, suspensos em me i o de enc istamento, eram 9S-· tCCe.d09 g 4°0.

1!:ncistamento espontâneo podie ser obtiao êtil culturatl agitadas que, após âtingirem Uma densidade de aproxim~damente lxl06 células/rol, começavam a encistar ilssincrônicamente.

3. Germinação (Excistamento)

Os cistos eram centrifUgados e três vezes com meio de crescimento (lOOOxg, 10

lavados

tnin.·) i sob condiçbes assépticas. Os cistos lavados , eram, en-tão; inocu1aaos ao nível de 5x103 organismos/rol, em me·io de crescimento f e cultivados sob agitação a. 28°C • Â germinação era acompanhada durante 8 horas~ retirando-se a1íquotas (intervalos de 30 min), que erâm observadas ao microscópio de fase pâra verificàção do apa~

redimentb de amebas livrES nO meio.

4. I,sólB:IApnto de p:~.cleos de trofozoi "bOIS

.. nu-1'0-

Vários métodos para purificaç~o de c1eos, utilizando meios aquosos de homogenização, raro testados. Segue-se uma descrição sucinta de m~todo:

oS.da

a) Método de Chauvea~ et aI. (1956): o procedime~ to adotado era semelhante ao descrito originalmente par~ f!gado de rato.

b) Método que emprega o detergente Nonidet P-40: as células eram sedimentadas e lavadas com sacarose

0,25M; GaC12 3 mM e Tris-HCl 0?05 M, pH 7,4. Em seguida, as células eram suspensas na mesma solução contenao detergente e agitadas em agitador magn~tico por 10 a 30 t11H ILl.to8 e. 4°00 Foram testadas várias CQncentra-

31+

ç~es do detergente, variando de 0,5 a 5 ,0%.

c) Método de Stevenson (1967), modificado: a 1i-

se celular era obtida por suspensão das

méios hipotônicos (NaCl 0 ,05 M, CaC12 1

0,1% (v/v) de Tween 80.

células em

mM) , contendo

d) Homogenização de células em um aparelho Vir

tis, modelo 45: Foram testados diferentes meiQs de' ho~

mo genização, cont~ndo oU não d~tergehtes e v~ride ' ~em~

pos e velocidades de agitação.

, e) Rompimento de células' por ultra-som: ,

celulas

lavadas e suspensa's em sacarose 0,25 M" contendo CaC12

3 mM' e Tris-HCl 0,05 M, ,pH 7,4, eram submetidas a di

ferentes tempos e intensidades de sonicação em um apa~

relho modelo Wl85D da Heat-Systems Ultrasonics, Inc.

f) Método de Schneider e Hogeboom (1950), modi

ficado: cet'r.a de 3xl08 células eram centrifugadas (800

xg , 10 min.) e lavadas com sacaro s e 0, 25 M; MgC12 lmM ~

suspensas em 0,5 ml de pacarose 0,88 M; Mg012 lmM e

for çadas através de uma agulha hipodérmica 25-8, por

20 vezes. ° precipitado obtido por centrifugação do

homogenato a 800xg, durante 10 minutos, era lavado

duas vezes com a. sacaros e mais concehtrada e suspenso

em 1 rol da ínesma. saluç.ão. A 'fração nuclear impura era

colocada sobre 10 ml de sacarose 2,4 M, contendo

MgC1 2 lmM e centrifugada a 28000 rpm no rotor 50 Ti da

ultracentrífuga Spinoo, durante 1 hora.

g) Método de' Hymer e Kuff (1966), modificado: a

modificação introduzida refere-sé à homogenizaçãc que

era obtida por passagem em agulha hi podérmica 25-8, em

vez de empregar um homogenizador tipo Potter-Elvejenem.

h) Método de Blobel e Potter (1966), modificado:

o precipitado de núcleos impuros era obtido pelo méto -

do (f). A purificaçáo posterior dos núcleos era feita

conforme descrito por Blobel e Potter (1966).

i) Método de Rozijn e Tonino (1964): o método foi

testado sem nenhuma modificação considerável.

j) Método adotado rotineiramente (Marzzoco e

Colli, 1974):

Os núcleos eram sempre isolados de célu

las em crescimento exponenc ial. Todas as etapas do iso-

')/

l a mento eram r eali z adas entre O P. h OO .

Cer c a de 3xl 08 c élul as e ram coletadas por

(~e ntri fuga r; ã o (nOOxg , 10 mi n.) e l av ad.as com NaCl

0i14 M~ Em .geguida, d e t e rminava-se o pe s o úmido de células . Às c élulas eram s u spensas e m 1 ml de uma solu

Ça0 (me i o PVP), com á seguin te compo s ição: polivinil

p -irrol idona 8% ; MgC1 2 lmMi CaC12 2mM; KCl 2 mM e Tris

RCl 0, 05 M, pH ~,4. As c~lul as e r a m rompidas por passagem em

seringa com agulh a hip o d érmica nº 25-8, por 15 a 20 ve-

ze s . O hOTtlo genato era diluído c om meio PVP contendo

sacarO ~3 e 0 , 6 M, até concentração :final ele 25% (peso úmido ini c i a l / v o lume). O h omo gen 3.to diluído era centrifu

g ado a 700x g por 10 min uto s . O pre c ipitado obtido er~

sus penso em um volume conh ecido de meio PVP-sacarose

0, 6 Mo

A purificação dos núcleos era obtida

c entri fugação em gr adiente s descontínuos de tneio

por

1?VP~

conten do diferentes concentrações de .sacarose. Os gra

dient e s tinham a seguinte composição do topo ao ftlndo:

0,3 ml de sacarose 1,2 M; 0,7 fil de sacarose 1,5M; 0,7 ml

de sac arose 1,8 M ~ 2,] ml de sacarose 2 i O M. A amostra

(0,7 ml). contendo os núcleos era cuidadosamente coloca

da no topo do gradiente e centrifugada no rotor SW 65-Ti

da ultracentrífuga Spinco L3, a 50000xg, por 1 hora 'l.

4°C. Para volumes maiores, utilizava-se o rotor SW 25.1,

mantendo as mesmas proporções relativas de soluções de

sacarose. Depois da centrifuga~ão, o material se distri-'" . , buia em tres bandas · sobrenadantes constlt1udas por frag-

mentos de membranas de tamanho variado e um precipitado

que continha os núcleos.

Os núcleos eram suspensos em meio PVP-saca

rose 0,6 M, eentrifugados a 700xg por 10 minutos c fi

nalme nte ressuspensos na mesma solução o

50 Controle da pureza das preparações de

núcleos

a) Microscopia de f ase : o s núcleos isolados

e ram roti ne i r ame nte anal i sados, a o ~lcroscópio de fase ,

6

qu.ant~o 8 sua i ntegr i rlane morfológica e aus ência de célu

las int e iras ou fragmentos de membranas contaminantes .O , d; , 1 . · numero .e nUtCleos e celu as J_nte1ras era det e:rminado

por cont ~gem em eâmara d'e NeubRuer . Para isso 4 as prepa

raç5eA erR~ ~oranas com lmR soluç~o n8 Giemsa JO% em sa

carOS8 0; 25 M; MgC12 1 ruM. b) Micr oscopia eletrônica: 0 ,8 precipitados

de núcleos ~l'al11 fixldo s , durante '+8 horas , em glutaral -

detdo 1 , 5% ; em tampão fosfato de sódio 0, 22 M~ pH '7 ; 2 •

Os fragmentos eram, então, transferidot3 para uma sol u

ç~o de Os 04 1% e, em següida para uma solução de acet ffi

to de nranila 0,5%, onde permaneciam por 3 e. 12 horas re s pec f:i vRmenb'l. A de s i fl rataqão ArR COJl(tuzida atrflv~s

de uma série p;radativa oe soluções de etanol. Os nú-cleos fi xaoos e de s irlratadoE~ erRm embe"b i.doR em Ara.ldite

e cortedos em um ultra-illiGrótomo Porter-Blrun MT-l. As

secçõe s ohtiàas , com cerca tie 90 nm de espe ssUra, eram

coradas em acetato de uTé3nila ~% e citrato de

2 , 6% e eXRminact8s em um mi croscópio e letrônico

EM9 S-2.

chumbo

Zeiss

6. :posagem de RNA; UNA e pl'otelna em

~leo~ e homogenato.

; nu-

A composi ção qUlmlca de núcleos e homogena~

tos, e ra analisada através do método de Schmidt~Thannhau

ser; conforme . descrito por Munro e Fleck (1966 ). Segue -se uma de scrição sucihta do procedimento adotado para o fracionamento das ~reparações de núcleos e homogena

tos. 1mostrRstriplicatas eram precipitadas no

gelo, durante , 20 min~, com concentração final de paA igUal· a 0,4 No O' preeipitado obtido por centrifuga.ção a .

10000xg , 10 mini, era lavado duas 'vezes com PCA 0,4 N • O material áci'do-insolúvel era suspenso em NaOH 0,33 N

e · incubado durante 1 hora a 37<:'C. ° digesto alcalino era acidifi cado com PCA (concentração final de 0,4 N) e man-

tido no gel o por 20 ·min . O prec i pi tado obtido por cen.,.

t ri f u ga ção ( l OOOOxg , 10 min o), era lavado com PCA 0,4 N.

37

RNA era dosado no s obrenadante e DNA no precipitado.

O precipitado obtido por acidificaç;o do

dige s to alca'lino . era dis s olvido em NaOH 0, 33 N, a 37°C, por 20 mine e dosado quanto . ao teor de DNA~ se~ gundo o método de Ceriotti (1952). O padr;o utilizado

era 2-desox i-D-ribo s e.

RNA era dosado no digesto alcalino com

o reagente de orcinol (bische , 1955), empregando DNri

b ose COIDO padr;o. . t A dosagem de protelna e r a feita nas pre~ - . ; -paraçoes de nucleos e homogenatos nao fracionados~ de

acordo com o procedimento de Lowry et aI. (1951). Al

bumina sérica bovina 'era empregada como padrão nas de

terminações.

7. Ensaio da atividade de RNA

se (E.C.2.7.7.6)

polimera-

Os núcleos utilizados para a determinaç;o

da atividade de RNA polimerase, foram lavados por cen

trifugação (800xg, 10 rrdin.) e suspensos em sacarose

0;25 M; MgC12 ·1 mM e Tris-HCl 10mM, pH 7,4.

A mástura de incubação 'para o ensaio en-

zimático tinha· p- segulnte composiç;o~ 10 )lei/ml de

3H- UTP ( 11,7 Ci/mM); ATP 1 mM; GTP 0,4 mM;CTP 0;4 mM;

DTT 4 ' mM; KCl . 20 mM; MgC12 4 mM; NaF 4 mM e Tris-HCl

0,1 M, pH 7,6 0

A reaç;'o era iniciada pela adição de uma

al!quota da suspensão de núcleos contendo l5pg de DNA.

A incubação era ~eita a 30o C, sob agitação o A reação

era paralizada por adição de 10 volumes de pirofosfa-

to de s ódio em TCA 20% e 200)1g de a lbumina para fac i

li..tar a precipitação, obtida por manutenção dos ,tubos

durante 45 mino no gelo • . Os ·precipitadosrecolhidos

por centrifugação a 10000x g, por 15 mino, eram lava~

dos com pirofosfato de sódio 0,05 M em TCA 10% e de

pois com etano l 95%, contendo acetato de ' sódio 1%. Os

precipitados eram hidrolizados com KOH 0,3 N por 1 ho

ra a 37°C . O h idrolizado era acidificado com TCA até

38

concentração final de 10% e centrifugado (lOOOOxg, 10 mina)~ A radioatividade incorporada em RNA era deter

minada no sobrenadante, constituído pelo material ácido-insõlúvel; . e sensível à hidrólise alcalina. O prow

cedimento . adotado reduz a radioatividade 'Ibackground" & cerca de 4,5% da radioatividade incorporad~ · em RNA, após 30 minutos de incubação. Alíquotas (50 )11) do $0-

brenadante eram colocadas sobre filtros Whatman GF/A. que eram secos e contados em frascos cqntendo 10 ml de líquido de cinti1ação; contendo: hidroxi1-hiamina 0,5%

(v/v); 4 g/l de PPO; 100 mg/l de POPOP e tolueno q.s.p. À radioatividade era determinada em um cintilador Beck man LS-250, com eficiência de contagem de aproxlmada -mente 37%.

Farale1amente, a atividade de .RNA polimerase dos núcleos isoladps, foi analisada em presença de actinomicina D e rifàmpicina, ao nível de 8}lg por.

ml da mistura de incubação.

8. Purifipação de mitocôndrias

Todas as opera.çoes eram realizadas entre

O e 4 0 0. Células em fas:e exponencial de crescimento ,

eram sedimentadas e lavadas com 'sacarose 0,24 M;MgC12 10 mM; KC1 10 mM e Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 por centrifugação a 1000xg durante 10 mine As células, suspensas em três volumes da mesma sacarose, contendo EDTA

5 mM em vez de MgC12 10 mM, ,eram homogenizadas em um homogenizador tipo Dounce (10 movimentos)o A extensão

do rompimento celular era acompanhada · ao · microscópio de · fase. O homogenato era centrifugado 10 minutos a

900xg' e o sobrenadante obtido era centrifugado a 10000xg por '20 ·min. Os precipitados compactos obtidos eram submet~dos a dois ciclos adicionais de centrifuga çãe diferencial. A suspensão final ' de' mitocôndrias ,ao

. '. - , , IDlcroscoplO defase, nao apresentava nucleos ou celu-las inteiras. A mesma ·contatação era feita ao microsc2 pio eletrônico onde, tOdavi·a, era possível verificar a presença de fragmentos de membranas contaminantes.

