2015 年 第 60 卷 第 4 期：344 ~ 355

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引用格式: 王瑞芳, 高建峰, 陈鹏忠, 等. 基于磷光猝灭的比率式光学氧气探针. 科学通报, 2015, 60: 344–355

Wang R F, Gao J F, Chen P Z, et al. Ratiometric optical oxygen sensor based on phosphorescence quenching (in Chinese). Chin Sci Bull, 2015, 60:344–355, doi: 10.1360/N972014-01042

《中国科学》杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 进 展

基于磷光猝灭的比率式光学氧气探针

王瑞芳①②, 高建峰①, 陈鹏忠②, 陈玉哲②*, 杨清正②*

① 中北大学理学院, 太原 030051;

② 中国科学院理化技术研究所, 光化学转换与功能材料重点实验室, 北京 100190

* 联系人, E-mail: chenyuzhe@mail.ipc.ac.cn; qzyang@mail.ipc.ac.cn

2014-11-04 收稿, 2014-11-17 接受, 2015-01-15 网络版发表

国家自然科学基金(21102155, 21272243, 21222210)和国家重点基础研究发展计划(2013CB933800)资助

摘要 近几十年来, 对氧气的有效检测和识别一直受到研究者的极大关注. 传统的检测方法, 如

滴定法、电流分析法、热致发光法, 存在着许多缺陷, 如响应时间长、灵敏度差和检测过程中消耗

氧气等, 限制了其广泛应用. 由于基态氧是三重态, 能够猝灭三重态分子的发光, 因此基于磷光强

度变化的光学氧气探针克服了传统检测方法的不足, 具有灵敏度高、选择性好、可逆性好、方便

快捷以及无需消耗氧气等优点, 逐渐成为研究热点. 其中比率式的光学氧气探针同时引入对氧气

不敏感的荧光分子作为内标和对氧气敏感的磷光分子作为指示剂分子, 其输出信号依赖于内标分

子和指示剂分子发光强度比例的变化, 能够有效地避免环境和仪器的干扰, 是检测氧气的理想模

式. 而且, 大部分比率式氧气探针的溶液发光颜色会随氧气含量的变化而改变, 从视觉上就可达

到快速检测氧气的目的. 本文从氧气检测机理、探针的构筑以及细胞成像等方面总结了近10年来

比率式光学氧气探针的研究状况, 并对其未来的发展做了一定的展望.

关键词

比率式

光学探针

氧气

磷光

猝灭

氧气是自然界和生物体系的重要组成成分 . 尤

其是对人类而言, 氧气是人体新陈代谢的关键物质,

是生命活动的第一需要. 一般情况下, 氧气在人体内

的含量会在一定范围内正常波动 . 若体内氧气含量

过低, 人体就会启动许多代偿机制, 比如增加血红素

浓度和红血球数量. 但是当体内长期缺氧, 代偿机制

失灵时, 人体生理过程就会发生病变, 导致一些慢性

疾病的发生, 比如癌症等. 研究表明, 若人体组织细

胞的氧气含量低于正常值的65%时, 缺氧组织细胞就

会发生癌变, 这已成为医学界的定论. 因此人体细胞

内氧气的水平被视为人体生理过程和新陈代谢正常

与否的信息标志 , 其定量检测对癌症的预防和及时

发现具有重要意义.

到目前为止 , 关于氧气的检测已有大量文献报

道. 传统的检测方法, 比如温克勒尔滴定法[1]、克拉

克电分析方法 [2]、化学发光法 [3]和热致发光法 [4]等 ,

虽然能够有效检测氧气含量 , 但是存在着响应时间

长、无法持续检测、需消耗氧气以及易被其他气体干

扰等缺陷, 而且检测成本较高, 限制了其广泛应用[5].

光学氧气探针是通过探针分子与被检测物氧气

发生特异性相互作用, 引起探针分子的光学性质(发

光强度、分子寿命等)发生变化, 从而达到检测的目

的. 由于基态氧是三重态, 能够猝灭三重态分子的发

光 , 因此基于磷光强度变化的光学氧气探针克服了

传统检测方法的不足, 具有灵敏度高、选择性好、可

逆性好、方便快捷以及无需消耗氧气等优点, 逐渐成

为研究热点. 根据已有文献, 光学氧气探针按照检测

信号输出模式可分为单一依靠磷光信号强度变化的

氧气探针 [6~11]和比率式的光学氧气探针 [12~16]. 依靠

磷光信号强度变化的氧气探针构筑简单 , 能够定性

和半定量地检测氧气, 但是易受外界环境的干扰, 准

确度较差 . 基于比率式的光学氧气探针是在体系内

345

进 展

同时引入对氧气不敏感的荧光分子(比如香豆素、荧

光素等)和对氧气敏感的磷光分子(比如卟啉铂、联吡

啶钌), 检测信号的输出依赖于荧光和磷光强度的比

例, 从而能够有效避免外界因素的干扰, 大大提高检

测的准确性 , 并且能够直接通过肉眼观测到探针溶

液颜色的变化, 方便快捷.

