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Detector de fluorescencia ACQUITY

UPLCGuía de inicio rápido

71500142403_ES / Revisión B

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Marcas comerciales

ACQUITY UPLC, UPLC, Millennium, PIC y Waters son marcas registradas, y ACQUITY, busLAC/E, PowerStation y “THE SCIENCE OF WHAT’S POSSIBLE” son marcas comerciales de Waters Corporation.

Micromass es una marca registrada y MassLynx es una marca comercial de Micromass Ltd.

Phillips es una marca registrada de Phillips Screw Company.

TORX es una marca registrada de Textron Corporation.

Otras marcas registradas o comerciales pertenecen exclusivamente a sus respectivos propietarios.

Comentarios del cliente

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Contacto con Waters

Contactar con Waters® para presentar solicitudes de mejora o preguntas técnicas relativas al uso, el transporte, la retirada o la eliminación de cualquier producto de Waters. El contacto puede hacerse a través de Internet, teléfono o correo convencional.

Información de contacto de Waters

Medio de contacto Información

Internet El sitio web de Waters incluye información de contacto de las filiales internacionales de Waters. Visitar el sitio web www.waters.com y hacer clic en Waters Division (División de Waters).

Teléfono y fax Desde EE. UU. o Canadá, llamar al 800 252-HPLC o enviar un fax al 508 8721990.Desde otros países, consultar los números de teléfono y fax de las filiales internacionales en el sitio web de Waters.

Correo convencional Waters Corporation34 Maple StreetMilford, MA 01757EE. UU.

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Consideraciones de seguridad

Algunos de los reactivos y las muestras que se utilizan con los instrumentos y dispositivos de Waters pueden suponer un peligro radiológico, biológico o químico. Se deben conocer los efectos potencialmente peligrosos de todas las sustancias con las que se trabaja. Hay que seguir siempre las buenas prácticas de laboratorio y consultar las recomendaciones del responsable de seguridad de la organización.

A la hora de desarrollar métodos, se recomienda seguir las indicaciones del "Protocol for the Adoption of Analytical Methods in the Clinical Chemistry Laboratory" (Protocolo para la adopción de métodos analíticos en el laboratorio de química clínica), American Journal of Medical Technology, 44, 1, páginas 30 - 37 (1978). En este protocolo se describen las técnicas y los procedimientos de funcionamiento adecuados que son necesarios para la validación del rendimiento tanto de los sistemas como de los métodos.

Consejos de seguridadConsultar el Apéndice A para ver la lista completa de advertencias y precauciones.

Uso de este instrumento

Al utilizar este instrumento, seguir los procedimientos estándar de control de calidad (QC) y las indicaciones que aparecen en esta sección.

Símbolos aplicables

Símbolo Definición

Garantiza que un producto fabricado cumple con todas las directivas aplicables de la Comunidad Europea.

Marca C de cumplimiento de CEM de Australia.

Confirma que un producto fabricado cumple con todos los requisitos de seguridad aplicables en Estados Unidos y Canadá.

ABN 49 065 444 751

iv

Destinatarios y finalidadLa presente guía está dirigida al personal encargado de la instalación, funcionamiento y mantenimiento de los Detectores de fluorescencia (FLR) ACQUITY UPLC®.

Uso previsto del Detector FLR ACQUITY UPLCWaters ha diseñado el Detector FLR ACQUITY UPLC para analizar gran número de compuestos, incluidos indicadores diagnósticos y compuestos controlados terapéuticamente.

CalibraciónPara calibrar los sistemas de cromatografía líquida (LC), se deben seguir métodos adecuados y utilizar por lo menos cinco estándares para generar una curva de calibrado. El intervalo de concentraciones de los estándares debe incluir la gama completa de muestras de control de calidad (QC), muestras habituales y muestras atípicas.

Para calibrar los espectrómetros de masas, se debe consultar la sección de calibración de la guía de funcionamiento del módulo que se desea calibrar. En los casos en los que el módulo no vaya acompañado de una guía de funcionamiento, sino de una descripción general y una guía de mantenimiento, consultar las instrucciones de calibración en la Ayuda en línea del módulo.

Control de calidadSe recomienda analizar de forma sistemática tres muestras de control (QC) que representen los niveles por debajo de lo normal, normal y por encima de lo normal de un compuesto. Los resultados del análisis de estas muestras deben encontrarse dentro de unos límites aceptables y se debe evaluar la precisión entre un día y otro, y entre un análisis y otro. Es posible que los datos obtenidos cuando las muestras de control estén fuera de los límites no sean válidos. Dichos datos no se deben incluir en un informe hasta asegurarse de que el instrumento funciona satisfactoriamente.

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Clasificación ISM

Clasificación ISM: ISM Grupo 1, Clase BEsta clasificación se asigna según la Norma CISPR 11, relativa a los requisitos de los instrumentos industriales científicos y médicos (ISM). Los productos del Grupo 1 contienen energía de radiofrecuencia acoplada conductivamente, generada o utilizada de forma intencional, necesaria para el funcionamiento interno del equipo. Los productos de Clase B se pueden utilizar tanto en instalaciones comerciales como residenciales, y se pueden conectar directamente a la red de suministro eléctrico de bajo voltaje.

Representante autorizado en la CE

Waters Corporation (Micromass UK Ltd.)Floats RoadWythenshaweManchester M23 9LZReino Unido

Teléfono: +44-161-946-2400

Fax: +44-161-946-2480

Contacto: Gerente de calidad

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Contenido

Información sobre derechos de autor (copyright) ........................................ ii

Marcas comerciales .............................................................................................. ii

Comentarios del cliente ....................................................................................... ii

Contacto con Waters ........................................................................................... iii

Consideraciones de seguridad .......................................................................... iv Consejos de seguridad ........................................................................................ iv

Uso de este instrumento ..................................................................................... iv Símbolos aplicables............................................................................................. iv Destinatarios y finalidad ..................................................................................... v Uso previsto del Detector FLR ACQUITY UPLC .............................................. v Calibración ........................................................................................................... v Control de calidad ................................................................................................ v

Clasificación ISM ................................................................................................. vi Clasificación ISM: ISM Grupo 1, Clase B......................................................... vi

Representante autorizado en la CE ................................................................. vi

1 Teoría de funcionamiento .................................................................... 1-1

Teoría de la fluorescencia ............................................................................... 1-2

Detección de fluorescencia ............................................................................. 1-3 Descripción general.......................................................................................... 1-3 Fuentes de excitación ...................................................................................... 1-3 Tipos de fuentes de luz .................................................................................... 1-3 Selección de la longitud de onda de excitación............................................... 1-3 Excitación de la muestra ................................................................................. 1-4 Cubeta de flujo ................................................................................................. 1-4 Unidad de la cubeta ......................................................................................... 1-4

Contenido vii

Medición de la fluorescencia .......................................................................... 1-5 Cuantificación .................................................................................................. 1-5 Selección de la longitud de onda de emisión................................................... 1-5 Tubo fotomultiplicador .................................................................................... 1-5 Barrido.............................................................................................................. 1-5 Funcionamiento multicanal ............................................................................ 1-5 Datos de fluorescencia ..................................................................................... 1-6 Referencias ....................................................................................................... 1-7

Descripción del detector ................................................................................. 1-8 Características ................................................................................................. 1-8

Principios de funcionamiento ........................................................................ 1-9 Componentes ópticos del detector ................................................................... 1-9 Trayectoria de la luz a través del conjunto óptico........................................ 1-10 Calibración del fotomultiplicador.................................................................. 1-12 Sensibilidad del fotomultiplicador ................................................................ 1-12 Filtrar el ruido ............................................................................................... 1-12 Componentes electrónicos ............................................................................. 1-13 Prueba y verificación de la longitud de onda................................................ 1-14

Modos de funcionamiento ............................................................................. 1-14 Modo monocanal ............................................................................................ 1-15 Modo multicanal ............................................................................................ 1-16 Modo 3D.......................................................................................................... 1-16 Modo de espectro lambda-lambda................................................................. 1-17

Barrido de espectro ........................................................................................ 1-17

Alimentación y rendimiento de la lámpara .............................................. 1-18

Optimización automática de la ganancia .................................................. 1-19 Optimización del método ............................................................................... 1-20 Ejemplo de propuesta de desarrollo de un método....................................... 1-21 Garantizar la optimización de la ganancia para cada pico de interés ........ 1-22

Pruebas diagnósticas de puesta en marcha ............................................. 1-23

Desgasificación del eluyente de la fase móvil .......................................... 1-23

Selección de la longitud de onda ................................................................. 1-24

viii Contenido

2 Configurar el detector .......................................................................... 2-1

Antes de empezar .............................................................................................. 2-2

Instalar el detector ........................................................................................... 2-3

Conexión de los tubos del detector ............................................................... 2-5 Instalar la bandeja de recogida para múltiples detectores............................ 2-9

Realizar las conexiones de Ethernet .......................................................... 2-12 Conectores de señales de E/S ........................................................................ 2-12 Conexiones de señales ................................................................................... 2-14

Conexión a la fuente de alimentación ........................................................ 2-16

3 Preparar el detector para su uso ....................................................... 3-1

Puesta en marcha del detector ...................................................................... 3-2 Supervisar los indicadores LED del detector ................................................. 3-4 Panel de control del detector ........................................................................... 3-4

Realizar un análisis .......................................................................................... 3-6 Preparación para el análisis............................................................................ 3-6 Crear el método de prueba .............................................................................. 3-7

Instalar la unidad de la cubeta ...................................................................... 3-8

Apagar el detector .......................................................................................... 3-10 Entre análisis ................................................................................................. 3-10 Apagado durante menos de 72 horas............................................................ 3-11 Apagado durante más de 72 horas................................................................ 3-11

4 Mantenimiento del detector ................................................................ 4-1

Contactar con el Servicio Técnico de Waters ............................................. 4-2

Consideraciones sobre el mantenimiento ................................................... 4-3 Seguridad y manejo ......................................................................................... 4-3 Procedimientos para un funcionamiento adecuado ....................................... 4-3

Mantenimiento sistemático ............................................................................ 4-4

Contenido ix

Mantenimiento del sensor de fugas .............................................................. 4-4 Solucionar errores del sensor de fugas del detector....................................... 4-5 Sustituir el sensor de fugas del detector ........................................................ 4-9

Mantenimiento de la cubeta de flujo .......................................................... 4-11 Enjuagar la cubeta de flujo ........................................................................... 4-12 Enjuague inverso de la cubeta de flujo ......................................................... 4-14 Sustituir la cubeta de flujo ............................................................................ 4-14

Sustituir la lámpara ....................................................................................... 4-17

Sustituir los fusibles ....................................................................................... 4-22

Limpiar el exterior del instrumento .......................................................... 4-23

A Consejos de seguridad ......................................................................... A-1

Símbolos de advertencia ................................................................................. A-2 Advertencias de peligro asociadas con tareas específicas.............................. A-2 Advertencias aplicables a instrumentos, componentes y tipos de

muestras específicos .................................................................................. A-3

Símbolo de precaución .................................................................................... A-5

Advertencias que se aplican a todos los instrumentos de Waters ......... A-6

Símbolos eléctricos y de manejo .................................................................... A-7 Símbolos eléctricos........................................................................................... A-7 Símbolos de manejo ......................................................................................... A-8

B Especificaciones ................................................................................... B-1

Especificaciones del Detector FLR ACQUITY UPLC .............................. B-1

Índice .................................................................................................. Índice-1

x Contenido

1 Teoría de funcionamiento

Este capítulo explica la teoría y la tecnología de funcionamiento del Detector de fluorescencia (FLR) ACQUITY UPLC® de Waters® y describe las características del módulo.

Contenido

Tema Página

Teoría de la fluorescencia 1-2

Detección de fluorescencia 1-3

Medición de la fluorescencia 1-5

Descripción del detector 1-8

Principios de funcionamiento 1-9

Modos de funcionamiento 1-14

Barrido de espectro 1-17

Alimentación y rendimiento de la lámpara 1-18

Optimización automática de la ganancia 1-19

Pruebas diagnósticas de puesta en marcha 1-23

Desgasificación del eluyente de la fase móvil 1-23

Selección de la longitud de onda 1-24

1-1

Teoría de la fluorescencia

La fluorescencia tiene lugar cuando algunas moléculas absorben luz a determinadas longitudes de onda, lo que produce el ascenso de éstas a un estado superior de energía. Al volver a su estado de energía normal, las moléculas "excitadas" liberan la energía absorbida en forma de fotones.

Muchos compuestos orgánicos absorben luz, pero pocos emiten fluorescencia. Los sistemas LC que incorporan detección de fluorescencia identifican con efi-cacia hidrocarburos poliaromáticos, aflatoxinas, vitaminas, aminoácidos, etc. Los métodos de derivatización química amplían la detección de fluorescencia a algunos compuestos no fluorescentes como los pesticidas de carbamato.

La detección de fluorescencia requiere tanto de una longitud de onda de excitación como de una de emisión, logrando obtener un grado superior de sensibilidad. Como resultado, esta técnica es útil para análisis que requieren límites de detección bajos.

Algunas condiciones pueden interferir con la capacidad de un compuesto de emitir fluorescencia, disminuyendo el rendimiento analítico:

• Cambios de pH: la pérdida o ganancia de protones y el incremento o disminución de carga asociado afecta a la estructura electrónica de un analito y puede aumentar o disminuir la fluorescencia.

• Cambios de temperatura: la intensidad de fluorescencia disminuye a medida que la temperatura de la muestra aumenta.

• Cambios de la cantidad de oxígeno disuelto: en algunas moléculas la presencia de oxígeno disuelto disminuye la fluorescencia.

Los detectores de fluorescencia se pueden adaptar para medir la quimioluminiscencia, con la que una molécula sin exposición a ninguna energía de excitación emite una señal de intensidad baja. Este tipo de detección se puede adaptar desactivando la fuente de luz o (como en el caso de este detector) colocando un obturador para impedir que llegue luz de excitación a la cubeta de flujo.

El proceso de detección de fluorescencia comprende una fuente de excitación y los siguientes procesos:

• Filtración de la luz de la fuente.• Excitación de la muestra con luz filtrada.• Captura y filtración de la fluorescencia emitida.• Medición de la fluorescencia emitida.• Amplificación de la señal emitida.

1-2 Teoría de funcionamiento

Detección de fluorescencia

Descripción generalEl detector de fluorescencia de barrido ilumina una muestra con una banda estrecha de luz de gran intensidad. Después mide los niveles de fluorescencia bajos emitidos por la muestra. La luz emitida se filtra, se amplifica y se convierte en señales eléctricas que se pueden registrar y analizar.