39

9. Extração de DNA

° método descrito a seguir era utilizado, com as ,devidas adaptações,para extrair DNA celular total, nuclear e mitocondrial de trofozoitos e DNA total de cistos.

Todas as operações eram realizadas entre ° - - . ° e 4 O~ A preparaçao em questao era lavada com NaOl

0,14 M, 'por centrifugação. () material centrifugado era, pesado e · suspenso em um meio de extração contendo die

tilditiocarbamato de sódio 0;3 M e fenolftale!na difosfato 0,015 M, pH 7,5, na proporção de 811 (v/w). Adicionava-se SDS até concentração final de 2,5% (w/v) e a suspensão era homogenizada manualmente em genizador tipo Potter-Elvejehem. ° lisado era do com i~al volume de uma mistura contendo 3 de fenol e 1 parte de meio de extração (v/v) 30 min o à temperatura ambiente. As soluções de

um homoextra!partes

durante fenol

e meio de extração eram preparadas imediatamente antes de usar. Após a extração fenólica, a emulsão , era centrifUgada (lOOOOxg, 15 min.) e a fase aquosa, extremamente viscosa, era removida e precipitada COm 2 volumes de etanol. ° precipitado fibroso, contendo os ácidos nucleicos era cole.tado com a ajuda de um bastão de vidro em rotação. Os ácidos nucleicos eram dissolvidos . em sse, num volume igual ao da fase aquosa da extração com fenol e incubados a 37°0 com RNase P8.E; creática (150 pg/ml, 1 hora) e pronase (500 pg/ml, 3

horas). ambas previamente aquecidas a 80°0 por 15 minutos. Adicio~almente, o DNA · era tratado com a-amil~

se (200 pg/ml , 2 h. a 37°e), previamente analisada quanto à cont aminação por DNase. Seguia-se nova desproteínização, agora com fenol 88% (v/v),colltendo 0,1% de hidroxi-quinolina. A fase aquosa era precipitada

com 2 volumes de ·etanol. ° DNA obtido ·era dissolvido em 0,1 sse e precipitado com isopropanol, conforme descrito por Marmur (1961), Finalmente, . o DNA er~ submetido a extensa diálise contra 0,1 8S0.

40

10. Centrifugação em gradientes de CsCl

~) Centrifugação preparativa

As preparações de DNA e r am adic ion almen

te purificadas ou fracionadas em diferen tes c omponen

tes, por centrifugação em gradientes de Cs Cl. O pro

cedimento adotado era o seguinte: CsCl sóli 'io era a

dicionado a 3,5 ml de solução de DNA cont endo 1 a 20

unidades de absorbância ( 260 nm) em 0,1 SSC ou Tris

HOl 0,01 M, , até ser obtida uma densidade inicial de

11725 g/cm3. A densidade d a soluç ão era determin ad a a

partir do índice de refraç ão (Ifft et aI., 1961). A

solução era distribuída em tubos de nitrocelulose,

preenchidos com óleo mineral (Sigma). A centrifugaçã0

era feita no rotor SW 50.1 da ultracentrífuga Spinco

t o --3, a 38000 rpm e 25 C. Cerca de 40 fraçoes com 8

gotas cada uma, eram recolhidas por punção no fundo

do tubo, convenientemente diluídas com tampão e ana

lisadas quanto à absorbância a 260nm. A linearidade

do gradiente era verificada através do índice ' de re

fração das fraç6es não diluídas o As frações com ~l

ta absorbância eram reunidas e dializadas contra o

mesmo tampão. O DNA era coletado por centrifugação n o

rotor 50 Ti da Spinco L-3, a 40000 rpm, 4 0 C, durante

cerca de 20 horas.

Em alguns experimentos, as frações d,os

gradientes eram analisadas quru1to ao teor de hexoses

e desoxirribose, determinado segundo os mé todos des

critos por Mockrash (1954) e Giles e Myers (1965),

respectivamente o Os padrões utilizados nas do s agens

eram D-glicose e 2-desoxi-D-ribose.

b) Centrifugaç ão analítica (de termin a ç'ão

da densidade de flutuaç ão)

As s oluç6es de DNA e r am previa mente dia

lizad as c ontra NaCl 0,01 M e centrifugadas a 8000xg

durante 45 mi n u to s .

Amostra s de DNA contendo cerca de 3 pg,

41

eram centrifugadas a 44000 rpm, durante 21 horas a 25°C, em gradiente de CsCl ( p inicial = 1~700 g/cm3), con-

·tendo DNA do fago 2C de Bacilus . subtilis ( p = 1,742 g/cm3) como padrão de densidade. As análises -eram rea-lizadas em uma ultracentrífuga Spinco, modelo E, equipada com um sistema padronizado para a medida da absor

ção no ultravioleta, um monocromador e um. "scannér lí ·ele trônico. A densidade de flutuação era calculada segun-

_do Vinograd e;Hearst (1962), a partir da densidade de referência -(1,742 g/cm3 ) e expressa em termos da densidade inicial da solução, à pressão atmosférica.

11. Fragmentação de DNA

Para a obtenção de fragmentos de DNA de

baixo peso - molecu~ar, utilizava-se um Omni-Mixer da· Sorvall Inc. t equipado cóm um "micro-attachment" , ope-

o -rando a O-C. Cerca de 3 ml de ·soluçao contendo 100 pg de DNAJml, eram agitados durante 30 minutos, com o dial na posição 8.

12. Avaliação de peso moleeular

a) DNA nativo

O peso molecular (PM) era avaliado a partir da velocidade de sedimentação, determinada por centrifugação zonal em gradientes lineares de sacarose. O padrão de PM utilizado era o TINA do fago T

7, marcado

com 32p.

As amostras -de DNA eram , cuidadosamente co

locadas sobre 25 ml de um gradiente de sacarose 5 a 20%, contendo NaCl 1 M; EDTA 1 mM· e Tris-HC1 lOmM, pH 7,.8 (gr~diente neutrd) ou -NaGl 0,9 -M;EDTA 1 mM e NaOHO,l M (gradiente alGalino) e centrifugadas a l8000 . rpm no rotor SW 25.1 (Spinco L-3), por 16 horas a 40 C. Frações de aproximadamente 1 ml eram coletadas

a partir do fundo do tubo e analisadas quanto à absorbância· a 260nm· e radioatividade. A radioatbri dade era determinada por cintilação líquida na s olu~~o descrita

4 2

por Bray \1960), em um cintilador Beckman LS-250o

O PM do DNA nativo (gradientes meutro s )

era det erminado con~orme sugerido por Burgi e Hershey

(1963) e o PM do TINA mon ocatenário (gradiente s alca-

linos), através da equação proposta por

(1965).

b) DNA fragmentado

Studier

o peso molecular de DNA fragmentado conf orme descrito no item 11, era avaliado a partir da

velo c idade de sedimentação em gradientes lineares de

sacarose 5 a 20% em SSC. O DNA era desnaturado com ál-

50.1 cali, neutralizado e centrifugado no rotor SW

(Spinco), a 45000 rpm, durante 4 horas a 4 0 C.

° DNA utilizado como referência era o

DNA do fago ' fd (circular, monocatenário), que, nas

condições utilizadas, ' comporta-se corno uma molécula

linear com S20

0 = 24,48 (Colli et al., 1971). As ,w . constantes de sedimentação obtidas eram relacionadas

ao s pesos moleculares dos DNAs, através da equação

proposta por Eigner e Doty (1965).

O procedimento empregado para a fragmen

tação de TINA · prolduz:la sempre uma população homogênea

de moléculas, c?nforme sugerido pelos perfis de ab

sorbância dos gra.dientes de sacarose, caracterizados

por uma distribuição unimodal e gaussiana.

1 3 ) Renaturaç ão de DNA

A renaturação de DNA era medida pela

queda de ab sorbância a 260nm (Wetmur e Davidson,1968),

determinada em um e s pectrofotômetro Zeiss PMQ 11. A

temperatura das soluções de DNA, contidas em cubetas

de quartzo com tampa 1e t~flon, era mantida constan

te por circulaç ão de água proveniente de uni banho Co

lora (NB-36252 , Germany), termostatizado a 600 C. As

amo stras ' de TINA em NaCl 1 M, eram desnaturadas por ad,!

ç ão de 0 , 05 par t es de NaOH 1 N e, depois de 15 min.

neutrali z a i a s com igual volume de NaH2P04 2M. As so-

43

luções utilizadas para a désnaturação e neutrali~ação eram mantidas a 600 0 e adicionadas ao DNA contido na cubeta do espectrofotômetro com o auxilio de uma seri~ gá térmostatizadá.

As experiências de renaturação empregavam sempre, preparações d~ TINA fragmentado conforme descri to no f tem 11. A tabelá 6 (ResUltados) mostra os ~alo~ res de PM de algumas preparações de DNA.

14. Curvas de desnaturação térmica (Determinação de T

tri).

A determinação de T. foi realizada de a-m

cardo com o método de MandeI e Marmur (1968), utiliz~ do o mesmo equipámento descrito para as experiências de renaturação. A temperatura era medida através de um termômetro especialmente adaptado para ficàr imerso e~ uma solução de referência. Os diferentes TINAs estavam dissolvidos em 0,1 -SSG e todos os dados eram caÍ' rigidos para expansão térmica.

VI. Resultados

1. Curvas de Crescimento

o crescimento foi testado em dois

d.e cultura (A e B), sob diferente,s condições de

méios

aera-

ção (culturas agitadas e e s tacionárias). A figura 1 mos

tra os resultados obtidos. O crescimento em meio A é ligeiramente mais acentuado, tanto em culturas estacio

nárias, como àgitadas. Culturas estacionárias caracte

rizam-se por crescimento máximo de cerca de 4xl05 cé

lulas/ml, atingido em torno do l8º dia de cultivo , Nes

sa oca sião, a maioria dos organismos apresenta

esférica e há baixa porcentagem de cistos. Nas

ras agitadas, a fase logarftmica é mais longa,

ro máximo de células/ml é maior (2-7xl06 ) e,

o

a

forma

cultu-,

nume-

par-

tir do 8º dia de cultivo, inicia-se o encistamento em f ,

massa das amebas. O nlvel de celulas presentes na fase

estacionária é maior em culturas ag~tadas crescendo em

tubos inclinad0s (maior aeração), do que em erlen-

meyers. Conforme verificado por outros autores ( Byers

et aI., 1969), o crescimento parece ser determinado pe

la quantidade de oxigênio dissolvido no meio.

As curvas de crescimento determinadas por " . contagem do numero de celulas por ml de melO de cultu-

ra (Figura la) apresentam uma fase de crescimento expo-

nencial e uma fase estacionária. A aparente fase de

"lag"verificada quando o c rescimento é medido por absor

bância da cultura a 690nm (Figura IA), pode ser expli

cada pela r e lação nao linear existente entre absorbân -

cia e nº de células/ml (rabela 1).

Para a obtenção de grandes quantidades de

células, adotou-se, rotineiramente, a utiliz ação de

fermentador. Nessas eondi ç ões, as curvas de ,crescimento

obtidas são semelhantes às curvas de culturas agitadas

em erlenmey e r s, mostradas na Figura la.

107,. 45

E "-

106

tn lOS j 3 'w u

w c

~

li

/-/~ " . --. ,'~ ,/'-

103, , , , 100 200 300

HORA 5 DE CUL T I 'VO

0,6' A

E c 0,5

o o lO

0,4 <t:

u

.~ 0,3 (TI

ex: ~ 0,2 m I -~

<t:

0.1

100 200 300 HORA S DE CULT IV O

Figura 1 - Crescimento . de A. castellanii em diferentes condições de cultura. O crescimento foi medido por contagem do número de células por ml em câmara de Neubauer (gráfico a) ou por determinação da absorbância a 600 nm (gráfico A). Os resultados são a média de duas experiências. No gráfico a, os círculos e triângulos indicam, respectivamente, o crescimento de culturas agitadas e estacionárias em erlenmeyers.O crescimento foi determinado em meio A (símbolos va-zios) e t;ni meio B (símbolos c heios). Os círculos cheios interrompidos re:j2resentam tuna Cl..1.I'va de crescimento em tubos SO'O agitaçao, contendo meio Bo O gráfico A mostra o crescimento de culturas agitadas em meio A.

46

Tabelg 1 - Relação entre absorbância a

600nm e número de organismos por ml em culturas de trofozoitos de A. castellanii

nº de células/ml .1600

1, 2xl06 0,245

4;6xl05 0,155

2,3xl05 0,125

1,4xl05 0,120

5,4xlO 4 0;115

3,OxlO 4 0,115

2,lxl04 0,115

3,2xl03 0,115

Os dados foram 0btidos com suspensões de cé l ulas de uma ' culturR. em fase logarítmica, diluídas com meio de crescimento estéril (média de três determinações). O número de organismos/ml foi , medido por contagem em câmara de Neubauer; a absorbância foi determinada em um espectrofotômetro Coleman Jr. 11.