1987年, Wilson课题组[17]利用基于磷光寿命的可

溶性氧气探针来分析组织中的氧化作用和体内细胞

成像 , 这一工作拉开了基于比率式的光学氧气探针

在生物医学中应用研究的序幕. 此后, 利用各种模型

组装的氧气探针的研究也相继被报道. 到21世纪初,

光学氧气探针得到了迅猛发展 , 其中包括传感器载

体材料的多元化和磷光染料分子的多样化两部分 .

此外影响氧气探针性能的关键因素如发光化合物的

光物理性质以及氧气在载体中的吸附和扩散特性的

研究也取得了长足进步.

近几年来, 研究者从探针材料[18]、对氧气敏感的

磷光染料 [19~21]和氧气探针在生物领域的应用 [22,23]等

几个方面来对氧气探针进行了综述 . 本文主要介绍

近10年来基于金属配合物的比率式的光学氧气探针

的研究状况, 从氧气的检测机理、探针的构筑等方面

加以描述 . 另外基于磷光寿命变化来检测氧气的研

究逐渐兴起, 本文也会适当加以介绍.

1 检测机理

雅布隆斯基图 (图1)描述了氧气检测的理论基

础 [18]. 磷光的产生过程如下 , 受激分子的激发单重

态经过系间窜越到达三重态后, 很快发生振动弛豫,

到达激发三重态的最低振动能级 , 分子在三重态的

寿命较长(10−4~102 s), 所以可延迟一段时间, 然后以

辐射跃迁返回基态. 基态氧气为三重态, 磷光分子的

激发态能与其发生三重态能量转移 , 生成激发单重

态的氧, 从而猝灭磷光分子的发光, 并降低磷光分子

的三重态寿命.

氧气对磷光的猝灭是一个动态可逆的过程, 它并

不会改变磷光分子自身的吸收光谱, 只会降低磷光强

度和寿命, 并与氧气的浓度满足Stern-Volmer方程: I0/I=τ0/τ=1+KS-V[O2],

其中, I(τ)和I0(τ0)分别表示探针在有氧和无氧条件下

的磷光强度(磷光寿命); Stern-Volmer方程常数KS-V则

决定了探针的敏感度; [O2]表示样品中氧气的浓度 ,

有些情况下, 氧气浓度[O2]可用氧气的分压PO2来表

图 1 (网络版彩色)雅布隆斯基图[18]. S, 单重态; T, 三重态; F, 荧光;

P, 磷光; IC, 内转换; ISC, 系间窜越; VR, 振动弛豫; E, 能量 Figure 1 (Color online) Jablonski diagram[18]. S, singlet state; T, triplet state; F, fluorescence; P, phosphorescence; IC, internal conversion; ISC, intersystem crossing; VR, vibrational relaxation; E, energy

示, 此时常数KS-V的数值和单位会发生变化. 理论情

况下, I0/I(T0/T)与氧气浓度[O2](PO2)满足线性关系.

2 基于磷光猝灭的比率式光学氧气探针的

构建

比率式光学氧气探针是将对氧气敏感的磷光分

子和对氧气不敏感的荧光分子通过化学键连接或者

物理掺杂的方式结合在一起 , 同时激发荧光分子和

磷光分子, 荧光和磷光分属于不同的波段, 不同浓度

的氧气对磷光染料的猝灭程度不同 , 而荧光染料却

不受氧气的影响 . 通过荧光强度和磷光强度比值的

变化, 达到对氧气定性和定量的检测. 比率式光学氧

气探针能够避免仪器自身和外界环境的干扰 , 提高

检测的准确度.

构建比率式光学氧气探针的关键是选择和合成

对氧气敏感的室温磷光分子, 该分子要有较强的磷光

量子产率和较长的磷光寿命. 常用的磷光分子主要有

2类: 一类是芳香稠环的有机小分子, 比如芘、苝、蒽

等, 这类分子通常需要掺杂到聚合物或者环糊精等介

质中, 或者引入重原子来增强系间窜越效应以达到室

温磷光的目的 [24,25]; 另一类为过渡金属配合物(图2),

由于过渡金属的重原子效应, 系间窜越效应较强, 因

此往往具有较高的磷光量子产率, 如过渡金属卟啉化

合物、铱的络合物、钌的络合物、铼的化合物等[26~29].

3 基于磷光猝灭的比率式光学氧气探针的

分类

按照构筑方式的不同 , 基于磷光猝灭的比率式

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图 2 对氧气敏感的染料分子的结构式 Figure 2 Chemical structures of some representative oxygen-sensitive indicator dyes

光学氧气探针大致可以分为以下3大类: (1) 基于小

分子的光学氧气探针 . 该类探针是将荧光分子与磷

光分子通过化学键连接起来或者是具有双发射性能

的单一发光体的一类小分子 , 它们具有对生物体细

胞亲和力强、易于化学修饰等优点, 得到了广泛关注;

(2) 基于聚合物的光学氧气探针. 该类探针是将荧光

分子和磷光分子包裹在聚合物或者二氧化硅纳米颗

粒中. 由于每个颗粒都包含大量的发光体, 具有发光

亮度强、光稳定性好等优点, 而且聚合物可将染料分

子与细胞环境隔离开以达到保护染料分子的作用 ;

(3) 基于量子点或纳米晶的光学氧气探针是一类新

型的纳米探针 , 该类探针是在对氧气不敏感的无机

量子点或无机纳米晶的表面负载对氧气敏感的磷光

材料从而达到检测氧气的目的, 具有量子产率高、光

稳定性好等优点.

