東海大學生命科學系碩士論文

Jak/STAT 訊息傳遞鏈中配體在果蠅發育過程扮演的角色

Functional study of ligands of the Jak/STAT signaling during

Drosophila development

研究生: 林詩涵

Shih Han Lin

指導教授：蔡玉真 博士

Yu-Chen Tsai, Ph.D.

中華民國九十九年八月

致謝

我要由衷感謝我的指導老師蔡玉真老師。在碩班的兩年期間耐心

的教導，因為老師的指導讓我不只在實驗上在處理事務方面也學習到

許多經驗。感謝孫以瀚老師對於實驗上的建議以及無私的提供實驗材

料讓我能更順利完成碩士論文。此外也感謝胡承波老師、范盛興老師

與劉俊宏老師。也非常感謝系上所有的老師，在實驗方面的建議以及

學業上認真的教導

在碩士班期間的生活與大學生活大不相同，不僅要兼顧實驗及課

業 需要花費許多精力，但因為有實驗室的學姊：小邱及鈺婷仔細教

導實驗上的技巧。以及實驗室的同伴：映柔、俊銘、心怡 柏凱、夙

彣、兩津、柏霖、琬淇這些貼心的學弟妹，分擔我許多雜事，讓實驗

室生活充滿溫暖。感謝系上的學長姐們：老郭、小波、小妤、成翰、

小玉 跨實驗室的幫助。我的同學們陪伴我一起完成碩士的課業，以

上所有人在這兩年的幫助。

最後要感謝我的家人 給我無盡的支持及關心，讓我在這兩年能

夠專心於學業。

1

目錄

目錄…………………………………………………………………1

圖表目錄……………………………………………………………3

中文摘要……………………………………………………………4

英文摘要……………………………………………………………6

前言…………………………………………………………………8

Jak/STAT pathway在哺乳動物的傳遞方式及調控的生物功能………...8

果蠅中Jak/STAT訊息傳遞鏈調控的發育過程、成員及傳遞方式……..9

果蠅中的Jak (Hopscotch)………………………………………………..11

果蠅中的STAT (STAT92E)………………………………………………12

Jak/STAT訊息傳遞鏈的配體 (ligand): Upd、Upd2、Upd3……………13

Jak/STAT 訊息傳遞鏈的受體(receptor): Dome、Domelike(latran)……15

實驗材料…………………………………………………………....19

Primer list………………………………………………………………19

Fly stocks…………………………………………………………………22

化學藥品…………………………………………………………………24

化學溶液…………………………………………………………………26

實驗方法…………………………………………………………....28

細胞培養 (Cell culture)………………………………………………….28

細胞的短暫轉殖 (Transient transfection of cells)……………………….28

萃取細胞蛋白質 (Cell lysate)…………………………………………...28

蛋白質濃度的定量……………………………………………………….29

共同免疫沉澱法 (co-immunoprecipitation)…………………………….29

2

西方點墨法 (Immunoblotting)…………………………………………..30

聚合酶連鎖反應 (PCR)…………………………………………………31

勝任細胞 (competent cell for electroporation)…………………………..32

轉型作用 (transformation)……………………………………………….32

小量質體的製備 ………………………………………………………...33

中量的質體製備………………………………………………………….34

果蠅培養………………………………………………………………….35

雙分子螢光互補法……………………………………………………….35

掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy)…………………….36

實驗結果……………………………………………………………………...39

Upd 及 Upd3 是醣化蛋白質………………………………………………40

在 S2 細胞株 Upd-like 蛋白質之間具有交互作用………………………41

在果蠅體內，Upd-like 蛋白質之間具有交互作用……………………….43

在果蠅眼睛發育過程中，單獨或同時表現不同組合的 upd-like 會造成不

同的影響…………………………………………………………………50

討論…………………………………………………………………53

不同醣化形式的Upd-like可能會影響與其他Upd-like交互作用………..53

標示蛋白質接在Upd3的C端會影響Upd3的部分功能…………………..53

Upd-like蛋白質交互作用的區域…………………………………………54

在果蠅體內Upd-like交互作用的位置受到調控…………………………55

果蠅中Jak/STAT訊息傳遞練可能與MAPK訊息傳遞鏈有交互作用…...55

參考文獻……………………………………………………………57

3

圖表目錄

圖表

圖一：Upd 及 Upd3 為醣化蛋白質(glycoprotein)…………………………………..65

圖二：共同免疫沉澱法及雙分子螢光互補法所需之質體…………………………66

圖三：在 S2 細胞株中 Upd-like 能夠形成同雙體(homodimer)及異雙體

(hetrodimer)…………………………………………………………………………..67

圖四：Upd-like-GFP-N(C)轉殖果蠅在眼碟的邊緣具有功能………………….…70

圖五：Upd3-GFP-N(C)轉殖果蠅表達在眼碟中正分化細胞的作用……………….72

圖六：Upd-like-GFP-N(C)轉殖果蠅表達在眼碟中正分化細胞的作用 …………74

圖七：Upd-GFP-N(C)及 Upd2-GFP-N(C)轉殖果蠅能夠補救 os1 小眼的外表

型 …………………………………………………………………………………....76

圖八：Upd3-GFP-N(C) 及 GFP-N(C)-Upd3 轉殖果蠅能夠補救 upd3p106-2 小眼的外

表型……………………………………………………………………………………………………… ………….78

圖九：Upd –like 在眼碟及唾液腺能夠形成同雙體(homodimer) …………...…….80

圖十：Upd –like 在眼碟及唾液腺能夠形成異雙體(hetrodimer) ………………….82

圖十一：單獨表達 Upd-like 或不同組合的 Upd-like 對果蠅成蟲複眼會造成不同

的影響………………………………………………………………………………84

表一：在眼睛發育過程中，於眼盤不同位置表現不同 upd-like的外表型 ………..86

附圖

附圖一：果蠅 Jak/STAT 訊息傳遞鏈………………………….…………………..…87

附圖二：在果蠅的眼碟及睪丸中，upd-like 表現位置重疊或彼此相鄰 …………..88

附圖三：在果蠅成蟲睪丸中，同時表達不同組合的 Upd-like 外表型與單獨

表達不同的 Upd-lik 相異 ……………………………………………………..……89

附圖四：Jak/STAT 訊息傳遞鏈調控不同果蠅發育過程可能的分子機制之模式

圖。 ………………………………………………………………………………..…90

個人資料表…………………………………………………………...…91

4

摘 要

在哺乳動物中，Janus Kinase (Jak) /Signal Transducers and

Activators of Transcription (STAT)訊息鏈受到細胞激素(cytokine)及生

長因子的活化。Jak/STAT 訊息鏈對於血液生成及免疫反應扮演重要的

角色，若 Jak/STAT 訊息鏈失去調控會造成免疫疾病或癌症。哺乳動物

中有四個 Jaks 及七個 STATs，相較之下果蠅中只有一個 Jak 和一個

STAT，具有基因不重複性及演化高度保留性。除此之外，果蠅已建立

好的遺傳工具，我的研究主要是利用果蠅來研究 Jak/STAT 訊息鏈在發

育上扮演的角色。Jak/STAT 訊息鏈在果蠅參與許多發育過程，例如：

胚胎體節生長、眼睛大小、血球生成、免疫反應及維持幹細胞的特性。

Jak/STAT 訊息鏈在果蠅中的配體 (ligand)為：Unpaired (Upd) 及兩個

Unpaired-like 蛋白質 (Upd2 及 Upd3)；兩個可能的受體 (receptor) 為：

Domeless (Dome)及 Domeless-like (Dome-like)。只有已是雙體的 Dome

及 Dome-like 才能夠受到 Upd-like 的調控，並且活化 Jak/STAT 訊息鏈。

在胚胎、眼睛以及睪丸發育過程中，已知 upd-like 的基因表現位置重

疊或在鄰近表達。果蠅中目前仍不清楚為何 Jak/STAT 這個簡單的訊息

鏈 (一個 Jak 和 STAT) 可以調控多種不同發育過程?我們推測不同配

體之間及受體之間可能會形成同雙體 (homodimer) 或異雙體

(hetrodimer)，進而活化 Jak/STAT 訊息鏈以及不同的因子，藉由上述的

反應能夠引起多種不同的發育過程。我利用共同免疫沉澱法及雙分子

螢光互補技術 (Bimolecular Fluorescence Complementation

technology；BiFC)，在果蠅及 S2 細胞株中測試不同配體間是否會形成

雙體。目前，我利用共同免疫沉澱法發現 Upd/Upd、Upd2/Upd2 及

Upd3/Upd3 會形成同雙體；Upd/Upd2、Upd/Upd3 及 Upd2/Upd3 會形

成異雙體。除此之外，我利用 BiFC 技術發現在果蠅體內唾液腺及眼

5

盤中，Upd/Upd、Upd2/Upd2 及 Upd3/Upd3 會形成同雙體，Upd/Upd2、

Upd2/Upd3 及 Upd/Upd3 會形成異雙體。當在眼睛以及睪丸發育過程

中，共同表達不同組合的 Upd-like 相較於單獨表現 Upd-like 蛋白質會

有不同的作用。我的結果顯示，在果蠅中 Upd-like 蛋白質可以形成同

雙體或異雙體不同多樣性組合，且不同組合的 Upd-like 蛋白質會影響

果蠅的發育。

6

Abstract

The Janus kinase (Jak) / Signal Transducers and Activators of

Transcription (STAT) signaling transduces signals for cytokines and

growth factors in mammals. The Jak/ STAT signaling plays important

roles in immune responses and hematopoiesis. Mutations of this signaling

cause inflammatory diseases and cancer. There are four Jaks and seven

STATs in mammals. In contrast, only one Jak and one STAT exist in

Drosophila. The nonredundancy of the evolutionarily conserved

Jak/STAT pathway components makes Drosophila an effective animal

model for studying the Jak/STAT pathway. The Jak/STAT signaling

participates in multiple developmental processes, including segmentation

of embryos, eye development, haematopoiesis, immune response and

stem cell maintenance in Drosophila. There are three ligands, Unpaired

(Upd), Upd2 and Upd3), and two putative receptors, Domeless (Dome)

and Domeless-like (Dome-like) in the Drosophila Jak/STAT signaling.

Only dimerized Dome receptors are competent to response Upd-like and

activate the Jak/STAT pathway. The expression patterns of Unpaired-like

proteins are overlapping or adjacent to each other during embryonic, eye

and testis development. It is still unclear why such a simple Jak/STAT

pathway (one Jak and one STAT) can mediate multiple developmental

processes in Drosophila. I propose different combinations of Jak/STAT

ligands and receptors can activate Jak/STAT pathway and downstream

effectors. Those results induce distinct biological processes. I checked

interaction of ligands in S2 cells and in vivo by co-immunoprecipitation

(co-IP) and Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

7

technology. In my preliminary data, I found that the homodimers of

Upd/Upd, Upd2/Upd2 and Upd3/Upd3 and hetrodimers of Upd/Upd3,

Upd/Upd3 and Upd2/Upd3 were detected by co-IP in S2 cells. Upd/Upd,

Upd2/Upd2 and Upd3/Upd3 can form homodimer, Upd/Upd2, Upd/Upd3

and Upd2/Upd3 can form hetrodimers in the eye discs and salivary glands

in vivo. The effects of co-expression of Upd-like are different from

expression of each Upd-like protein in eye and testis. From my studies, I

found Upd-like can form homodimer and hetrodimer. Different

combination of Upd-like proterins can perform distinct effects in vivo.