Fuentes de excitaciónLa fuente de energía habitual usada en la detección de fluorescencia es una lámpara que proporciona un espectro intenso y estable de luz en las regiones ultravioleta (UV) y visible. La intensidad de la fluorescencia resultante está directamente relacionada con la intensidad del espectro de excitación. Por este motivo, los detectores de alta sensibilidad usan la fuente de excitación más potente que existe.

Tipos de fuentes de luzEntre las fuentes comunes de luz de excitación de banda ancha figuran las lámparas de arco de xenón y de mercurio-xenón. Las lámparas de xenón son las fuentes preferidas para los detectores de fluorescencia de uso general. La lámpara de arco de mercurio-xenón del Detector FLR tiene la ventaja adicional de concentrar su mayor intensidad en ciertas bandas de emisión.

Selección de la longitud de onda de excitaciónLa longitud de onda de excitación de elección debe ser filtrada de la fuente de luz. Los detectores modernos suelen utilizar un monocromador para este fin.

Un monocromador es un dispositivo regulable que se usa para seleccionar valores de longitudes de onda de un intervalo amplio del espectro. Un monocromador de difracción utiliza una red de difracción que deja pasar solo un pequeño intervalo, o ancho de banda, de longitudes de onda. Moviendo la red de difracción se pueden seleccionar longitudes de onda dentro de un determinado intervalo de longitudes de onda. Un monocromador de difracción deja pasar además fracciones, u órdenes, de una longitud de onda seleccionada. Por ejemplo, si el monocromador se configura para que deje pasar la energía lumínica a 600 nm, deja pasar además energía a la longitud

Detección de fluorescencia 1-3

de onda de segundo orden de 300 nm. Un filtro amplio puede absorber la energía de orden superior producida por un monocromador. Del mismo modo que un monocromador puede seleccionar la longitud de onda de excitación, también puede hacerlo con la de la emisión (energía irradiada). Los detectores con monocromadores de excitación y emisión pueden hacer un barrido manteniendo la configuración fija en un monocromador y cambiando la del otro. Este tipo de funcionamiento es necesario cuando se evalúan mezclas o se analizan estructuras químicas.

Excitación de la muestraLa banda ancha de luz de gran intensidad de la lámpara pasa a través de un filtro o monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda. Esta banda estrecha de luz se dirige después a la cubeta de flujo, donde excita a los analitos al atravesarla. Las longitudes de onda de excitación se corresponden a menudo con la longitud de onda de absorbancia del analito.

Cubeta de flujoLa cubeta de flujo de cuarzo minimiza la cantidad de luz difusa que puede afectar a la medición, y maximiza la señal de fluorescencia. El compartimento de muestras se dispone de tal manera que la energía de fluorescencia se capture en un ángulo perpendicular al haz (lámpara) de excitación. Esta disposición minimiza el efecto de la dispersión de Rayleigh sobre los niveles de luz de fondo.

Unidad de la cubetaEl Detector FLR provisto de una lámpara de mercurio-xenón puede ofrecer una mayor sensibilidad de la que era posible con los sistemas de fluorescencia tradicionales para HPLC. No obstante, el nuevo perfil de energía puede requerir que el espectro de excitación de los analitos se tenga que desplazar significativamente para ajustarse a las bandas de energía de la lámpara de mercurio-xenón, lo cual exige la optimización de un método de detección de HPLC tradicional para utilizarlo con el Detector para ACQUITY. Para determinar los valores óptimos, se puede hacer un barrido de los intervalos de longitud de onda de excitación y emisión utilizando la cubeta y ver el gráfico de espectros en la Consola ACQUITY o en el software Empower utilizando la función gráfica Spectrum λ-λ (Espectro λ-λ).


Medición de la fluorescencia

Para medir la fluorescencia en la cubeta de flujo, el detector tiene que equilibrar la necesidad de buscar una alta selectividad (para distinguir longitudes de onda de fluorescencia muy específicas) con la necesidad de tener una alta sensibilidad (para medir intensidades bajas de fluorescencia).

CuantificaciónLa fluorescencia es lineal a concentraciones bajas, pero puede dejar de serlo a concentraciones altas.

Selección de la longitud de onda de emisiónUn monocromador selecciona la longitud de onda de emisión.

Tubo fotomultiplicador El tubo fotomultiplicador (PMT) produce una corriente proporcional al flujo de fotones emitidos por las moléculas en la cubeta de flujo.

BarridoLos detectores equipados con monocromadores de excitación y emisión pueden hacer fácilmente un barrido de varias longitudes de onda de excitación o emisión. Cambiar la longitud de onda implica cambiar también la configuración del monocromador. Durante un barrido, la configuración de un monocromador se mantiene constante mientras el otro monocromador barre varias longitudes de onda.

Funcionamiento multicanalLos detectores equipados con monocromadores de excitación y emisión pueden cambiar la longitud de onda de las configuraciones de excitación y emisión. En funcionamiento multicanal, los dos monocromadores se mueven rápidamente entre los pares de longitudes de onda seleccionados para producir múltiples trazados de cromatogramas. Múltiples salidas de señales pueden entonces proporcionar información adicional a partir de una única separación.


Datos de fluorescenciaLos detectores presentan sus datos en unidades de intensidad (emisión) o energía de fluorescencia. El Detector FLR también indica la intensidad usando unidades normalizadas para compensar la variabilidad entre detectores individuales y la posible disminución de la intensidad de la lámpara relacionada con el paso del tiempo. Al usar unidades normalizadas, los cambios de ganancia mejoran la relación señal-ruido, pero no cambian la respuesta de los picos, lo que confiere un alto grado de reproducibilidad de las mediciones de las señales fluorescentes.

Unidades de emisión y normalización

El Detector FLR ofrece dos tipos de unidades de señal: emisión y energía. Las unidades de emisión se normalizan a una referencia de agua estándar, y su magnitud es tan independiente de la ganancia del fotomultiplicador (PMT) como sea posible. Se puede compensar los cambios que normalmente influyen en la intensidad de la señal de las mediciones de fluorescencia, como degradaciones ópticas o de la lámpara, renormalizando periódicamente a la referencia de agua estándar. Esta renormalización reduce las variaciones de la intensidad de las señales de fluorescencia de un detector a otro.

La siguiente ecuación sirve para calcular el valor de las unidades de emisión (EU) en cualquier momento (t):

EUt = (Recuentos PMTt / Ganancia.) × (GananciaRaman / RecuentosRaman) × 100

donde

GananciaRaman y RecuentosRaman = valores de la ejecución más reciente de la función de normalización de unidades.

Recuentos PMTt y Gananciast = valores en el momento de la recopilación de datos.

La normalización de las unidades de emisión tiene como resultado un valor de relación de la intensidad de la señal agua/Raman, en Ex 365 nm/Em 416 nm, de 100 unidades de emisión. La señal del espectro de mercurio-xenón no es uniforme a lo largo del intervalo operativo del detector y las longitudes de onda UV bajas pueden degradarse más deprisa que las longitudes de onda de normalización.


Unidades de energía

La alternativa a las unidades de emisión son las unidades de energía, similares a las usadas por los Detectores de fluorescencia HPLC tradicionales. Se correlacionan directamente con la corriente anódica del PMT, con lo que dependen del parámetro de ganancia. Todas las variables instrumentales, como la intensidad de la lámpara, eficiencia óptica y ganancia, influyen directamente en la intensidad de la señal de emisión. Como resultado, las unidades de energía son menos fiables. No obstante, cuando hay que calcular unidades de energía para cumplir con los protocolos establecidos, se utiliza la siguiente ecuación:

EU = Recuentos PMT × K × (Recuentos de referencia0 / Recuentos de referenciat)

donde K escala la máxima señal de fluorescencia detectable a 10000 unidades.

ReferenciasConsultar los siguientes textos para obtener información adicional sobre la detección de fluorescencia:

N. Ichinose, G. Schwedt, F. M. Schnepel y K. Adachi, Fluorometric Analysis in Biomedical Chemistry (Análisis fluorométrico en química biomédica), Capítulo 5, Wiley-Interscience: Nueva York, 1991.

E. S. Yeung, ed., Detectors for Liquid Chromatography (Detectores para cromatografía líquida), Capítulo 5, Wiley: Nueva York, 1986.

W. R. Seitz, en Treatise on Analytical Chemistry (Tratado sobre química analítica), 2ª Ed., P. J. Elving, E. J. Meehan, I. M. Kolthoff, eds., Parte I, Vol. 7, Capítulo 4, Wiley: Nueva York, 1981.

J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy (Principios de la espectroscopia de fluorescencia), Plenum: Nueva York, 1983.

S. G. Schulman, Fluorescence and Phosphorescence Spectroscopy: Physicochemical Principles and Practice (Espectroscopia de fluorescencia y fosforescencia: principios fisicoquímicos y práctica), Pergamon Press: Nueva York, 1977.

J. D. Winefordner, S. G. Schulman y T. C. O’Haver, Luminescence Spectroscopy in Analytical Chemistry (Espectroscopia de luminiscencia en química analítica), Wiley-Interscience: Nueva York, 1972.


Descripción del detector

El Detector FLR ACQUITY UPLC de Waters es un detector de fluorescencia multicanal variable diseñado para aplicaciones con el sistema UltraPerformance LC®.

CaracterísticasEl detector funciona de 200 a 900 nm. Utiliza dispositivos ópticos diseñados con un sistema de iluminación mejorado, optimizado para su funcionamiento en UPLC®. Las siguientes características del diseño incrementan el rendimiento de la óptica y la sensibilidad, lo que da lugar a un aumento global de la relación señal-ruido:

• Altas velocidades de adquisición de datos: garantizan la compatibilidad con los picos estrechos obtenidos en UPLC.

• Pequeño volumen de la cubeta: evita el ensanchamiento de la banda y mantiene la concentración.

• Modo monocanal o multicanal: se puede controlar la fluorescencia a uno o más pares de longitudes de onda diferenciados.

• Referencia de la calibración de erbio integral: asegura la exactitud del valor de longitud de onda.

• Filtro automático de segundo orden: se coloca automáticamente para longitudes de onda de 400 nm o superiores, y se extrae para longitudes de onda de 399 nm o inferiores.

• Visualización del almacenamiento y barrido de espectros: compatible con el barrido, la visualización y la sustracción espectral, además de la funcionalidad estándar de fluorescencia variable.

• Unidades de emisión normalizadas: mejoran la reproducibilidad de un equipo a otro.

• Modo de reposo (inactivo): cierra un obturador para prevenir la degradación de los componentes ópticos.

• Modo 3D: barre de forma dinámica la red de difracción de emisión o la de excitación a lo largo de un intervalo de longitudes de onda seleccionable para controlar la fluorescencia de una serie de longitudes de onda, permitiendo la producción de datos 3D.

• Modo de espectro lambda-lambda: crea un espectro que define la fluorescencia del analito a lo largo de los ejes de excitación y emisión.


Principios de funcionamiento

Para usar el detector de manera eficiente, hay que familiarizarse con su diseño óptico y electrónico, y con la teoría y los principios de su funcionamiento.

• Componentes ópticos.

• Prueba y verificación de la longitud de onda.

• Cubeta de flujo.

• Componentes electrónicos.

Componentes ópticos del detectorLos componentes ópticos se basan en un par de monocromadores regulables e incluyen las siguientes partes:

• Lámpara de arco de mercurio-xenón.

• Dos espejos elipsoidales y un espejo parabólico.

• Obturador, filtro de calibración de la longitud de onda y filtro de segundo orden.

• Ranuras de entrada.

• Ranuras de salida.

• Red de difracción holográfica de tipo blaze, plana y cóncava.

• Tubo fotomultiplicador (PMT).

• Cubeta de flujo de Waters con iluminación axial.

Los siguientes diagramas muestran las trayectorias de la luz a través del conjunto óptico y sus componentes.


Conjunto óptico del monocromador de excitación

Conjunto óptico del monocromador de emisión

Trayectoria de la luz a través del conjunto ópticoEl detector, optimizado para UPLC, muestra un rendimiento superior al usar varios elementos de diseño exclusivo. El novedoso diseño de la cubeta de flujo minimiza la luz de fondo difusa e incrementa la capacidad de detección de señales de bajo nivel. La sencillez de los componentes ópticos minimiza la pérdida de señal e incrementa el rendimiento.

Lámpara de mercurio-xenón

Red de difracción

Espejo parabólico

Ranura de entrada

Rueda de filtros

Cubeta de flujoEspejo elipsoidal Ranura de salida

Tubo fotomultiplicador

Ranura de entrada

Espejo elipsoidal

Máscara de salida de la cubeta de flujo

Cubeta de flujo

Red de difracción

Ranura de salida


Fuente de luz

El detector utiliza como fuente una lámpara de arco de mercurio-xenón de alta intensidad de 150 vatios. La luz emitida pasa a través del monocromador de excitación para iluminar la apertura de la cubeta de flujo. Un espejo elíptico situado detrás de la lámpara, con su centro de curvatura orientado hacia el foco de ésta, recoge la luz.

Monocromador de excitación

El detector utiliza un monocromador para seleccionar las longitudes de onda de excitación apropiadas definidas por su geometría. La red de difracción puede girar rápidamente, dando respuesta a múltiples longitudes de onda de excitación y/o a barridos.

Monocromador de emisión

La luz emitida por la muestra viaja desde la parte superior de la cubeta de flujo a los componentes ópticos de emisión. Éstos están colocados en ángulo recto con respecto a la fuente de excitación para minimizar la posibilidad de que llegue luz difusa al PMT. El monocromador de emisión selecciona las longitudes de onda de emisión apropiadas.

Cubeta de flujo con iluminación axial

El diseño de la cubeta de flujo incorpora una cubeta de cuarzo fundido con iluminación axial.

Cubeta de flujo con iluminación axial

Energía de emisión Ventana de cuarzo

Espejo

Salida de líquidoEspejo

Entrada de líquido

Lente

Energía de excitación


La energía de excitación se concentra en un espejo adaptado geométricamente cuya forma es la opuesta a la de la lente de entrada de la energía de excitación. La energía de excitación se refleja a lo largo del eje de la cubeta de flujo y da la vuelta, duplicando de hecho la longitud de la trayectoria en la cubeta. Este incremento de la longitud de la trayectoria proporciona una sensibilidad superior en comparación con los detectores de fluorescencia tradicionales.

Calibración del fotomultiplicadorLa sensibilidad del detector se controla con el parámetro de ganancia, que incrementa el voltaje del fotomultiplicador (PMT) para amplificar y aumentar su respuesta. La ganancia se consigue controlando el suministro de alto voltaje aplicado al PMT. Después del montaje y la alineación del detector, y siempre que se sustituya el PMT o cualquier tarjeta de circuito integrado, el personal de Waters calibrará los PMT usando una función diagnóstica integrada de mantenimiento.