2 0 Encistamento induzido

Obtinha-se, em média, 96% de encis tamen -" 1\.. . to, des d.e que o numero de celulas por ml fosse l.gual

ou inferior a 105 • Densidade maior de células impedia o encistamento o Os cistos ob t idos eram viáveis , conforme demonstrado pela germinação observada depois de 5 horas de incubação em meio de crescimento. O, excistamento foi acompanhado ao microscópio de fase, tendo sido pos s íve l constatar a s afda da ameba por um dos os tíolos da par e de do cis t o que permanebe i ntacta no final do proce sso.

47

3. Isolamento de núcleos

A I , N

malor parte . dos .metodos testados nao produz.1.a lise celular adequada. O método de Blobe1 e

Potter (1967) modificado, proporcionava Um homogenaio contendo baixa porcentagem de células inteirlis e p-úeleos aparentemente integros. Todavia, não foi possíve1 . obter purificação dos núcleos por ultracentrifuga~ ção. A adoção do método descrito por Rozijn e Tonino

(1964), sem modificações, produzia homogenato com grande número de células intactas. O procedimento adotado rotineiramente (Marzzoco e Col1i, 1974) é uma modificação desse método e permite obter isolamento e purificação de núcleos em espaço de tempo relativa -mente curto (90 minutos após homogenização). A homoge-. - , , . . nlzaçao das celulas por passagem em serlnga com a~~-

lha hipOdérmica, constitui um método eficiente, já que a porcentagem de células intactas na fração nu-ctear era em torno de ~%. A fração nuclear impura, resultante da cehtrifugação em baixa velocidade do homogenato. é altamente pUTificada por .ultracentrifugação em gradientes desco.nt1nuos de soluções -concentradas de

sacarose. A pureza das preparações de núcleos era ver! ficada por microscopia óptica e eletrônica. A figura 2 mostra o aspecto da suspensão final de núcleos iso-

. " A. ·' ladOs, onde e posslvel observar a ausenCla de celulas inteiras e fragmentos de membranas o Micrografias- eletrônicas (Figura 3), mostram núcleos intactos, envolvidos por um ·envelope duplo, . com ribossomos -aderidos à membrana externa .• Nucléolos grandes e densos, que são

característicos dessa espécie, também podem ser vis

tos. O grau de pr e s ervação estrutural mantido pelos

núele-osisolados é constatado por comparação com micrografia de núcleos "in situ", conforme ilustrado na figura 3. Os meios de extração utilizados contêm 8% de -polivinil-pirrolidona, necessária para manter a integridade dos núcleos durante o isolamento (Rozijn e Tonino, 1964). O meio de homogenização conté~, adicio

nalmente, baixa concentraç ão (0,02%) do detergente Tri

4(3

ton X-IOO, que acelera a lise celular e propicia me

lhor dispersão dos componentes celulares liberados,

além de ser um inibidor de DNase (Hymer e KUff,1966) .

O rendimento de núcleos é de aproximadamente 80% con

forme avaliado pela recuperação de DNA (Tabela 2).

Figura 2 - Aspecto de uma preparaçao de

núcleos de trofozoitos de ~. castellanii, suspensos

em meio PVP-sacarose 0,6 M ao microscópio de fase. , _ • H ,

Os nucleos es tao lntactos e nao se observam celu -

las inteiras ou fragmentos de membrana. Aumento

2560 vezes.

49

(a)

(b)

Figura 3 - Micrografias de núcleos de A. castellanii. A vreparação do material para microsco pia eletronica esta descrita em Métodos. A foto (a)m9stra o grau de ~re servação estrutural mantido pelos nucle o s i s olados, como pode ser observado por comparaç ã o c om a ap a rência dos núcleos "in situ", mostrada na foto (b). Os aumentos das fotos (a) e (b) são respecti vamente i guai s a 14000 e 10000 vezes. -

Núcleos

Homogenato

Tabela 2 - Composição química -de núcleos isolados de trofozoitos

de Â. castellanii

TINA RNA p.roteína RNA

mg % mg % mg % TINA

0,1151:0,032 20,5 0, 0232:0,005 4,1 0,422±0,029 75,4- 0,2

0,1431:0,015 0,64 , 2 ,18±O, 26 9,8 20,0:!:1,1 89,6 15 ,3

Proteína

DNA

3 , 7

140,3

Os nÚmeros se referem a núcleos isolados de 1 ml de homogenato 25% (w/v). Os resultado s para

1 ml de homogenato são incluídos para comparação. Valores médios de triplicatas de 4 experimeg

t os independen tes são dados ± o desvio padrão.

51

L~. Composição química de núcleos isolados

A tabela 2 mostra os resultados relativos

ao tecr de DNA, RNA e proteína, no homogenato e nú-

cleos purificados. Os resultados mostram que 80% do

DNA do homogenato foi recuperado no precipitado de nú

cleos. As preparações de núcleos utilizadas para o es

tudo da composição química também foram analisadas qu~ " , to ao numero de nucleos por ml, Rtraves de contagem em

A • '. camara de Neubauer ao mlcroscoplO de fase. Com esses

resultados e os dado s da tabela 2, foi possível ava-. . - '. , . .

llar a compOSlçao medla por nucleo, que era 19ual a

38;8; . 2,1 e 10,6 pg de proteína, RNA e DNA, respectiva

mente.

5. Atividade de RNA polimerase(E.C.2.7.7.62,

em núcleos isolados

A figura ~ mostra os resultados da

tica da reação catalisôda pela RNA polimerase da

. , Clne-

fra-

ção nuclear. Nas condj)ções de incubação adotadas, a v~

locidade da reação diminui logo ap6s os primeiros 5 mi

nutos de incubqção.A velocidade inicial de síntese de

RNA nos núcleos isolados, conforme avaliada pela incor

poração de UMP em RNA, era igual a 83 picomoles de UMP/

min/mg de TINA a 300 C. Essa velocidade, todavia, pode

estar um pouco subestimada; já que nãe foi considerada

a possibilidade da existência d.e um II poo lll endógeno de

UMP,que poderia influenciar os Eesu1tados nas condições

de ensaio empregadas. Conforme esperado para uma

reação TINA-dependente, a adição de actinomicina D, ao

nfvel de 8 )1g/ml, reduza incorporação de radioativida

de em ·RNA de cerca de 80%. Por outro lado, rifampicina,

conhecido inibidor Je síntese de IDJA bacteriano ( di

Mauro et aI., 1969) e mitocondrial (Mukerjee e Goldfe -

der, ' 1973), não teve nenhum efeito na enzima nuclear

da ameba. Os resultados estão resumidos na tabela 3.

lOO

" " 200 rb .-

IC

~ a.. u

52

10 20 30

Tr:MPO (min)

Fi€~a 4 - Cinética de incorporação de

UMP~3H em núcleos isolados de trofozoitos de A. cas

tellanii. A radioatividade TCA precipitável e sens:t

vel à hidrólise alcalina foi determinada conforme des

crito em M~todos. O nº de cpm/ml da mistura de incu

baçã o é registrado em função do tempo de reação a

300 C.

53

Tabela 3 - Efeito de antibióticos na rea

ção catalizada pela RNA polimerase de núcleos isolados

de A. castellanii.

Adições

actinomicina D

rifampicina

cprn/mg de DNA

(xlO-6 )

5,32 0,96

5,72

% de inibição

82

zero

Condições de ensaio descritas em Métodos. Resultados

obtidos por incubação durante 10 minutos a 30o C. A con

centração de antibióticos testada foi de 8pg/ml.

6. Extração de DNA

° DNA total ~e trofozoitos, obtido pelo

procedimento descrito em Métodos (Marzzoco e COlli,

1974), apresenta espectro de absorção característico

ilustrado na figura 5. Inicialmente, o DNA não era tra

tado com a-amilase (Adam et aI., 1969), fornecendo

um espectro de absorção atípico; provàvelmente devido à

contaminação por glicog~nio, conforme sugerido pela

comparação entre o espectro de absorção de DNA não tra

tado com a-amilase e glicog~nio comercial, no ultra

violeta (Figura 5). O glicog~nio utilizado (Sigma), f'oi

analisado quanto ao teor de hexoses (reação de antro

ma), DNA (Reação de difenilamina), RNA (reação de orci

nol) e proteína (reação de Folin-Ciocalteau). Os resul

tador obtidos mo s tram que a preparação de glicog~nio

é realmente pura, contendo baixa porcentagem de protef

na (0,3%) e ácidos nucleicos (cerca de 0,1%) contaminan

tese

54

0,6.

- , <[ • • Z

,

Jf\ • e DA , • , ,

<[ fi -~D,3

.c:{

Dl o:: 00,2 1Il m <[

200 250 300 ONDA (nm) COMPRIMENTO DE

.- » Dl Vl

1.0~ m 1>-

o,s?5 l>

o o

Q4 ~ z o

Q,2-

Figura 5 - Espectro de absorção de DNA total de trofozoitos tratado ou não c om a-amilase e de glicogênio comercial ( Si gma). A c oncentração de DNA tratado com a - ami lase (círculos ch e i os ) e DNA não t ratado (círculos v azios, linha ponti l hada ), conforme avaliado pe l ~ absorb~nci~ ~ 260~, era igu~l a 22pg/ ml . A concentraçao de gJ l cogenl o (clrcul os vaZl OS , linha cheia), determinada p or reação com antrona, era i gual a 3 mg/ml. As soluções eram feitas em 0, 188C e a absorbância no ultra-vio l eta medida em um espectrofotômetro Zeiss PMQ 11.

'55

o DNA nuclear também apresentava razões

de absorbância típicas: 230/260 nm = 0,435 e 280/260

nm = 0,534.

o peso molecular do DNA nativo, uti1izag

do-se DNA radioativo do fago T7

como padrão, variava

de 8 a 12 xl06 daltons (gradientes de sacarose neu

tros). Em gradientes alcalinos, obtinha-se um valor

de peso molecular próximo à metade do peso molecular

do DNA nativo.

7. Centrifugação em gradientes de CsCI

a) TINA total de trofozoitos

À análise do perfil do DNA total de tro

fozoitos em gradientes de densidade preparativos, su

geria, inicialfuente, a presença de dois satélites com

densidade menor que o componente principal, conforme

evidenciado na figura 6B. O satélite menos denso, si

tuava-se na mesma região de densidade que glicogênio

comercial (Sigma) (Figü.:ra 6A). As frações ip.dicadas

pela barra presente na figura 6B, foram reunidas e

submetidas à centrifugação analltica em gradientes de

CsCl. O 'perfil obtido (Figura 6b), confirma a exis-

tência de dois satélites: um com densidade igual a

1,692 g/cm3 e outro com densidade igual a 1,670 g/cm3 •

Esta última banda tem um comportamento anômalo, já

que absorve radiaçãO' de ' 320nm (Figura 6a). Na tentati

va de elucidar a natureza dessa banda, foi feita a do

sagem de desoxirribose (reação de difenilamina) e he

xoses (reação de antrona), em cada fração de gradien

tes preparativos de DNA total tratado ou não com a

amilase. A figura 7 mostra os resultados obtidos. A

banda anômala (componente menos denso), não contém

DNA ( Fi gura 7A), mas contém grande quantidade de hexo

ses , de acordo com a reação fortemente positiva com

o reagente de antrona. Essa banda é composta provàvel-. "". , ( " ....

mente por glicogenlo, porque e sens lvel a açao de

amilase , que el imina o material antrona-positivo (Fi-

0,1

E c o oD

'" <{

u z

.<{ (lJ

:3 0,5 V1 I (lJ <{

a

E

I ~~ I b <t u Z

<<t m o:: o lfl m E <t c

C)

lO N

W70

A

8

"

1,8

56

DE NSIDADE (q /cm 3 )

1,7

I ~~

1,6

~ 10 20 30 40

~ da FRACÃO

1,692 1,717

DENSIDADE (g / cm3 )

1,742

Figura 6 - Perfil de absorbância de DNA to

tal de trofozoitos de A. caste llanii e glicogênio comeE

c ial, ap ós centrifugação em gradientes de CsCl. As fi-

guras A e B mostram os resultados obtidos com gradiente s

prep~rativos contendo 2 mg de gl icogênio (Sigma) e

146 p g de DNA to t a l respect i vamente . As fi guras a e b

mostram o perfil a 320 e 260nm,obtido por cent~ifugaç~o

analí tica das fraç õe s do gradientes·o indicados pela bar

ra hori zontal que foram reunidas e dializadas contra

NaCl 0 , 01 M. Condi ç õe s de centrifugaç ~o descritas em

Métodoso Na f igura b, o pico com dens i dade igual a

1, 742g/cm3 , re f ere - se ao DNA do fago 2C , u~ilizado co

mo mar cador o

57

0,2 A

A 1\ I 0,1

0,5 ~ ••••• ••••••••••••••••••• 4 R i'i-············ 1,0+0,0 fij lrl

}> o rD

;;u lJ1 m o }>. ;u z

I • \ CU'o

(JJ n <t }>- }> 2 Z O

' ,,, ~ O -....... OO~~, . 1> 0,0

I~ ~I ' 10 20 30 40

Li: Nº da FRAÇÃO fT1 ;;u

rn >< -o:: o tD o B lrl o Vl rn 0,1 lJ1 rn lJ'l fT1 « 'O,S --

••••••••••••••••••• • •••••••• 1,0 + 0,0

CXJO 000 0Cb0

Dt:ro 0,5

(~:pocJ!lxtl:txfJX'ocxf~Jbo~ 00" ' , ' I , , 0,0 I 10 20 30 ~O

NQ da FRAÇÃO

Fi gura 7 - Centrifugaç ão de DNA total Je trofozoitos de Ao castellanii em gradientes de CsCl . As figuras A e TI mostram os resu ltados da medi da de absorbância a 260nrn (círculo s cheios ) , dosagem com di-fenilamina (círcul os vazios) e d osagem com antrona (círculos vazios pontilhados) , nas fraç õe s de gradientes contendo DNA total tratado ou não com a- amilase re specti y amente o Condiç õe s de centrifugar; ão d e:'3 cri-tas e m Metodos o

,59

gura 7B) e As outras d uus bandas ob se rvadas s ão reaJ_men

te constituídas por DNA, conforme evidenciado pela su

perpo s i ~ ão do perfil de absorbância a 2GOnrn e abs fl !'ba.n

cia de desoxirribose, medida pela reaç ão c om dife rü lami

na (Figura 7A e B). Além disso, o tubo do gradiente de

CsCl contendo DNA não tratado com u-amilas e, apre s en -

ta uma banda opalescente que é eliminada por tratamento

com u .... amilase (Figura 8).