3.1 基于小分子的比率式氧气探针

2012年, Tobita课题组[30]发展了一种在生物体细

胞和组织中检测氧气的比率式分子探针 . 该探针是

通过刚性四脯氨酸(PrO4)将荧光发光体香豆素(C343)

和磷光发光体铱的络合物(BTP)连接起来(图3(a)), 四

脯氨酸可以有效地将2个发光体分开, 使磷光分子和

荧光分子保持合适的距离 , 从而发生高效的能量传

递以达到增强磷光强度的目的.

通过能量共振转移, 用405 nm的光激发香豆素

(图3(b)), 香豆素可将能量传递给BTP, 在氩气氛围

下可以同时观测到C343和BTP的发光 , 但是在空气

条件下BTP的磷光被明显猝灭 . 将此分子探针用于

Hela 细胞中氧气含量的检测(图4(a)), 激发波长采用

400~410 nm, 在460~510 nm范围内可以观测到香豆

素的蓝色荧光 , 而且在氧气含量分别为20%和2.5%

图 3 (网络版彩色)(a) 分子探针的结构示意图和(b)探针分子在不同

氧气压力下的发射光谱[30]

Figure 3 (Color online) (a) Structures of the probe C343-PrO4-BTP and (b) emission spectra of C343-PrO4-BTP under different oxygen pressure[30]

时, 细胞内香豆素的荧光强度基本保持不变, 这说明

作为内标分子的荧光体对氧气很稳定. 而如图4(b)中

610 nm以上为BTP的磷光成像 , 在氧气含量为2.5%

时发出很强的红光, 而在20%氧气含量时则观察不到

BTP的发光. 细胞实验表明分子探针有望用于活细胞

和组织中氧气的定量检测.

2005年, Vinogradov课题组[31]设计合成树枝状双

光子氧气探针 . 如图S1所示 , 以对氧气敏感的卟啉

铂为探针中心 , 在其周围修饰与之符合能量共振转

移且双光子吸收性能好的荧光分子香豆素和大量的

水溶性基团 . 这种探针结构不仅可以将染料分子与

细胞内的生物大分子隔离开 , 而且可以促进能量转

移, 控制氧气扩散, 并使得整个探针分子的水溶性大

大提升. 利用双光子激发的特点, 激发波长通常位于

近红外区, 光波的穿透能力强, 光子能量低, 减少光

347

进 展

图 4 (网络版彩色)培养在 20%和 2.5%氧气中的HeLa细胞的发光照

片[30]. (a) λem = 460~510 nm; (b) λem > 610 nm Figure 4 (Color online) Luminescence images of HeLa cells incubated under 20% and 2.5% oxygen conditions observed at emission wave-lengths of (a) 460~510 nm and (b) above 610 nm[30]

损伤. 用波长为780 nm的光激发天线分子香豆素, 然

后将能量传递给中心核卟啉铂 , 其磷光强度得到了

明显提高.

2014年, Vinogradov课题组[32]通过双光子寿命显

微镜 , 将基于双光子天线的氧气探针PtTCHP-C307

直接用于检测活鼠骨髓造血干细胞内氧气压强 (图

S2). 相比于之前其他研究者报道过的双光子磷光探

针PtTCHP-C343[33~35], 该探针的重要突破在于更进一

步增强磷光量子产率以达到增强发光的目的, 提高了

天线分子与核之间的能量传递效率, 并且增强响应信

号的动态范围, 从而实现了在细胞中的应用.

除了上述介绍的利用化学键将荧光发光体和磷

光发光体连接起来的比率式氧气探针 , 最近几年发

展起来的具有双发射性能单一发光体的比率式氧气

探针也引起了研究者的极大兴趣 , 虽然这类文献目

前还很少报道 , 但是对其深入研究将为以后在生物

学和环境学中氧气的检测提供良好的理论基础.

2012年, Cheng课题组[36]首次将基于吲哚衍生物

的中性亚铜配位化合物作为比率式氧气探针 . 由于

铜配合物(图S3)的金属-配体间的电荷转移机制表现

出双发射现象 , 而且其配体之间具有完美的协调能

力, 所以表现出更加优越的响应性和可逆性. 除此之

外, 该探针的另一个优点是, 在紫外灯照射时, 探针

在不同含氧氛围中的发光颜色从橘色到蓝色呈现出

明显差异, 所以很容易从视觉上判断.