Sensibilidad del fotomultiplicadorDespués de calibrar el fotomultiplicador (PMT), se debe seleccionar un parámetro de ganancia para él, antes de realizar una inyección cromatográfica. La saturación, que tiene lugar cuando la concentración de la muestra es alta o la fase móvil experimental tiene un fondo alto, siempre es un problema, incluso cuando el parámetro de ganancia del PMT está al nivel más bajo. Por esta razón, el Detector FLR ACQUITY UPLC tiene una función diagnóstica de optimización automática de la ganancia que permite regular la granularidad de la ganancia.

Filtrar el ruidoEl detector utiliza un filtro digital para minimizar el ruido.

Un valor más bajo de la constante de tiempo produce los siguientes efectos:

• Se obtienen picos estrechos con distorsión y tiempo de demora mínimos.

• Los picos muy pequeños se vuelven más difíciles de distinguir del ruido de la línea base.

• Se elimina menos ruido de la línea base.


Un valor más alto de la constante de tiempo produce los siguientes efectos:

• Disminución importante del ruido de la línea base.• Picos acortados y ensanchados.

El software incluye constantes de filtración rápida, normal o lenta en cada frecuencia de datos, apropiadas para aplicaciones de alta velocidad o de alta sensibilidad, respectivamente.

La siguiente figura muestra la relación entre el aumento de la constante de tiempo y los tiempos de respuesta.

Efecto de la constante de tiempo de filtración

Componentes electrónicosLos componentes electrónicos comprenden los siguientes elementos:

• Tarjeta preamplificadora: recopila y procesa las señales analógicas de entrada desde el PMT y el fotodiodo al microprocesador para su posterior acondicionamiento. La señal de referencia y la de la muestra se integran, y la conversión A/D se realiza simultáneamente. Este componente asegura el mejor rechazo del ruido de modo común en los dos haces de luz, dando lugar a una línea base limpia.

• Tarjeta personalizada: recibe señales de entrada de la tarjeta preamplificadora y de eventos externos. Además permite el control de los subsistemas de posicionamiento óptico y de la fuente de alimentación de la lámpara.

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Tiempo (minutos)

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0 seg.

1 seg.

2 seg.


• Tarjeta CPU: contiene el procesador de señales digitales, los puertos de conexión, la RAM no volátil (con batería) y la RAM de tipo flash en la que está el firmware.

• Interfaz de comunicación Ethernet: permite al detector comunicarse con el software del sistema de tratamiento de datos.

• Fuente de alimentación de la lámpara: permite el funcionamiento estable de la lámpara de mercurio-xenón.

• Fuente de alimentación de corriente continua (CC): proporciona voltaje para los circuitos analógicos y digitales del detector.

Prueba y verificación de la longitud de ondaLa lámpara de arco de mercurio-xenón y el filtro de erbio integral muestran picos en el espectro de transmisión a longitudes de onda conocidas. En la puesta en marcha el detector espera 5 minutos a que la lámpara de mercurio-xenón se caliente y se estabilice. El detector verifica la calibración comparando las ubicaciones de estos picos con los datos de calibración almacenados en la memoria. Si los resultados de esta verificación difieren de la calibración almacenada en más de ± 2.0 nm, el detector muestra un mensaje de fallo de verificación de la longitud de onda. Este mensaje indica que es necesaria una calibración manual de la longitud de onda. El detector verifica, y no recalibra, para evitar errores que puedan tener lugar si la cubeta de flujo contiene materiales residuales. La calibración requiere una cubeta de flujo limpia y una fase móvil transparente. Se puede iniciar una calibración manual de la longitud de onda en cualquier momento para sustituir la información de calibración anterior con nuevos datos.

Nota: la especificación de exactitud de la longitud de onda combinada del detector es de ± 3.0 nm; en cambio, la exactitud de la longitud de onda de cada red de difracción se mantiene en ± 2.0 nm.

Cuando el detector funciona constantemente hay que realizar una verificación semanal de la longitud de onda, bien apagándolo y encendiéndolo de nuevo, o mediante la función de calibración de la longitud de onda de la consola. Las pruebas de verificación requieren 5 minutos de tiempo de calentamiento de la lámpara para que ésta se estabilice.

Modos de funcionamiento

El detector funciona en los modos monocanal y multicanal, permite el barrido de espectros usando una cubeta de flujo y ofrece las funciones de Difference plot (Gráfico de diferencias) y MaxPlot (Cromatograma de máxima intensidad).


Modo monocanalEl detector funciona por defecto en el modo monocanal, controlando un solo canal para un par de longitudes de onda de excitación/emisión. Se puede especificar la longitud de onda de excitación entre 200 y 890 nm en el canal A.

En el modo monocanal, el detector coloca de forma automática el filtro de segundo orden para longitudes de onda de excitación de 400 nm y superiores, y lo retira para longitudes de onda inferiores a 399 nm. El filtro de segundo orden es un filtro óptico que impide que la luz UV no deseada, que puede interferir con la detección de fluorescencia a partir de 400 nm, llegue a la red de difracción.

Seleccionar la velocidad de adquisición adecuada

Para definir bien la forma de un pico, éste debe contener un número suficiente de puntos. Por este motivo, la definición entre picos se puede perder a velocidades de adquisición muy bajas. El software Empower utiliza el número del punto de adquisición de datos más próximo al tiempo de finalizaciónel del pico, menos el número del punto de adquisición de datos más próximo al tiempo de inicio, para calcular el valor Points Across Peak (Puntos por pico) para cada pico integrado en el cromatograma.

Indicación: el valor Points Across Peak (Puntos por pico) aparece en la tabla Peaks (Picos), en la parte inferior de la ventana principal Review (Revisión). Si el campo Points Across Peak (Puntos por pico) no es visible, hacer clic con el botón derecho del ratón en cualquier lugar de la tabla, y después hacer clic en Table Properties (Propiedades de la tabla). Hacer clic en la ficha Columns (Columnas) y después desplazarse hacia abajo para buscar el campo Points Across Peak (Puntos por pico). Quitar la marca de la casilla de verificación y hacer clic en OK.

Si el valor Points Across Peak (Puntos por pico) del pico de interés más estrecho es inferior a 25, hay que especificar una velocidad de adquisición superior en el método de instrumento. Si el valor es superior a 50, hay que especificar una velocidad de adquisición más baja en el método de instrumento.

Configurar la velocidad de adquisición al menor valor necesario para adquirir 25 puntos o más a lo largo del pico más estrecho. Las velocidades de adquisición excesivamente altas muestran niveles de ruido más altos.

Modos de funcionamiento 1-15

Modo multicanalEn el modo multicanal, o modo de longitud de onda múltiple, el detector controla dos o más pares de longitudes de onda excitación/emisión. El intervalo de frecuencias de adquisición es reducido, limitando la utilización de este modo a una cromatografía más estándar, en la que los picos no son excesivamente estrechos. Se puede utilizar el modo de longitud de onda múltiple para obtener información adicional sobre un analito ejecutando un gráfico Difference Plot (Diferencias) o MaxPlot (Máxima intensidad). Se pueden seleccionar hasta cuatro longitudes de onda de excitación de 200 a 890 nm y hasta cuatro longitudes de onda de emisión de 210 a 900 nm. Para conseguir la mejor relación señal-ruido, ajustar una ganancia que maximice el intervalo dinámico de los componentes electrónicos. Una ganancia demasiado alta sobrecarga el preamplificador, dando como resultado picos planos en la parte superior y una advertencia de calentamiento.

MaxPlot (Cromatograma de máxima intensidad)

El detector permite obtener un gráfico de máxima intensidad (MaxPlot) en modo multicanal. La función de gráfico de máxima intensidad controla la fluorescencia en los pares de longitudes de onda de excitación/emisión seleccionados y marca el valor máximo de la señal de fluorescencia para cada componente de la muestra. El gráfico de máxima intensidad presenta el mayor de los valores de fluorescencia en los canales seleccionados.

Consultar también: Ayuda en línea de la Consola ACQUITY UPLC

Difference Plot (Gráfico de diferencias)

El detector permite obtener un gráfico de diferencias (Difference Plot) en modo multicanal. La función de gráfico de diferencias controla la fluorescencia en los pares de longitudes de onda de excitación/emisión seleccionados por el usuario y traza la diferencia de valor de la señal entre ellos.

Consultar también: Ayuda en línea de la Consola ACQUITY UPLC

Modo 3DEl detector adquiere datos 3D (barridos de excitación o de emisión) y los almacena en archivos de los que se pueden extraer cromatogramas 2D, seleccionar y optimizar selecciones de longitudes de onda para aplicaciones específicas y crear bibliotecas explorables. La resolución suele ser más elevada que los modos de barrido de flujo interrumpido.


Modo de espectro lambda-lambdaUtilizando el modo de espectro lambda-lambda (λ-λ) del Detector FLR se pueden determinar los máximos de fluorescencia para muestras problema y utilizarlos para crear rápidamente métodos cromatográficos tradicionales basados en el tiempo de retención. El modo de espectro λ-λ crea un espectro que define la fluorescencia del analito a lo largo de los ejes de excitación/emisión. En condiciones de flujo estático, el detector barre un intervalo concreto de longitudes de onda de emisión a lo largo de un intervalo también concreto de longitudes de onda de excitación. La fluorescencia se representa así frente a los ejes de excitación/emisión y los resultados aparecen en un archivo de datos.

Las longitudes de onda de excitación aparecen a lo largo del eje que normalmente muestra el tiempo, y sus valores se reducen en un factor de 10 para que queden ajustados en el eje del tiempo. El eje continúa rotulado en "minutos".

Requisito: hace falta una cubeta opcional para poder hacer un barrido en modo lambda-lambda.

Barrido de espectro

El detector se puede usar como fluorímetro para adquirir espectros y almacenarlos como un archivo. La principal diferencia entre este detector y un espectrofotómetro de doble haz radica en que este detector utiliza solo una cubeta de flujo, en vez de un par de cubetas de flujo simultáneas de muestra y de referencia. El detector obtiene un espectro de fluorescencia realizando los siguientes tipos de barrido en la cubeta de flujo:

• Barrido cero: define el espectro de absorbancia de la línea base de un eluyente.

• Barrido de excitación de la muestra: resta el barrido cero, de modo que los resultados mostrados son solo de los espectros de excitación de la muestra.

• Barrido de emisión de la muestra: resta el barrido cero, de modo que los resultados mostrados son solo de los espectros de emisión de la muestra.

Para obtener un espectro de excitación o emisión de una muestra, se debe realizar un barrido cero seguido del barrido de muestras apropiado. Normalmente el barrido cero se realiza con eluyente puro. Un barrido de muestras se realiza habitualmente con el analito disuelto en el mismo eluyente.

Barrido de espectro 1-17

Alimentación y rendimiento de la lámpara

En diseños convencionales de detectores de fluorescencia, la relación señal-ruido del instrumento es directamente proporcional a la entrada de energía de la lámpara en el instrumento. Ésta puede verse afectada por:

• La antigüedad y eficacia de la lámpara.

• Un mantenimiento indebido de los componentes ópticos o de la cubeta de flujo.

• La degradación normal de los componentes ópticos (incluido el PMT).

Los componentes ópticos se degradan lentamente con el paso del tiempo. En los detectores de fluorescencia convencionales, la respuesta se incrementa aumentando la ganancia del PMT. Sin embargo, la respuesta de la muestra varía con el rendimiento de energía. Si la energía de excitación se degrada, también lo hace la respuesta del pico. Si la intensidad de excitación disminuye, la respuesta del pico decrece y el ruido aumenta.

Durante el funcionamiento normal, las lámparas suelen sustituirse cuando la energía de referencia desciende por debajo de un umbral establecido por el usuario. La vida útil de la lámpara depende de las necesidades de rendimiento del ruido.

Indicación: inspeccionar las condiciones generales del detector al sustituir las lámparas.

No se puede predecir con exactitud cuándo disminuirá el rendimiento del detector hasta un nivel inaceptable basándose únicamente en la energía de referencia. Cada análisis del usuario requiere diferentes niveles de sensibilidad. Verificar solo la energía de referencia para evaluar el rendimiento supone que cada lámpara tiene la misma longevidad, los mismos patrones de degradación y las mismas características de salida espectral. Para reducir esta incertidumbre, Waters ha diseñado el detector para que funcione del modo más independiente posible respecto al rendimiento de la lámpara. Una vez que la unidad ha verificado la calibración del monocromador, el instrumento evalúa los niveles de energía en un número de regiones características a lo largo del espectro. El instrumento ajusta el tiempo de integración de los componentes electrónicos frontales para aumentar al máximo la señal en estas regiones. Se pretende así mantener una elevada relación señal-ruido y funcionar con una señal limpia. De esta manera, se elimina prácticamente la sensibilidad del instrumento a la energía de la lámpara como factor importante del rendimiento.


En última instancia, el rendimiento del detector es una función de cada uno de los requisitos de la aplicación. Las mediciones de señal-ruido son la mejor manera de evaluar el rendimiento y establecer los márgenes para unos límites de sensibilidad de funcionamiento aceptables.

El encendido y el resultado aceptable en las pruebas diagnósticas de la lámpara de la fuente del Detector FLR están garantizados durante 1000 horas o 1 año a partir de la fecha de compra, lo que ocurra primero. La Consola ACQUITY UPLC permite registrar el uso de la lámpara e informar de su número de serie.

Optimización automática de la ganancia

El valor del parámetro de ganancia adecuado del PMT es aquél que incrementa la señal en el convertidor interno de señal analógica a digital sin sobrepasar su límite potencial. Si se especifica una ganancia muy elevada, las emisiones de fluorescencia sobrecargan los componentes electrónicos de captura de la señal. Una ganancia muy baja reduce la sensibilidad de las señales de emisión, degradando la relación señal-ruido. Por lo tanto, el detector requiere que se especifique un parámetro de ganancia para el PMT antes de inyectar la muestra. Sin embargo, no se puede conocer la magnitud de la señal de fluorescencia antes de la inyección. Normalmente los usuarios solucionan esta dificultad realizando varias inyecciones para determinar un parámetro de ganancia adecuado, en un proceso especialmente tedioso cuando se realizan cambios de valores de ganancia y/o longitud de onda en eventos programados.

La función diagnóstica Auto-Optimize Gain (Optimización automática de la ganancia) permite realizar un cromatograma de prueba y muestra los valores de ganancia ideales. Estos valores se basan en un algoritmo que asegura un margen de 2 veces (2×) la sobrecarga del PMT y sus componentes electrónicos asociados, con variaciones de la intensidad de la fluorescencia para muestras concentradas. En el caso de cambios de eventos programados de ganancia y longitud de onda, el informe refleja los valores ajustados que representan el parámetro de ganancia ideal para cada región crítica de eventos programados. Se deben incorporar los valores de ganancia en el método, incluyendo la tabla de eventos programados, para optimizar el rendimiento del método.