8

前言

我的實驗為探討在果蠅發育過程中，Janus kinase (Jak)/ signal

transducers and activators of transcription (STAT) 訊息傳遞鏈的配體：

Unpaired (Upd)、Unpaired 2 (Upd 2)以及 Unpaired 3 (Upd 3)調控果蠅

的發育的作用機制，我主要是在 S2 細胞株及果蠅體內探討 Upd-like

蛋白間的交互作用。

Jak/STAT pathway在哺乳動物的傳遞方式及調控的生物功能

在哺乳動物中，Janus kinase (Jak)/ signal transducers and activators

of transcription (STAT) 訊息傳遞鏈受到細胞激素 (cytokine) 及生長

因子活化 (Argetsinger et al., 1993; Imada and Leonard, 2000; Levy,

1999; Mui, 1999; O'Shea et al., 2002; Yeh and Pellegrini, 1999)。

Jak/STAT訊息傳遞鏈主要成員為 Jak及STAT， Jak為酪氨酸激酶

(tyrosine kinase) (Rane and Reddy, 2000) 。 STAT 為 轉 錄 因 子

(transcriptional factor)，被活化的STAT會進入細胞核接上Gamma

interferon Activated Site (GAS) 這個核苷酸片段，調控下游具有GAS

的基因進行轉錄 (Hou et al., 2002; Kisseleva et al., 2002; Lew et al.,

1991)。Jak/STAT訊息傳遞鏈對於血球生成、免疫反應、乳腺發育、

乳汁分泌、脂肪形成等扮演很重要的角色 (Rawlings et al., 2004)。當

Jak/STAT訊息傳遞鏈無法進行正常的調控時，會造成癌症或免疫方面

9

的疾病 (Rawlings et al., 2004)。哺乳動物Jak/STAT訊息傳遞鏈中有四

個Jak (Jak1、Jak2、 Jak3及 Tyk2) (Firmbach-Kraft et al., 1990; Harpur

et al., 1992; Johnston et al., 1994; Krolewski et al., 1990; Rane and

Reddy, 1994; Wilks, 1991)以及七個STAT (STAT1、STAT2、STAT3、

STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6) (Schindler and Darnell, 1995)，

多種的Jak及STAT在功能上具有重複性，這使得Jak/STAT訊息傳遞鏈

在哺乳動物中不易研究。相較於哺乳動物在果蠅中只有一個Jak和一

個STAT組成簡單且完整 (Binari and Perrimon, 1994; Hou et al., 1996;

Yan et al., 1996)，具有演化高度保留性及基因不重複性。且在果蠅中

已建立許多遺傳上的工具 (genetic tool) 及方法。因此我的研究將利

用果蠅來探討Jak/STAT訊息傳遞鏈在個體發育過程中扮演的角色。

果蠅中Jak/STAT訊息傳遞鏈調控的發育過程、成員及傳遞方式

在果蠅， Jak/STAT訊息傳遞鏈參與許多重要的發育過程

(Arbouzova and Zeidler, 2006; Hombria and Brown, 2002)，在胚胎時期

Jak/STAT訊息傳遞鏈參與性別決定 (Jinks et al., 2000; Sefton et al.,

2000) 及體節分化 (Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980)，在幼蟲時

期參與血球細胞的發育 (Harrison et al., 1995; Luo et al., 1995)、眼睛

細胞的增生 (Bach et al., 2003; Tsai and Sun, 2004)、小眼的極性排列

(Zeidler et al., 1999)、卵巢發育時border cell的移動 (Beccari et al., 2002;

10

Ghiglione et al., 2002)，在成蟲時期參與免疫反應 (Agaisse and

Perrimon, 2004; Agaisse et al., 2003)、維持生殖幹細胞的命運 (Kiger et

al., 2001; Tulina and Matunis, 2001) 及在果蠅腸子受傷或感染時活化

幹細胞並維持表皮細胞的修復 (Buchon et al., 2009)。在細胞層次

Jak/STAT訊息傳遞鏈則會調控細胞分化 (Harrison et al., 1998;

Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980; Tsai et al., 2007)、細胞增生

(Bach et al., 2003; Tsai and Sun, 2004) 及細胞移動 (Beccari et al., 2002;

Ghiglione et al., 2002; Harrison et al., 1998) 。Jak/STAT訊息傳遞鏈是

受到它們的配體 (ligand) 精準的調控並影響這些發育過程。在果蠅

基因組中，Jak/STAT訊息傳遞鏈具有三個可能的配體：Unpaired

(Upd)、Unpaired 2 (Upd 2) 以及Unpaired 3 (Upd 3)，之後統稱為

Upd-like。其中Upd及Upd2已被證實是Jak/STAT訊息傳遞鏈的配體

(Gilbert et al., 2005; Harrison et al., 1998; Hombria et al., 2005)，並且在

本實驗室中結果顯示Upd3也可以活化Jak/STAT訊息傳遞鏈 (黃鈺婷,

2009, 碩士論文)。Upd、Upd2及Upd3蛋白質序列相似度不高，相同

度及相似度僅為7.3%與24%。但其序列上有一段約77個胺基酸極為相

似，相同度及相似度為23%及52.6%，我們稱之為Upd區域，此區域保

留於果蠅中12個物種 ，並且在哺乳動物中Jak/STAT訊息傳遞鏈的配

體Leptin也保留有此Upd區域，若一起比對Leptin與Upd、Upd2及Upd3

11

的Upd區域則相同度及相似度為23%與52.6% (黃鈺婷, 2009, 碩士論

文)。Upd、Upd2及Upd3都具有訊息序列 (signal sequence) 以及醣化

位點 (N-link glycosylation site) (Arbouzova and Zeidler, 2006; Hombria

et al., 2005) 。

果蠅中 Jak/STAT訊息傳遞鏈有一個已知的受體 (receptor)

domeless簡稱dome (亦稱master of marelle, mom) (Brown et al., 2001;

Chen et al., 2002) 及一個可能的受體cg14225 (亦稱domeless-like簡稱

dome-like或又稱latran) (Arbouzova and Zeidler, 2006; Hombria and

Brown, 2002); Michele Crozatier personal communication)。先前研究已

知Dome要先行成雙體 (dimer) 才有能力接上配體 (Brown et al.,

2003)。當Upd-like結合Dome會活化Jak (又稱Hopscotch簡稱Hop)，活

化態的Jak會Jak進一步磷酸化STAT，被磷酸化的STAT形成雙體後會

進入細胞核內調控下游的基因轉錄 (附圖一) (Arbouzova and Zeidler,

2006)，例如：socs36E (Karsten et al., 2002)、ptp61F (Baeg et al., 2005)、

cyc D (Tsai and Sun, 2004)，dome (Hombria et al., 2005)以及Draf (Kwon

et al., 2000)。

果蠅中的Jak (Hopscotch)

果蠅中若Jak失去功能 (loss of function) 會使胚胎時期的體節

12

T2、T3、A4及A5缺失(Perrimon and Mahowald, 1986)，所以命名為

Hopscotch簡稱Hop。不正常活化的hopTum-l (gain of function) 則會造成

血球細胞不正常增生及分化，導致類似白血病的疾病 (leukemia-like)

(Luo et al., 1995)。Hop為非受器酪氨酸激酶 (nonreceptor tyrosine

Kinases) (Binari and Perrimon, 1994)，蛋白質C端具有kinase domain與

哺乳動物所有Jak family約有39 %相同 (identity)。完整的蛋白質與哺

乳動物所有Jak family比較約有25 %相同，其中與Jak2最相似，有27 %

相同性 (Binari and Perrimon, 1994; Nusslein-Volhard and Wieschaus,

1980; Perrimon and Mahowald, 1986)。在哺乳動物中，Jak/STAT訊息

傳遞鏈不同的配體會活化不同的Jak而進一步活化不同的STAT，在生

物體引起不同反應，然而果蠅中只有一個Jak (Hop)，單一的Jak是如

何引起下游不同的作用仍然不清楚。

果蠅中的STAT (STAT92E)

果蠅中STAT位於唾液腺第三條染色體中的區域92E，所以又稱為

STAT92E (Yan et al., 1996)。STAT92E與哺乳動物中STAT5最為相似，

它們的胺基酸序列具有37%相同 (Hou et al., 1996; Yan et al., 1996)。

因為stat92E轉錄的起點不同具有有兩種isoform，一個是全長總共761

個胺基酸，另一種是在N’端少了133胺基酸，稱為∆NSTAT92E

13

(Henriksen et al., 2002)。在功能上，哺乳動物STAT中N’端被認為是正

向調控轉錄作用，且在果蠅大量表現∆NSTAT92E或增加∆NSTAT92E

和全長 STAT92E 的比例會造成 dominant-negative 作用，推測 ∆

NSTAT92E為Jak/STAT訊息傳遞鏈的負向調控者，且STAT92E全長會

正向調控Jak/STAT訊息傳遞鏈 (Henriksen et al., 2002)。

Jak/STAT訊息傳遞鏈的配體 (ligand): Upd、Upd2、Upd3

先前研究證明Upd是個分泌性蛋白質，被分泌出來的Upd會接在

細胞外基質 (extracellur matrix) 上 (Harrison et al., 1998)。Upd是一種

醣化蛋白質 (glycoprotein)，當Upd在人類293T細胞表現時，其分子量

範圍為 45 到 65kDa ，然而以抑制 N-link glycosylation 的抑制劑

tunicamycin處理時其分子量為45kDa，顯示45kDa以上的產物為帶有

不同醣化形式的Upd (Harrison et al., 1998)。在功能方面，Upd調控果

蠅體節發育 (Brown et al., 2001; Harrison et al., 1998)、果蠅border cell

的移動 (Beccari et al., 2002; Ghiglione et al., 2002) 、影響果蠅眼睛的

增生 (Bach et al., 2003; Tsai and Sun, 2004)、決定果蠅小眼的極性排列

(Zeidler et al., 1999)以及維持果蠅公生殖幹細胞的命運 (Tulina and

Matunis, 2001)。Upd2在果蠅中及果蠅的細胞株中可以透過Dome活化

Jak/STAT訊息傳遞鏈 (Gilbert et al., 2005; Hombria et al., 2005)。upd2

14

基因功能完全缺失 (null mutant的) 果蠅是可以存活且可孕 (Hombria

et al., 2005)，並且果蠅成蟲複眼的外表型約有700個小眼 (Yu-Ting

Chiu)略小於野生型 (750至800個小眼)。不僅如此，在胚胎時期upd2

表現的位置和upd相似。在胚胎時期九，體節中upd及upd2表現呈現

striped的位置。在胚胎時期十，upd及upd2表達於果蠅氣管(Harrison et

al., 1998; Hombria et al., 2005) 推測在胚胎發育時期Upd2的功能和

Upd有重複性。在我們實驗室發現upd3基因失去功能會使果蠅眼睛變

小 (約520個小眼)，並且進一步證明Upd3可經由Jak/STAT訊息傳遞鏈

調控果蠅眼睛的發育(黃鈺婷, 2009, 碩士論文)。Upd3也參與幼蟲時期

淋巴腺(lymph gland)的發育(Arbouzova and Zeidler, 2006; Jung et al.,

2005)。除此之外Upd3也表現於果蠅性腺(gonads)，推測Upd3會影響

果蠅性腺的發育 (Hombria et al., 2005)。並且Upd3可調控果蠅的先天

性免疫反應 (innate immune response)，當果蠅表皮組織受到細菌性感

染時，Upd3由血球細胞分泌，透過活化Jak/STAT訊息傳遞鏈促使脂肪

體 (fat body，功能相當於人類的肝臟)，釋放出抗微生物蛋白質 (TEP1

及TOT A)，抵抗外來的微生物 (Agaisse and Perrimon, 2004; Agaisse et

al., 2003)。在果蠅腸子受傷或感染Ecc15時會表達Upd3來活化幹細胞

中的Jak/STAT訊息傳遞鏈，促進幹細胞分裂，修復受傷的表皮細胞來

維持表皮細胞的恆定 (Buchon et al., 2009; Jiang et al., 2009)。

15

Jak/STAT 訊息傳遞鏈的受體 (receptor) : Dome、Domelike (latran)