同年 , Zhao课题组 [37]利用环金属铂配合物的系

间窜越效应发展了具有双发射性质的单一荧光体的

比率式光学氧气探针. 化合物Pt-1和Pt-2(图5(a))都表

现为比例合适且分离很好的荧光 /磷光双发射光谱 ,

它们的单重态和三重态特性以及对氧气的敏感性可

通过发射光谱和发光寿命测得. 从图5(b)和(c)可以看

出化合物的磷光峰被氧气有效猝灭而荧光峰则保持

不变 . 从图 5(d)看出磷光强度变化与氧气含量在

0.0~20%的范围内表现为良好的线性关系 , 根据

Stern-Volmer方程 KSV值为 45.1±1.4 bar−1(1 bar=105

Pa), 说明环金属铂配合物对氧气具有较高的灵敏度.

此分子探针的最大优势在于可以通过合成不同寿命

的配合物来调节氧气探针的动态检测范围 , 而配合

物的寿命可以通过C^N配体的结构来调节.

图 5 (网络版彩色)(a) Pt-1 和Pt-2 的结构式; (b) Pt-1 和(c) Pt-2 对氧气的光谱响应; (d) 比率式线性响应[37]

Figure 5 (Color online) (a) Molecular structures of the Pt(Ⅱ)(acac) complexes Pt-1 and Pt-2; (b), (c) ratiometric luminescence response of Pt-1 and Pt-2 to variation of the oxygen: and (d) the linear correlation between the ratiometric photoluminescence response toward O2 partial pressure[37]

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2013年 , Zhao课题组 [38]利用线性乙炔基铂化合

物的易修饰性, 在其上连有香豆素、萘二酰亚胺、苯

基乙炔化合物等不同配体 , 其中接萘二酰亚胺的化

合物具有双发射现象. 从图S4可以看出在630 nm处

的磷光逐渐被氧气猝灭, 而469 nm处的荧光不受影

响 . 作者还利用不同氧气含量下的荧光和磷光发光

强度比和寿命比分别拟合了线性关系 , 进一步证明

了此双发射氧气探针的稳定性.

2014年, Yang课题组 [39]在铂-乙炔化物Pt(PBu3)2

上接具有较强刚性的非平面性骨架分子-五蝶烯, 得

到具有双发射性能的比率式氧气探针(图S5(a)). 由

于五蝶烯大的π共轭体系所具有的扭转能力和空间位

阻效应减弱了自旋轨道耦合作用 , 从而使得化合物

C1和C2(图S5(b))具有蓝色荧光和绿色磷光的双发射

特性 , 其中磷光寿命长达90~202 μs, 对氧气高度敏

感 , 而C3和C4只有磷光现象 . 为了对比探针在溶液

中和固体中光学特性的差异 , 作者将这类化合物植

入聚甲基丙烯酸甲酯中 , 由于探针的磷光强度逐渐

增加荧光强度逐渐减弱使得磷光寿命增至700 μs, 双

发射性质消失从而得到了对氧气浓度敏感的光学响

应“开关”.

3.2 基于聚合物的比率式氧气探针

尽管小分子氧气传感器具有容易修饰、方便控制

等优点, 但是由于大多数有机分子水溶性较差, 需要

将其先负载到磷脂膜上或者通过繁琐的合成来改变

其水溶性, 然后才能实现在生物体细胞中的应用. 而

基于聚合物的氧气探针具有光稳定性好、发光强等优

点, 并且将染料分子包裹在聚合物内增强了水溶性,

方便实现在生物体内的应用 , 同时聚合物还可将染

料分子与细胞隔离开以达到保护的作用 . Kopelman

课题组 [40~43]做了一系列基于聚合物的比率式氧气探

针的工作, 本文将重点介绍. 2012年以前的其他相关

工作请参考文献[18], 在此不再赘述.

2001年 , Kopelman课题组 [40]首次报道了基于溶

胶凝胶的比率式光学纳米探针 (PEBBLEs). 如图

S6(a)所示, 尺寸为50~300 nm的PEBBLEs包含对氧气

敏感的钌配合物([Ru(dpp)3]2+, λP,max = 610 nm)和对氧

气不敏感的荧光化合物Oregn Green488-右旋糖酐

(λF,max = 525 nm). PEBBLEs具有良好的可逆性和动态

变化范围宽等特点 , 并且可以抑制染料泄漏和光漂

白 . 由于PEBBLEs的小尺寸和惰性矩阵 , 其能够有

效进入活体细胞中并且对细胞的物理和化学干扰较

小 . PEBBLEs对小鼠C6神经胶质细胞的成像效果如

图S6(b)所示: 光照激发探针, 在543和610 nm的波段

处分别显示绿光和红光, 从而达到检测氧气的目的.