El detector controla también el nivel máximo de la señal de fluorescencia durante el proceso. Al usar las salidas analógicas durante la captura de datos, se muestra un valor EUFS mínimo que se aplica a todo el cromatograma. Al igual que el valor de ganancia ideal, el valor EUFS asume un margen de 2×


para tener en cuenta cualquier variación de la intensidad de la fluorescencia. En función de este informe, se deben ajustar los valores de ganancia en el método, incluida la tabla de eventos programados, para optimizar el rendimiento del método.

El detector controla también el máximo nivel de la señal de fluorescencia durante el proceso. Se recomienda un valor EUFS mínimo, que se aplica a todo el cromatograma y aparece cuando se utiliza las salidas analógicas en la captura de datos. Este valor también se calcula suponiendo un margen de error de 2×.

Optimización del métodoEs posible descargar un método que incluya cambios de eventos programados. Los cambios de eventos programados que alteran la ganancia, la longitud de onda de excitación o la de emisión, son cambios críticos de la "condición lumínica". Éstos son los puntos en los que se renueva la búsqueda del máximo de la señal de pico. Por tanto, hay que introducir cualquier cambio de ganancia de evento programado en puntos estratégicos antes de los picos para mejorar la sensibilidad del detector a los mismos. El objetivo es proporcionar un punto de demarcación del tiempo de retención, en el que se tolere un cambio de ganancia sin afectar a la integración de los picos en el cromatograma. Antes de ejecutar la función diagnóstica de optimización automática de la ganancia, hay que ajustar las condiciones iniciales. No es necesario utilizar eventos programados. Sin embargo, esto significa que el detector recomendará solo una configuración del valor de la ganancia para todos los picos del cromatograma, sin una optimización por regiones de los picos segregados.


Ejemplo de propuesta de desarrollo de un métodoUtilizar un método con dos cambios de eventos programados para optimizar el cromatograma expuesto a continuación.

Cromatograma con ganancia optimizada

El primer cambio del parámetro de ganancia podría ocurrir a los 1.5 minutos, justo antes del pico pequeño que se detecta mejor a una ganancia de 1000. El siguiente cambio podría ocurrir a los 2.0 minutos, donde es necesario variar el par de longitudes de onda. El parámetro o las condiciones iniciales de ganancia no son críticos. El único requisito para el primer evento programado es que se lleve a cabo alguna configuración de la ganancia. A continuación se muestra un ejemplo de tabla de un método inicial.

Ejemplo de desarrollo de método

Tiempo (min) Evento

Inicial (0.0) Excitación = 375 nm, Emisión = 410 nm, Ganancia = 100

1.5 Ganancia = 1

2.0 Excitación = 375 nm, Emisión = 410 nm (aquí no es necesario cambiar la ganancia)

Emisión

0.0Ganancia: 10Ex: 375 nmEm: 410 nm



Región 1 Región 2 Región 3

100

4.0Time (Tiempo)


Una vez activada la función de optimización automática de la ganancia, el detector muestra los valores de ganancia recomendados.

Indicaciones:

• La tabla anterior contiene los mejores valores de ganancia optimizados con un margen de error de 2× que mantienen la mitad de su capacidad en reserva para fluctuaciones inesperadas de la señal de fluorescencia.

• La magnitud de las unidades de emisión es independiente de la ganancia, de forma que ésta no afecta a los valores de las unidades de emisión. No obstante, si se usan unidades de energía de muestra, al cambiar la ganancia se ve afectada la magnitud de la señal de salida.

Garantizar la optimización de la ganancia para cada pico de interés

Consultar la figura “Cromatograma con ganancia optimizada” en la página 1-21. Si se utiliza un solo evento programado (el par de longitud de onda cambia a 2 minutos para los picos 3 y 4), se recomienda la siguiente tabla de ganancias.

La ganancia para la Región 2 está determinada por el máximo nivel de señal de la Región 1. Por tanto, se utilizaría una ganancia de solo 10 en el intervalo de tiempo de 0.0 a 2.0. Sin embargo, puede ser que el pico pequeño no se resuelva adecuadamente con estos parámetros. Si el detector lo ha encontrado, el área de integración del pico sería mucho menos exacta debido al mayor ruido de la línea base. La omisión de la programación de un cambio de ganancia en un punto estratégico del cromatograma puede dar lugar a un mal enfoque del desarrollo del método.

Valores de ganancia recomendados

EUFS: 2000 Tiempo del evento (minutos) Ganancia óptima

0.0 (Inicial) 10

1.5 1000

2.0 5

Valores de ganancia recomendados con un solo cambio de evento programado

EUFS: 2000 Tiempo del evento (minutos) Ganancia óptima

0.0 (Inicial) 10

2.0 5


Pruebas diagnósticas de puesta en marcha

El detector ejecuta una serie de pruebas diagnósticas de puesta en marcha y muestra un mensaje de error en el caso de que falle alguna de estas pruebas. Son las siguientes:

• Prueba de la unidad central de procesamiento (CPU).

• Prueba de la interfaz de comunicación en serie (SCI).

• Prueba de la memoria de solo lectura programable con borrado eléctrico (EEPROM).

• Prueba de la RAM.

• Verificación de la integridad de los programas de aplicación.

• Prueba de la lámpara.

• Prueba de fotodiodo.

• Prueba de PMT.

• Prueba de componentes ópticos/Verificación de la longitud de onda.

Desgasificación del eluyente de la fase móvil

Al menos un 70% de todos los problemas de cromatografía líquida están relacionados con la fase móvil. La utilización de eluyentes desgasificados es importante, especialmente en las longitudes de onda de excitación inferiores a 220 nm. Las burbujas en la cubeta de flujo afectan negativamente al rendimiento del detector. El Sistema ACQUITY UPLC tiene un desgasificador en línea para eliminar la mayor parte del gas (aire) de los eluyentes. La desgasificación proporciona:

• Una respuesta fluorescente reproducible.

• Líneas base estables y mayor sensibilidad.

• Tiempos de retención reproducibles para los picos eluidos.

• Volúmenes de inyección reproducibles para la cuantificación.

• Funcionamiento estable de la bomba.

Pruebas diagnósticas de puesta en marcha 1-23

Selección de la longitud de onda

En fluorescencia, si el monocromador de excitación se configura por debajo del punto de corte UV de un componente de la fase móvil, se da lugar a que el eluyente absorba parte de la intensidad lumínica de excitación disponible, lo cual reduce la respuesta de emisión de fluorescencia de la muestra. Para obtener una lista completa de los intervalos de corte UV para eluyentes y fases móviles mezcladas comunes, consultar el Apéndice C de la Guía de funcionamiento del Sistema ACQUITY UPLC.

Advertencia: el uso de eluyentes incompatibles puede causar graves daños al instrumento y lesiones al usuario.


2 Configurar el detector

Contenido

Tema Página

Antes de empezar 2-2

Instalar el detector 2-3

Conexión de los tubos del detector 2-5

Realizar las conexiones de Ethernet 2-12

Conexión a la fuente de alimentación 2-16

2-1

Antes de empezar

Requisito: para instalar el detector, se debe conocer previamente el proceso de instalación y el funcionamiento de los módulos de laboratorio y los equipos controlados por ordenador, así como la manipulación de eluyentes.

Indicación: utilizar esta guía junto con la documentación y la Ayuda en línea del Sistema ACQUITY UPLC.

Antes de instalar el detector, comprobar que:

• No esté situado debajo de una salida de calefacción o de aire acondicionado.

• Se cuente con los componentes necesarios.

• Ninguno de los embalajes de transporte ni los productos desembalados tiene desperfectos.

Si durante la inspección del contenido del embalaje se comprueba que éste ha sufrido daños o que existe alguna discrepancia con respecto a la lista de componentes, se debe contactar inmediatamente con el transportista y con el representante local de Waters.

Los clientes de EE. UU. y de Canadá deben informar sobre los daños y las anomalías al Servicio Técnico de Waters, llamando al 1 800 478 4752. El resto de los usuarios pueden ponerse en contacto telefónico con su filial más cercana (el teléfono del Servicio Técnico en España es 902 254 254), con la sede central de Waters en Milford, Massachusetts (EE.UU.), o bien pueden visitar el sitio web www.waters.com y hacer clic en Waters Division (División de Waters).

Para obtener información detallada sobre la comunicación de daños materiales y reclamaciones, se recomienda consultar el documento Licencias, garantías y servicio técnico de Waters.

Especificaciones ambientales

Atributo Especificación

Temperatura de funcionamiento De 4 a 40 °C (de 39.2 a 104 °F)

Humedad de funcionamiento Del 20 al <95%, sin condensación

Temperatura de transporte y almacenamiento

De −30 a 60 °C (de −22 a 140 °F)

Humedad de transporte y almacenamiento

Del 0 al <95%, sin condensación

2-2 Configurar el detector

Instalar el detector

Para instalar el detector:

1. Situar el detector encima del horno para columnas, comprobando que las patas estén bien colocadas en las muescas del horno.

Resultado: la bandeja de recogida del detector está ahora correctamente alineada sobre el orificio de canalización del drenaje, en la parte superior izquierda del horno para columnas.

Colocación correcta del sistema de control de goteo

2. Colocar el módulo de la bandeja de eluyentes encima del detector.

Advertencia: Para evitar lesiones, se recomienda que el Detector FLR ACQUITY UPLC sea levantado por dos personas.

TP02465

Muesca

Guías para la colocación de las patas

Orificio de canalización del drenaje para el sistema de control de goteo

Instalar el detector 2-3

Detector FLR ACQUITY UPLC instalado en el Sistema ACQUITY UPLC

Organizador de muestras (opcional)

Detector FLR ACQUITY UPLC

Bandeja de eluyentes

Horno para columnas

Sistema de administración de muestras

Sistema de administración de eluyentes binario


Conexión de los tubos del detector

La conexión de los tubos del detector incluye el acoplamiento de la cubeta de flujo y la instalación del regulador de contrapresión, en su caso.

Aunque el desgasificador en línea elimina la mayor parte del gas (aire) de los eluyentes, se reintroduce algo de gas durante las inyecciones por llenado parcial del bucle. Mientras está bajo presión, este gas permanece en la solución. Sin embargo, como la presión poscolumna es por lo general muy inferior a la presión precolumna, el gas puede salir de la solución y producir una línea base inestable que se caracteriza por grandes picos inesperados.

El regulador de contrapresión mantiene una presión poscolumna mínima de 1724 kPa (17 bar, 250 psi), con lo que se evita la eliminación de gas disuelto poscolumna y se garantiza una línea base plana.

Advertencia: el uso de eluyentes incompatibles puede causar graves daños al instrumento y lesiones al usuario. Consultar el Apéndice C de la Guía de funcionamiento del Sistema ACQUITY UPLC para obtener más información.

Precaución: para evitar contaminaciones, se recomienda utilizar guantes sin talco que no sean de látex para realizar las conexiones de los tubos del detector.

Precaución: al instalar la cubeta de flujo de gran volumen en el Detector FLR, no utilizar el regulador de presión estándar que se entrega con el detector. El valor configurado de 1724 kPa (17 bar, 250 psi) de ese regulador, que supera el límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi) de la cubeta de flujo de gran volumen, puede dañar la cubeta de flujo. Utilizar el regulador de contrapresión que se entrega con la cubeta de flujo de gran volumen, que tiene un valor configurado de 689 kPa (7 bar, 100 psi).


Requisitos:

• Como la cubeta de flujo estándar tiene una presión nominal máxima de 3447 kPa (34 bar, 500 psi), el Detector FLR debe ser el último detector del sistema. Para un funcionamiento óptimo, se requiere instalar el regulador de contrapresión.

• Si se va a utilizar un espectrómetro de masas en el Sistema ACQUITY UPLC, hay que instalar un divisor de caudal delante del Detector FLR.

Recomendación: para evitar la contaminación por partículas en la cubeta de flujo, enjuagar las columnas antes de conectarlas al detector.

Consultar también: “Recomendaciones para la instalación de los conectores" en la Guía de funcionamiento del Sistema ACQUITY UPLC.

Para conectar los tubos del detector:

Recomendación: si el detector ya está encendido, seleccionar Detector FLR en

el esquema del sistema en la consola y hacer clic en (Lámpara apagada) para apagar la lámpara.

Precaución: para evitar que se rompa la cubeta de flujo, no superar la presión máxima permitida de 3447 kPa (34 bar, 500 psi). Si se ha instalado una cubeta de flujo de gran volumen, no superar su límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi).


1. Abrir la puerta del panel delantero del detector.

Detector FLR ACQUITY UPLC con la puerta del panel delantero abierta

2. Retirar la cubierta protectora de los tubos de PEEK de entrada de la cubeta y conectarlos a la entrada de la cubeta de flujo. Confirmar que la etiqueta de los tubos coincide con el tipo de detector y de cubeta de flujo del sistema.

Precaución: al instalar la cubeta de flujo de fluorescencia de gran volumen en el Detector FLR ACQUITY UPLC, no utilizar el regulador de presión estándar que se entrega con el detector. El valor configurado de 1724 kPa (17 bar, 250 psi) de ese regulador, que supera el límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi) de la cubeta de flujo de gran volumen, puede dañar la cubeta de flujo. Utilizar el regulador de contrapresión que se entrega con la cubeta de flujo de gran volumen, que tiene un valor configurado de 689 kPa (7 bar, 100 psi).

TP02821

Bloque de la cubeta de flujo

Tubo de entrada

Tornillos de ajuste manual

Regulador de contrapresión

Tubo de salida

Conector del sensor de fugas

Sensor de fugas


3. Acoplar la porción pequeña del tubo de salida del regulador de contrapresión a la salida de la cubeta de flujo.


4. Dirigir el extremo largo del tubo de salida del regulador de contrapresión a través de los clips del canal por el lado delantero derecho del sistema hasta un recipiente para desechos adecuado.

De la salida del detector

Al recipiente para desechos


Instalar la bandeja de recogida para múltiples detectoresSi el Sistema ACQUITY UPLC tiene más de un detector, hay que instalar la bandeja de recogida para múltiples detectores.

Detector FLR ACQUITY UPLC instalado en un Sistema ACQUITY UPLC dividido

Material necesario

• Kit de bandeja de recogida para múltiples detectores.

• Destornillador/desarmador TORX® T20.

Sistema de administración de eluyentes binario

Sistema de administración de muestras

Horno para columnas

Detector PDA o TUV ACQUITY UPLC

Detector FLR ACQUITY UPLC


Para instalar la bandeja de recogida:

1. Girar el Detector FLR ACQUITY UPLC hasta que descanse sobre su lado izquierdo.

2. Extraer los tornillos que sujetan las cuatro patas a la parte inferior del detector con el destornillador TORX T20.

3. Con el destornillador TORX T20 y tornillos de 30 mm, fijar las patas de goma cortas, y después las largas, a la parte inferior del detector.