先前研究中證明Dome是Jak/STAT訊息傳遞鏈的受體，Upd可與

Dome結合並活化Jak/STAT訊息傳遞鏈 (Brown et al., 2001; Chen et al.,

2002)。結構上已知Dome具有三個區域 (domain)：細胞外膜區

(extracellular domain)、穿膜區 (transmembrane domain) 及細胞內膜區

(intracellualr domain)。Dome的細胞外膜區包含五個fibronectin-type-III

(FnIII) domain，其中有兩個是cytokine binding module (CBM)，靠近N

端的CBM有在演化上具有保留性的四個半胱氨酸 (cysteine)，在C端

的CBM則有部分的WSXWS motif，這個WSXWS motif可能提供一個

位點讓配體接上 (Brown et al., 2001)。細胞內膜區具有演化上保留性

的YXXQ motif，此motif有酪胺酸 (tyrosine) 可能會被Jak磷酸化，產

生STAT的停靠點 (Brown et al., 2001; Chen et al., 2002)。果蠅基因體

定序結束後發現cg14225 ((亦稱domeless-like簡稱dome-like又稱作

latran)可能是 Jak/STAT訊息傳遞鏈的受體 (Hombria and Brown,

2002)。本實驗室研究發現，在果蠅眼睛大量表達dome-like，會使果

蠅眼睛變小，並且會抑制 Jak/STAT訊息傳遞鏈的活性 (Yu-Ting

Chiu)，顯示domelike在果蠅內是具有功能的基因，並且能調控

Jak/STAT訊息傳遞鏈的活性 (Yu-Ting Chiu)。先前研究利用蛋白質互

16

補法βlue-βlau technique (Blakely et al., 2000; Mohler and Blau, 1996)證

明Dome在果蠅體內會先形成同雙體 (Brown et al., 2003)，且形成雙體

的Dome才可被Upd活化 (Brown et al., 2003)。βlue-βlau technique可在

生物體內大範圍的偵測蛋白質之間是否有交互作用。它的原理是

β-glactosidase (簡稱β-gal) 有兩種突變蛋白質，一是ω domain有缺失，

稱為∆ω；另一種是αdomain有缺失，稱為∆α，∆ω以及∆α皆不具β-gal

的酵素活性，但是∆ω以及∆α距離很接近時可以互相補償彼此的功

能，使之具有β-gal的酵素活性，便可利用X-gal 染色的方法偵測得到

β-gal的活性 (Blakely et al., 2000; Mohler and Blau, 1996)。利用β-gal

這樣的特性，分別將Dome接上∆ω以及∆α，做成融合蛋白質 (fusion

protein)，Dome-∆ω以及Dome-∆α，結果顯示Dome與Jak/STAT訊息傳

遞鏈的配體結合前就已經在細胞膜上形成雙體，並且只有已經形成雙

體的Dome會被Upd活化 (Brown et al., 2003) 。

總結

另一方面，果蠅中Jak/STAT這個簡單的訊息鏈 (一個Jak和STAT)

為何可以調控多種不同發育過程仍未清楚。已知Dome及Dome-like會

形成同雙體(homodimer) (Brown et al., 2003)； Michele Crozatier

personal communication) ， Dome 與 Domelike 也 會 形 成 異 雙 體

17

(hetrodimer)(Michele Crozatier personal communication)。由於Dome及

Dome-like在細胞質的區域不同，不同雙體組合的受體活化後可進一

步活化Jak/STAT訊息傳遞鏈及不同的因子，藉由上述的反應能夠引起

多種不同的發育過程 (附圖四)。近期本實驗室結果顯示，在眼碟及

睪丸upd-like表現位置重疊或彼此相鄰 (附圖二)，並且在果蠅睪丸表

達不同組合的upd-like，對果蠅造成的影響與單獨表達upd-like不同

(附圖三)，所以我們推論Upd-like蛋白質可能具有交互作用。我們推

測Upd-like可能會形成同雙體或異雙體，產生相對於單獨Upd-like來調

控Jak/STAT訊息傳遞鏈有較多的多樣性。並且不同組合的upd-like對

不同組合的Dome及Dome-like可能有不同的專一性或親和力，進而活

化不同組合的Dome及Dome-like來調果蠅不同的發育過程 (附圖四)。

為了瞭解 Upd-like 是否會有交互作用，我利用生物化學

(biochemistry)的方法：共同免疫沉澱 (Co-Immunoprecipitation(Co-IP))

以及雙分子螢光互補法 (Biomolecular Fluorescence Complementation

(BiFC)) 來測試是否Upd-like會有交互作用。BiFC可以直接在果蠅體

內的特定組織來觀察Upd-like蛋白質間交互作用的位置 (Kerppola,

2006)。我分別觀察果蠅的眼碟及唾液腺，眼碟為upd-like內生性皆有

表達的組織；唾液腺是具有極性的組織，並且由較大的細胞組成，方

便觀察Upd-like蛋白質間交互作用的位置是否在細胞內特定的地方。

18

我利用共同免疫沉澱的法發現Upd/Upd、Upd2/Upd2以及Upd3/Upd3

會形成同雙體，Upd/Upd2、Upd/Upd2以及Upd2/Upd3形成異雙體。

使用雙分子螢光互補法的結果發現，在唾液腺及眼盤中，Upd/Upd、

Upd2/Upd2以及Upd3/Upd3會形成同雙體，Upd/Upd2、Upd/Upd3以及

Upd2/Upd3會形成異雙體，並且不同組合的Upd-like形成雙體的位置

在細胞內不相同。

19

實驗材料

Primer list

construct Primer

(enzyme site)

Sequence of primer (Tm)

upd-GFP-N

(Yu Lin)

Upd-5F

(EcoR I)

TCACAGCAGTTGGCGGCAC (Tm=57.8℃)

GFP-3’-157

-Not I

GCGGCCGCTTACTTGTCGGCCATGATATA

GAG (Tm=59.3℃)

upd-GFP-C

(Syu-Jia Yan)

Sac II TCCCCGCGGCAGAAGAACGGCATCAAG

GTG (Tm=54.7℃)

PUAST-R

(Not I)

GTGTCTTCATTCCAAGGAA (Tm=44.2℃)

upd2-GFP-N

(Syu-Jia Yan)

Sac II

GFP-3’-157

-Not I

GCGGCCGCTTACTTGTCGGCCATGATATA

GAG (TM=59.3)

upd2-GFP-C

(Yu Lin)

upd3-GFP-N Upd3-5’

-EcoR I

GAATTCTAAATGACGACAGCTGACCGCC

C (Tm=61.9℃)

GFP-3’-157

-Not I

GCGGCCGCTTACTTGTCGGCCATGATATA

GAG (Tm=59.3℃)

upd3-GFP-C

(Syu-Jia Yan)

CGTCGACACAGAAGAACGGCATCAAGG

TG (Tm=54.7℃)

20

PUAST-R

(Xba I)

GTGTCTTCATTCCAAGGAA (Tm=44.2℃)

GFP-N-upd3

Upd3-5’

EcoR I

GAATTCTAAATGACGACAGCTGACCGCC

C (Tm=59.5℃)

Upd3-SP-

GFP-R

CTCGCCCTTGCTCACGGAGAGGGCAAA

CTGGGACATGG (Tm=62.4℃)

GFP-N-upd3

upd3

SP-GFP-F

CAGTTTGCCCTCTCCGTGAGCAAGGGCGAG

GAGCTGTTCA (Tm=66.3℃)

GFP-N-B TCATATGCTTGTCGGCCATGATATAGACG

(Tm=56.3℃)

GFP-C-upd3

Upd3-5’

EcoR I

GAATTCTAAATGACGACAGCTGACCGCC

C (Tm=59.5℃)

Upd3-sp-gfp

(Upd3-SP-GF

P-C-B)

GATGCCGTTCTTCTGGGAGAGGGCAAAC

TGGGACATGG (Tm=62.4℃)

F:Upd3-sp-

gfp-c-f

CAGTTTGCCCTCTCCCAGAAGAACGGCA

TCAAGGTGAACT (Tm=59.6℃)

GFP-B

NdeI-R

TCATATGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC

GAGAGTG (TM=66.4)

GFP-N

GFP-N-F

EcoR I

AGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

G (Tm=60℃)

Dome-GFP-

N-Xba I

ATCTAGATTACTTGTCGGCCATGATATAG

ACG (Tm=56.3℃)

GFP-C GFP-C-F AGAATTCATGCAGAAGAACGGCATC

21

EcoR I (Tm=54.7℃)

GPF-C-B

Xho I

ACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCAT

GCCGAG (Tm=63.2℃)

SP-GFP-N

Upd3-5’

EcoR I

GAATTCTAAATGACGACAGCTGACCGCC

C (Tm=59.5℃)

Dome-gfp-n

-B Xba I

ATCTAGATTACTTGTCGGCCATGATATA

GACG (Tm=56.3℃)

SP-GFP-C

Upd3-5’

EcoR I

GAATTCTAAATGACGACAGCTGACCGCC

C (Tm=59.5℃)

GFP-C-B

Xho I

ACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCAT

GCCGAG (Tm=63.2℃)

upd-HA

upd 5f TCACAGCAGTTGGCGGCAC (Tm=57.8℃)

pAC5.1

Upd 1B AGCGGCCGCCCGAGGAGAGGGTTAGGG

ATAGG (Tm=58.1℃)

upd2-flag

Upd2-3F GCAACCTACACCAAGCTTTTCTTAC

(Tm=55℃)