基于以上工作 , 2004年Kopelman课题组 [41]通过

溶胶凝胶法发展了一种基于有机改性硅酸盐纳米颗

粒的氧气探针(ormosil PEBBLEs), 如图S7所示 . 该

探针是以有机改性硅酸盐颗粒作为模板 , 在其中嵌

入两对染料 (PtOEP/DiO或者PtOEPK/OEP), 从而达

到比率式检测氧气的目的 . 此类型纳米探针的灵敏

度极高, 在氧气浓度为0~100 ppm(1 ppm=1 mg/L)范

围内, 磷光强度与氧气浓度呈现非常好的线性关系,

对氧气的猝灭响应达到了97%. 除此之外, 由于该类

纳米探针具有高渗透性和疏水性的特点 , 可方便进

入细胞从而用于细胞成像 . 如图S8, 用波长为568

nm的光激发, 共聚焦活细胞照片可以同时观察到磷

光分子和荧光分子的发光 . 尽管此纳米生物学定位

探针(PEBBLEs)在很大程度上超越了以往的氧气探

针, 但是其不足之处就是探针的空间分辨率较低.

2005年Kopelman课题组 [42]发展了一种光纤氧气

探针解决了空间分辨率低的问题. 由核为100 μm和

壳直径为112 μm的全石英多模光纤制成的纤维微传

感器, 通过浸渍法形成约2 μm厚度的光纤化学传感

器膜 . 如图S9所示 , 在具有高渗透性的聚氯乙烯

(PVC)上负载对氧气敏感的八乙基卟啉铂(图S9(a))和

参比染料八乙基卟啉(图S9(b))或者bodipy-马来酰亚

胺(图S9(c)), 然后将其均匀覆盖在光纤末端. 此光纤

传感器对水中溶解氧呈良好的线性响应 , 不但能有

效阻止光漂白, 而且可以提高空间分辨率, 这对在纳

米尺度的多个分析物种同时检测是非常必要的 , 已

经被证实是一种优异的载体材料 , 可以用来检测细

胞间和细胞内的溶氧量.

2010年Kopelman课题组 [43]又发展了基于聚丙烯

酰胺水凝胶的纳米颗粒探针 . 将对氧气敏感的发光

在近红外区的取代四苯基苯并卟啉钯 (λP,max = 800

nm)和对氧气不敏感的花菁染料Alexa 647 dextran

10000 或HiLyte 680 SE(λF,max = 680 nm)一起载入到

聚丙烯酰胺水凝胶(PAA)中, 并在探针表面修饰对肿

瘤组织特异性识别的多肽(TAT或F3), 从而得到尺寸

在30 nm左右的无毒、具有靶向性的比率式氧气探针

(图S10). 纳米探针中的两类染料在正常生理条件下

与氧气浓度呈良好的线性响应. 并且在pH 5~9的变

349

进 展

化范围内以及150 ppb NO(1 ppb=1 μg/L, 下同)或者

9%的牛血清蛋白(BSA)的环境下, 探针不受干扰. 由

于该纳米探针的发光染料处于近红外区 , 并且选择

性和稳定性好 , 可以定量检测正常或低氧状态下的

癌细胞中氧气含量.

基于以上Kopelman课题组一系列开创性的工作,

可以发现基于聚合物的比率式氧气探针的重点在于,

通过聚合物和对氧气敏感的发光材料的多样化来提

高探针的灵敏度、响应性和稳定性. 随后许多基于聚

合物和溶胶凝胶的氧气探针体系逐渐发展起来 . 例

如2011年Schaferling课题组 [44]发展了以聚苯乙烯纳

米颗粒为模板的近红外氧气传感器 . 在聚苯乙烯纳

米颗粒中掺杂对氧气敏感的近红外发光染料四苯基

卟啉(PdTPTBP, λP,max = 800 nm)和对氧气不敏感的荧

光分子花菁染料(λF,max = 670 nm). 如图S11所示, 该

纳米颗粒是一个良好的比率式氧气传感器 , 用635

nm的光将其激发, 800 nm处的磷光发射峰在氧气中

和无氧条件下明显不同, 而670 nm处的发光则基本

一致 . 因为有大量的荧光分子嵌入到PS-NPs中 , 使

得在细胞或肿瘤中可以观察到高亮度的分析信号 .

该氧气探针很容易进入到小鼠肺泡吞噬细胞中 , 并

且其发光强度比与氧气含量呈现良好的线性关系 .

另外 , 聚苯乙烯纳米颗粒经过表面功能化以后可将

此探针应用在体外研究.

从上述报道可以看出 , 基于纳米颗粒的光学氧

气探针的共同特点是将磷光染料包裹在聚合物或二

氧化硅纳米颗粒内部 , 探针的磷光强度随氧气含量

增加而减弱, 而内标分子荧光强度则基本不变. 这样

的探针虽然亮度大 , 但是不足之处就是磷光发光较

弱、灵敏度较低, 所以发展高强度磷光的氧气探针是

近几年大多数科研工作者的方向所在.

目前基于能量传递的氧气探针 , 可以在很大程

度上改善氧气探针的灵敏度 . 例如 , 2009年McNeill

课题组[45]发展了基于能量传递的纳米颗粒氧气探针.