Pata de goma corta

Tornillo

Pata de goma corta

Pata de goma larga

Tornillo


4. Fijar la bandeja de recogida a la parte inferior del detector insertando los remaches encajables en los orificios libres.

Indicación: el número de remaches necesario depende del tipo de detector.

5. Girar el Detector FLR a su posición original.

6. Volver a colocar el Detector PDA o TUV ACQUITY UPLC en su posición original sobre el Detector FLR.

7. Deslizar un conducto para desechos por la conexión rápida del tubo de drenaje situada en la parte derecha de la bandeja de recogida y después dirigirlo a un contenedor de desechos adecuado.

TP02827

Remaches encajables

Patas de plásticoextendidas

Conexión rápida del tubo de drenaje

Remaches encajables


Realizar las conexiones de Ethernet

Para realizar las conexiones de Ethernet:

1. Desembalar e instalar la estación de trabajo preconfigurada del sistema de tratamiento de datos.

2. Conectar un extremo de uno de los cables Ethernet a la red y después el otro a la tarjeta Ethernet de la estación de trabajo.

Indicación: en los sistemas preconfigurados, la tarjeta Ethernet corresponde a la tarjeta LAN del módulo.

3. Conectar un extremo de uno de los cables de Ethernet en la parte posterior del detector y después conectar el otro extremo al switch (conmutador) de red.

Conectores de señales de E/SEn el panel posterior del detector hay dos conectores extraíbles con sus correspondientes terminales atornillados para las señales de I/O (Inlet/Outlet), (E/S [Entrada/Salida]). Estos conectores tienen unas ranuras para que solo se puedan insertar los cables de señal de una manera determinada.

Ubicación de los conectores de señales de E/S

�

��

��

��

Conectores de señales de E/S


Conectores de señales de E/S

Conexiones de salida analógica/entrada de eventos del Detector FLR

Conexiones de señales Descripción

Inicio de inyección Activa la temporización de eventos mediante la puesta en marcha del reloj de tiempo de análisis. Esta conexión no se debe utilizar.

Lámpara Permite que un dispositivo externo apague la lámpara de mercurio-xenón.

Marca en el gráfico Agrega una marca en el gráfico (a un 10% de su escala completa) en uno o ambos canales de salida analógica (Salida del detector 1 y Salida del detector 2).

Puesta a cero automática

Realiza la función de puesta a cero automática en ambos canales (Salida del detector 1 y Salida del detector 2).

Salida del detector 1 Señal de salida analógica de 1 V a escala completa del Canal A (adaptada al parámetro EUFS actual).

Salida del detector 2 Señal de salida analógica de 1 V a escala completa del Canal B (adaptada al parámetro EUFS actual).

12345678910

+−

+−

Salida del detector 1


Tierra



Interruptor 1

Interruptor 1

Tierra

Interruptor 2

Interruptor 2

Conector I (entradas y salidas)

12345678910

+−

+−+−

+−

Inicio de inyección

Inicio de inyección

Tierra

Lámpara

Lámpara

Marca en el gráfico

Marca en el gráfico

Tierra



Conector II (entradas)


Conexiones de señalesConsultar la ubicación de las conexiones de señales mostradas en la etiqueta serigrafiada del panel posterior de cada instrumento.

Requisito: para cumplir con los requisitos normativos de inmunidad a las perturbaciones eléctricas externas hay que instalar cubiertas de conexiones sobre los conectores de señales.

Para realizar las conexiones de señales:

1. Conectar los cables positivos y negativos del cable de señales al conector.

2. Deslizar la abrazadera (con la parte curva hacia abajo) en el blindaje de protección.

Interruptor 1 (2) Se puede controlar mediante eventos programados y de umbral.

Interruptor 2 (2) Se puede controlar mediante eventos programados y de umbral.

Conexiones de salida analógica/entrada de eventos del Detector FLR (continuación)

Conexiones de señales Descripción

Cable de señales

Conector


3. Insertar la abrazadera y el blindaje (con la parte curva hacia abajo) en la cubierta de la conexión y ajustar sin apretar con un tornillo autobloqueante.

4. Insertar el conector con el cable de señales en la cubierta de la conexión, colocar la abrazadera sobre la guía de los cables y después apretar la abrazadera en su sitio con el segundo tornillo autobloqueante.

5. Colocar la segunda cubierta de la conexión sobre la primera y encajarla en su sitio.

Cubierta de la conexión

Blindaje

Abrazadera

Guía de los cables

Abrazadera

Conector de señales

Cubierta de la conexión


Conexión a la fuente de alimentación

El Detector FLR requiere una fuente de electricidad independiente, conectada a tierra. La conexión a tierra de la toma de corriente debe ser común y encontrarse cerca del sistema.

Para efectuar la conexión a la fuente de alimentación:

Recomendación: usar un acondicionador de línea o un sistema de alimentación ininterrumpida (SAI) para lograr la máxima estabilidad posible del voltaje de entrada a largo plazo.

1. Conectar el extremo hembra del cable de alimentación a la clavija del panel posterior del detector.

2. Conectar el extremo macho del cable a una toma de corriente adecuada.

Alternativa: si el sistema incluye el FlexCart opcional, conectar el extremo hembra del cable eléctrico del FlexCart (incluido en el kit de puesta en marcha) a la conexión del panel posterior del detector. Conectar el extremo macho protegido del cable eléctrico del FlexCart a la regleta de alimentación que hay en la parte posterior del carro. Por último, conectar el cable de la regleta de alimentación a una toma de corriente con circuito propio.

Advertencia: para evitar el riesgo de descargas eléctricas:• Utilizar cable de alimentación tipo SVT en los Estados Unidos y tipo

HAR (o mejor) en Europa. En otros países, consultar al distribuidor local de Waters.

• Hay que apagar y desconectar el detector antes de realizar tareas de mantenimiento en el instrumento.

• Conectar todos los componentes del Sistema ACQUITY UPLC a una toma de tierra común.


3 Preparar el detector para su uso

Contenido

Tema Página

Puesta en marcha del detector 3-2

Realizar un análisis 3-6

Instalar la unidad de la cubeta 3-8

Apagar el detector 3-10

3-1

Puesta en marcha del detector

La puesta en marcha del detector implica encender el detector y cada módulo del sistema individualmente, así como la estación de trabajo del sistema de tratamiento de datos, y poner en marcha el software operativo (Empower o MassLynx).

Consultar también: Guía de funcionamiento del Sistema ACQUITY UPLC.

Advertencia: • Siempre que se utilice este equipo y se trabaje con eluyentes y

soluciones de prueba se deben cumplir las buenas prácticas de laboratorio. El usuario debe conocer las propiedades fisicoquímicas de los eluyentes y las muestras que utiliza. Para obtener más información sobre éstos, se recomienda consultar las hojas de datos sobre seguridad de materiales.

• El uso de eluyentes incompatibles puede causar graves daños al instrumento y lesiones al usuario. Consultar el Apéndice C de la Guía de funcionamiento del Sistema ACQUITY UPLC para obtener más información.

Advertencia: peligro de explosión. El punto de inflamabilidad es la temperatura más baja a la que se puede propagar una llama a través del vapor de un material combustible a su superficie líquida. El punto de inflamabilidad de un componente químico está determinado por la presión de vapor del líquido. El vapor de un eluyente permite la combustión solamente cuando se alcanza una concentración lo suficientemente elevada.

Precaución: • Para evitar que se rompa la cubeta de flujo, no superar la presión

máxima permitida de 3447 kPa (34 bar, 500 psi).• Si se ha instalado la cubeta de flujo de gran volumen en el Detector

FLR, no utilizar el regulador de presión estándar que se entrega con el detector. El valor configurado de 1724 kPa (17 bar, 250 psi) de ese regulador, que supera el límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi) de la cubeta de flujo de gran volumen, puede dañar la cubeta de flujo. Utilizar el regulador de contrapresión que se entrega con la cubeta de flujo de gran volumen, que tiene un valor configurado de 689 kPa (7 bar, 100 psi).

3-2 Preparar el detector para su uso

Para poner en marcha el detector:

1. Encender la estación de trabajo.

2. Pulsar el interruptor de encendido que hay en la parte superior izquierda de la puerta del sistema de administración de eluyentes binario y en la puerta del sistema de administración de muestras.

Resultados:

• Cada instrumento del sistema emite un pitido y realiza una serie de pruebas de inicialización.

• El indicador LED de encendido de cada instrumento del sistema se ilumina de color verde.

• Durante la inicialización, el indicador LED de estado de cada uno de los instrumentos del sistema parpadea en color verde.

• Una vez se han encendido correctamente los instrumentos, el indicador LED de cada uno de ellos se ilumina en color verde de forma continua. Los indicadores LED del caudal del sistema de administración de eluyentes binario y de funcionamiento del sistema de administración de muestras permanecen apagados.

3. Iniciar el software Empower o MassLynx.

Indicación: se puede observar si en la Consola ACQUITY UPLC aparecen mensajes e indicaciones de LED.

4. Enjuagar el sistema con metanol o acetonitrilo de calidad HPLC filtrado y desgasificado.

5. Bombear fase móvil durante 15 minutos por lo menos.

6. Comprobar que la cubeta del detector está llena de eluyente y no tiene burbujas.

Indicación: si la cubeta contuviera aire, el detector podría no inicializarse correctamente.

7. Pulsar el interruptor de encendido del panel delantero para encender el detector.

Resultado: el detector realiza una serie de pruebas diagnósticas de inicio.

Indicación: el indicador LED de la lámpara parpadea en color verde durante las pruebas diagnósticas de inicio pero se muestra de color verde continuo cuando se enciende la lámpara.

8. Cuando el indicador LED de la lámpara aparezca en color verde continuo, inicializar el software Empower o MassLynx y cargar un método de instrumento o un método de entrada, según corresponda.


Indicación: se puede observar si en la Consola ACQUITY UPLC aparecen mensajes y señales visuales.

Recomendación: para obtener mejores resultados, esperar 1 hora a que el detector se estabilice antes de comenzar la adquisición de datos.

Supervisar los indicadores LED del detectorLos indicadores LED (diodos emisores de luz) del detector indican su estado de funcionamiento.

Indicador LED de encendido

El indicador LED de encendido, situado en el lado izquierdo del panel delantero del detector, indica cuándo está encendido o apagado.

LED de la lámpara

El indicador LED de la lámpara, ubicado a la derecha del de encendido, indica el estado de la lámpara.

Panel de control del detectorSi el sistema está controlado por el software Empower, el panel de control del detector aparece en la parte inferior de la ventana Run Samples (Analizar muestras). Si el software MassLynx controla el sistema, el panel de control del detector aparece en la parte inferior de la ventana Inlet Editor (Editor de entrada).

Indicaciones del indicador LED de la lámpara

Modo y color de los indicadores LED Descripción

Apagado Indica que la lámpara del detector está apagada.

Verde continuo Indica que la lámpara del detector está encendida.

Verde intermitente Indica que el detector se está inicializando o calibrando.

Rojo intermitente Indica que un error ha detenido el detector. Consultar la consola para obtener información sobre el error.

Rojo continuo Indica un error del detector que impide que el sistema siga funcionando. Apagar y volver a encender el detector. Si el indicador LED sigue de color rojo continuo, se recomienda ponerse en contacto con un representante del Servicio Técnico de Waters.


Panel de control del detector

El panel de control del detector muestra el estado de la adquisición y la posición del obturador. Los parámetros del detector no se pueden modificar durante el procesamiento de muestras.

La tabla siguiente enumera los elementos del panel de control del detector.

Elementos modificables del panel de control del detector

Elemento del panel de control Descripción

LED de lámpara encendida/apagada

Refleja el estado real de encendido/apagado del LED de la lámpara, a menos que se pierda la comunicación con el detector. Haciendo clic sobre él se abre la ventana de control de la lámpara.

Estado Indica el estado de la operación actual.

Gain (Ganancia) Muestra el parámetro de ganancia del PMT.

A: λ ex Muestra la longitud de onda de excitación.

A: λ em Muestra la longitud de onda de emisión.

A: EU Muestra las unidades de energía.

Mode (Modo) Muestra el modo en el que está funcionando el detector (monocanal, multicanal, barrido de espectro, modo 3D o modo lambda-lambda).

(Lámpara encendida) Enciende la lámpara del detector.

(Lámpara apagada) Apaga la lámpara del detector.

LED de lámpara encendida/apagada

Encendido/apagado de la lámpara del detector

Estado

Valor de ganancia

Longitud de onda de excitación

Longitud de onda de emisión

Unidades de energía


Se puede acceder a funciones adicionales haciendo clic con el botón derecho del ratón en cualquier lugar del panel de control del detector:

Realizar un análisis

En esta sección se explica cómo realizar un análisis con un detector de fluorescencia.

Antes de comenzar este procedimiento, el detector debe instalarse y configurarse como se describe en el Capítulo 2 y en este capítulo.

Preparación para el análisisLa preparación es la misma tanto si el detector está controlado por el sistema de tratamiento de datos Empower como por MassLynx.

Para preparar un análisis:

1. Preparar una fase móvil de agua de calidad HPLC/acetonitrilo de calidad HPLC 90:10 y rotularla “A”.

2. Sumergir el tubo A1 en la botella rotulada “A”.

3. Preparar una fase móvil de acetonitrilo de calidad HPLC al 100% y rotularla “B”.

4. Sumergir el tubo B1 en la botella rotulada “B”.

Funciones adicionales en el panel de control del detector

Función en el panel de control Descripción

Autozero (Puesta a cero automática) Restablece los ajustes del detector.

Reset FLR (Restablecer FLR) Reinicia el detector tras un error.

Help (Ayuda) Muestra la ayuda de la consola.

Advertencia: siempre que se utilice este equipo y se trabaje con eluyentes y soluciones de prueba se deben cumplir las buenas prácticas de laboratorio. El usuario debe conocer las propiedades fisicoquímicas de los eluyentes y las muestras que utiliza. Para obtener más información sobre éstos, se recomienda consultar las hojas de datos sobre seguridad de materiales.


5. Cebar el Sistema ACQUITY.

6. Una vez cebado el Sistema ACQUITY, equilibrar la columna ACQUITY UPLC 2.1 × 50 mm BEH C18 con A/B 30:70.

Crear el método de pruebaLa muestra utilizada en este experimento es antraceno, 5 pg/µL, disponible en el kit de mantenimiento.