Upd2-B-

flag

AGCGGCCGCTCACTTGTCGTCATCGTCT

TTGTAGTCCATAGACTCATTGGATCCGC

CATCGG

22

Fly stocks

w1118

Bloomington Drosophila Stock Center

w ; Pin/CyO from Dr. Y. Herry Sun

w ; TM6B/TM3,Sb from Dr. Y. Herry Sun

w ; Sp/CyO; Dr/TM6B from Dr. Y. Herry Sun

w ; DH/ SM6-TM6B from Dr. Y. Herry Sun

w ; os1,; ey-GAL4/TM6B from Dr. Y. Herry Sun

w ; upd3p106-2

; ey-GAL4/TM6B from our lab

GAL4 line

w ; ey-GAL4 (III) from Dr. Y. Herry Sun

w ; dpp-lacZ;

dpp-GAL4/SM6-TM6B

from Dr. Y. Herry Sun

w ; GMR-GAL4 (Ⅱ) from Dr. Y. Herry Sun

BiFC

w; UAS-upd-GFP-N/CyO

w;UAS-upd-GFP-N/TM6B33-3

In this study

w; UAS-upd-GFP-C/CyO2-1

In this study

w; UAS-upd-GFP-C/TM6B

w;UAS-upd2-GFP-N/CyO19-1

In this study

w; UAS-upd2-GFP-N/TM6B

w; UAS-upd2-GFP-C/CyO11-3

In this study

w; UAS-upd2-GFP-C/TM6B

w; UAS-upd3-GFP-N/CyO In this study

w;UAS-upd3-GFP-N/TM6B7-2

w; UAS-upd3-GFP-C/CyO2-2

In this study

w; UAS-upd3-GFP-C/TM6B In this study

w; UAS-GFP-N-upd3/CyO

w; UAS-GFP-N-upd3 /TM6B5

w; UAS-GFP-C-upd3/CyO

w; UAS-GFP-C-upd3 /TM6B

w; UAS-GFP-N/CyO2-2

In this study

w; UAS-GFP-N/TM6B

w; UAS-GFP-C/CyO In this study

w; UAS-GFP-C/TM6B8-2

In this study

w; UAS-upd-GFP-N33-3

/CyO; Dr/TM6B In this study

23

w; Sp/CyO; UAS-upd-GFP-N/TM6B

w; UAS-upd-GFP-C/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-upd-GFP-C/TM6B

w;UAS-upd2-GFP-N/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-upd2-GFP-N/TM6B

w; UAS-upd2-GFP-C/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-upd2-GFP-C/TM6B

w; UAS-upd3-GFP-N/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-upd3-GFP-N/TM6B

w; UAS-upd3-GFP-C/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-upd3-GFP-C/TM6B

w;UAS-GFP-N-upd3/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-GFP-N-upd3 /TM6B

w; UAS-GFP-C-upd3/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-GFP-C-upd3 /TM6B

w; UAS-GFP-N/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-GFP-N/TM6B

w; UAS-GFP-C/CyO; Dr/TM6B

w; Sp/CyO; UAS-GFP-C/TM6B

In this study

w; UAS-upd-GFP-C2-1

; UAS-upd-GFP-N33-3

/SM6-TM6B

In this study

w; UAS-upd2-GFP-C11-3

; UAS-upd2-GFP-N19-1

/SM6-TM6B

In this study

w; UAS-upd3-GFP-C2-2

; UAS-upd3-GFP-N7-2

/SM6-TM6B

In this study

w; UAS- GFP-C-upd32-2

; UAS- GFP-N-upd35/SM6-TM6B

In this study

w; UAS-upd2-GFP-C11-3

; UAS-upd-GFP-N33-3

/SM6-TM6B

In this study

w; UAS-upd3-GFP-C2-2

; UAS-upd-GFP-N33-3

/SM6-TM6B

In this study

w; UAS-upd3-GFP-C2-2

; UAS-upd2-GFP-N19-1

/SM6-TM6B

In this study

w; UAS-GFP-N2-2

; UAS-GFP-C8-2

/SM6-TM6B

24

化學藥品

2-mercaptoethanol Merk：8.05740

Acetone Merk：100020

Agar BD:214530

Agarose Amersco：0710

Ampicillin Sigma：A9518

Aprotitin Sigma：A1153

BSA(Bovine serum albumin) Sigma：A9647

Bromophenol blue Sigma：B0126

Chloroform Merck：1.02445

dNTP Roche：11969064001

EDTA Merck：1.08418

EtBr (Ethidium Bromide) Sigma：E8751

Ethanol Merck：1.00983

Glycerol Merck：1.04093

Glycine Bio-rad：161-0724

IAA Merck：1.00979

Isopropanol Merck：1.09636

KCl Merck：1.04936

KH2PO4 Merck：1.04873

KOAc Merck：1.04820

LB Agar Bio-101 Systems：3001-232

Leupetin Sigma：L2884

Methanol Merck：1.06007

25

MgCl2 Usb：18641

Na2HPO4˙2H2O Merck：1.06580

NaCl Amresco：0241

NaOH Merck：1.06498

NH4OAc Merck：1.01116

Nonfat milk 安佳脫脂奶粉

NP-40 Sigma：BM0919-1

N-propyl gallate Sigma：P3130

Paraformadehyde Merck：1.04005

Pepstatin A Sigma：P5318

Pfu Turbo DNA Polymerase Stratagene：0280316

pGEM-T-vector Promega：A362A

Phenol Amresco：0981

PMSF Sigma：P7625

Prime Taq polymerase GeNet Bio

RNase Promega：M6101

SDS (Sodium dodecyl sulfate) Merck：8.22050

sodium orthovanadate Sigma：S6508

T4 ligase Promega：M180A

T4 ligase buffer Promega：C126B

TB DRY Powder Growth Media Mo Bio：12105-1

Tris Amresco：0710

Triton X-100 Sigma：T8532

Tumicamycin Sigma：T7765

Tween-20 Sigma：P5927

26

Yeast extract BD：212750

化學溶液

1. Lysis buffer

0.05 M Tris (pH=7.8), 0.15 M NaCl, 0.5% Triton x-100, 0.5% NP-40,

O.1 mM PMSF, 5μg/ml Leupetin, 10 μg/ml Aprotitin

2. 蛋白質緩衝液 (protein buffer)

0.6 mM Tris-HCl, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM

2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue

3. 轉印緩衝溶液 (transfer buffer)

50 mM Tris, 380 mM glycine, 0.05% SDS, 20% methanol

4. 阻隔緩衝液(blocking buffer)

5% nonfat milk or BSA in PBST

5. PBST

137 mM NaCl, 2.68mM KCl, 10mM Na2HPO4•2H2O, 1.76mM

KH2PO4,0.05%(v/v) Tween-20

6. Solution I

50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH=8.0), 10mM EDTA (pH=8.0)

7. Solution II

0.2 N NaOH, 1 % SDS

8. Solution III

0.3 M CH3COOK (KOAc) pH= 5.2, 11.5% CH3COOH (HOAc)

9. 1x TE

10 mM Tri-Cl (pH=8.0), 1mM EDTA (pH=8.0)

27

10. Co-IP 緩衝液(buffer)：

20 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 % NP 40，10 mM NaF，10

% glycerol

11. Co-IP 緩衝液外加蛋白質酶抑制劑

20 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 % NP 40，10 mM NaF，10

% glycerol，0.1 mM PMSF，5 ug/ml Leupetin，10 ug/ml Aprotinin，5

ug/ml Pepstatin A，2 mM sodium orthovanadate

28

實驗方法

(一) 細胞培養 (Cell culture)

S2與 S2R+皆以 1x Schneider's Drosophila Medium (GIBCO) 外加

熱去活性的 10%胎牛血清 (heat-inactivated fetal bovine serum)、50

U/ml penicillin 及 50 μg/ml streptomycin 培養，置於 25℃的培養箱中

生長。

(二) 細胞的短暫轉殖 (Transient transfection of cells)

將 6x106 顆 S2 或 S2R+細胞以 serum-free 1x Schneider's

Drosophila Medium 培養在 6 well dish (TPP) 中。各別混合 16μl

cellfectin Ⅱ (invitrogen) 及 2μg 重組質體 (plasmid) 於 100μl 1x

Schneider's Drosophila Medium (GIBCO)，再將含有 cellfectin Ⅱ及質

體的 1x Schneider's Drosophila Medium 小心混合，靜置 30 分鐘。加

至細胞中，25℃培養 16小時後，將 serum-free medium換成含 10% FBS

的 1x Schneider's Drosophila medium。讓細胞表達質體的蛋白質產物

48 小時後，收集細胞進行西方點墨色或共同免疫沉澱法。

(三) 萃取細胞蛋白質 (Cell lysate)

將細胞連同細胞培養液收集於 15 ml 離心管中，以轉速 1000 rpm

離心 5 分鐘，去除上清液，加入 1 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2.68 mM

KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4) 清洗細胞，同時將細胞換於

29

1.5 ml 的離心管，以轉速 1000 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，加入

適量 lysis buffer (0.05 M Tris (pH=7.8), 0.15 M NaCl, 0.5% Triton

X-100, 0.5% NP-40, O.1 mM PMSF, 5μg/ml Leupetin, 10 μg/ml

Aprotitin)，置於冰上 30 分鐘。之後在 4℃下以轉速 13,000 rpm 離心

10 分鐘，取上清液，再次 4℃下以轉速 13,000 rpm 離心 5 分鐘取上清

液，上清液即是細胞蛋白質的萃取物。

(四) 蛋白質濃度的定量

配製五種標準濃度的蛋白質 (BSA) ，濃度為 1μg/μl、2μg/μl、

3μg/μl、4μg/μl 以及 5μg/μl。將染劑 (Bio-Rad protein assay, Bradford)

以無菌水做 5 倍稀釋，每個標準濃度 BSA 蛋白以及樣本各加 5μl 到

1ml 已稀釋的染劑中，均勻混合後在室溫下反應 5 分鐘，取置比色管，

放入分光光度計以波長 595 nm 測定標準濃度蛋白質及樣品的吸光

度，先藉標準濃度 BSA 蛋白建立標準曲線，再依樣本的吸光度根據

標準曲線換算出樣本的蛋白質濃度。

(五) 共同免疫沉澱法 (co-immunoprecipitation)

利用短暫轉殖將特定蛋白質大量表達於細胞，以外加蛋白酶抑制

劑的 co-IP 緩衝液 (20 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 % NP

40，10 mM NaF，10 % glycerol，0.1 mM PMSF，5 ug/ml Leupetin，

10 ug/ml Aprotinin，5 ug/ml Pepstatin A，2 mM sodium orthovanadate)

30

萃取細胞蛋白質。取 1000μg 細胞萃取物加入 50μl 已混合均勻的

protein G beads 到細胞萃取物，並且以 co-IP 緩衝液 (20 mM HEPES

pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 % NP 40，10 mM NaF，10 % glycerol)將

總體積至 1ml。在 4℃下搖晃 3 小時，使 protein G pre-absorb 細胞萃

取物。在 4℃下以轉速 1200G 離心 1 分鐘，取出上清液並且加 2μg 的

抗體至上清液，在 4℃下搖晃至隔天。為了使 protein G 接上抗體，加

入 50μl 已混合均勻的 protein G beads 在 4℃下搖晃 3 小時。之後以離

心的方法將 protein G beads 沉澱，離心條件為 4℃下以轉速 1200G 離

心 1 分鐘，上清液即是 flow through。以 co-IP 緩衝液清洗沉澱下來的

protein G beads 三次，每次在 4℃下搖晃 20 分鐘。接著將 protein G

beads 沉澱，並加入 40μl 的 5 倍 protein dye，在 100℃下煮 7 分鐘，

洗提與 protein G beads 結合的蛋白質，最後利用西方點墨法檢視蛋白

質之間是否有交互作用。

(六) 西方點墨法 (Immunoblotting)