如图6(a)所示, 在作为内标分子的聚芴的2种衍生物

(PDHF或PFO)上掺杂对氧气敏感的八乙基卟啉铂

(PtOEP), 形成直径为25 nm左右的π-共轭聚合物纳米

颗粒(CPdots). 根据能量共振转移原理, 在纳米颗粒

中充当能量给体的聚芴与能量受体的PtOEP之间存

在能量传递. 从荧光寿命图6(b)也可看出掺杂PtOEP

的小球中PFO的荧光寿命大大减弱(从110 ps降至18

ps), 说明二者之间存在高效的能量传递.

PtOEP掺杂的聚芴纳米颗粒的磷光量子产率约

为9%, 这种纳米颗粒的磷光亮度是传统氧气探针染

料的1000倍, 并且是同样尺度、同样染料负载量的二

氧化硅纳米颗粒的5~10倍 . 作者还对单个纳米粒子

图 6 (网络版彩色)(a) CPdots的形成示意图; (b) 染料分子光谱图和荧光寿命图[45]

Figure 6 (Color online) (a) Schematic illustration of the formation of CPdots for oxygen sensing; (b) spectrogram and fluorescence decays of the dyes[45]

2015 年 2 月 第 60 卷 第 4 期

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进行磷光成像(图S12(a)). 在空气环境中 , 单个纳米

粒子的磷光被明显猝灭 , 而在氮气条件下其磷光强

度逐渐恢复 . 这些现象说明了相对于传统二氧化硅

或者其他聚合物纳米颗粒基质, CPdots具有很强的光

捕获能力 , 更进一步表明利用能量传递可以使受体

发光增强, 从而对氧气的响应性更灵敏. 作者最后通

过细胞成像证明基于能量传递的氧气探针有望用于

活细胞和组织中氧气的检测(图S12(b)).

2012年, Papkovsky课题组 [46]发展了一种可用多

种检测模式对细胞内的氧气进行检测和成像的新型

磷光传感器MM2. 该探针是将磷光分子PtTFPP和荧

光分子聚芴(PFO)掺杂到阳离子聚合物RL-100形成的

纳米颗粒中(图S13(a)). 由于PFO作为FRET机制的能

量给体及其双光子天线效应, MM2具有极高的亮度,

并且其毒性低、渗透性好, 能有效进入细胞中. MM2

可通过发光强度的比率式变化和磷光寿命变化两种

检测模式达到对细胞内氧气的有效检测 . 如图

S13(b), 随着细胞内氧气含量变化, MM2探针中PFO

的发光强度(410~460 nm)基本稳定 , 而PtTFPP的发

光明显变化. 在21%~0的氧气含量范围内, 随着细胞

内氧气含量逐渐减少 , 探针的寿命逐渐增加 (图

S13(c)). 相比于大多数氧气探针, MM2具有传统氧气

探针的优点, 诸如合成简单、纳米颗粒光稳定性好、

发光强等 , 其突破之处在于对不同的检测平台具有

良好的兼容性 , 从最简单的荧光光谱到复杂的活细

胞成像和荧光寿命显微镜成像 , 在定量检测细胞内

氧气含量时 , 它们都提供了优越的分析性能和可靠

准确的数据.

最近Papkovsky课题组[47]发展了一种新型具有细

胞穿透性的阴离子磷光纳米颗粒探针. 如图S14所示,

在阴离子聚合物PMMA-MA上负载PtTFPP和PFO,

形成的纳米颗粒探针具有极高的细胞着色效率和细

胞穿透能力. 这种探针不但有利于检测不同细胞、组

织中的氧气含量 , 而且有利于对三维细胞组织模式

中的氧气进行高分辨成像 . 该探针的设计和研究对

未来一些生物体组织中设计药物探针分子和传输系

统提供了良好的平台.

2014年, Zhao课题组 [48]首次报道了一系列基于

铱配合物和聚芴的半导体聚合物碳点(CPdots), 它既

是一种比率式又是比色式的氧气传感器(图7(a)), 可

用于细胞内氧气的检测和光动力治疗 . 将铱配合物

连接到聚芴主链上制备成的聚合物碳点 , 具有粒径

小(小于10 nm)、光稳定性好、生物兼容性强等特点,

并且从聚芴到铱配合物能发生高效能量传递 , 有利

图 7 (网络版彩色)探针WPF-Ir8 的结构式和性能检测[48]. (a) 聚合物碳点CPdots的结构式; (b) 探针WPF-Ir8 在不同氧气压力下的光谱图; (c)

WPF-Ir8 在不同饱和气体中的发光寿命以及发光照片 Figure 7 (Color online) (a) Chemical structures of phosphorescent CPdots; (b) PL spectra of WPF-Ir8 under different oxygen pressures; and (c) fluo-rescence decays and emission images of WPF-Ir8 saturated with nitrogen, air and oxygen[48]

351

进 展

于 氧 气 的 检 测 和 细 胞 成 像 . 如 图 7(b) 所 示 , 将

WPF-Ir8置于PBS缓冲溶液中, 630 nm处铱配合物的

磷光强度随着氧气含量增加而逐渐减弱 , 磷光寿命

也有着明显的降低. 并且CPdots溶液在氮气、空气和

氧气的条件下显示不同的颜色 , 可以通过肉眼直接

观测(图7(c)).