Figura 8 - 'F ')t :ogra fi a de g~ adientes

DNA total de trofozoitos, centrifug ad os conforme

cr i to e m Métodos. O tubo da direi ta c on tém ~l\! A

d e

des---nao

t ratado com a-amilase '3 apre s ent; a uma b anda cl a:t:'a

que de s aparece após t ra tamento c om u-ami lase ( t ubo

d a e squerda).

r-

Portanto, o DNA total de trofozoitos apresenta um componente maior (84% do DNA celular total) e

um componen t e menor (16%), com densidades respectivamen te iguais a 1,717 e 1,692 g/cm3 • Os perfis do DNA to: tal em gradiente preparativo e analítico de CsCl podem ser vistos nas figuras 9b e 9B, respectivamente.

b) DNA nuclear de trofozoitos

O perfil do DNA nuclear, fragmentado até peso molecular igual a 6xl05 daltons, tem uma distribu,! ção unimo daI em gradientes de CsCl (Figura 9a), caracterizado por densidade igual a 1,717 g/cm3 (Figura 9A). Esses resultados indicam claramente a origem nuclear do componente maior do DNA total (Figura 9B).

c) DNA mitocondrial de trofozoitos

O DNA de mitocôndrias isoladas conforme descrito em MétOdOS, foi purificado por fracionamento

em gradientes de CsCl (Figura lOA). O perfil de sedimeg tação obtido em gradientes analíticos (Figura 10B),mos

tra a existência de uma Única banda, com densidade de flutuação igual a 1,692 g/cm3 •

d) DNA total de cistos

o perfil do DNA de cistos em gradientes de CsCl (Figura lIA), mostra a presença de dois componen

tes com densidades · idênticas a dos componentes do DNA to

tal de t rofozoitos: 1,717 e 1,692 g/cm3 (Figura llB). O componente maior representa aproximadament e 93% do DNA celular t ot al e o componente menor 7%.

a f-

q5

-E c o ..o N -c::(

u z

cc::(

CD a:: \5 o U)

CD c::(

1,01-

0,5

I.~

fJl

OENSIDA DE (g/cm3 ) W 1,7 1,& r----- --T

n

~._. ..........

~

J'ft l l ..... ~

10 20 · 30 40

~ da fRAÇÁO

A

I cCle u Z ~ tIl a:: o U)

a:J c::(

1,692 1,7171,742 DENS I OADE (gA:m3 )

Figura 9 - Centrifugação em gradientes de

CsCl de DNA total e nuclear de trofozoitos. As figuras

a e b mostram os resultados de gradientes preparativos

contendo , respectivamente, 157)1g de DNA nuclear frag -

mentado (PM = 6xl05) e 109 pg de DNA total nativo. O

perfil de A260 após centrifugação isopícnica e as den

sidades obt i das são apresentadas na figura A ( DNA nu-

clear) e figura B (DNA total). DNA marcador de fago 7-

2 C tem densidade igual a 1,7Lj2 g/cm./ o

1 ~ «(

~ c~

~ ú"I CD C[

119 -U Z

t«:(

m o:: o li') Dl C[

A 0.2

0.1

\5~2

62

DENSIDADE (Q/cm3)

1,'õ 1,7 1,5 i

10 20 ~ ~

Nº ~ F"RACAO

\142 1,111 tJt NSIOADt (q/c,"~)

Figura 10 - Centrifugação de DNA mitocon

drial em gradientes de CsCl. A figura A mostra o per-

fil de abs orbância de 60)1g de DNA, fracionado por

centrifugação em gradiente preparativo. A barra indi

ca as frações que f oram reunidas, dializadas contra

NaCl 0,01 M e submetidas à centrifugação anal:ttica,cu

j o traçado fotoelétrico póde ser visto na figura B. A

contaminação por material com densidade igual a

1,717 g/cm3 é muito baixa. ° marcador de densidade é o DNA do fago 2C ( p = 1,742 g/cm3 ) o Condições de cen

trifugação descritas em Métodos.

, é Ü z:

fllt m a: ~ UJ ~

0,4

1 ~ o,~

'-"

c ~ 0,2

'i ~ ~

"-1 0.1

B

A

1,"92

63

tJt NSI[)AtJt (Q' Gm3) ~ 1J 1!

~ .1J 40

~ttJ "RAÇ~O

\711 OE:NSIOADE (g/cm3 )

1,7~ 2

Figura II - Gentrifugação de DNA total

de cistos de A. castellanii em gradientes de CsCl.Os

picos obtidos por centrifugação preparativa de 34,~g

de DNA (Figura A), são caracterizados pelos valores de

densidade de flutuaqão mostrados no perfil fotoelétri

co obtido na centrífuga analíti~a (Figura B). DNA de

fago 2C (p = 1,742 g/cm3 ) é o marcador utilizado

Maiores detalhes em Métodos o

64

e) DNA total de trofozoitos em diferentes

estágios de crescimento.

A figura 1 2 mo s tra o perfil, em gradien

tes de CsCl analíticos do DNA de c élulas em fase l oga

rítmica precoce (12A), mediana (12B) e tardia ( 12C ).

Aparentemente, há urna variação da fração do DNA celu

lar representada pelo componente menor. A tabela 4 re

sume as características de cada fase da cultura quan-·

to à densidade de células, número de cistos e porcen

tagem do componente menor.

Tabela 4 - Variaç ão da porcentagem do

componente menor do DNA total de trofozoitos em dife

rentes fa s e s de crescimento.

Etapas da Nº de células % de c i s - % do compo-

fase log por ml tos nente menor

Preco ce 4xl04 zero 4

Mediana 5xl05 1 16

Tardia lxl06 11 6

o nº de cél/ml e a % de cistos foram determinados por

contagem em câmara de Neubauer . As etapas da fase lo

garítmica foram delimitadas de acordo com as cUrvas

de crescimento de culturas agitadas em erlenmeyers

(Figura l)e As porcentagens do componente menor, em

relaç ão ao DNA total, foram obtidas a partir da área

dos p i cos obtidos por centrifugação em CsCl ( Figura

1 2 ). Os resultados representam a média de dois expe

rimento s isolados.

c{

u z

<c:t co a: o V)

co c:t

65

A

8

c

1,692 1/17 1,742 DE NSIDA D E (g/cm~

Figura 12 - Traçado do registro fotográ

fico obtido após centrifugação analftica em gradien

tes de CsCl de DNA t 'otal de trofozoi tos em diferentes

fases de crescimento. As figuras A, B e C, represen

tam, respectivamente, os resultados obtidos com DNA

de células em fase logarítmica precoce, mediana e

tardia o DNA de fago 2C ( p = 1,742 g/cm3) é o mar

cador de densidade utilizadoo Condições de centrifug~

ção descritas em MétodoBo

66

8. Perfil de fusão dos componentes do DNA

de trofozoito

à) DNA tota.l

A figura 13 mo s tra a desnaturação do DNA

total, onde a transição ocorre ao longo de um grande

intervalo de temperaturas. A primeira derivada do per-

fil de fusão (Figura l3A), confirma a e xistência de

dois componentes, caracterizados por valores de T - m iguais a 75,5°C ' (componente maior) e 63 0 C (componente

menor). A determinação do Tm foi feita para os dois

componentes, após fracionamento por centrifugação em

gradientes de CsCl.

b) Componente maior do DNA total e DNA

nuclear

A transição em torno do T é abrupta (Fi~ m -ra l4a) e a curva derivada (Figura l4A) mostra um pico

gaussiano. O valor médio de T é igual a 75,5°C. O DNA m -nuclear apresenta comportamento idêntico ao componente

maior (ver figura 14).

c) Componente menor e DNA mitocondrial

O componente menor (Figura 15 A e B), -nao

apre s enta uma curva derivada simétrica,distinguindo-se

três componentes com Tm em torno de 6 2 ; 65 e 75°C. A fi

gura 15 A mostra, ainda, a curva derivada do perfil de

fusão do TINA mitocondrial, também plurimodal, mas que

não se superpõe à curva derivada do componente menor.

67

1,3-

E a r:: co ~

~

<t > i= 1.2 <t ...J Ui o::

<t u z

.<{ 11 ID' a: o til (Jl <{

1,_ 50 60 70 80 90

TEMPE.RA1'LJRA (OCI

I f A

A I

0,10

Y

0,05

50 50 70 80 90 TEMPERATURA (OC)

Fi gura 13 - Curvas de desnaturação termi0a

do DNA tot .::ü de trofozoitos, em 0,188C ( 24 pg/ml). A

fi gu r a ~ mo s tra a variação de absorbância relativa

( corrigida para expans ão térmica), em função da tempe

ratu r a d a s olução. A figura! mostra a curva diferen -

cial de fusão, onde a ordenada (Y) indica a variaç ão da

% de hipercromicidade por grau:

(Atl - At2 )/(AIOO - A25

)

Y (tI - t 2 )

onde Atl , At2 , AIOO e A25 são as absorbâncias medidas

nas temperaturas tI' t 2 , 100 e 25° C, respectivamente.Os

valore s na abc i ss a são i guai:3 a t~ +t2/2. As absorbâncias

f or8JTl det e r minadas em um e s p e c.trofotôme tro Zeiss PMQII,

c(1 JJfo rme descrit:J em Méto doso

Gn

R I

',3 E t: o lO N

4 > ;:: t? ~ . IX

<t w z '4 fi Cl: ',1 o V1 m <t

'04. • n - t::= '5(} 60 70 80 90

TEM PE R A T U R 1\ (0 C )

0,15.' ------------

II

0,10

y o

lI,fI ~)

50 60 70 80 90 TEMPE RA TURA (OC)

Figura 14 - Perfil de fusão do DNA nuc l e a r e componente maior do DNA to~al de trofozoito s , em °11 SSC. Os valore s de absorbanc~a relativa . das s oluçoes de DNA nuclear (18 pg/ml, c l rculos che lo s ) e componente maiS?r (?O p g/ml, ~ círcu~os vazi oR), eOErigidos para expansao terml ca , sao reglstrados em fun ç ao da temperatur a da s oluç ão (Figura a). A figura A mostra a curva der ivada da desnaturaçao , onde a ordenada ( Y) repre sent a o incremento em absorbância rel a tiva por grau . No eixo das abcissas estão i ndicadas as temperaturas m~dias do s i n t e r val os . Para maiore s detalhes , ver legenda ela fi e;ur8. 13 .

a 1,3

~

E c

CJ <D N

<t 1,2 ::>

t-<t ~ w o::

<t 1,1 u z «[ (]) o:: o lfl (]) <{

1,0 50

O/lOr A

y UOS

69

60 70 80

TEMPERATURA (Oel

90 TEMPERATURA (OCl

Figura 15 - Perfil de desnaturação térmica do componente menor do DNA total de trofozoitos (14 pg/ml) , em 0,1 SSC. A figura a representa a variação de absorbância relativa, corrigida para expansão de volume, em função da temperatura. Na curva diferencial de fusão (Figura A), as ordenadas indicam a variação da % de hipercromicidade por grau. Os valores em abcissas referem-se à temperatura média dos inter -valos considerados. A figura A mostra, ainda, os resultados obtidos com uma preparação de DNA mitocondxial (13pg/~1 , circulos vazios), que exibe comportamento heterogeneo, como o componente menor (circulos cheios). Maiores detalhes na legenda da Figura 13.

'70

A tabela 5 resume algumas característi -

cas do DNA de trofozoitos.

Tabela 5 - Propr i edades físicas dos c ompo

nentes do DNA de trofozoitos de A. castellani~.

DNA Densidade T % GC m (g/cm3 ) (oC) (densidade ) (T ) m

Total

componente maior 1,717 75,5 58,2 52 ,7

componente menor 1,692 63,0 32, 7 22,2

Nu clear 1 ,717 75,5 58,2 52 , 7

A determinação de densidade e T est~ descrita em M~m todos . A % de GC ( fraçáo molar) foi calculada a par-

tir da densidade ou T (em 0, 1 SSC) de cada DNA, sem gundo as equ ações empíricas de MandeI et aI. ( 1 968 ) e

MandeI e Marmur ( 1968 ) .