將蛋白質萃取物混合五倍蛋白質緩衝液 (5 x sample buffer，60

mM Tris-HCl, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol,

0.1% bromophenol blue)，置於 100℃的沸水中 7 分鐘將蛋白變性

(denature)。之後注入 8%或 10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳

(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis ， 簡 稱

31

SDS-PAGE) ，進行電泳分離 (electrophoresis) 以分離不同分子量的

蛋白質。接著將電泳膠體及硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane) 浸

泡且搖晃在轉漬緩衝溶液 (transfer buffer) (50 mM Tris, 380 mM

glycine, 0.05% SDS, 20% methanol) 10 分鐘，利用半乾式轉漬裝置

(BIO-RAD) 使電泳膠體上的蛋白質轉漬到硝化纖維膜 (BIO-RAD,

0.45μm )。為了減少 1 級抗體與硝化纖維膜非專一性結合，硝化纖維

膜浸於阻隔緩衝液 (blocking buffer，5% nonfat milk or BSA in PBST)

且在室溫下反應 1 小時，以 PBST (137 mM NaCl, 2.68mM KCl,

10mM Na2HPO4•2H2O, 1.76mM KH2PO4, 0.05%(v/v) Tween-20) 輕微

清洗，加入一級抗體 (1° antibody) 在室溫培養 1 小時或 4℃至隔天

(overnight) 後，以 PBST 清洗 10 分鐘 3 次後。將硝化纖維膜以結合

HRP(horse radish peroxidase) 的二級抗體 (HRP-conjugated secondary

antibody) 在室溫下培養 1 小時，再以 PBST 清洗 10 分鐘 3 次。將硝

化纖維膜用 ECL 試劑進行化學冷光反應 (Chemiluminescent

reaction)，再利用冷光感應系統，cool CCD camera (Fuji film, Japan)

偵測硝化纖維膜上的訊號。

(七) 聚合酶連鎖反應 (PCR)

混合 2μl 低濃度的 DNA 模板、2μl 正向引子 (5 pmol/μl)、2μl 反

向引子 (5 pmol/μl) 、2μl dNTP (2.5mM)、4μl 5X PCR 緩衝液 (5x

32

prime Taq buffer)、2μl 已稀釋的 Taq 酵素 (1μl prime Taq (2U/μl)加入

11.5μl 10 倍 Taq 稀釋液)。放入 PCR 機器 (Applied Biosystems 9700,

AB9700)，設定反應溫度及時間：以 95℃預熱 PCR 機器，在 94℃下

1 分鐘將雙股模板分開，視不同的引子在不同溫度下，使引子黏上模

板 1 分鐘 (見引子黏合溫度)，72℃下讓 Taq 酵素做出 PCR 產物，以

上條件反應 30 周期。利用瓊質膠體電泳 (agarose gel electrophoresis)

分析 PCR 產物的正確性以及產率。

(八) 勝任細胞 (competent cell for electroporation)

以四區劃法讓 E.coli XL-1 blue 菌種在 LB 外加 tetracyclin 培養基

(10 μg/ml tetracyclin) 長出單一菌落 (single colony)，挑兩顆單一菌落

種入 50 ml TB 培養液中，在 37℃下以轉速 180 rpm 生長至隔天。為

增加菌液量，菌液以 50 倍體積新鮮的 TB 培養放大，培養細菌至 OD600

值到達 0.5 到 0.7 之間。菌液以轉速 4200 rpm 離心 20 分鐘，去除培

養液。後續皆在冰上操作，細菌以預冷的無菌二次水清洗三次，再以

預冷的 10% glycerol 清洗細菌一次，加入適當體積的 10% glycerol 回

溶細菌，以每管 100 μl 的細菌分裝至 1.5 ml 離心管，並保存於-80℃

冰箱。

(九) 轉型作用 (transformation)

勝任細胞及 Cuvette (BIO-RAD) 放於冰上解凍及預冷，待勝任細

33

胞解凍後，立即加入適量的重組質體到勝任細胞中，均勻混合，且放

入 Cuvette 中。將 Cuvette 裝置於 MicroPulser (BIO-RAD)，利用在 1.8

kV 的條件下，將 Cuvette 中的重組質體送入勝任細胞，之後勝任細胞

加入 1 ml TB 以及在 37℃以轉速 180 rpm 培養 40 分鐘。將菌液以轉

速 13,000 rpm 離心 1 分鐘且去除部分上清液，並將勝任細胞回溶於所

剩的上清液中，取適量體積的菌液塗在加有抗生素的 LB 洋菜膠培養

基上，在 37℃培養 14 至 16 小時，長出的菌落即是可能帶有重組質

體的細菌。

(十) 小量質體的製備

以 2ml TB 培養含有質體的大腸桿菌 XL-1 blue。於 37℃、180 rpm

環境下震盪培養 14 到 16 小時，將菌液混和均勻取 1ml 至 1.5 ml 離心

管。以轉速 13,000 rpm 離心 1 分鐘將細菌沉澱，去除上清液，將細菌

溶於 100 μl solution I (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl pH=8.0, 10mM

EDTA pH=8.0)。之後加入 200 μl solution II (0.2 N NaOH, 1 % SDS)，

以旋轉 (rotation) 的方法小心混合液體，在室溫下作用 1 分鐘。加入

150 μl solution III (0.3 M CH3COOK (KOAc) pH= 5.2, 11.5%

CH3COOH (HOAc))，以旋轉的方式小心混合液體，在室溫下作用 3

分鐘。加入 100μl Chloform 及 Isoamyl alcohol 24：1 的混合液體後溫

和混勻。以轉速 13,000 rpm 離心 15 分鐘分離有機層以及水層，吸取

34

水層後，得到質體 DNA。加入 900 μl 100% EtOH 沉澱質體 DNA，放

於-20℃超過 5 分鐘後，以轉速 13,000 rpm 離心 15 分鐘，去除上清液，

沉澱物即是質體 DNA。加入 1ml 70% EtOH 清洗質體 DNA，再以轉

速 13,000 rpm 離心 5 分鐘將 DNA 沉澱，留下固體，待水分揮發後，

加入 2μl RNase (10mg/ml) 以及 40 μl 1x TE (10 mM Tri-Cl pH=8.0,

1mM EDTA pH=8.0)，去除 RNA 以及回溶質體 DNA。

(十一) 中量的質體製備 (Viogen midi kit)

以 50 ml TB 培養含有質體的大腸桿菌 XL-1 blue。在 37℃180 rpm

環境下，震盪培養生長 14 至 16 小時。取約 30 ml 菌液以轉速 6000g

離心 15 分鐘沉澱細菌，去除上清液。以 4 ml VP1 buffer 回溶細菌，

加入 4ml VP2 以旋轉的方法溫和混合液體，再加入 4ml VP3 buffer，

以旋轉的方式小心混合液體，於冰上作用 5 分鐘後，在 4℃下轉速

13,000 rpm 離心 15 分鐘。等待時製備 Midi-V100TM 管柱 (column)，

加 3ml 100% EtOH 至 Midi-V100TM 管柱，以重力使之流過，在加入

10 ml VP4 並以重力使之流過。取上清液至已製備管柱中，使質體接

上管柱的濾膜，加入 15 ml VPN 清洗管柱的濾膜。依序加 5ml VPE

及 5ml TE 至管柱，洗提 (elute) 且回溶出質體，收集洗提液後加 10ml

3M NaOAc 以及 40 ml 100% EtOH 到 10ml 含有質體的洗堤液體沉澱

質體(最後濃度 0.5M NaOAc 以及 66.6% (v/v) EtOH)，置於-20℃兩小

35

時以上。在轉速 13,000 rpm下離心 30分鐘將DNA沉澱，以 70 % EtOH

清洗在質體上的鹽類三次，待水分揮發，將質體溶於 1x TE，並且保

存於 4℃。

(十二) 果蠅培養

果蠅培養於 25℃生長箱，大約一至兩個月換到新的培養皿。特

殊實驗溫度在內文結果的部分有特別附註。

(十三) 雙分子螢光互補法

為了使 upd-like-GFP-N (C) 表達於果蠅眼碟未分化的細胞以及

唾液腺，並且 ey-GAL4 表達於果蠅眼碟未分化的細胞及唾液腺中。

利用帶有 ey-GAL4 的轉殖果蠅與帶有 upd-like-GFP-N (C) 的轉殖果

蠅於 25℃交配。三天後將其子代置於 29℃下發育至三齡幼蟲。將三

齡幼蟲在 5 分鐘內於 1X PBS 緩衝液 (137 mM NaCl, 2.68mM KCl,

10mM Na2HPO4•2H2O, 1.76mM KH2PO4) 取出果蠅眼碟及唾液腺，

將取出的組織馬上放在 20%多聚甲醛 (paraformaldehyde) 室溫下固

定 15 至 20 分鐘。之後以 PBST 緩衝液 (137 mM NaCl, 2.68mM KCl,

10mM Na2HPO4•2H2O, 1.76mM KH2PO4, 0.3% Triton X-100) 液清洗

3 次，再於 PBST 緩衝中去除多餘的組織，利用 DABCO 溶液 (0.22 M

N-propyl gallate，90% glycerol in 1X PBS) 封片，以 Zeiss LSM510 共

軛焦顯微鏡觀察。

36

(十四) 掃描式電子顯微鏡 (Scanning Electron Microscopy)

分成四大步驟：(1) 樣品製備 (2) 臨界點乾燥 (3) 金屬離子覆膜 (4)