该探针具有极低的生物毒性 , 可以穿过细胞膜

进入细胞质 , 基态氧与铱的络合物经过三重态能量

转移得到单重态氧, 1O2可以有效诱导肿瘤细胞死亡

从而达到光动力学治疗癌症的目的. 因此, 该研究为

设计生物传感器、细胞成像和生物治疗等多功能聚合

物纳米颗粒提供了一个良好的平台.

综上所述 , 该类探针实现了从将两种染料分子

包裹在聚合物中到选用发光的聚合物作为内标分子

这一重大改变, 使得氧气探针越来越简单高效. 聚合

物如聚苯乙烯、聚酯纤维、硅树脂、有机改性硅酸盐、

溶胶凝胶、水凝胶、聚芴和聚醚砜等, 广泛应用于染

料封装 , 可将磷光染料与细胞环境隔离开以达到保

护染料的作用, 尤其在选择性、测试范围、响应时间、

生物兼容性等方面具有优异的性能 [49~51]. 因此发展

具有高穿透性、氧气扩散性好且发光的聚合物氧气探

针具有重要的意义.

3.3 基于量子点的比率式氧气探针

尽管有机染料和一些金属配合物广泛应用于光

学探针中, 但是它们仍存在一些缺陷, 比如发射峰较

宽以及光漂白现象 . 近年来逐步发展的基于无机量

子点(QDS)或纳米晶(NC)氧气探针可以弥补这些缺

点. 它们具有高量子产率、光稳定性好、吸收峰宽、

发射峰窄、斯托克位移大、激发波长范围宽等优点.

而且可充当高效率的单光子或双光子能量转移中的

给体, 并且具有可调性和良好的光物理性质, 从而开

启了量子点在生物探针领域的大门.

2009年, Nocera课题组[52]设计了一种以半导体纳

米晶 (N C)作为骨架的氧气探针 , 如图8所示 , 在

NCs表面修饰对氧气敏感的多吡啶锇化合物 (NC-

Os(Ⅱ)PP). 由于化合物Os(Ⅱ)PP宽的吸收峰以及发

光处于近红外区的特点使得它成为一个良好的能量

受体. 根据荧光共振能量转移机制, NC与Os(Ⅱ)PP之

间存在着较高的能量转移效率 . 此外 NC具有很大

的 双 光 子 吸 收 截 面 积 , 所 以 可 以 用 近 红 外 区

(600~1000 nm)的光激发NC以达到增强Os(Ⅱ)PP发

图 8 (网络版彩色)纳米晶探针的示意图和在不同氧气压力下的发射

光谱[52]

Figure 8 (Color online) Schematic diagram of nanocrystal sensors and its emission spectrum under different oxygen pressure[52]

光的目的 . 化合物Os(Ⅱ)PP的发光可被氧气猝灭而

NC却不受影响, 所以可以通过光谱和寿命测试定量

检测氧气. 然而根据Stern-Volmer分析, 此纳米晶探

针 对 氧 气 响 应 的 灵 敏 度 在 0~760 Torr(1 Torr =

133.322 Pa, 下同)范围内, 而在生物学测试中要求对

氧气检测的灵敏度在0~160 Torr, 可见此探针的动态

响应范围较高, 无法准确检测生物体的氧气含量, 所

以还需要进一步修饰以达到在生物领域的应用.

量子点虽然具有吸收截面积宽、吸光系数高、尺

寸可调等优点, 但是往往具有一定的毒性. 为解决这

一问题, 通常采用在QDs表面覆盖ZnS或Si等惰性外

壳或者双亲性聚合物表面配体等方法来降低量子点

的毒性 . 在众多的量子点中目前广泛应用在光学氧

气探针的是CdTeQDs. 直径约为2 nm的CdTeQDs发

蓝光, 直径约为6 nm时发红光.

2013年, Nocera课题组[53]设计了通过3组吡啶基

取代的卟啉钯和量子点自组装的超分子纳米传感器.

如图S15, 将卟啉钯修饰在量子点表面, 由于量子点

与卟啉之间具有良好的光谱重叠 , 其能量传递效率

高达67%~94%, 所以无论是基于单光子还是双光子

发射, 量子点具有良好的光捕获天线效应. 由于量子

点对氧气极其不敏感, 又可以作为氧气探针的内标.

相比于2009年该组发展的纳米晶氧气探针 , 此探针

最大的突破在于对氧气压力的响应处于0~160 Torr的

低动态范围 , 这意味着探针对氧气的灵敏度大大

2015 年 2 月 第 60 卷 第 4 期

352

提高.