90 Renaturação de DNA

Os resultados obtidos através da análise

espectrofotométrica da cinética de renaturação, p odem

ser analisados segundo a equação proposta por Wetmur

e Davidson (1968 ) :

1 -4 1

A - A 2,04 x 10 k 2 t +

0,36A 00 00

Aro = absorbânc i a do DNA nativo (260nm)

A = absorbânci a em tempo t (segundos)

k 2 = constante de segunda ordem

Nessa equação, o fator de hipercromici dade

(aumento de absorbância devido à desnatur~ção), conside-

'71

rando- se um erro experimental de 5%, é dado por:

A o Aoo 0,36 Aoo

Ao = absorbâncj a do DNA desnaturado

Portanto, colocando- se em um gráfico, os

valores dos inverso s da hipercromi c idade re s idual

(l/A-Aoo ), em função do tempo de reação, obtem-se uma

linha reta. O coeficiente angular da reta, dividido por

( 2 ,04xlO- 4 ), forne ce o valur da constante de segunda

ordem (k2 ).

A raúí.o entre as velocidades de renatura

ção de dois DNAs com o mesmo peso molecular, ob

tido por métodos de fragmentação semelhantes , é inver

samente proporcional à r~z ão entre o peso molecular das

mo léculas de DNA não fragmentado (complexidade). Assim,

a comple x idade de um DNA pode ser obtida a partir da

determinação experimental da constante de velocidade de

renaturação desse DNA e de outro DNA com complexidade

conhecida , nas me s mas condições de i~cubaç ão (Britten

e Kohne, 1967; Wetmur e Davidson, 1968)0 DNAs de bac-

tér ias ou viru8 são cineticamente homogêneos, ou seja,

sua renaturação é r epresent:{da por uma única reta. A

renaturação de DNAs het e ro gêneos, · como ocorre nos or

ganismos superiores, fornece uma curva de renatur~ção

complexa que pode ser sub dividida em retas que represeg

tam a renaturação de diferentes familias de DNA.

Neste trabalho, a reação de renaturação

foi acompanhada pela queda da absorbância a 260nfi. As

cons tantes de velocidade de renatur ação dos diferentes ·

componentes do DNA da ameba, foram calculadas a par

tir do coeficiente angular das r e tas obtidas em gráfi

cos do tipo sugeriHo por Wetmur e Davidson (1968), mos

trados nas figuras 16-19. As retas apresentadas repre

sentam as retas médias obtidas por um conjunto de pon

to s experimentais submetidos à análise de regressão linear, em um calculador Hewlett-Packard, modelo 9820A.

O programa de r egressão linear foi gentilmente cedido

pela Dra . Helena Li Chum. O coeficiente de variância

eLo des vio padrão da inclinação e d.o intercepto das re-

72

tas era , em média, 5% e 0,4%, respectivamente. O coefi

ciente de correlação médio era igual .a 0,98. Os valo

res de coeficiente angular e linear das retas médias

for am submetidos ao teste t de Student, mono caudal , e

foram con!3iderados significativos . .... .

nas 23 exper1enC1as

de renaturação consideradas o

O padrão utilizado nas medidas de rena tu-

ração foi o DNA de E. coli, que é um DNA - -- homogêneo , constituído predominantemente por sequências únicas e

com comple~idade bem estabelecida (Cairns, 1963). A

figura 16 mostra a renaturação do DNA de E'. coli, re

presentada, conforme e sperado , por uma única reta. A

mesma figura mostra a renatur~ção do DNA celular total

de trofozoitos de A. castellanii , que exibe comporta-

mento h e terogêneo. A curva de rena turrtção desse DNA po

de ser dividida em 4 secções, indicando a presença de

4 familias de DNA com diferentes velocidades de renatu

ração. A contribuição de cada fração pode ser calculada

por extrapolaç ão da reta que repre s enta a fraç ão de re

naturaç ão mais lenta, ao valor de l/A-A"" em tempo ze

ro de reação (Wells e Birnstiel, 1969). O inverso des se

valor fornece a hipercromicidade devida à fração len-

ta. O mesmo procedimento é adotado para as outras · fra-

çoes. Comparando-se o valor obtido para cada fr~ão

com o valor de hipercromicidade total (A -A = 100%) ., o ""

é possivel calcular a porcentagem do genoma correspon -

dente a cada família de DNA. Por analogia com as famí -

lias do DNA de outros organismos superiores (Britten et

aI., 1972), as famílias de DNA da ameba foram denomina

das de "rápida", "inte.rmediária", "lenta" e "única",ad

mitindo~se que a fração que renatura mais lentamente

seja constituída por DNA "único". Os valores médios

de p orcentagem obtidos para as famílias do DNA total

for am respectivamente de: 86; 7,5; 4 e 2,5%0 Após longos pe r íOdOS de incubação, quan-

do a maior parte das sequên oias com renaturação r~pi

da já reagiu, a inclinação d a ·c urva de r enaturação re

presenta , efetivamente , a fr ayã o de DNA com renaturação

mais lenta (DNA "único")o Go mo e s sa fração representa a

4,0

8 l5 <t

~II

<t

3,0

2,9

I~ 2,8 .-, <t

2,7

2p ro

73

25

20

• 15 ti l>~

B

10

5

5 10 15

TEMPO (segundos" 10-3 )

2 ~

TEMPO (seg4nQos x lri3 )

Figura 16 - Renaturação do DNA total de

trofozoitos de !. castellanii (~9jlg/ml) e DNA de ~. ~li (32jlg/ml), em NaCl 1 M a 600 C. Os valores do inverso da hipercromicidade residual são medidos em função do tempo de reação Q Aw e A representam, respectivamente, a absorbância a 260nm, das soluções de DNA nativo e DNA parcialmente renaturada em diferentes tem

pos de reação. DNA de ~. coli (círculOS cheios,ordenada do lado direito), mostra a relação linear esperada e

DNA total da ameba (círCUlOS vazios,ordenada do lado esquerdo) comporta-se heterogênearnente. Porcentagens do genoma da ameba são obtidas a partir dos interceptas das diferentes secções da curva de reassociação,obtidos por regressão linear. A metade inferior da figura representa, em escala aumentada, os dados relativos à parte inicial (tempo de incubação de zero a 3x10-3 seg.)da rea ção de renatul' llç ão do DNA total da ameba.

7Lj-

maior parte do genoma (86%) , pode-se assumir que o k 2 aparente , c alculado a partir da inclinação final da

curva de r en'aturação (Figura 16, 4~ reta do DNA total;

Tabela 6), aproxima- se muito da constante verdadeira

de segunda ordem para. o DNA de renaturação mais lenta

(DNA "úni c o ") .

Tabe l a 6 - Cin~tica de renaturaç~o de di-

ferentes frações do DNA total de trofozoitos de !. castel l anii .

DNA Pe so Mol ecular x 105 k2 (daI tons)

componente menor 5,4- 23 ,5 6 ,7 0, 68

rrii t ocondri a l 4, 9 5,2 0, 69

componente maior 15 , 4 0,109

n u clear 6 , 2 0,118

total (4ª reta) 10,7 0,09

E. coli 9,5 5,74

Os DNAs foram dissolvidos em NaCl 1M e incubado s a

60 oC. A cinética de renaturaç~o foi analisada pelo m~todo ó ptico e as constantes aparentes de ve l ocidade

cal culadas segundo Wetmur e Davi dson (1968). Os valo

res de k 2 (média de 3 determinações), fora-m normali za

dos p a ra PM = 9 , ) x 105 daI tons (Wetmur e Davids on ,

1968 ). ° pe s o molecular foi determinado conforme des -'t M't· - 1 ) crl o em e odo s o Unl dades de k 2 = moI. seg. l •

75

o cálculo das constantes de velocidade

das famíliap de renaturação mais rápida, é prejudica

do pelo nÚmero relativamente grande de componentes ,

de modo que a renatur :-tção de cada família é afetada

pela renaturA.(;.ão da outra o Além disso, quando se ana

lisa a renaturaç ão das famílias que reagem inicialmen

te, a contribuição de hipercromicidade de cada fra

ção está sendo constantemente alterad~ pela fração

lenta, presente em todas as , fases da renaturação.Quag

do apenas dois componentes estão presentes, pode-se

cons eguir uma aproximação do valor de k 2 verdadeiro

para a fração "rápida", através do método de corre

ção sugerirro por Wetmur (1967) e Wells e Birnstiel

(1969)0 Balsamo (1972 ) sugeriu um método de correção

adequado para a de t erminação do k2 verdadeiro quan

do exi s tem tres famílias com velocidades de renatura

ção diferentes. A superposição das retas na renatura-

ção do DNA total da ameba dificulta o cálculo das ,

cons tantes aparentes e b numero de componentes observa

do impede a aplicação dos métodos de correção cita-

dos.

Uma melhor resolução entre as retas po

de ser obtida at'ravés éla renaturação dos dois compo -nentes do DNA total da ameba, isolados em gradientes

de CsCl.

A figura 17 mostra o perfil de renatura

ção do componente menor do DNA total de trofozoitos

que apresenta um comportamento cinético heterogêneo ,

com tres velocidades de renaturação diferentes, ca

racterizadas pelos val.ores de k 2 aparentes citados na

tabela 6. O componente maior (Figura l8)comporta-se

como um DNA muito homogêneo, não apresentando sequên

cias com renaturação rápida. O valor médio da cons

tante de segunda ordem para a reação observada, en

contra-se na tabela 6.

DNA de núcleos isolados apresenta carac

terísticas derenaturação pràticamente iguais às do

componente maior (Figura 18 é Tabela 6). A comparação

entre a porcentagem do genoma, perfil de renaturação

e valores de k 2 do componente maior, DNA nuclear e

76

10,0

9,oL ~

IJ 8,0 -, <1

7,0

6,0 500 1000 1500 2000

TEMPO (segundos)

12

11 ~~

_11'~t 0 -----0 ~ ~ o

/ÕO

<{ 8

7 6

5 10 15 20 TEMPO (segundos}(1Õ3 )

1:i'igura 17 - Renaturação do componente me-

nor d o DNA t o tal de trofozo i tos de A. castellanii.

O compone n t e menor f o i i s olado por centri fugação em

gradientes de CsCl, d i ssolv ido em NaCl 1 M e incubado

a 6 0 0 C. A me tade i nferi or da figura repre senta a rea

ção em tempos mai ores de i ncubação , mostrando apenas

as retas da fi gura superior que mostra , em escal a au

mentada , os d a dos para, os primei ros 2000 seg o de rena

tur~ç ão . As constru1tes aparentes (k2 ) s ão calcul adas a

parti r do coefic i en te angular das tres retas obtidas

por regressão linear • As abrevic-l. '.; õe s empregadas são

as mesmas da Fi gura 1 6 0

~,6

~,5

4,4

J ~,3 _I, <t 4,2

4)

77

0..//1 o ----..-..--............... •

~-1'

4.0 r J I

3,9 10 20

TEMPO (segundos x lÕ3) 30

Figura 18 - Renaturação do DNA "Único" de

trofozoitos de A. castellanii. O componente maior

(54 pg/ml), purificado em gradient{~ s de CsCl e o DNA

nuclear (53jUg/ml) foram dissolvidos em NaCl 1 M e in

cubados a 600 C. Os círculos vazios e cheios representam

a renaturação do componente maior e DNA nuclear respec

tivamenteo A construlte de segunda ordem (k2 ) foi calcu

lada s e gundo Wetmur e Davidson (1968), a ·partir da in-. - , .. - . . c llnaç ao da reta medla obtlda por regressao llnear. Pa-

ra maiores detalhes , v e r legenda da Figura 160

78

~ reta do DNA total, indica qUê em~eB componentes se

referem à fração do DNA da ameba que apresenta renatura . -ção mai8 lenta (fração "única"). A partir do valor da

const~nte de renaturação do DNA d.e ~. coli, renaturado nas mesmas condições, é posslvel estimar a complexida-de do DNA nuclear (fração "única"), por comparação ~om o genoma de ~. cOli, igual a 2,7xl09 daltons (Cairns,

foram 1963). Para isso, os valores de k 2 observados normalizados para o mesmo peso molecular, através equação proposta por Wetmur e Davidson (1968), que

da

de-monstra a proporção existente entre a raiz quadrada do peso molecular e a constante de segunda ordem. Â partir do valor médio de k2 ,determinado para a fração "única" (0,106), a complexidade do DNA nuclear de A. castellanii pode ser estimada em 1,46xlOll daltons~

À renaturação do DNA de mitocôndrias tam-, ' . A • A • bem e heterogenea t mostrando a eXlstencla de duas fra-

ções (Figura 19), com velocidades de renaturação definidas por constantes aparentes, cujos valores estão na Tabela 6. Esses resultados indicam que o componente menor do DNA total não é exatamente idêntico ao DNA de mitocôndria que não contém as sequências de renaturação ffrápida'~ mas contém as sequências ,de renaturação "inter

mediária" e "lénta". As constantes verdadeiras para as diferen

tes famllias presentes no TINA mitocondrial e componente menor poderiam ser obtidas através' da aplicação dos métodos de correção mencionados anteriormente ( Wetmur,

1967; Wells e Birnstiel, 1969; Balsamo, 1972), desde que a fração "lenta" apresentasse características cinéticas de DNA uúuico lJ

• Entretanto, os resultados obtidos (localização mitocondrial, valor de k2 apareniie e porcentagem do genoma), podem ser interpretados supondo-se que essa fração do DNA f6sse constituída por sequências com baixa frequência 'de repetição. Esse resultado torna muito difícil o cálculo do k2 verdadeiro e, consequentemente, da complexidad.e cinética das famílias do componente menor e DNA mitocondrial, a partir de gráficos do tipo sugerido por Wetmur e Davidson (1968). ,

13 <l

17

16

-11 <t 15

14

79

'3~r~ __________ L-__________ ~ __________ ~ ____________ ~ __________ ~

'5 10 15 20 25 TEMPO (5II!gUIldos II 1(P)

Figura 19 - Renaturaç§o do DNA mitocon

drial de trofozoitos de A. castellanii. TINA -de mitucôndrias isoladas conforme descrito em Métodos, foi dissol'vido em NaCl 1 M (18 pg/ml) e reassociado a 60°C. O k 2 aparente das duas retas componentes foi de terminado a partir do coeficiente angular obtido por regressão linear. As abreviações empregadas são as

mesmas da Figura 16.