掃描式電子顯微鏡觀察

(1) 樣品製備

將果蠅收集在約可裝 4ml 的小玻璃瓶內，利用不同濃度的酒精小

心將果蠅置換到 100 % acetone。其方法如下：依序以 50 % EtOH、70

% EtOH 搖晃 10 分鐘以進行置換，樣品可穩定保存於 70 % EtOH 中

4℃數月。再以 70 % EtOH、80 % EtOH、95 % EtOH、兩次 100 %

EtOH、100 % EtOH 比 100 % acetone (1:1)、100 % EtOH 比 100 %

acetone (1:2)，搖晃 10 分鐘以進行置換。之後果蠅置換於 100 %

acetone 兩次，每次搖晃 15 分鐘，最後使果蠅置換於 100 % acetone

中。

(2) 臨界點乾燥

清潔臨界點乾燥機的冷卻樣品室 (chamber) 並且放入刻度棒

(O-ring)。啟動臨界點乾燥機電源，設定樣品室溫度為 0℃。接著

開啟二氧化碳鋼瓶及緩緩打開進氣閥 (Inlet)，注入二氧化碳液面

至刻度棒位置 5，停留 5 分鐘後打開排氣閥 (Exhaust) 排氣。將浸

泡於 100 % acetone 的樣本及標籤放入樣品籃中，迅速放入樣品籃

37

至冷卻樣品室，過程中樣品不可暴露於空氣。緩緩打開進氣閥注

入二氧化碳，讓二氧化碳液面蓋過樣品籃，約刻度棒位置 5，關閉

進氣閥，靜置 10 分鐘，打開排氣閥至液面些微低於樣品籃，以上

重複 3 次。緩緩打開進氣閥注入二氧化碳至液面刻度約至刻度棒

位置 7~8，關閉二氧化碳鋼瓶，調整溫度至 20℃，待升溫後靜置

15 分鐘。再將溫度調整至 37℃，待升溫後靜置 10 分鐘。由流量

計洩氣閥 (Leak) 以 2 l/min 之速度釋放二氧化碳，直至壓力減為

0。調整溫度控制至 25℃，待達到 25℃後取出樣品果蠅已進行金

離子覆膜。

(3) 金屬離子覆膜

於 SEM 樣品平台側邊標上樣品編號，底部貼上專用雙面膠以固

定樣品。將 10 隻果蠅樣品以頭朝內與觀察面朝上的方式排於樣品平

台上。逆時針轉 Leak valve 以破除 chamber 真空，打開玻璃罩蓋子置

入樣品平台，在玻璃罩及金屬離子覆膜機上覆蓋均勻的油以使之密

合。開啟幫浦，壓下 LPG vale 並同時逆時針旋轉 90 度與抽氣管成平

行狀態。約 10 分鐘後檢視真空度：開啟金屬離子覆膜機，Selector

選至 coat 的位置，再將 H.V control 轉至 5，按 Flash 鈕 (勿超過 2 秒

鐘)，檢視 Ion current 是否在 2mA 以下，若達此標準，再將 H.V control

轉至 10，按 Flash 鈕此時 Ion current 應於 7mA 以下，若達此標準則

38

可進行樣品覆膜，否則繼續抽真空。若達真空標準後，將 HV. Control

調至 8-10 位置，使 Ion current 在 7mA 的位置，計時 1 分 30 秒使樣

品覆上金離子，過程中在樣品室應有穩定的紫藍光，並且隨時注意 Ion

current 應在 7mA，若非在 7mA 的位置可調整 HV. Control 控制 Ion

current 的數值。待時間到達後，關 LPG valve，開 Leak valve 以破除

真空，接著取出樣品，利用拭鏡紙清理玻璃罩及金屬離子覆膜機的油

漬，並罩回玻璃罩，檢視真空度即可。

(4) 掃描式電子顯微鏡觀察

樣本以 SEM (Scanning Electron Microscopy, Hitachi S2300) 觀

察，並以數位影像擷取系統 (Digital Image Acquisition, GW Electronic,

Norcross, GA)拍攝樣品影像。

39

實驗結果

果蠅中Jak/STAT訊息傳遞鏈有3個可能的配體：Upd、Upd2及

Upd3，統稱為Upd-like。其中Upd在果蠅發育上的功能研究最清楚。

我們實驗室對於Upd-like如何調控果蠅複眼的發育以及如何參與胚胎

及幼蟲發育的機制很感興趣。我的研究將在果蠅體內及S2細胞株中探

討Upd-like的功能及它們之間的交互作用，進一步探討Upd-like如何調

控果蠅發育的作用機轉。

我們對於果蠅中Jak/STAT這個簡單的訊息鏈 (一個Jak和STAT)

為何可以調控多種不同發育過程的機制非常有興趣。已知Dome、

Dome-like會形成同雙體 (homodimer) 及異雙體(hetrodimer) (Brown

et al., 2003)；Michele Crozatier personal communication)。不同雙體組

合的受體活化後，藉由Dome及Dome-like不同的膜內區 (intracellular

domain)，除了活化主要的Jak/STAT訊息傳遞鏈，也可能會活化不同

的因子，藉由上述的反應能夠調控多種不同的發育過程 (附圖四)。

在果蠅睪丸表達不同組合的upd-like對果蠅造成的影響與單獨表達

upd-like不同 (附圖三)，除外在眼碟、睪丸upd-like表現位置重疊或在

鄰近表達 (附圖二)，所以使我們推論Upd-like蛋白質可能除了單獨具

有不同的功能外可能還有交互作用。我們推測Upd-like可能會形成同

40

雙體或異雙體，產生相對於單獨Upd-like較多的配體組合來調控

Jak/STAT訊息傳遞鏈。並且不同組合的Upd-like對Dome及Dome-like

可能有不同的專一性或親和力，進而調控多種果蠅的發育過程 (附圖

四)。

為了瞭解Upd-like是否有交互作用，我利用共同免疫沉澱法

(Co-Immunoprecipitation(Co-IP)) 以 及 雙 分 子 螢 光 互 補 法

(Biomolecular Fluorescence Complementation (BiFC)) 來測試是否

Upd-like會有交互作用。由於Upd-like可能為醣化蛋白其分子量不易判

讀，我首先先確認Upd-like蛋白在S2細胞株中的分子量。

Upd及Upd3是醣化蛋白質

由於Upd為醣化蛋白質 (glycoprotein)，並且Upd、Upd2以及Upd3

胺基酸序列上皆具有預測的醣化位點 (N-link glycosylation site)

( Hombrıía et al., 2005; Arbouzova and Zeidler, 2006)，所以推測Upd2

及Upd3可能也是醣化蛋白質。由於醣化蛋白質的分子量不易判讀，

為了明確了解Upd-like的分子量，我將比較Upd-like在有無抑制醣化反

應前後的分子量，以正確判讀Upd-like蛋白質的分子量。

為了明確了解Upd-like的分子量，在S2細胞株表達帶有HA標示蛋

白質 (tag) 的upd cDNA，以anti-HA的抗體偵測，結果顯示Upd-HA在

41

分子量約55-65 kDa的位置可偵測到多種不同的分子量 (圖一A)。在

S2細胞株中，經tunicamycin處理抑制N-link glycosylation後，出現45

kDa訊號 (箭號) 推測為Upd-HA未被醣化的形式 (圖一A)。為了證明

Upd3是否為醣化蛋白，並得知其分子量，我在S2細胞株中表達upd3

cDNA，並利用anti-Upd3的抗體偵測Upd3，約在43 kDa至55kDa可偵

測到多種不同分子量的Upd3蛋白 (圖一B)，在tunicamycin處理抑制

N-link glycosylation後，Upd3分子量在預計分子量36 kDa處被偵測到

(箭頭)，推測為Upd3未被醣化的形式，證明Upd3是醣化蛋白質 (圖一

B)。

在S2細胞株Upd-like蛋白質之間具有交互作用

為了瞭解Upd-like之間是否有交互作用，我利用共同免疫沉澱法

來證明Upd-like是否有交互作用。由於本實驗室目前無anti-Upd及

anti-Upd2的抗體，所以使Upd及Upd2分別帶有兩種不同的標示蛋白質

(Tag): Upd-HA (Su-Wen Cheng)、Upd-GFP (Tsai and Sun, 2004)、

Upd2-flag以及Upd2-GFP(Yu-Ting Chiu)。Upd3則帶有一種標示蛋白

質 : GFP-Upd3 (Yu-Ting Chiu)，以及本實驗室製備有anti-Upd3抗體。

我將上述帶有不同標示蛋白質的Upd-like，利用短暫轉殖法及

UAS-GAL4系統表達於S2細胞株中，之後再進一步以共同免疫沉澱法

42

及西方點墨法來驗證Upd-like之間是否有交互作用。

在S2細胞株中，以Actin-GAL4表達Upd-like蛋白，以anti-GFP的抗

體做免疫沉澱，左圖為細胞萃取物，右圖為共同免疫沉澱後的結果(圖

三)。當以Actin-GAL4大量表達Upd-GFP及Upd-HA，利用anti-GFP的

抗體及anti-HA的抗體分別偵測Upd-GFP及Upd-HA (圖三 A，左圖)，

由於Upd為醣化蛋白質，具有不同分子量的訊號 (mutiple band)。從共

同免疫沉澱的結果顯示Upd能夠形成同雙體 (圖三 A，右圖)。在S2

細胞株中表達Upd2-GFP及Upd2-flag，利用anti-GFP的抗體及anti-flag

的抗體分別偵測Upd2-GFP及Upd2-flag (圖三 B，左圖) 。共同免疫沉

澱的結果顯示，Upd2能夠形成同雙體 (圖三 B，右圖)。在S2細胞株

中表達GFP-Upd3及Upd3 (圖三 C，左圖)，利用anti-GFP的抗體及

anti-Upd3的抗體分別偵測GFP-Upd3及Upd3。從共同免疫沉澱的結果

顯示，Upd3能夠形成同雙體 (圖三、C，右圖)。在S2細胞株中表達

Upd2-GFP及Upd-HA，共同免疫沉澱的結果顯示Upd及Upd2能夠形成

異雙體 (圖三 D，右圖)。在S2細胞株中表達Upd-GFP及Upd3。共同

免疫沉澱的結果顯示Upd及Upd3能夠形成異雙體 (圖三 E，右圖)。

在S2細胞株中表達Upd2-GFP及Upd3，共同免疫沉澱的結果顯示Upd2

及Upd3能夠形成異雙體 (圖三 F，右圖)。為證實上述免疫沉澱的結

果並非來自於anti-GFP的抗體非專一性的作用，我在S2細胞株內只表

43

達Upd-HA或Upd3，結果發現Upd-HA及Upd3無法被anti-GFP的抗體非

專一性的免疫沉澱 (圖三 G, H)。證明上述共同免疫沉澱後所偵測到

的Upd-HA與Upd3非由anti-GFP的抗體非專一性的將Upd-HA及Upd3

免疫沉澱。

在果蠅體內，Upd-like蛋白質之間具有交互作用

為瞭解Upd、Upd2以及Upd3之間在果蠅活體中是否會有交互作

用，以及Upd-like在細胞內交互作用的位置，我利用雙分子螢光互補

法 (BiFC)，可以在果蠅的眼碟及唾液腺觀察Upd-like蛋白質間交互作

用的位置 (Kerppola, 2006)。眼碟為upd-like內生性皆有表達的組織；

唾液腺是具有極性的組織，且由較大的細胞組成，易於觀察Upd-like

蛋白質間交互作用的位置。

我應用雙分子螢光互補測試法結合 UAS-GAL4 系統 (Brand and

Perrimon, 1993)，可在果蠅體內觀察 Upd-like 蛋白質之間是否會有交

互作用，以及在細胞內交互作用的位置。由於表現 Upd-like 的方法是

利用 GAL4-UAS 系統，且 GAL4 的活性會受到溫度影響，在高溫度

時 GAL4 的活性較高，之後藉由控制溫度以控制 Upd-like-GFP-N (C)

在果蠅體表達的強度。雙分子螢光互補法的原理為綠螢光蛋白質

44

(Green Fluorescence Protein, 簡稱 GFP) 為可發螢光的蛋白質。當 GFP

分成兩個片段 GFP-N (核苷酸 1 到 471 base pair，胺基酸序列 1 到 157)

及 GFP-C (核苷酸 472 到 720 base pair，胺基酸序列 158 到 239)，此

兩片段蛋白質無法發螢光 (Ghosh et al., 2000)，若使兩片段距離很相

近時，則可恢復發螢光的能力。並且此兩片段蛋白質無交互作用使彼

此靠近而產生螢光(Kerppola, 2006)。為了使用雙分子螢光互補法，在

upd、upd2 以及 upd3 分別接上 GFP-N 及 GFP-C，進而產生融合蛋白

質 (fusion protein)。為了將每一種融合蛋白質能夠在果蠅體內表達，

將這些帶有綠螢光蛋白質片段的 upd-like 接在 UAS 序列之後，分別

為 UAS-upd-GFP-N 、 UAS-upd-GFP-C 、 UAS-upd2-GFP-N 、

UAS-upd2-GFP-C、UAS-upd3-GFP-N 及 UAS-upd3-GFP-C (Y. Lin and

S. C. Yuan)，以上共有六種構築的質體統稱為 UAS-upd-like-GFP-N (C)

(圖二)。再使這六種 upd-like-GFP-N (C) 分別嵌入果蠅基因體內，使

果蠅成為帶有 UAS-upd-like-GFP-N (C) 的轉殖果蠅(transgenic fly) (C.