随后, Nocera课题组[54]又发展了一组基于量子点

的光化学纳米传感器 (图9), 在QDs上修饰不同响应

功能的染料, 分别用来检测pH, 氧气和葡萄糖, 并通

过多光子成像成功用于检测肿瘤微环境中酸度、含氧

量和葡萄糖含量.

4 展望

综上所述 , 最近几年基于光学氧气探针的研究

已取得较快发展 , 这使更多学者对这一类探针的组

装及传感研究产生了浓厚兴趣. 在医药学、细胞生理

学、干细胞技术、基因工程等领域, 氧气探针是一种

不可缺少的研究手段 . 但是目前能够应用于活体细

胞中的探针还是非常少 , 而且检测灵敏度和响应速

度仍不太理想 , 这也在一定程度上限制了氧气探针

的广泛研究 . 预计今后该方面的研究热点可能集中

在以下几方面: (1) 对氧气探针的组装类型进行深入

开展, 来构建更多具有生物相容性、分析性能好和灵

活性强的新型光学探针; (2) 对氧气探针的性能做深

图 9 (网络版彩色)量子点光学传感器的检测示意图以及多光子

成像[54]

Figure 9 (Color online) Schematic diagram and multiphoton imaging of the quantum dot optical sensors[54]

入研究, 深入地认识和了解探针的结构、性质和检测

性能之间的关系 , 为检测氧气提供帮助和启发 ; (3)

扩展氧气探针的应用平台 , 比如 , 氧气探针在电子

学、纳米材料、细胞和组织工程、再生医学等领域的

灵活结合和构筑. 预计在未来的5~10年里, 随着光学

氧气探针的进一步发展 , 其在生物领域中的实际应

用将会得到更大突破.

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Ratiometric optical oxygen sensor based on phosphorescence quenching

WANG Rui-Fang1,2, GAO Jian-Feng1, CHEN Peng-Zhong2, CHEN Yu-Zhe2 & YANG Qing-Zheng2 1 Department of Chemistry, North University of China, Taiyuan 030051, China; 2 Key Laboratory of Photochemical Conversion and Optoelectronic Materials, Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of

Sciences, Beijing 100190, China

Molecular oxygen plays a pivotal role in various biological, chemical and environmental reactions, thus detection of oxygen has attracted much attention. Traditional methods of sensing oxygen including classical Winkler titration, electroanalysis, chemiluminescence and thermoluminescence suffer from limitations such as relatively long response time, oxygen consumption during the sensing process and poor selectivity. The ground state of oxygen is a triplet state, so oxygen can quench the long-lived triplet phosphorescence of luminophores. Optical sensors to detect oxygen through phosphorescence have become a very active research field because of their good sensitivity and selectivity, full reversibility, simplicity, suitability for real-time measurements and minimal consumption of oxygen during measurements. Common detection modalities in optical oxygen sensing include phosphorescence intensity, ratiometric and lifetime measurements. Ratiometric intensity measurements at two different wavelengths allow more reliable detection than at a single wavelength because oxygen responses depend on the ratio of the oxygen sensor and reference luminescent signals. In addition, most ratiometric optical oxygen sensors exhibit a perceivable color change, which is useful for rapid visual sensing. This review focuses on the mechanism of oxygen sensing, material designs for ratiometric sensors and cell imaging. The future development of oxygen sensors is also discussed.

ratiometric, optical sensor, oxygen, phosphorescence, quenching

doi: 10.1360/N972014-01042

355

进 展

补充材料

图 S1 双光子吸收磷光氧气探针的示意图

图 S2 氧气探针 PtTCHP-C307 的结构式

图 S3 中性铜配合物的结构式

图 S4 铂乙炔基化合物的结构式以及对氧气的光谱响应和比率式线性响应图

图 S5 铂化合物 C1~C4 的结构式以及 C1 和 C2 对氧气的光谱响应图

图 S6 PEBBLEs 在不同气体状态下的发射光谱图和携带 PEBBLLEs 的细胞共聚焦图像

图 S7 PtOEP/DiO 和 PtOEPK/OEP ormosil PEBBLEs 在不同氧气浓度下的发射光谱图

图 S8 载有 PtOEPK 纳米探针的细胞共聚焦图像

图 S9 组成纤维氧气探针的分子结构式和探针示意图

图 S10 载有染料的聚丙烯酰胺水凝胶(Cov-AFP-3)在不同溶氧量下的发射光谱图

图 S11 聚苯乙烯纳米颗粒氧气探针(Ox-PS-NPs)在纯氧和无氧条件下的发射光谱图

图 S12 单个聚合物纳米颗粒(CPdots)在氮气和氧气中的磷光成像图以及将 CPdots 植入巨噬细胞的磷光成像图

图 S13 探针 MM2 的组成结构以及标记 MM2 的小鼠细胞在不同氧气浓度下的发射光谱图和磷光寿命显微镜图

图 S14 阴离子探针的组成结构式

图 S15 自组装的卟啉钯量子点与氧气作用的示意图

本文以上补充材料见网络版 csb.scichina.com. 补充材料为作者提供的原始数据, 作者对其学术质量和内容负责.