Configurar un análisis isocrático con A/B 30:70 durante 2 minutos con los siguientes parámetros:

• Caudal: 0.4 mL/min

• Volumen de inyección: 5 µL

• Longitud de onda de excitación: 246 nm

• Longitud de onda de emisión: 402 nm

• Ganancia: 1

• Frecuencia de datos: 10

• Constante de tiempo: rápido

La figura siguiente muestra un cromatograma representativo de una de las soluciones arriba indicadas en un Detector FLR.

Realizar un análisis 3-7

Cromatograma del Detector FLR

El pico que eluye a 0.90 minutos es antraceno.

Instalar la unidad de la cubeta

Para determinar los valores óptimos del detector, utilizar la cubeta para explorar los intervalos de longitud de onda de excitación y emisión y ver el gráfico del espectro en la Consola ACQUITY o en el software Empower utilizando la función gráfica Spectrum λ - λ (Espectro λ - λ).

EU

Minutos


Para instalar la unidad de la cubeta:

1. Configurar la ganancia del Detector FLR en 0.

a. En la Consola ACQUITY UPLC, desplazarse a la pantalla interactiva.

b. Seleccionar el icono de control.

c. Cuando el enlace del parámetro de ganancia se vuelva azul, hacer clic en el valor.

d. Especificar "0" y después pulsar Enter (Entrar).

2. Extraer la cubeta de flujo. (Consultar la sección “Sustituir la cubeta de flujo” en la página 4-14).

3. Instalar la unidad de la cubeta.

Unidad de la cubeta, portacubetas y cubeta

Precaución: la exposición prolongada del tubo fotomultiplicador (PMT) a la luz pueden dañarlo permanentemente, especialmente con parámetros de ganancia elevados.

Cubeta

Unidad de la cubeta

Portacubetas

Instalar la unidad de la cubeta 3-9

Apagar el detector

Apagar el detector:

• Entre análisis.

• Durante la noche.

• Durante un fin de semana.

• Durante 72 horas o más.

Indicación: si el sistema está controlado por el software Empower, configurar los parámetros de apagado de éste en Instrument Method Editor (Editor de métodos de instrumento). Consultar la ayuda en línea de Empower o la ayuda en línea de la Consola ACQUITY UPLC para obtener más información.

Si el sistema está controlado por el software MassLynx, configurar los parámetros de apagado de éste en Shutdown Editor (Editor de apagado). Consultar la Ayuda en línea de MassLynx para obtener más información.

Entre análisis

Para apagar el detector entre análisis:

1. Seguir bombeando la mezcla de fase móvil inicial por la columna para conservar en ella el equilibrio necesario para una buena reproducibilidad del tiempo de retención.

2. Si van a transcurrir solo unas pocas horas hasta la inyección siguiente, reducir el caudal mientras tanto a unas décimas de mL/min para ahorrar eluyente.

Indicación: comprobar que el método de apagado está desactivado.

3. Mantener el detector en funcionamiento y el horno para columnas a la temperatura de funcionamiento durante este periodo.

Precaución: las soluciones tampón retenidas en el sistema pueden precipitar y deteriorar los componentes del instrumento, incluyendo la cubeta de flujo.


Apagado durante menos de 72 horas

Para apagar el detector durante menos de 72 horas:

1. Enjuagar la columna con agua de calidad HPLC/metanol 90:10 para mantener el lecho de la columna activo y húmedo.

Requisito: si se utilizan soluciones tampón, primero es necesario llenar la columna con una fase móvil de alto contenido de agua (90% de agua). A continuación, detener el caudal de la bomba.

2. Si es posible, apagar la lámpara del detector para aumentar su duración.

Recomendación: el horno para columnas puede seguir funcionando durante la noche, pero hay que apagarlo durante el fin de semana.

Apagado durante más de 72 horas

Para apagar el detector durante más de 72 horas:

1. Seguir los pasos anteriores para apagar el detector durante menos de 72 horas.

2. Después de enjuagar la columna y dejarla enfriar hasta la temperatura ambiente, desenchufar los tubos de entrada y de salida y unirlos con una conexión.

Apagar el detector 3-11

3. Instalar tapones terminales en las conexiones de entrada y salida de la columna, y después volver a meter la columna cuidadosamente en su caja para su conservación.

4. Bombear agua por el sistema entre 10 y 20 minutos a 0.5 mL/min.

5. Bombear isopropanol por el sistema entre 10 y 20 minutos.

6. Apagar la bomba, dejando el alcohol en los tubos de líquidos.

Precaución: • Si algún módulo del sistema se va a utilizar para otro tipo de

análisis, comprobar que los líquidos bombeados inicialmente a través del sistema se pueden mezclar con metanol, agua, metanol/acetonitrilo o isopropanol. Igualmente, antes de volver a encender el sistema, comprobar que todos los materiales residuales que no sean miscibles con la fase móvil inicial de metanol/agua han quedado bien enjuagados del sistema con un eluyente intermedio adecuado.

• Si no se va a utilizar la cubeta de flujo durante algún tiempo, hay que enjuagarla con fase móvil limpia, como una mezcla de agua/acetonitrilo o agua/metanol, y tapar los puertos de flujo o secar la cubeta de flujo con gases de laboratorio puros como helio, nitrógeno o aire de 5 a 10 minutos.


4 Mantenimiento del detector

Contenido

Tema Página

Contactar con el Servicio Técnico de Waters 4-2

Consideraciones sobre el mantenimiento 4-3

Mantenimiento sistemático 4-4

Mantenimiento del sensor de fugas 4-4

Mantenimiento de la cubeta de flujo 4-11

Sustituir la lámpara 4-17

Sustituir los fusibles 4-22

Limpiar el exterior del instrumento 4-23

4-1

Contactar con el Servicio Técnico de Waters

Los clientes de EE. UU. y Canadá deben comunicar las averías y otras anomalías al Servicio Técnico de Waters (800 252-4752). El resto de los usuarios deben ponerse en contacto telefónico con su filial más cercana (el teléfono del Servicio Técnico en España es 902 254 254) o con la sede central de Waters en Milford, Massachusetts (EE. UU.). En el sitio web de Waters se pueden encontrar los números de teléfono y las direcciones de correo electrónico de las oficinas de Waters en otros países. Ir a www.waters.com y hacer clic en Waters Division (División de Waters).

Independientemente de la forma de contactar con Waters, se debe proporcionar la siguiente información:

• Mensaje de error (en su caso).

• Naturaleza de la anomalía.

• Número de serie del instrumento.

• Caudal.

• Presión de trabajo.

• Eluyentes.

• Parámetros de configuración del detector.

• Tipo y número de serie de las columnas.

• Tipo de muestras.

• Versión del software Empower o MassLynx y número de serie.

• Modelo de la estación de trabajo del sistema de tratamiento de datos y versión del sistema operativo.

Para obtener información detallada sobre la comunicación de daños materiales y reclamaciones, se recomienda consultar el documento Licencias, garantías y servicio técnico de Waters.

4-2 Mantenimiento del detector

Consideraciones sobre el mantenimiento

Seguridad y manejoSe deben tener en cuenta las advertencias y precauciones indicadas al realizar las tareas de mantenimiento en el detector:

Procedimientos para un funcionamiento adecuadoPara garantizar un funcionamiento eficiente del sistema, se recomienda seguir las directrices y procedimientos operativos descritos en el Capítulo 3.

Repuestos

Sustituir solamente las piezas que se indican en este documento. Para obtener información sobre los repuestos, consultar Waters Quality Parts Locator (Localizador de piezas de calidad de Waters) en la página Services & Support (Servicios y soporte) del sitio web de Waters.

Advertencia: para evitar daños físicos, es necesario cumplir con las buenas prácticas de laboratorio cuando se manipulen eluyentes, se cambien los tubos o se trabaje con el sistema. Se deben conocer las propiedades fisicoquímicas de los eluyentes. Es importante leer las hojas de datos sobre seguridad de materiales referentes a los eluyentes que se manipulen.

Advertencia: para evitar una descarga eléctrica:• No abrir la cubierta del detector. El detector no tiene ningún

componente que el usuario pueda reparar.• Hay que apagar y desconectar el detector antes de realizar tareas de

mantenimiento en el instrumento.

Precaución: para evitar dañar las piezas eléctricas, no se debe desconectar nunca un componente eléctrico mientras el detector esté recibiendo corriente. Para interrumpir el suministro eléctrico al detector, situar el interruptor de encendido en la posición Off (Apagado) y después desenchufar el cable de alimentación de la toma de CA. Después, se debe esperar unos 10 segundos antes de desconectar cualquier componente.

Consideraciones sobre el mantenimiento 4-3

Recomendaciones:

• Apagar el detector al menos cada 2 semanas para iniciar la verificación.

• Para evitar que entre suciedad en el conjunto óptico, hay que mantener siempre cerrada la puerta del detector cuando no esté instalada una cubeta de flujo en el mismo.

• Para prolongar la vida útil de la columna, minimizar las fluctuaciones de presión y disminuir el ruido de la línea base, hay que filtrar y desgasificar los eluyentes.

• Si no se va a utilizar la lámpara durante 4 o más horas, se recomienda apagarla. Dejar el detector encendido pero inactivo.

Mantenimiento sistemático

El detector requiere un mantenimiento sistemático mínimo:

• Sustituir los filtros de la botella de eluyentes periódicamente.

• Para prolongar la vida útil de la columna, minimizar las fluctuaciones de presión y disminuir el ruido de la línea base, hay que filtrar y desgasificar los eluyentes.

• Eliminar las fases móviles tamponadas del detector con agua de calidad HPLC seguida por una solución de metanol al 5% - 10% cada vez que se apague el detector. Esto evita:

– La obturación de los tubos de eluyente y de la cubeta de flujo.

– Daños en los componentes.

– Crecimiento microbiano.

Mantenimiento del sensor de fugas

El sensor de fugas de la bandeja de recogida del Detector FLR controla de forma continua la existencia de fugas en el detector. El sensor interrumpe el flujo del sistema cuando detecta líquido acumulado proveniente de fugas en el depósito que lo rodea y aparece un mensaje de error en la Consola ACQUITY UPLC que describe el problema.

Precaución: para evitar dañar el detector o la columna, retirar la columna y desconectar el detector antes de enjuagar el sistema.


Solucionar errores del sensor de fugas del detectorCuando se acumulan aproximadamente 1.5 mL de líquido en el depósito del sensor de fugas, suena una alarma que indica que el sensor de fugas ha detectado una fuga.

Material necesario

• Guantes sin talco, limpios y resistentes a compuestos químicos.

• Torundas o bastoncillos de algodón.

• Paños no abrasivos que no dejen pelusa.

Para solucionar un error del sensor de fugas del detector:

1. Consultar el cuadro de diálogo Leak Sensors (Sensores de fugas) en la Consola ACQUITY UPLC para confirmar que el sensor de fugas del detector ha detectado una fuga.

Indicación: si se detecta una fuga, aparecerá el mensaje de error "Leak Detected" (Fuga detectada).

2. Abrir la puerta del detector, tirando suavemente del borde derecho hacia fuera.

3. Localizar el origen de la fuga y realizar las reparaciones necesarias para detenerla.

Advertencia: el sensor de fugas se puede contaminar con materiales tóxicos o con riesgo biológico. Es necesario utilizar siempre guantes limpios sin talco resistentes a compuestos químicos para llevar a cabo este procedimiento.

Precaución: para evitar rayar o dañar el sensor de fugas:• No permitir que los eluyentes tamponados se acumulen o se sequen

sobre el sensor.• No sumergir el sensor en un baño de limpieza.

Precaución: para evitar dañar el sensor de fugas, no sujetarlo por el cable de cinta.


4. Para retirar el sensor de fugas de su alojamiento, sujetarlo por los bordes dentados y tirar hacia arriba.

Indicación: si no se puede manipular con facilidad el sensor de fugas después de retirarlo del depósito, desconectar el conector de la parte delantera del módulo (consultar la página 4-9).

5. Utilizar un paño no abrasivo, que no deje pelusa, para secar el prisma del sensor de fugas.

Bordes dentados

TP02891

Prisma

Paño que no deje pelusa.


6. Enrollar un paño no abrasivo, que no deje pelusa, y utilizarlo para absorber el líquido del alojamiento del sensor de fugas y las zonas colindantes.

7. Con una torunda de algodón, absorber cualquier resto de líquido que haya quedado en las esquinas del depósito del sensor de fugas y zonas colindantes.

Paño sin pelusa enrollado

Alojamiento del sensor de fugas

Torunda de algodón

Alojamiento del sensor de fugas


8. Alinear la barra en forma de T del sensor de fugas con la ranura del lateral del alojamiento del sensor de fugas y deslizar el sensor de fugas hasta colocarlo en su sitio.

9. Si se ha desconectado el conector de la parte delantera del instrumento, volver a conectarlo.

10. En la Consola ACQUITY UPLC, seleccionar el detector en el esquema del sistema.

11. En la ventana de información del detector, hacer clic en Control > Reset (Control > Reiniciar) para reiniciar el detector.

TP02913

TP02892

Ranura en el alojamiento del sensor de fugas

Barra en forma de T

Sensor de fugas instalado en el alojamiento


Sustituir el sensor de fugas del detector

Material necesario

• Guantes sin talco, limpios y resistentes a compuestos químicos.

• Sensor de fugas.

Para sustituir el sensor de fugas del detector:


2. Presionar la pestaña hacia abajo para desconectar el conector del sensor de fugas de la parte delantera del módulo.

Advertencia: el sensor de fugas se puede contaminar con materiales tóxicos o con riesgo biológico. Es necesario utilizar siempre guantes limpios sin talco resistentes a compuestos químicos para llevar a cabo este procedimiento.


Presionar la pestaña hacia abajo para soltar el conector.


3. Para retirar el sensor de fugas de su alojamiento, sujetarlo por los bordes dentados y tirar hacia arriba.

4. Desembalar el nuevo sensor de fugas.

5. Alinear la barra en forma de T del sensor de fugas con la ranura del lateral de su alojamiento y deslizar el sensor de fugas hasta colocarlo en su sitio.

Bordes dentados

TP02913

TP02892

Ranura del alojamiento del sensor de fugas

Barra en forma de T

Sensor de fugas instalado en su alojamiento


6. Encajar el conector del sensor de fugas en la parte delantera del módulo.

7. En la Consola ACQUITY UPLC, seleccionar el detector en el esquema del sistema.

8. En la ventana de información del detector, hacer clic en Control > Reset (Control > Reiniciar) para reiniciar el detector.

Mantenimiento de la cubeta de flujo

Precauciones

Para evitar la contaminación, hay que utilizar dediles o guantes sin talco para manipular, retirar o sustituir la cubeta de flujo.

Material necesario

• Llave fija, adecuada para desmontar y sustituir los conectores.

• Conexión y tubo de acero inoxidable.

• Eluyente tipo metanol, que se pueda mezclar con la fase móvil y con el agua.