Y. Tang, Academia Sinica)。每種轉殖果蠅都至少得到三個以上的獨立

轉殖株 (independent line)。由於在果蠅表達的 Upd-like 帶有 GFP-N

(157 個胺基酸) 或 GFP-C (82 個胺基酸) 蛋白質片段，這些綠螢光蛋

白質的片段有可能會影響 Upd-like 的結構與功能，所以我先分析這些

Upd-like-GFP-N (C) 的功能是否受到改變，之後再進一步觀察

45

Upd-like 是否會交互作用及其在細胞內交互作用的位置。

為了分析每個轉殖果蠅株所表達的 upd-like-GFP-N (C) 的功能

是否和 upd-like 相同。我分別在野生型的果蠅眼睛中大量表達這六種

upd-like-GFP-N (C) (圖四、五、六)，並且在 upd-like 缺失的小眼果蠅，

於果蠅幼蟲未分化眼睛的前驅細胞中補回不同的 upd-like-GFP-N (C)

來補救 (rescue) 果蠅小眼的缺失，接著再比較這些果蠅的表現型是

否與 upd-like 相同 (圖七、八)。

在野生型的果蠅體於 17°C 中，利用 dpp-GAL4 在眼碟的後端邊

緣 (posterior margin) 表達 upd，果蠅大多死於成蛹時期 (pharate

adults) 只有少數果蠅可生長至成蟲，成蛹果蠅 (pharate adults) 及成

蟲的果蠅眼睛會變大 (圖四 B)。在野生型的果蠅體於 17°C 中利用

dpp-GAL4 在眼碟的後端邊緣表達 upd-GFP-N 和 upd-GFP-C，結果與

表達 upd 相同，果蠅大多死於成蛹時期 (pharate adults)，只有少數果

蠅可生長至成蟲，成蛹果蠅 (pharate adults) 及成蟲的果蠅眼睛會變

大 (圖四 E, F)。野生型果蠅於 25°C 中，利用 dpp-GAL4 在眼碟的後

端邊緣表達 upd2 及 upd3 果蠅眼睛會變大 (圖四 C, D)。野生型果蠅

中於 25°C，利用 dpp-GAL4 表達 upd2-GFP-N (圖四 G)、upd2-GFP-C

(圖四 H)、upd3-GFP-N (圖四 I) upd3-GFP-C (圖四 J) 發現皆會使果

蠅眼睛變大，外表型和表達 upd2 及 upd3 一樣。接著利用 GMR-GAL4

46

於 25°C 中，在果蠅眼碟正在分化的神經細胞中大量表達 upd 及 upd3

果蠅眼睛會變大(圖五 B, D) 並且往外增生(圖六 B, D)。在野生果蠅體

中利用 GMR-GAL4 表達 upd-GFP-N、upd-GFP-C、upd3-GFP-C 皆能

使果蠅眼睛變大(圖五 E, F, J)且往外增生(圖六 E, F, J)。然而在野生果

蠅體中利用 GMR-GAL4 表達 upd3-GFP-N 無法使果蠅眼睛變大(圖五

I)，顯示 Upd-GFP-N、Upd-GFP-C 及 upd3-GFP-C 在果蠅正在眼碟分

化的細胞具有功能，Upd3-GFP-N 這個融合蛋白質在果蠅眼碟的邊緣

有功能，在眼碟正在分化的細胞並不具功能，所以 Upd3-GFP-N 只具

有 Upd3 部分功能。利用 GMR-GAL4 表達 upd2、upd2-GFP-N、

upd2-GFP-C 並無法使果蠅眼睛變大 (圖五 C, G, H) 且往外增生 (圖

六 C, G, H)。此外利用補救的方法來分析六種 Upd-like-GFP-N (C) 的

功能。在 os1 (upd、upd2 及 upd3 皆有部分缺失) 小眼果蠅中 (圖七

C)，利用 ey-GAL4 於 25°C 下，在眼碟未分化的細胞表達 upd 可補

救 (rescue) os1 小眼的外表型成野生型 (圖七 E)。在 os1 果蠅利用

ey-GAL4 在 25°C 下表達 upd-GFP-N 於眼碟未分化的細胞可補救小眼

的外表型成野生型，結果與 upd 相同 (圖七 G)。在 os1 果蠅中利用

ey-GAL4 於 25°C 下表達 upd2 能夠部分補救 os1/Y 小眼的外表型成野

生型 (圖七 F)。在 os1果蠅利用 ey-GAL4於 25°C下表達 upd2-GFP-N

及 upd2-GFP-C 能夠部分補救 os1 小眼的外表型成野生型，結果與

47

upd2 相同 (圖七 H , I)。這些表現型都和在 os1果蠅中表達 upd cDNA

及 upd2 cDNA得到的結果一樣 (圖七)。在 upd3p106-2 (upd3 null mutant)

的小眼果蠅中，於 22°C 中利用 ey-GAL4 在未分化的眼碟中表達

upd3-GFP-N (圖八 C)、 upd3-GFP-C (圖八 D)，可將小眼的外表型回

復成野生型，這與利用 upd3 cDNA 做補救的結果相同 (圖八 B)。總

和以上的結果，除了 Upd3-GFP-N 只具有 Upd3 部分功能以外，其餘

的 Upd-like-GFP-N (C) (upd-GFP-N、upd-GFP-C、upd2-GFP-N、

upd2-GFP-C 及 upd3-GFP-C) 的功能與 Upd-like 蛋白質一樣。

為了得到帶有 GFP-N 且功能正常的 upd3，我將 GFP-N 接在

Upd3的N端，稱為GFP-N-Upd3 (圖二)。且由於蛋白質構形 (topology)

的原因，我也同時構築將 GFP-C 接在 Upd3 的 N 端，稱為 GFP-C-Upd3

(圖二)。利用 GMR-GAL4 於 25°C 中在果蠅眼碟的邊緣及果蠅眼碟正

在分化的細胞大量表達 GFP-N-Upd3 ( 圖五 K, 圖六 J) 及

GFP-C-Upd3 (圖五 L, 圖六 K) 皆可使果蠅眼睛變大，且外表型和大

量表達 upd3 cDNA 一致 (圖五 D, 圖六 D) 。在 upd3p106-2的小眼果

蠅中，利用 ey-GAL4 表達 GFP-N-upd3 及 GFP-C-upd3，可將小眼回

復正常眼 (圖八 E, F)。以上顯示 GFP-N-Upd3 及 GFP-C-Upd3 具有

完整的功能。

為了排除 BiFC 的實驗結果的綠色螢光是由大量表現綠螢光蛋白

48

質時，GFP-N 及 GFP-C 兩個片段彼此靠近而產生，而非因為 Upd-like

之間有交互作用，而導致實驗結果誤判。為了同時在果蠅體內表達

GFP-N及GFP-C，因此在UAS序列之後分別接上GFP-N及GFP-C (圖

二)。將這兩種綠螢光蛋白質的片段嵌入果蠅體內，成為轉殖果蠅，

結果兩種綠螢光蛋白質的片段皆得到七個以上的獨立轉殖株。

利用上述帶有綠螢光蛋白質片段的 Upd-like，我觀察 Upd-like

之間是否會形成同雙體，利用 ey-GAL4 在眼碟中未分化的細胞以及

唾液腺分別表達 Upd-GFP-N/ Upd-GFP-C、Upd2-GFP-N/ Upd2-GFP-C

以及 Upd3-GFP-N/ Upd3-GFP-C (圖二)。讓果蠅於 29°C 下發育，果

蠅生長至三齡幼蟲時分別觀察眼碟及唾液腺。結果發現 Upd-like 之間

在眼碟及唾液腺皆會形成同雙體 (圖九)。當在眼碟未分化細胞及唾

液腺同時表現 Upd-GFP-N 及 Upd-GFP-C，眼碟中會在囊泡上有明顯

的綠螢光訊號 (圖九 A)，顯示 Upd 會在囊泡內形成雙體。除此之外

在許多細胞質的位置也有綠螢光訊號 (圖九 A)，推測 Upd 也會在細

胞質形成雙體。在唾液腺中則觀察到在細胞質及靠近內腔 (apical) 的

地方上有綠螢光訊號，推測在唾液腺中，Upd 會在細胞質及靠近內腔

(apical) 處形成同雙體 (圖九 B)。當在眼碟未分化細胞及唾液腺同時

表現 Upd2-GFP-N 及 Upd2-GFP-C，在眼碟及唾液腺的細胞交界及唾

液腺中的細胞質有綠螢光產生，表示 Upd2 會在細胞交界處形成同雙

49

體 (圖九 C, D)。在眼碟未分化細胞及唾液腺同時表現 Upd3-GFP-N

及 Upd3-GFP-C，觀察是否 Upd3 在果蠅體內會形成同雙體，結果在

眼碟中在不特定的位置會產生許多囊泡，且許多囊泡上有綠螢光，推

測 Upd3 會在囊泡內形成同雙體 (圖九 E)。觀察唾液腺，則在細胞質

及內腔有綠螢光，且在靠近內腔的細胞交界上有較強的綠螢光產生

(圖九 F, F’, F’’)。若在果蠅未分化的眼碟中表達 GFP-N-upd3 及

GFP-C-upd3，在囊泡 (圖九 G’, G’’)中有綠螢光訊號產生。在唾液腺

表達 GFP-N-upd3 及 GFP-C-upd3，在細胞質、細胞交界 (圖九 H’’)

以及靠近內腔的細胞交界處 (圖九 H’) 皆有綠螢光產生。總結以上

的結果，Upd、Upd2 以及 Upd3 在眼碟及唾液腺中會在不同的地方形

成雙體。在眼碟中，Upd 及 Upd3 會在不特定的囊泡中形成同雙體，

Upd2 則在細胞交界處形成同雙體。在唾液腺中，Upd 及 Upd3 會在

細胞質及靠近內腔的細胞交界形成同雙體，不僅如此 Upd3 會在細胞

交界處形成同雙體，Upd2 則會在細胞交界處形成同雙體。

接著測試 Upd-like 蛋白質是否會形成異雙體。在眼碟中未分化的

細胞以及唾液腺分別表達 Upd-GFP-N/ Upd2-GFP-C、Upd-GFP-N/

Upd3-GFP-C以及Upd2-GFP-N/ Upd3-GFP-C。當同時表現Upd-GFP-N

及 Upd2-GFP-C 時，在眼碟會有囊泡產生，並且在囊泡中有綠螢光

(圖十 A, A’, A’’)，顯示 Upd 與 Upd2 會在囊泡中形成雙體。在唾液腺

50

中，在細胞交界有許多綠螢光，少部分細胞質有綠螢光產生 (圖十

B)，顯示Upd與Upd2會在細胞交界形成雙體。當同時表現Upd-GFP-N

及 Upd3-GFP-C 時，在眼碟中有囊泡產生且其中有綠螢光 (圖十 C,

C’, C’’)，推測 Upd 與 Upd3 會在其中形成異雙體。在唾液腺中則大多

在細胞質並且少部分在細胞交界形成異雙體 (圖十 D)。當同時表現

Upd2-GFP-N 及 Upd3-GFP-C 時，眼碟中的 Upd2 與 Upd3 會在細胞

交界處形成異雙體 (圖十 E, E’)，在唾液腺中則會有許多在細胞質、

細胞交界及與內腔形成異雙體 (圖十 F, F’’)。總和以上的結論，

Upd/Upd2 以及 Upd/Upd3 在眼碟的囊泡內會形成異雙體，在唾液腺

則會在細胞質與細胞交界形成異雙體。Upd2/Upd3 在眼碟中會在細胞

交界處形成異雙體，在唾液腺則在細胞質、細胞交界及與內腔形成異

雙體。

在果蠅眼睛發育過程中，單獨或同時表現不同組合的upd-like會造成

不同的影響

在果蠅發育過程中，當不同upd-like失去功能時會對果蠅胚胎、

幼蟲發育及成蟲免疫反應造成影響 (Arbouzova and Zeidler, 2006;