80

Todavia, os resultados de cin~tica de re

naturação J\odem ser apresentados de maneira mais con

veniente, cvnforme sugerido por Britten e Kolme (1967), o que cons titui um método alternativo para a determi -

nação da complexidade cinética e tem a vantagem de

permitir a comparação entre reaçÕes com concentraç~es

diferentes de DNA, al~m de mostrar claramente se o # '" - • " • DNA em estudo e homogeneo ou nao. Neste tlpo de grafl-

co (Figuras 20 e 21), a fração de DNA reassociado

(A ~A/A -Aoo ) é colocada em função do logaritmo do o o produto da concentração inicial de DNA pelo tempo de

reação (log Cot). Os valores de "Cot" são expressos em

moles de nucleotidios por litro por segundos (mol.seg.

1-1). Cot igual a 1 resulta da incubação por 1 hora de

DNA em uma concentração de 100 pg/ml. Nesse tipo de

gráfico, uma reação ideal de segunda ordem fornece umq

curva sim~trica, cuja parte central se ajusta a uma re

ta. A inclinação dessa reta é estimada pela razão en

tre os valores de Cot que a linha intercepta no iní

cio e fim da reação e serve como diagnóstico na deter

minação do grau de homogeneidade do DNA. Para uma rea

ção ideal. a razão é próxima de 100 (2 unidades de

log de Cot); se a razão for maior do que 100, a reação

é heterogênea, isto é, espécies com velocidades de

renaturação diferentes estão presenteso

Britten e Kolme (1967) desenvolveram e

quações que permitem analisar a cin~tica de renatura -

ção, cons iderando Cot como o parâmetro que controla a

velocidade da reação. No caso de DNA único, o Cot ne

ce ssário para 50% de reassociação (Cot l / 2 ), é propor

cion al ao tamanho do genoma (G):

G (1) Cotl / 2 ::::

K

A constante de proporcionalidade (K) "e

avaliada pela medida, em condiç~es id~nticas, da velo

cidade de reassociaç ão do DNA de um organismo com ge

n oma con hecido, s em rep ~ tição significativa.

QMando um~ f amília de DNA formada por

uma sequência de nucl€ot~.d i o s repetida x. vezes esti-1

ao

00.1 o c:{

o e lrl 1I1

~Q2 a::

c:{

zo

~Q,3

o I c:{

<.> c:{

a:: I.L- 0,4

104

81

fIC • • • ............... ....-...-...- .... ...ct ~

(j\,~

103 102.

~ ct.. ,

10

q

''q\

b

0,0

." ::o 1> D 1>. a CID

a z 1>

::o 0,5 m

1> lJ"I lJ1 o n 1> a o

O,s ' . ' 'la -3 -2. -1 o 1 '

loq cot

Figura 20 - Renaturação de diferentes preparações de DNA. A reassociação (NaCl 1 M; 60QO), foi medida espectrofotometricamente, pela hipocromicidade de senvolvida a 260nm. A fração de DNA reassociado-(Ao-A/Ao-A <lO ) é colocada em função do logaritmo do produto da concentração de DNA (00) expressa em . moles de nucleot:f.dios/l, pelo tempo de incubação (segtmdos) (Britten e Kohne, 1~68). A ordenada no lado direito do gráfico, refere-se a renaturação do DNA de E. coli (li-

t ) -, ----nha cheia, clrculoa vazios e a da esquerda a renatura-ção do DNA total (linha cheia, circulos cheios) e nuclear (linha pontilhada, círculos cheios e vazios) de trofozoitos -de A. c a stellaniL A curva de reassociaç ão do DNA nuclear {linha pontilhada), ilustra o efeito da conc entração de DNA na velocidade da reação: circulos vazios, 53 J-lg/ml e círculos cheios, 39 "ug/ml. As setas no eixo das abcissas indicam os valores de Cot onde metade do DNA deveria reassociar de acordo com vários graus de r epetição. Concentração de DNA de E. coli e DNA total == 33 pg/ml.