• Dediles o guantes sin talco.

• Eluyente de limpieza fuerte adecuado para el sistema.

• Agua de calidad HPLC.

• Contenedor independiente para los desechos ácidos.

Precaución: para evitar daños en la cubeta de flujo:• Manejarla con cuidado.• No desmontarla.• Enjuagar las columnas previamente con fase móvil limpia antes de

conectarlas a la cubeta de flujo. Por ejemplo, lavar una columna de 2.1 x 50 mm durante 10 minutos a 0.5 mL/min.


Enjuagar la cubeta de flujoEnjuagar la cubeta de flujo si se contamina con restos de análisis anteriores y cada vez que se apague el detector. Una cubeta de flujo sucia puede producir ruido en la línea base, reducir los niveles de energía, causar errores de calibración y producir otros problemas. Enjuagar y purgar siempre la cubeta de flujo como prevención inicial de la aparición de estos problemas.

Enjuagar la cubeta de flujo siempre que:

• El ruido sea mayor del esperado.

• Los resultados de la prueba de relación señal-ruido Raman no se ajusten a las especificaciones.

• El detector no se pueda normalizar.

Si se utiliza una fase móvil tamponada, hay que purgar del detector antes de desconectarlo de la alimentación.

Indicación: hay que utilizar siempre eluyentes bien desgasificados.

Precaución: para evitar daños en la cubeta de flujo durante el enjuagado inverso, no ejercer sobrepresión sobre ella.

Precaución: • Si no se va a utilizar la cubeta de flujo durante algún tiempo, hay que

enjuagarla con fase móvil limpia, como agua/acetonitrilo o agua/metanol, y después tapar los puertos de flujo o secar la cubeta de flujo con nitrógeno o helio puros.

• Para evitar problemas en la cubeta de flujo, no se debe conectar ningún tubo o dispositivo que puede crear una contrapresión que supere el valor nominal máximo de la cubeta de flujo, de 3447 kPa (34 bar, 500 psi).

• Si se ha instalado la cubeta de flujo de gran volumen en el Detector FLR, no utilizar el regulador de presión estándar que se entrega con el detector. El valor configurado de 1724 kPa (17 bar, 250 psi) de ese regulador, que supera el límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi) de la cubeta de flujo de gran volumen, puede dañar la cubeta de flujo. Utilizar el regulador de contrapresión que se entrega con la cubeta de flujo de gran volumen, que tiene un valor configurado de 689 kPa (7 bar, 100 psi).


Para enjuagar la cubeta de flujo:

1. Detener el flujo de eluyente y extraer la columna.

2. Sustituir la columna por una conexión o un trozo de tubo.

3. Enjuagar el detector con agua de calidad HPLC.

4. Bombear metanol al 100 % a través de la cubeta de flujo para limpiarla por dentro.

5. Bombear un eluyente de limpieza fuerte, como isopropanol, a través de la cubeta de flujo (opcional).

6. Si la fase móvil es miscible en agua, reanudar el bombeo de la fase móvil. En caso contrario, enjuagar primero con un eluyente intermedio.

7. Volver a conectar la columna.

Recomendación: volver a normalizar con agua pura antes de reanudar los análisis.

8. Si la cubeta de flujo sigue sucia u obstruida, hay que enjuagarla en sentido inverso.

Precaución: si la fase móvil no se puede mezclar con agua, hay que enjuagar primero con un eluyente intermedio.

Precaución: no superar 3447 kPa (34 bar, 500 psi) con la cubeta estándar. Si se ha instalado una cubeta de flujo de gran volumen, no superar su límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi).

Precaución: no superar 3447 kPa (34 bar, 500 psi) con la cubeta estándar. Si se ha instalado una cubeta de flujo de gran volumen, no superar su límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi).


Enjuague inverso de la cubeta de flujoSi el enjuague directo de la cubeta de flujo no mejora su rendimiento, hay que hacerlo en sentido inverso.

Para enjuagar la cubeta de flujo en sentido inverso:

1. Invertir las conexiones de los tubos de entrada y de salida de la cubeta de flujo.

2. Enjuagar la cubeta de flujo durante aproximadamente 15 minutos.

Indicación: si se reduce la presión del sistema significa que la cubeta de flujo está limpia.

3. Si la cubeta de flujo sigue sucia o atascada, hay que extraerla y sustituirla.

4. Devolver la cubeta de flujo atascada a Waters (consultar “Contactar con el Servicio Técnico de Waters” en la página 4-2).

Sustituir la cubeta de flujo

Material necesario

• Destornillador/desarmador plano de 1/4 de pulgadas.


Precaución: • Para evitar la sobrepresión de la cubeta de flujo estándar, no

superar 3447 kPa (34 bar, 500 psi).• Si se ha instalado la cubeta de flujo de gran volumen en el

Detector FLR, no utilizar el regulador de presión estándar que se entrega con el detector. El valor configurado de 1724 kPa (17 bar, 250 psi) de ese regulador, que supera el límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi) de la cubeta de flujo de gran volumen, puede dañar la cubeta de flujo. Utilizar el regulador de contrapresión que se entrega con la cubeta de flujo de gran volumen, que tiene un valor configurado de 689 kPa (7 bar, 100 psi).


Para sustituir la cubeta de flujo:

1. Desconectar el detector de la alimentación.

2. Detener el flujo de eluyente.


4. Desconectar el tubo de entrada del detector de la conexión de salida de la columna.

5. Desconectar el regulador de contrapresión, si existe.

6. Extraer la cubeta de flujo:

a. Aflojar los 3 tornillos de ajuste manual de la placa delantera del bloque de la cubeta de flujo.

b. Inclinar la parte inferior de la cubeta de flujo hacia arriba y tirar suavemente de ella hacia fuera.

7. Desembalar e inspeccionar la nueva cubeta de flujo.

Precaución: si no se inclina la parte inferior de la cubeta hacia arriba, se puede dañar la máscara de la cubeta de flujo.

TP02821


Tubo de entrada

Tornillos de ajuste manual


Tubo de salida


Sensor de fugas


8. Cuadrar el bloque de la cubeta de flujo frente a la abertura y después insertarlo lentamente de forma que las clavijas de la parte delantera del compartimento de la cubeta de flujo se alineen con los orificios del detector de la cubeta de flujo.

9. Continuar insertando la cubeta de flujo hasta que los 3 tornillos de ajuste manual queden alineados con sus orificios en el chasis.

10. Apretar los tornillos con los dedos.

11. Conectar el tubo de entrada a la conexión de salida de la columna y a la entrada de la cubeta de flujo y conectar el tubo de salida al regulador de contrapresión.

12. Cerrar la puerta del detector.

13. Antes de conectar el detector a la alimentación, cebar el sistema para llenar la cubeta con eluyente y eliminar todo el aire.

Precaución: al instalar la cubeta de flujo de fluorescencia de gran volumen en el Detector FLR, no utilizar el regulador de presión estándar que se entrega con el detector. El valor configurado de 1724 kPa (17 bar, 250 psi) de ese regulador, que supera el límite de presión de 1000 kPa (10 bar, 145 psi) de la cubeta de flujo de gran volumen, puede dañar la cubeta de flujo. Utilizar el regulador de contrapresión que se entrega con la cubeta de flujo de gran volumen, que tiene un valor configurado de 689 kPa (7 bar, 100 psi).



Sustituir la lámpara

La lámpara se debe cambiar cuando no se encienda en repetidas ocasiones o cuando no se pueda calibrar el detector.

El encendido y el resultado aceptable en las pruebas diagnósticas de la lámpara de la fuente del Detector FLR están garantizados durante 1000 horas o 1 año a partir de la fecha de compra, lo que ocurra primero.

Material necesario

• Destornillador/desarmador Phillips.


Para extraer el módulo de la lámpara:

1. Hacer clic en el Detector FLR en el panel izquierdo de la consola y

después en para apagar la lámpara.

Resultado: el LED verde de la consola se apaga, al igual que el LED Lamp (Lámpara) de la puerta.


Advertencia: el alojamiento de la lámpara se calienta excesivamente cuando el sistema se encuentra en funcionamiento. Para evitar daños por quemaduras:• Dejar que la lámpara se enfríe durante 60 minutos antes de

extraerla.• Mantener la lámpara en su alojamiento al manipularla.

Advertencia: la presión del gas dentro de la lámpara aumenta cuando está caliente. Para evitar lesiones, dejar que la lámpara se enfríe durante 60 minutos antes de extraerla.

Advertencia: para evitar daños oculares derivados de la exposición a la radiación ultravioleta:• Llevar una protección ocular que filtre la luz ultravioleta.• Mantener la lámpara en el alojamiento durante el funcionamiento.


3. Para facilitar el rápido enfriamiento de la lámpara, abrir la puerta de acceso a la lámpara con un destornillador plano pequeño.

4. Dejar que la lámpara se enfríe durante 60 minutos.

Indicación: dejar encendido el detector mientras se enfría la lámpara permite que los ventiladores sigan funcionando, lo que facilita el rápido enfriamiento de la lámpara.

5. Apagar el detector y desconectar el cable de alimentación del panel posterior.

6. Tirar suavemente del conector eléctrico superior en línea recta.

Advertencia: la lámpara y su alojamiento pueden estar calientes. Esperar 60 minutos a que se enfríen estos componentes antes de tocarlos.

Precaución: no sujetar el conector por el cable. Puede dañarse el conector o el mismo cable.

Conector eléctrico superior


7. Oprimir el mecanismo de cierre del conector inferior entre el dedo índice y el pulgar antes de extraerlo hacia fuera.

8. Con la ayuda de un destornillador/desarmador Phillips, aflojar los 2 tornillos cautivos del alojamiento de la lámpara.

Advertencia: para evitar heridas, mantener la lámpara siempre orientada hacia fuera cuando se extrae.

Conector inferior

Mecanismo de bloqueo

Tornillos cautivos


9. Extraer con cuidado la lámpara de su alojamiento.

Advertencia: • El gas de la lámpara se encuentra bajo presión positiva. Para

evitar que se rompa el cristal, hay que tener mucho cuidado al manipular la lámpara. Waters recomienda proteger de forma adecuada la lámpara vieja dentro del embalaje del nuevo repuesto antes de desecharla.

• La lámpara contiene mercurio y por tanto no se debe desechar en los contenedores de residuos municipales. Consultar la normativa medioambiental local para obtener información sobre cómo desechar y reciclar lámparas que contengan mercurio.

Conector eléctrico superior


Para instalar la lámpara:

1. Desembalar la nueva lámpara de su embalaje sin tocar la bombilla.

2. Inspeccionar la lámpara nueva y su alojamiento.

3. Registrar el número de serie, que está ubicado en la etiqueta colocada en el cable del conector de la lámpara.

4. Volver a conectar el conector eléctrico inferior de la lámpara, comprobando que encaje en su sitio.

5. Volver a conectar el conector eléctrico superior de la lámpara.

6. Colocar el cartucho de la lámpara e insertarlo en el alojamiento.

Indicación: no se requiere alineación adicional.

7. Empujar suavemente la lámpara hasta que entre por completo en su lugar.

8. Apretar los 2 tornillos de sujeción.

9. Cerrar la puerta de acceso de la lámpara.

10. Volver a conectar el detector a la alimentación y esperar unos 30 minutos para que la lámpara se caliente antes de reanudar las operaciones.

Indicación: al conectar cíclicamente el detector a la alimentación (es decir, desconectar y volver a conectar el módulo) se inician los procedimientos de verificación.

11. En la consola, seleccionar Maintain > Change Lamp (Mantenimiento > Cambiar lámpara).

12. Hacer clic en New Lamp (Lámpara nueva).

Indicación: si no se registra el número de serie de una lámpara nueva en la Consola de ACQUITY UPLC, la fecha de la instalación de la lámpara anterior permanece en la memoria del detector, lo cual anula la garantía de la lámpara nueva.

13. Escribir el número de serie de la lámpara nueva (consultar la etiqueta fijada al cable del conector de la lámpara) y hacer clic en OK (Aceptar).

Precaución: no tocar la bombilla de la lámpara nueva. La suciedad y las huellas dactilares afectan negativamente al funcionamiento del detector. Si es necesario limpiar la bombilla, debe hacerse con una toallita para limpiar lentes y etanol. No utilizar tejidos abrasivos. No aplicar una presión excesiva.


Sustituir los fusibles

El detector necesita dos fusibles de 100 a 240 VCA, 50 a 60 Hz, F 3.15 A, 250 V (acción rápida), 5 × 20 mm (tipo IEC).

Se debe sospechar de un fusible roto o defectuoso cuando:

• No se puede encender el detector.• Los ventiladores no funcionan.

Para sustituir los fusibles:

Requisito: sustituir ambos fusibles a la vez, aunque solo uno esté abierto o dañado.

1. Desconectar el detector y el cable de alimentación del módulo de entrada de alimentación.

2. Apretar los laterales del portafusibles con resorte, situado sobre el módulo de entrada de alimentación del panel posterior del detector.

3. Mediante una presión mínima, retirar el portafusibles con resorte.

Advertencia: para evitar el riesgo de descargas eléctricas, hay que apagar y desenchufar el Detector FLR antes de comprobar los fusibles. Para disponer de protección permanente contra incendios, los fusibles de repuesto deben ser del mismo tipo y clasificación.

Fusibles

Portafusibles

Módulo de entrada de alimentación


4. Extraer y desechar los fusibles.

5. Comprobar que los fusibles nuevos sean de la clasificación correcta para las necesidades en cuestión, insertarlos en el portafusibles y éste en el módulo de entrada de alimentación, empujando con suavidad hasta que encaje en su sitio.

6. Volver a conectar el cable de alimentación al módulo de entrada de alimentación.

Limpiar el exterior del instrumento

Limpiar la superficie exterior del detector con un paño suave humedecido con agua.

Limpiar el exterior del instrumento 4-23

A Consejos de seguridad

Los instrumentos de Waters muestran símbolos de peligro cuya finalidad es advertir al usuario de los peligros implícitos en relación con su funcionamiento y su mantenimiento. Estos símbolos aparecen también en las guías de funcionamiento correspondientes, acompañados de un texto que describe los riesgos y la manera de evitarlos. En este apéndice se describen todos los símbolos y advertencias de seguridad que se aplican a toda la línea de productos de Waters.

Contenido

Tema Página

Símbolos de advertencia A-2

Símbolo de precaución A-5

Advertencias que se aplican a todos los instrumentos de Waters A-6

Símbolos eléctricos y de manejo A-7

A-1

Símbolos de advertencia

Los símbolos de advertencia alertan del riesgo de muerte, lesiones o reacciones fisiológicas adversas y graves relacionadas con el uso de un instrumento o su uso indebido. Cuando se instale, se repare o se utilice un instrumento de Waters, se deben tener en cuenta todas las advertencias. Waters no asume ninguna responsabilidad por el incumplimiento de las precauciones de seguridad por parte de las personas que instalen, reparen o manipulen sus instrumentos.