Hombria and Brown, 2002; Luo and Dearolf, 2001)。Upd以及Upd3可透

過Jak/STAT訊息傳遞鏈的來調控眼睛大小 (Tsai and Sun, 2004；黃鈺

51

婷, 2009, 碩士論文)。先前研究發現在眼碟未分化的細胞大量表達

Upd-like會造成果蠅眼睛變大(圖十一 A-C)。顯示Upd-like對果蠅眼睛

發育扮演重要的角色。

從先前已知Upd-like在睪丸及眼碟中表現位置重疊或相近(附圖

二)，從我的實驗中觀察到Upd-like利用共同免疫沉澱法在S2細胞株，

以及利用雙分子互補法在果蠅體內會形成同雙體及異雙體。且在果蠅

單獨或同時表現不同組合的upd、upd2或upd3會對睪丸的發育造成不

同的影響(附圖三 F-H)。所以我想進一步觀察不同組合的Upd-like是

否會對果蠅複眼發育有不同的影響。

ey-GAL4表達於胚胎及幼蟲眼碟中未分化的細胞，利用ey-GAL4

分別表達upd、upd2及upd3後觀察成蟲的複眼有不同的外表型，在25

°C下表達upd會使果蠅眼睛的腹背軸(dorsal-ventral axis)明顯變長(圖

十一 A，表一)。在25°C下(圖十一 B，表一)及29°C下(data not shown)

表達upd2則果蠅眼睛並沒有明顯的改變。然而於29°C中在眼碟未分

化細胞表達Upd3，果蠅眼睛嚴重的往外增生(圖十一 C，表一)。

dpp-GAL4在果蠅幼蟲時期眼碟的後端邊緣(posterior margin)及15個

成蟲盤(imaginal disc)包括皆有表達。利用dpp-GAL4分別表達upd、

upd2及upd3成蟲有不同的外表型，在25°C中利用dpp-GAL4表達upd

果蠅會使腳的發育不全，使果蠅無法爬出蛹外成為成蟲，死於接近成

52

蟲的成蛹果蠅(pharate adults)。若於17°C中利用dpp-GAL4表達upd大

部分果蠅仍死於成蛹時期(pharate adults)只有少數果蠅可生長至成

蟲，成蛹果蠅(pharate adults)及成蟲的果蠅眼睛會變大 (圖十一 D，

表一)。在25°C中利用dpp-GAL4表達upd2與upd3則果蠅可存活且複眼

變大 (圖十一 E, F，表一)。GMR-GAL4表達於三齡幼蟲眼碟正在分

化的細胞，利用GMR-GAL4分別表達upd及upd3會使果蠅眼睛有大眼

的外表型 (圖十一 G, I，表一)，然而表達upd2則果蠅複眼大小沒有

改變(圖十一 H，表一)。

在29°C中利用ey-GAL4同時表達upd及upd2在果蠅眼睛未分化的

細 胞 會 使 果 蠅 眼 睛 腹 背 軸 (dorsal-ventral axis) 與 前 後 軸

(anterior-posterior axis) 皆明顯變長 (圖十一 J)，然而只表現upd只使

果蠅眼睛的腹背軸 (dorsal-ventral axis) 明顯變大 (圖十一 A)，表現

upd2果蠅眼睛並無顯著的改變 (圖十一 B)。於25°C中利用ey-GAL4

同時表達upd-GFP及upd3，果蠅大多死於成蛹時期，少數成蟲果蠅眼

睛變大，並且頭頂發育不正常且小眼數減少 (圖十一 K)。在果蠅眼

睛的未分化細胞中同時表達Upd2及Upd3會使果蠅眼睛變大 (圖十一

L)，但是在未分化的細胞單獨表達Upd2果蠅眼睛則無明顯的改變 (圖

十一 B)，而單獨表達Upd3會使果蠅眼睛嚴重往外增生會使果蠅眼睛

嚴重的往外增生 (圖十一 C)。

53

討論

不同醣化形式的Upd-like可能會影響與其他Upd-like交互作用

從我的實驗結果發現，Upd-like不同的醣化形式可能會影響與其

它Upd-like交互作用的親和力。在Upd3與Upd及Upd2形成異雙體的部

分，利用anti GFP的抗體將Upd-GFP及Upd2-GFP免疫沉澱，偵測Upd3

分子量發現，大多Upd3與之交互作用的分子量接近43 kDa，然而大多

Upd3與GFP-Upd3交互作用的分子量介於43 kDa及55 kDa。推測低度

醣化的Udp3較容易與Upd及Upd2形成異雙體，高度醣化的Upd3較易

形成同雙體。在先前研究也提出，細胞激素(cytokine)醣化的有無可能

會正向或負向影響其與其他分子交互作用的能力，像是影響細胞激素

與其受體或細胞外基質交互作用 (Opdenakker et al., 1995) 。

標示蛋白質接在Upd3的C端會影響Upd3的部分功能

Upd3在眼碟中是分泌性蛋白質，我的實驗中也證明Upd3是醣化

蛋白質。先前實驗室發現利用GMR-GAL4表達upd3 cDNA於果蠅幼蟲

正在分化的眼碟中，能夠使果蠅眼睛變大。然而將GFP接在Upd3的C

端，利用GMR-GAL4表達Upd3-GFP無法使果蠅眼睛變大(Yu-Ting

Chiu)。並且在我的實驗中也發現，以GMR-GAL4表達Upd3-GFP-N也

無法使果蠅眼睛變大。這顯示在Upd3蛋白質的C端加上GFP或GFP-N

54

時，會干擾UPd3的結構與功能。但利用dpp-GAL4表達Upd3-GFP-N

於果蠅幼蟲眼碟的後端邊緣能夠使眼睛變大，表示Upd3-GFP-N仍具

有Upd3的部分功能。在本實驗室發現，利用GMR-GAL4表達Upd3於

果蠅幼蟲能夠使眼碟1st mitotic wave及2nd mitotic wave細胞增生的數

目增加 (黃鈺婷, 2009, 碩士論文)。由於GMR-GAL4表現於正在眼碟

凹溝後端正在分化的細胞，而且1st mitotic wave位於未分化的細胞，

推測Upd3可分泌出細胞後位移到1st mitotic wave影響其增生。所以我

推測表達Upd3-GFP及Upd3-GFP-N於正在分化的細胞無法使眼睛變

大的原因為Upd3-GFP及Upd3-GFP-N移動的能力受到改驗變，使之表

現後無法位移至1st mitotive wave，使Upd3無法促使細胞增生。但將

GFP-C 接在 Upd3 的 C 端，無論用 GMR-GAL4 或 dpp-GAL4 表達

Upd3-GFP-C皆可使果蠅眼睛變大，推測是因為GFP-C的胺基酸序列

不影響Upd3的結構與功能。

Upd-like蛋白質交互作用可能的區域

比對Upd、Upd2及Upd3的胺基酸序列發現，其胺基酸的相同度

及相似僅為7.3%與24% (黃鈺婷, 2009, 碩士論文)。但其序列上有一段

約77個胺基酸極為相似，相同度及相似度為23%及52.6%，稱之為”Upd

區域”，此Upd-like區域在果蠅中12個物種也皆有保留的區域。推測此

55

Upd區域非常重要，可能使Upd、Upd2及Upd3具有相似的功能，例如

可幫助Upd-like與其受體交互作用。除此之外，在我的實驗結果中，

無論在S2細胞株中利用共同免疫沉澱，或者在果蠅體中利用雙分子螢

光互補測試法皆發現Upd-like能夠形成同雙體或異雙體，所以推測

Upd區域可能與Upd-like交互作用有關。為了印證Upd區域是否與

Upd-like能夠形成同雙體或異雙體有關。本實驗室分別將Upd-like中去

除Upd區域以及Upd區域之後的序列，觀察是否Upd區域會影響

Upd-like之間的交互作用。

在果蠅體內Upd-like交互作用的位置受到調控

在表皮細胞這個有極性的組織中Jak/STAT訊息傳遞鏈成員的分

佈會受到調控(Sotillos et al., 2008)。在呼吸管末端的出口及後腸，

Dome和Jak位於細胞頂端(apical)以限制訊息傳遞的方向，在胚胎時期

的表皮細胞STAT的位置也大多聚集於細胞頂端的兩側以增加訊息傳

遞的速率(Sotillos et al., 2008)。在我的實驗結果發現在唾液腺這個有

極性的組織中Upd/Upd、Upd3/Upd3及Upd2/Upd3交互作用的位置分

佈於細胞頂端附近，推測Upd-like交互作用的分佈也是受到調控。

果蠅中Jak/STAT訊息傳遞練可能與MAPK訊息傳遞鏈有交互作用

已知Dome及Dome-like會形成同雙體，Dome與Dome-like會形成

56

異 雙 體 (Brown et al., 2003) ； Michele Crozatier personal

communication)。在我的模式圖中(附圖四)推測當不同組合的Jak/STAT

訊息傳遞練的受體被活化後由於細胞內的區域不同，除了活化

Jak/STAT訊息傳遞練以外，可能會招攬不同的細胞因子，進而活化不

同的訊息傳遞練一起調控不同的作用。在哺乳動物中，Jak/STAT訊息

傳 遞 鏈 會 與 receptor tyrosine kinase (RTK)/Ras/mitogen-activated

protein kinase (MAPK)訊息傳遞鏈有複雜的交互作用(Rawlings et al.,

2004)。其作用的機制是由被磷酸化的受體招攬 (recruit)具有SH2

domain的蛋白質。例如：磷酸化的受體會招攬Shc，進而招攬GRB2

且活化Ras(Heinrich et al., 2003)。以及磷酸化的受體會招攬p85，進而

活化phosphoinositide 3-kinase (PI3K)訊息傳遞鏈(Foster et al., 2003)。

由此活化不同的下游基因，增加Jak/STAT訊息傳遞鏈的複雜程度。 推

測果蠅中Jak/STAT訊息傳遞鏈也可能與MAPK訊息傳遞鏈有交互作

用。

57

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東海大學生命科學系研究所碩士論文。

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