0,0

o O 01" « , CJ o Vl Vl

~ li:: 0,2 ct 2 O

~

.~ 0,3 o. <!f o:: LL

0,4'-

82

~~~. ,

104 103

k •• \ \

.~~ ~

~

102 10

!OP

11 l> -o »1 o

f;} d t ::ti rtl »

0,5 ~ a n l> d o

OS" ,to J -3 -2 -1 O 1

log coi

Figura 21 - Renaturação do DNA reiterado de A. castell~nii. As condições de incub ação e outros detãlhes sao os mesmos da Figura 20. O perfil dê reassociação do DNA de ~. coli (linha cheta, escala da direita), ilustra a heterogeneidadx cinetica dos outros dois DNAs. O Cot(1/2) para as tres secções distintas da curva de reassocieçf:io do componente menor (círculos cheios) e para as duas retas do DNA mitocondrial (círculos vazios), foi calculado segundo Britten e Kohne (1967 ), considerando como padrão o Cot(1/2) do DNA de E. coli renaturado nas mesmas condições. Os valores m~ dios obtidos estão resumidos na Tabela 70 A concentra= ção do DNA mitocondrial e componente menor são re spec-ti VameJlte iguais a 26 e 16 p g/mlo .

83

ver pre s ente , o Cot necessário para 50% de renaturação da família é reduzido na proporção do grau de repeti -ção. Nessas condições, quando se e studa a reassociação de DNA não fracionado, a equação (1) deve ser modific.§! da e a frequência de repetição (x.) de um DNA rapida -

1

mente renaturado pode ser calculada a partir da se-guinte equação:

G (2) cotl / 2 K x.

1

Portanto, para calcular a frequência de repetição, deve-se conhecer o genoma do organismo em estudo.

A equação (2) · contém as relações necessárias para a interpretação de medidas de velocidade de reassociação de DNA repetido" Se uma fam!lia de sequências repetidas está contida . em uma fração C;l do

DNA total, a concentração efetiva muda e a equação (1) não pode ser aplicada. Nesse caso, o Cotl / 2 para uma determinada famllia de DNA reiterado deve ser multiplicada pela fração que ela representa do DNA total ( a ). A complexidade cinética (N) da família é obtida pela equação:

N = Cotl / 2 a K (3)

Conllecendo.:..se a e N, pode-se calcular a frequência de repetição do DNA ràpidamente reassocia

do: a G (4) x. =

1 N

A reação de neassociação do DNA de E. ~li (Figura 20) segue uma curva sigmóide com inclinação

característica para uma reação homogênea de segunda

ordemo A determinação do Cot l / 2 desse DNA fornece um ponto de calibração ladequado, conforme discutido acima. Por outro lado, a heterogeneidade cinética do DNA total, verificada nos gráficos (Figura 16) segundo We1 mur e Davidson (1968), é claramente confirmada pela C1l.-rva de reassociação ilustrad,élflq figura 20.

O DNA nuclear H~r'8 .c:J enta uma cinética de

SL~

l'enH:tul'a ç.ão (Figura 20) caracter1.stica para sequênciRs

que aparecem uma única vez no genoma, apresentando bai

xa porcentagem de renat1JJ'açã.o J;10 intervalo de valores

de Cot empregado s (cerca de 10%). A reação de reassocia

ção obedece cinética de segunda ordem como pode ser ob

servado .pelQs dois conjuntos de pontos mostrados na fi

gura 20.

Tabela 7 - Propriedades cinéticas das fra

çoes de DNA reiterado de trofozo itos de A. (,as te1lanii

DNA Cotl / 2 Complexidade A

Frequencia

observado cinética de reite-

(daltons) raçao

componente 0;011 1, 5xl06 2,Sx103

menor 0;11. 2·4x107 , 2 ,Sxl02

0,70 2 ,Sx108 45

mitocondrial O;OS 1;7xl07 3,4x102

0,60 2,4xlO 8 52

A renatuI'élção (NaCl 1 M, 60°C), foi anaJisada pela queda

de absorbâncie a 260nm. Os valores médios (3 determina .

ções ) de complexidade cinética e frequência de reitera -

ção foram calculados conforme sugerido por Britten e

Kolme (1967), por comparação com o cot l / 2 do DNA de

( ) 9 . . :§. coli 0,5, com genoma igual a 2,7xlO d lCalrns ,

1963 ). Cot l / 2 é o produto da concentração de DNA (moles

de nucleotidios/l), pelo tempo (seg1Jlldos) necessário pa

ra 50% de reassociação.

A análise da curva de reassociação do com

p one nte menor do DNA total (FigUJ'H 21) , . indica conside

rável b ete ro geneidacleno gr au de repe t ição das sequên

e i as de nucleot1.di os. Pode-s e distinguir três frações,

co m carac t er1. st; i cas mo stradas na Tabela 7. A comp1exida

8S

de cinética e frequência de reiteração de cada fração

foram calculadas conforme descrito acima, por compara

ção com os dados obtidos para o DNA de ~. coli, rena

turado nas mesmas condições. A renat'IT~ção do DNA de

E. col~ e do componente menor resultam na recuperação

de aproximadamente 80 e 50% da hipocromicidade ini-

cial re s pectivamenteo

O perfil de renaturação do DNA mitocon --

drial (Figura 21), mostra a existência de duas .fra-

ções com complexidade cinética e frequência de reite

ração semelhantes ~s frações do componente menor com

velocidade de renaturação "intermediária" e "lenta"

(Tabela 7). A porcentagem média de renaturação do DNA

mitocondrial é igual a 40%.

VII .. Discussão

. , 1. Isolamento de nucleos

'. , ~,

Varlos metodos para extraçao de nucleos,

utilizando meios aquosos de homogenização (ver Méto

dos)f foram testados, sem obtenção de resultados sa

tisfatórios. O procedimento descvito (Métodos), permi

tiu o isolamento de núcleos com baixa contaminação por

material citoplasmático ou células intei~as (Figura

2). Os núcleos isolados eram, aparentemente, intactos

(Figura 3a), mantendo a subestrutura nuclear observa

da "in vivo" (Figura 3b). O métodos empregado propor

cionava resultados reprodutíveis, conforme pode ser

julgado pelos valores de desvio padrão obtidos na de

terminação da composição química de diferentes prepa

rações (Tabela 2).

A demons tnação da atividade de RNA poli

merase (E.Co2.7.7.6), mostrou que os núcleos, além

d e estruturalmente intactos, eram fisiológicamente a

tivos. A reação catalisada pela enzima nuclear .era

DNA-dependente, conforme demonstrado pelo efeito da

adição d~ actinomicina D (Tabela 3). Rudick e Weis

man (1973a), demonstraram que trofozoitos de A. cas

tellanii apresentam duas atividades distintas qe

RNA polimerase-DNA-dependente , fração I e 11, sAndo

que ambas requerem magnésio e manganês para atividade

máx ima o A fração I era inibida por cicloheximida e a

fraç ão 11 por rifampicina e a-amanitina. A inibição

da fraç ão 11 por ri f ampicina só era obtida com al

tas concentrações da droga (200 pg/ml), ao contrário

do que acontece em Amoeba proteus, onde 70% da stn

tese de RN.A é inibida por concentrações da ordem de

O,lpg/ml (Tautvydas, 1971). Os resultados aqui des

critos (Tabela 3), indi c am que núcleos isolados de

!. castellanii, apresentam atividade de RNA polimera

se-DNA-depen dente , que não é inibida por rifampicina

na conc entr a ç ão te s tada (8 pg/ml)o

87

As micrografias eletrônicas (Figura 3)

mostra m que o proces s o de isolamento não remove a mem

brana nuc lear externa com ribo s somos aderidos, que po

deriam ser considerados como uma forma de contaminação

citoplasmáticao A membrana nuclear externa pode ser

removida opcionalmente (Blobel e Potter, 1966)0 Toda

via, esse procedimento apresenta vantage~s e desvanta

gens que devem ser consideradas em cada caso especifi

co. Para os objetivos do trabalho aqui descrito, a re

moção de traçqs do retículo endoplasmático das prepa

rações de núcleos foi considerada irrelevante o

A análise de ácidosnucleicos em protozoá

rios é dificuldade pelo fato de que poucas espécies

são cultiváveis axênicamente (MandeI, 1967)0 ° número

de espécies examinadas é pequeno e pouco repre s entati

vo, especialmente no caso das amebas. Os resultados de

composição qufmica de núc.leos isolados de A. castella

nii (Tabela 2), mostram que as ' razões RNA/DNA e pro

tefna/DNA são muito próximas das razões determinadas

para núcleos de fígado de rato (Blobel e Potter,1966)

e sig:p.ificantemente diflerentes das descritas para le

vedo (Rozijn e Tonino, 1964) e !. proteus (Tautvydas,

1971). Em !. castellanii, o teor médio de DNA por nú

cleo, foi avaliado em 10,6 pg (Resultados,item 4) •

Esse valor é intermediário entre os valores de 3,5 " e

13,6 pg, determinados, respectivamente, para Euglena

gracilis (MandeI, 1967) e Tetrahymena piriformis (Man

deI, 1967), mas, sem dúvida muito menor que os dados

para as amebas gigantes, como A. proteus ( Tautvydas ,

1971) e Paramecium au.I:elia (Isaacks et alo, 1973),res

pectivamente iguais a 34 e 51,2 pg por núcleo. Deve

se levar em consideração que o conteúdo de DNA por nÜ

cleo obtido pela análise química de núcleos isolados ,

repre senta um valor médio (Mirsky e Ris, 1951)0 A com-~ , .

paraçao des s es valores medlos demonstra o grau de he-

terogeneidade existente entre microrganismos eucario

tos, no que se refe re ao conteúdo de DNA por nttcleo.

20 Extração de DNA

Vários autore s (Kirtikar et aI., 1967 . ,

,

88

MandeI, 1967; Adam et aI., 1969), encontraram dificuld~

des na extração de DNA de !. castellanii e de outras

amebas. O procedimento adotado (Métodos) é um~ combina

ção dos métodos de Kirby (1962) e Adam et alo (1969)

descritos, respectivamente, para extração de DNA de

ovos de Drosophila e DNA celular total de trofozoito"S

de A. castellaniia Ao contrário do método de Adam et ..... .

alo (1969), o DNA é obtido a partir da fase aquosa da

extração com fenolo A metodologia adotada permite a re

cuperação de grandes quantidades de DNA altamente poli

merizado, com peso molecular uniforme, conforme avalia

do pelas bandas estreitas obtidas em gradientes de den

sidade. O DNA obtido era cons tituído por moléculas na

tivas que, quando desnaturadas, apresentavam o efeito

hipercrômico esperado. Além disso,os valores de peso

molecular obtidos em gradientes de sacarose neutros e

alcalinos, indicavam ausência significativa de que-

bras em uma Única fita de DNA. O espectro de absorção

(Figura 5), apresentava razões de abs.orbância:! caracte -

rísticas de DNA puro (Marmur, 1961)0

3. Caracterização do DNA de trofozoitos

a) DNA total

O UNA celular total de trofozoitos é cons

tituído por dois componentes com densidade de flutuação

igual a 1,717 g/cm3 (componente maior) e 1,692 g/cm3

(componente menor)o A contribuição de cada componente

é re s pectivamente igual a 84% e 16%, conforme avaliado

a partir do traç ado fotoelétrico de DNA total centrifu-

gado em gradient es de CsClo Um outro satélite menos

denso ( p = 1,670 g/cm3), foi observado em algumas pr~ paraç ões de DNA total que, quando centrifugadaa em gra

dient e s preparativos de CsCl, apresentavam uma banda

muitb nítida e opalescente na região de equilíbrio do

DNA. Os re sultados obtidos quanto à caracterização des~

se material, indi cam que ele sejaéons tituído por gli

cogênio, já que apre s enta te s te positiv o com o reagente

de antrona, sensibilidade à di~estão por a-amilase,

89

densidade de flutuação- semelhante à de glicogênio comer

cial (cf. Mandel et ale, 1968), precipitação com eta

nol e nature za não-dializável. Apesar de não apresentar

absorção máxima na região ultra-violeta do espectro, o

polissacarídeo causa disper s ãe de luz suficiente par~

afetar o espectro de absorção das preparações de DNA

(Figura 5). Conclusões semelhantes foram relatadas por

outros autores, que verificaram a presença de bandas

satélites de glicogênio (Brunk e Hanawalt, 1966) ou de

outros pOlissacarfdios (cf e Mandel et al., 1968), em

gradientes isopicnicos de CsCl. Portanto, componentes

desse tipo devem ser analisados com cuidado, para que

nao possam ser interpretados, errôneamente, como

lites de DNA ricos em AT (Rosenkranz e Carden,

1967).

saté-

111 ,

A análise da incorporação de timidina-3H em material ácido-insolúvel (não descrita neste traba

lho), demonstra que a vAlocidade de síntese de DNA di

minui muito durante a fase estacionária, conforme veri

ficado anteriormente For Rudick (1971)0 Entretanto, a

síntese dos dois componentes parece ser afetada dife-

rencialmente. A proporção do componente menor varia

sensivelmente ao longo da curva de crescimento, apreseg

tando um valor máximo de 16% do DNA celular total na

fase log mediana (Tabela 4)0 Fenômeno semelhante foi

descrito para o DNA mitocondrial de levedo (Moustachi e

Williams~n, 1966), apesar de existirem controvérsias a

esse respeito (Fukuhara, 1969). A porcentagem do compo

nente menor no DNA de cistos (7%) é semelhante ao va

lor apresentado por cu.lturas em fim de fase log (6%), quando se inicia o encistamento em massa das células.A

redução da proporção do componente menor no DNA de cis

to poderia, pelo menos em parte, ser atribuída à au~ólise de mitocôndrias, que são incorporadas em autoliS0-

ssomos durante o encistamento (Bowers e Korn, 1969). A

atribuição de um significado fun.cional à variação da

proporç ão do componente menor é dificultada pela exis

tência de diferente s fraç ões de DNA com densidade mé

dia i gual a 1, 692 g/cm3• Para efeito de padronização

todas as experiênci as aqui descritas, empregam DNA ex-

90

traído de células em fase log mediRna.

A renatuTação do DNA total de troLozoitos

apresenta características cinéticas comuns à maioria

dos eucariotos estudados (Britten e Kohne, 1967). A

curva de reassociação se estende por várias unidades

de log de Cot, sugerindo a existência de vários com

ponentp.s com diferentes velocidades de reassociaç ão

(Figura 20). A distinção entre as diferentes famílias

é dificultada pelos valores semelhantes das velocida

des de reassociaç ão. Foi possível obter urna aproxima -

ção através da aplicação da equação ( 2 ), (ítem 9, Re

sultados), para calcular o valor de Cot l / 2 correspon -

dente a vários graus de re i teração o Quando uma escala

de sses valores é marcada no diagrama de log de Cot

(Figura 20), obtem-se a delimitação do intervalo de

frequências de repetição exi stentes . O perfil de reas

sociação obtido nas condi ç ões de incubação adotadas

(NaCl 1M; 600 C), sugere que 14% do DNA seja constituí

do por sequências com frequência média de reiteração

igual a 1000 Estudo da cinética de r eassociação das

frações isoladas fornece urna visão mai s detal~ada do

espectro de s equências repetidas do DNA total.

b) DNA nuclear e componente maior

A comparação entre os resultados obti-

dos com o componente maior do DNA total e DNA isolado

de núcleo s de trofozoito (Tabelas 5 e 6), demonstram

a identidade entre essas duas espécies de DNA o

O alto grau de homogeneidade das sequên

cias de bases do DNA nuclear é claramente evidenciado

pe lo comportame r'i to em gradientes de CsCl, desnatuI'ação

térmica e renaturação. O perfil de fusão é caracteriz~

do por uma transição abrupta, mostrando um pico gaus

siano nas curvas derivadas de desnaturação(Figura 14).

Não for am observados satélites em gradientes de CsCl

de DNA nuclear nativo ou fragmentado, obtendo-se

pre, apenas uma banda estreita (Figura 9A). O DNA

sem-, e

c inéticamenbe homog&neo , apresentando uma única reta

em gráficos do tipo ·· suger i do por Wetmur e Davidson

91

(1968) (Figura 18). Assim sendo, a proporção de sequências reiter~das no DNA nuclear é muito reduzida e a maior parte das sequências do DNA total com renaturação rápida deve ter localização citoplasmática. o DNA nuclear seria compos t o principalmente por sequências ~nicas que renaturam com um k2 igual a 0,106 l.mol-l •

-1 d 1 'd d . ~t' seg ,que correspon e a uma comp eXl a e Clne lca de 1,46xlOlld. A complexidade analltica do DNA huclear , determinada por análise qulmica de núcleos isolados (10,6 pg de DNA/núcleo), apesar de ser um valor medio, aproxima-se da complexidade determinada por metodos cin~ticos (l,46xlOlld). A discrepância entre esses valores poderia indicar a presença de uma pequena quantidade de sequências reiteradas no genoma nuclear, n~o

detectadas pelas técnicas e condições de renaturação em pregadas. Realmente, uma certa porcentagem de

... sequen-

cias com repetição intermediária deve estar presente no

DNA nuclear, já que na maioria dos eucariotos estudados, sequências desse tipo parecem estar dispersas ao longo do genoma (Britten e Smith, 1970). Em protozoários, a infor,mação existente é muito escassa, ea ameba repre -sentaria um exemplo de eucarioto com proporção muito baixa de sequências reiteradas com localização nuclear.

A proporção de DNA nuclear (86%) obtida por extrapolação a tempo zero de reação (Wetmur, 1967 '; Wells e Birnstiel, 1969), em gráficos lineares de renaturação (Figura 16), concorda estreitamente com o valor obtido a partir da área das curvas de sedimentação em gradientes analíticos de CsCl (84%, Figura 9B).

v . - ~ Os graflcos de rellaturaçao construl.dos se-gundo Britten e Kohne (1967), mostram que não há contaminação de TINA nuclear com DNA repetido (Figura 20), confirmando o perfil unimo daI observado em gradientes de densidade (Figura 9A) .

c) DNA mitocondrial e componente menor

O DNA extraído da fração mitocondrial apresenta dens i dade de flutuação idêntica à do componen

te men or do DNA t otal (1, 692 g/cm3). As mitocôndrias

92

nao foram tratadas com DNase e o DNA mitocondrial esta

va consideràvAlmente contaminado por DNA nuclear (Figu

ra 10A). Todavia, purificR.ção por centrifugação em gra

dientes de CsCl, resultou em grande redução da conta

minaçao por DNA nuclear (Figura lOB), representada por

moléculas altamente degradadas, conforme mostrado pelo

perfil largo e achatado na região de den.sidade igual a

1,717 g/cm3 • Bohnert (1973) obteve resultados seme-

lhantes, verificando um enriquecimento

menor em preparações II1itocondriais.

O componente menor do DNA

do componente

total apresenta

uma transição térmica complexa, que sugere uma análise

mais detalhR.da, através da primeira derivada das cur

vas de fusão (Figura 15A)o A transição térmica é excep

cionalmente larga e assimétrica. A característica mar

cante é que essas curvas não apresentam uma distribui -

~ão gaussiana, ao contrário do DNA nuclear o A an~lise

d.e :3sas curvas mostra um componente principal com T m

Am torno de 620 C e dois componentes de menor importân -

cia com Tm de 65 e 750 C aproximadamente. A presença de

um componente com T semelhante a 75°C, poderia indi-m

car contaminação por DNA nuclear. Todavia, as prepara -

ções de componente menor, quando centrifugadas em · gra

dientes de CsCl, apresentavam um único pico estreito ,

com densidade · itwal aI, 692 g/ cm3 o Adam e colaborm:lores

(1969) também observaram a presença, no componente me

nor, de uma espécie de DNA com T semelhante ao do JNA m nuclear.

A curva de desnaturação do componente me

nor reflete a presença de segmentos de DNA com composi

ções médias de b a ses bastante diferent8s. ~ provável que

a heterogeneidade seja intramolecular e não intermolecu

lal:' l conforme sugerido pela banda Única e simétri0rt 1b

servada em gradientes de CsCl. Essa interpretação (Ber

nardi et alo, 1970), explica a diferença entre os valo

res de porcentagem de GC calculados a partir do Te m densidade de flutuação do componente menor do DNA to-

tal (Tabela 5)0 Não foi feita uma análise exaustiva do

perfil de fusão do DNA mitocondrial que , todavia, tam

bém apresenta caracteristicas compatíveis com uma com,-

93

posiç;o heterog~nea. A heterogeneidade de composiç;o

de bases não é muito comum em organismos eucariotos do

tipo selvagem, apesar de ter sido descrita para DNA

de cloroplastos de Chlamydomonas (Wells e Sager,197l),

DNA de cinetoplastos de Trypanosoma cruz i (Riou e Pao

letti, 1967) e DNA mitocondrial de algumas linhagens

"petite" de levedo ( Bernardi et aI., 1970). O arranjo

das frações com diferentes razões de bases no DNA mi

tocondrial, pode ser extrapolado a partir das curvas

derivadas de desnaturaç;o e perfil de sedimentaç;o em

gradientes de CsCl. Se essas regiões fôssem muito dis

tanciadas, o perfil obtido após centrifugaç;o isop!cni

ca seria constitu!do por várias bandas, ou, pelo me

nos, por uma banda muito alargada. Todavia , obtinha

se sempre, uma única banda, caracterizada pela largu

ra esperada segundo o tamanho do DNA utilizado (Vino

grad e Hearst, 1962). Os resultados, portanto, suge

rem que essas regiões heterog~neas são pequenas e dis

persas ao longo do genoma (Wells e Sager, 1971).

Conforme discutido anteriormente (ítem 9

de Resultados), é posslvel avaliar o conteúdo informa

cional (complexidade de sequ~ncia. ) de um DNA, através .. , . -,

de estudos de clnet~ca de renaturaçao. Os calculos se-

rão simples sàmente se o DNA em questão apresentar com

portamento homogêneo como o DNA nuclear ou o DNA de

E. coli, que serviu de padr;o nas experi~ncias de

reassociaç;o. No caso do componente menor ou DNA ·de

mitocôndrias que se comportaram heterogêneamente, a

avaliação da complexidade a partir da determinação das

constantes de velocidade é prejudicada pela renatura

ç;o precoce das famílias de DNA reiterado. Além dis so,

quando uma família de sequ~neias repetidas é isolada

do resto do DNA, ela reassocia mais rapidamente, em

virtude do aumento relativo na sua concentração.Nesse

caso, o Cot l / 2 obser~ado nos gráficos de log de Cot,

devem ser multiplicados pela fração do DNA original

representada pela famflia de sequências repetidas, ob

tendo-se o valor de Cot l / 2 "puro" (Firtel e Bonner,

1972), ou seja, o Cot1 / 2 que seria obtido se o DNA

fôs se cons titufdo sàménte pela fração em estudo. As

tabelas 6 e 7 re s umém os resultados de cinética de

94

reéiL-l f! oc iéi (; ão de várias frações de DNA, levando-se em

cons:Uleração as limitações discutidas. Os resultados

obtidos indicam que o DNA reiterado de trofozoitos a-

presenta três famílias distintas, definidas por fre-

quências médias de reiteração características para fa

mílias com renaturrrção "rápida" (3xl03 ), "intermediá -

ria" (3xl02 ) e "lenta" (50). O ... lÚInero de famílias com

diferentes velocidades de renaturação encontradas no

DNA mitocondrial e componente menor, corroboram a

existência de três fa~ílias de sequências reiteradas

sugeridas pelo perfil de renaturação do DNA total (Fi

gura 16). Além disso, os valores de frequência de rei

teraçao das famílias pre s entes no DNA mitocondrial e

componente menor (Tabela 7), situam-se dentro do in

tervalo de frequência das sequências reiteradas do

DNA total, calc·ulado a partir da complexidade do TINA

nuclear (ver escala de valores de Cot l / 2 calcu l ad.os

segundo diferentes graus de reiteração na Figu ra 20 ).

A compara <; ão entre os valores de cO lllplex~

dade cinética e frequência de reiteração (Tabela ·7) e

k2

aparente (Tabela 6) , sugere que o DNA mi tocondrial

contém as famílias com renaturação líintermediáriaít e

"lentat~ enquanto que a fração "rápida' deve ter origem

citoplasmática e xtramitocondrial.

Assim, o DNA mitocondrial seria constituí

do por um componente principal com velocidade de rena

turação compatível com uma complexidade cinética de

2,6xl08d"(fração "lenta") e por outro componente com

genoma próximo de 2~lxl07 d (fração "intermediárial! ),

que representa 35% do genoma mitocondrial, conforme e~

timado a partir da hipocromicidade devida a cada fra-

ção (Wetmur, 1967). Bohnert (1973), demonstrou que

35% do DNA mitocondrial era formado por círculos aber

tos, com um contorno médio de 12,8 um, que correspon -

dem a um PM de 2,77x107 d, valor esse comparável à complexidade cinética do componente mais rápido dO

DNA mitocondrial ( 2 ,lxl07 d). Portanto, é provável que

as moléculas anal is~das ao microsc6pio eletr&nico re

presentem as s equências de bases detectadas nas expe

riências de r en ât uraç ão aqui descritas o Adicionalmen -

95

te, Bohnert (1973) descreveu a exis tência de molécul as circulares maibres, ~ol~culas lineares e mol~culas colabadas cujo comprimento não pode ser medido, o que impede a comparação com os resultados cin~ticos.

A fração intermediária corresponde a 6xl09 d (4% do genoma da ameba), enquanto que a fra-ção lenta equivale a 1,3xlOlO d (7,5% do genoma). A, diferença entre a complexidade analítica e a complexida -de cin~tica indicaria, então, que os componentes do DNA mitocondrial estariam presentes, respectivamente; em cerca de 300 e 50 cópias por genoma nuclear.

O DNA mitocondrial de !. castellanii, como acontece em outros microrganismos eucariotos estudados, é constituído por mol~culas maiores que o DNA mitocondrial de c~lulas de animais vertebrados (Sager, 1972). Os dados obtidos são semelhantes aos valores de tamanho e conteúdo informacional determinados para TINA de cloropastos de algas e plantas superiores e DNA mitocondrial de plantas superiores (Sager, 1972). O comportamento cin~tico heterogêneo mostrado pelo INA mitocondrial de !. castell~ii, foi igualmente verificado em DNAs citoplasmáticos de mitocôndrias (Wells e Birns

tiel, 1969) e clorapastos (Wells e Birnstiel, 1969 Wells e Sager, 1971), que apresentavam um componente com renaturação rápida, presente em muitas cópias e um componente principal caracterizado por uma frequên -cia de reiteração menor.

A análise das tabelas 6 e 7, sugere que o componente menor do DNA total, de localização cito-plasmática, contem uma fração de DNA de origem extramitocondrial, presente em aproximadamente 3xl03 cópias. Esse DNA poderia ser análogo, em céLulas superiores,aos epissomos bacterianos, ou então, demonstraria a existêg cia de organismos simbiontes, sugerida anteriormente por Ito ~t aI. (1969). Esses autores postularam que os corpúsculos citoplasmáticos contendo DNA, identificados por autoradiografia, seriam constituídos por vírus defectivos ou epissomos. A complexidade cin~tica determinada para a fração rápida do DNA da ameba -(1,5xl06 d) , exclui a possibilidade de que os simbiontes possam ser

96

bactél'ias ou micoplasmas, concordando com as observações

citológicas anteriores CIto et aI., 1969). A natureza extracromosomal desse DNA sugere que uma pequena fra-ção do genoma (2,5%), não estaria submetida ao controle de replicação normal, formando múltiplas cópias, cada vez que o genoma da ameba sofresse duplicação. A autonomia genética dessas partículas seria melhor evidenciada, através da determinação do grau de multiplicidade em di

ferentes estágios de crescimento de culturas de amebas (Chiscon e Kohne, 1970). Qualquer que seja a origem fi

logenética dessas partículas, elas poderiam representar A , •

outro exemplo de um fenomeno comum entre os protozoarlos; conforme discutido por Soldo e Godoy (1973), quesalientam a vantagem seletiva da existência de muitas cópias para a manutenção da continuidade genética em um ambien

te intracelular. Por outro lado, a existência de um DNA ci

toplasmático extramitocondrial ~oderia ser relacionada com a extrusão de DNA nuclear para o citoplasma, des-

crita anteriormente (Bovlers e Korn, 1969). A natureza e destino do DNA liberado são desconhecidos .• A caracteriza

ção desse DNA poderia f{)lrnecer resultados interessante s , já que fenômenos semelhantes foram verificados apenas durante a meiose, envolvendo sempre a amplificação de

cistrons ribossômicos (Lima-de-Faria, 1973). Se o DNA citoplasmático, detectado nas experiências de renatura

ção fôsse de origem nuclear, dificilmente conteria informação ~ara a síntese de rRNA, já que os cistrons ri-bossômicos, na maioria dos eucariotos estudados, têm densidade de flutuação maior que a do DNA nuclear (Birn~

tiel et aI., 1971). Sem dúvida, a atribuição de uma função à fração rápida do DNA total de A. castellanii, re

quer maior investigação.

4. Análi1se das condições de renaturação

o grau de precisão de pareamento quências de nucleotídios é determinado pelas de incubação, ou seja, o tamanho da fração de

das se-condições DNA que

reassocia, varia ·com o "critério" estabelecido durante a

97

experiência realizada para estudar esse DNAs Como a re

associaç~o ~ acelerada em soluç6es de alta força i3ni

ca (Wetmur e Davidson, 1968), adotou-se, rotineiramen -

te, NaCl 1 M como meio de incubaç~o e temperatura igual a 600 C. Segundo Rice e Paul (1972), essas condi

ç6es de incubaç~o evitam a formação de hfbridos instá

veis e n~o especfficos, apesar de constitufrem um cri

tério n~o muito rfgido de renaturaç~o. A adoç~o de tem

peratura mais alta ou força i3nica mais baixa durante H •• . _ ,

a renaturaçao, determlnarlam a formaçao de moleculas d~

pIas, contendo menor proporção de bases mal pareadas •

Todavia, experiências de renaturaç~o empregando DNA

dissolvido em SSC, forneceram resultados idênticos aos

descritos neste trabalho, possibilitando a conclusão de

que as regi6es de homologia detectadas eram relativamen

' te extensas.

As condições de inc~baç~o adotadaspermi

tiram evidenciar a heterogeneidade desequências de ba~

ses do DNA mitocondriaJ de A. castellanii, evidenciada

pelas caracterfsticas do perfil de renaturação e desna

turaç~o térmíca. Estudos mais detalhados das curvas de

fusão, permitir~Q estabelecer uma posslvel correlação

entre as regiões de heterogeneidade local observadas na

desnatUl~aç~o e as fam!lias com diferentes velocidades

de , renaturaç~o.

Entretanto, a complexidade cinética , das

famllias de DNA reiterado deve ser interpretada critic~

mente, já que o "critério" adotado permite a reassocia

ç~o de sequências semelhantes, mas n~o idênticas, que

poderiam reduzir a velocidade de reas'sociaç~o (Bri tten

e Bonner, 1971), fonnecendo uma medida aumentada do

comprimento das s'equências que se repetem (Southern,

1970). Deve-se" também, levar em consideração que as

moléculas de DNA reassociado poderiam conter regiões

não pareadas (Britten e Kohne, 1967), se as sequências

repetidas ocorressem em segmentos de DNA muito meno

res que os fragmentos de DNA utilizados nas experiên

cias (Tabela 6). O tamanHo dos fragmentos de DNA e os va

lores relativamente baixos de Cot empregados, não per-

98

mitem excluir a existência de uma pequena porcentagem

de DNA Úni c o no genoma mi tocondrial, nem a presença de

uma bai xa porcentagem de sequências reiteradas no DNA

nuclear.

As constantes de segunda ordem obtidas não

foram corriginas quanto ao teor de GC, porque bá evi

dências c ontraditórias sobre o seu efei t .O (Wetmur e

Davidson, 1968; Gillis et aI., 1970). Além disso, no

caso do DNA mitocondrial 8 componente menor, a heteroge

neidade de composição de bases impos s ibilitaria essa ...

correçao.

Em resumo, as medidas de frequência e p~

porção de DNA "Único" e reiterado de !. castellani:l,re

presentam um número mínimo de componentes do genoma,já

que a família de reiteração intermediária poderia con-

ter outros componente s não individualizados

de estudos de cin~tica de reassociação.

, atraves

VIII. Hesumo

o t rabalh o descreve um método para i s ola

mento d e núcleos morfologi camente intactos e fisiologi

camente ativos, além da c ara cterizaç ão parcial do

DNA de Acanthamoeba cas tellanii (linhagem Neff).

o DNA celular total de trofo zoitos con-

tém quatro famílias com diferentes velocidades de re

naturação. A fração com renatur ação mais lenta (DNA

"único"), corresponde ao DNA nuclear ·(86% do genoma)e

apresenta características cinéticas compatíveis com

uma complexidade de sequência i.gili.al a · l,46xlOll dal

tons. O DNA reiterado (14% do genoma); . compreende três

fam1.lias de sequências de nucleotídios, denominadas

"rápida", "intermediária" e "lenta", com complexidade

cinética re s pectivanlente igual a 1,5xl06 ; 2,lxl07 e 8 . 3

2,6xlO daltons, pre s entes em aproximadamente 3xlO ,

3XI02 e 50 cópias. As famílias de DNA reiterado têm

localização predominantement.e citoplasmática, sendo

que as famílias "intermediárias" e "lenta" fazem par -

te do genoma mitocondri a l. O comp ortamento cin~tico he

terogêneo do DN.A mito c oYJdrial e sua complexidade asse

melham-se aos d~do s existente u para outros microrgani,ê.

mos eucariotos. A constatação de uma espéCie de DNA

extramitocondrial pode ser relacionada com a descri

ção ant erior de corpúsculos citoplasmáticos contendo

mA ou com a extrusão d.e cromatina para o citoplasma ,

verificada no início do encistamento.

O DNA de trofozoi tos também foi caracteri

zado quant o ao padrão de sedimentação em gradientes de

densidade, desnat~ação t~rmica e composição de ba

ses. O DNA celular Gotal apresenta dois componente s .em

gradiente s de CsCl, caracterizados por densidade de fl~

tuaç ão iguais a 1,717 g/cm3 (comp onente maior) e

1,692 g/cm3 (componpute menor). O perfil de fusão do

DNA ini tO G.'.ondrial sugere heterogeneid ade de composição

de bases o

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