Advertencias de peligro asociadas con tareas específicasLos siguientes símbolos de advertencia avisan de los riesgos que se pueden producir durante el funcionamiento o el mantenimiento de un instrumento o componente. Estos riesgos incluyen quemaduras, descargas eléctricas, exposición a radiación ultravioleta y otros peligros.

Cuando estos símbolos aparecen en las descripciones o en los procedimientos de un manual, el texto adjunto identifica el riesgo específico y explica la manera de evitarlo.

Advertencia: (riesgo general de peligro. Si este símbolo aparece en un instrumento, se recomienda consultar la información importante sobre seguridad que se incluye en la documentación del usuario del instrumento antes de su utilización).

Advertencia: (riesgo de quemaduras producidas por contacto con superficies calientes).

Advertencia: (riesgo de descarga eléctrica).

Advertencia: (riesgo de incendio).

Advertencia: (riesgo de punción con aguja).

Advertencia: (riesgo de lesiones causadas por maquinaria en movimiento).

Advertencia: (riesgo de exposición a radiación ultravioleta).

Advertencia: (riesgo de contacto con sustancias corrosivas).

A-2 Consejos de seguridad

Advertencias aplicables a instrumentos, componentes y tipos de muestras específicos

Las siguientes advertencias pueden aparecer en los manuales del usuario de determinados instrumentos, así como en las etiquetas de los instrumentos o de sus componentes.

Advertencia de reventón

Esta advertencia se aplica a los instrumentos de Waters con tubos no metálicos.

Advertencia: (riesgo de exposición a sustancias tóxicas).

Advertencia: (riesgo de exposición a radiación láser).

Advertencia: (riesgo de exposición a agentes biológicos que pueden suponer un grave peligro para la salud).

Advertencia: los tubos no metálicos o de polímeros presurizados pueden reventar. Se recomienda tener en cuenta las precauciones siguientes cuando se trabaje cerca de estos tubos:• Utilizar protección ocular.• Extinguir todas las llamas cercanas.• No utilizar tubos que se hayan doblado o sometido a tensiones.• No exponer los tubos no metálicos a compuestos incompatibles, como

tetrahidrofurano (THF), o los ácidos nítrico o sulfúrico.• Algunos compuestos, como el diclorometano y el dimetilsulfóxido,

producen una expansión de los tubos no metálicos, lo que reduce considerablemente la presión a la que pueden reventar.

Símbolos de advertencia A-3

Advertencia de eluyentes inflamables en el espectrómetro de masas

Esta advertencia se aplica a los instrumentos que se utilizan con eluyentes inflamables.

Peligro de descarga eléctrica del espectrómetro de masas

Esta advertencia se aplica a todos los espectrómetros de masas de Waters.

Esta advertencia se aplica a determinados instrumentos cuando están en funcionamiento.

Advertencia de peligro biológico

Esta advertencia se aplica a los instrumentos de Waters que se pueden utilizar para procesar materiales con posible riesgo biológico, como las sustancias que contienen agentes biológicos que pueden producir efectos nocivos en las personas.

Advertencia: cuando haya una cantidad importante de eluyentes inflamables, se requerirá un flujo continuo de nitrógeno en el interior de la fuente de ionización para evitar su posible ignición en este espacio cerrado. Es importante comprobar que la presión del suministro de nitrógeno no descienda nunca por debajo de los 690 kPa (6.9 bar, 100 psi) durante un análisis en el que se utilicen eluyentes inflamables. También es importante comprobar que haya una conexión de seguridad para el gas en el sistema de LC, con el fin de detener el flujo de eluyente de LC si falla el suministro de nitrógeno.

Advertencia: para evitar descargas eléctricas se recomienda no retirar los paneles protectores del espectrómetro de masas. Estos paneles no cubren ningún componente que el usuario deba manipular.

Advertencia: puede haber voltajes altos en ciertas superficies externas del espectrómetro de masas cuando el instrumento está en funcionamiento. Para evitar una descarga eléctrica no mortal, asegurarse de que los instrumentos están en modo de espera antes de tocar cualquier pieza que tenga el símbolo de advertencia de alto voltaje.


Advertencia de peligro químico

Esta advertencia se aplica a los instrumentos de Waters que pueden procesar material corrosivo, tóxico, inflamable o cualquier otro tipo de material peligroso.

Símbolo de precaución

El símbolo de precaución significa que el uso correcto o indebido de un instrumento puede causar daños al instrumento o poner en peligro la integridad de una muestra. El siguiente símbolo y el mensaje asociado son un ejemplo típico de los mensajes que alertan del riesgo de dañar el instrumento o la muestra.

Advertencia: los instrumentos y el software de Waters se pueden utilizar para el análisis o procesamiento de productos de origen humano, microorganismos inactivados potencialmente infecciosos, así como otros materiales de origen biológico. Con el fin de evitar infecciones con estos agentes, se debe considerar que todos los líquidos biológicos son infecciosos, cumplir las buenas prácticas de laboratorio, y consultar cualquier duda respecto a la utilización y el manejo correctos de estos agentes al responsable de seguridad para riesgos biológicos de la organización. La última edición de la publicación Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) de los NIH (Institutos Nacionales de Salud) de Estados Unidos incluye precauciones específicas.

Advertencia: los instrumentos de Waters se pueden utilizar para analizar o procesar sustancias potencialmente peligrosas. Para evitar lesiones con cualquiera de estos materiales, el usuario debe familiarizarse con los materiales y sus riesgos, cumplir las buenas prácticas de laboratorio (GLP), y consultar cualquier duda respecto a la utilización y el manejo correctos de estos materiales al representante de seguridad de la organización. La última edición de la publicación Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Disposal of Chemicals, del Consejo Nacional de Investigación de Estados Unidos incluye indicaciones generales.

Símbolo de precaución A-5

Advertencias que se aplican a todos los instrumentos de Waters

Al utilizar este dispositivo se deben seguir los procedimientos estándar de control de calidad y las indicaciones de uso del equipo detalladas en esta sección.

Precaución: para evitar que se produzcan daños, no utilizar sustancias abrasivas ni disolventes para limpiar la cubierta en la que se aloja el instrumento.

Atención: los cambios o modificaciones hechos a esta unidad que no hayan sido expresamente aprobados por la entidad responsable del cumplimiento pueden anular la autorización del usuario para utilizar el equipo.

Advertencia: se recomienda precaución cuando se trabaje con tubos de polímero sometidos a presión:• El usuario deberá protegerse siempre los ojos cuando trabaje cerca de tubos

de polímero sometidos a presión.• Extinguir todas las llamas cercanas.• No se debe trabajar con tubos que se hayan doblado o sometido a altas

presiones.• Es necesario utilizar tubos de metal cuando se trabaje con tetrahidrofurano

(THF) o ácidos nítrico o sulfúrico concentrados.• Hay que tener en cuenta que el diclorometano y el dimetilsulfóxido dilatan

los tubos no metálicos, lo que reduce su presión de ruptura.

Advertencia: el usuario debe ser consciente de que si el equipo se utiliza de forma distinta a la especificada por el fabricante, las medidas de protección del equipo podrían resultar insuficientes.

Advertencia: para evitar el riesgo de incendio, hay que cambiar los fusibles por otros del tipo y categoría impresos en los paneles adyacentes a las cubiertas de los fusibles del instrumento.


Símbolos eléctricos y de manejo

Símbolos eléctricosEstos símbolos pueden aparecer en los manuales del usuario y en los paneles delantero o trasero del instrumento.

Encendido

Apagado

En espera

Corriente continua

Corriente alterna

Terminal de protección del conductor

Terminal del chasis o armazón

Fusible

Símbolo de reciclaje: no desechar en los contenedores de residuos municipales.

Símbolos eléctricos y de manejo A-7

Símbolos de manejoLos siguientes símbolos de manejo y su texto adjunto pueden aparecer en las etiquetas del embalaje exterior de un instrumento o componente de Waters.

Mantener en posición vertical

No mojar

Frágil

No utilizar ganchos


B Especificaciones

Especificaciones del Detector FLR ACQUITY UPLC

Indicación: las especificaciones indicadas en este apéndice dependen de las condiciones del laboratorio. Se recomienda consultar la ACQUITY UPLC Site Preparation Guide (Guía de preparación de la instalación del Sistema ACQUITY UPLC) o ponerse en contacto con el Servicio Técnico de Waters para obtener más información sobre las especificaciones.

Especificaciones ambientales


Temperatura de funcionamiento De 4 a 40 °C (de 39.2 a 104 °F)

Humedad de funcionamiento Del 20 al <95%, sin condensación

Temperatura de transporte y almacenamiento

De −30 a 60 °C (de −22 a 140 °F)

Humedad de transporte y almacenamiento

Del 0 al <95%, sin condensación

Especificaciones eléctricas


Clase de proteccióna Clase I

Categoría de sobrevoltajeb II

Grado de contaminaciónc 2

Protección contra la humedadd Normal (IPXO), interiores

Voltajes, nominales CA conectada a tierra

Altitud 2000 m (6561.6 pies)

Especificaciones del Detector FLR ACQUITY UPLC B-1

Grado de contaminación 2

Requisitos del suministro eléctrico De 100 a 240 VCA

Frecuencia de la línea De 50 a 60 Hz

Consumo 280 VA (nominal)

Salidas Cuatro salidas (2 analógicas y 2 de eventos)

Entradas Cuatro entradas de eventos

a. Clase de protección I: el esquema de aislamiento utilizado en el módulo como protección frente a descargas eléctricas. La clase I identifica un único nivel de aislamiento entre las partes con tensión (cables) y las partes conductoras expuestas (paneles metálicos), en el que las partes conductoras expuestas están conectadas a un sistema de toma de tierra. A su vez, este sistema de toma de tierra está conectado a una tercera clavija (clavija de tierra) en el enchufe del cable de alimentación eléctrica.

b. Categoría II de sobrevoltaje: se refiere a los módulos que reciben su alimentación eléctrica de una ubicación local, como una toma eléctrica de pared.

c. Grado 2 de contaminación: medida de contaminación en los circuitos eléctricos, que puede producir una reducción de la fuerza dieléctrica o de la resistividad superficial. El grado 2 solo hace referencia a la contaminación normalmente no conductora. Sin embargo, en ocasiones, se puede esperar una conductividad temporal provocada por la condensación.

d. Protección frente a humedad: normal (IPXO). IPXO significa que no existe protección frente a la entrada de ningún tipo de goteo o de agua pulverizada. La X es un marcador de posición que identifica la protección frente al polvo, si procede.

Especificaciones de funcionamiento


Intervalo de longitudes de onda

De 200 nm a 890 nm (excitación)De 210 nm a 900 nm (emisión)

Ancho de banda 20 nm

Exactitud de la longitud de onda

± 3 nm

Repetibilidad de la longitud de onda

± 0.25 nm

Sensibilidada Relación señal-ruido > 1000 (espectro Raman del agua)

Intervalo de medición De 0.001 a 10000 EU

Especificaciones eléctricas (continuación)


B-2 Especificaciones

Adquisición de datos Hasta 80 Hz

Funcionamiento desatendido

Sensor de fugas, datos de diagnóstico de 96 horas mostrados mediante el software de la Consola ACQUITY UPLC.

Especificaciones de los componentes ópticos

Fuente de luz Lámpara de arco de Hg/Xe (garantía de 1000 horas)

Diseño de la cubeta de flujo

Iluminación axial

Volumen de la cubeta < 2 μL

Límite de presión 3447 kPa (34 bar, 500 psi) para la cubeta de flujo estándar

Materiales Acero inoxidable, sílice fundida, FEP, PEEK™

a. Condiciones: 2 Hz, 2s FTC, Ex 416 nm, EM 365 nm, modo de λ único.

Especificaciones de funcionamiento (continuación)


Especificaciones del Detector FLR ACQUITY UPLC B-3

B-4 Especificaciones

Índice

AAdvertencia de peligro biológico A-4Advertencia de peligro químico A-5Advertencia de reventón A-3Alimentación

Fuente 1-14Indicador LED 3-4

AnálisisPreparación 3-6Realizar 3-6

ApagarA largo plazo 3-11Entre análisis 3-10Indefinidamente 3-11Menos de 72 horas 3-11

BBandeja de recogida para múltiples

detectores, instalar 2-9

CCalibración manual de la longitud de

onda 1-14Calibración, tubo fotomultiplicador

(PMT) 1-12Clasificación ISM viComponentes electrónicos 1-13Componentes ópticos 1-9Conectores de señales de E/S 2-12Conexión de los tubos 2-5Conexiones

Ethernet, realizar 2-12Fuente de alimentación 2-16Señales, realizar 2-14

Conexiones de señales, realizar 2-14Conjunto óptico

Monocromador de emisión 1-10Monocromador de excitación 1-10

Trayectoria de la luz 1-10Consejos de seguridad A-1Contrapresión, regulador 2-8

Explicación 2-5Representación 2-8

Control de la puesta a cero automática 3-6

Control Reset, detector 3-6Cromatografía, fluorescencia 1-2Cuantificación 1-5Cubeta

Generalidades 1-4Instalar 3-9

Cubeta de flujo 1-4, 1-9, 1-11Enjuagar 4-12Enjuague inverso 4-14Representación 2-7Sustituir 4-15

DDesgasificar

Eluyentes 4-4Ventajas 1-23

Destinatarios y finalidad vDetector

Apagar 3-10, 3-11Conexión de los tubos 2-5Configurar 2-2Control Reset 3-6Encendido 3-2Generalidades 1-8Instalar 2-3Puesta en marcha 3-2Superficie exterior, limpiar 4-23

DiseñoElectrónico 1-9Óptico 1-9

Índice-1

EEluyente

Desgasificar 4-4Filtro 4-4

Eluyentes inflamables A-4Emisión

Componentes ópticos del monocromador 1-10

Monocromador 1-11Selección de la longitud de onda 1-5Unidades 1-6

Enjuagar, cubeta de flujo 3-3, 4-12Enjuague inverso, cubeta de flujo 4-14Especificaciones

Adquisición de datos B-3Ambientales 2-2, B-1, B-22Ancho de banda B-2Componentes ópticos B-3Eléctricas B-1Exactitud de la longitud de

onda B-2Funcionamiento B-2Intervalo de longitudes de onda B-2Intervalo de medición B-2Reproducibilidad B-2Sensibilidad B-2

Espectro, barrido 1-17Espejos, elipsoidales y parabólico 1-9Ethernet

Conexiones, realizar 2-12Interfaz de comunicación 1-14

EU 1-6Excitación

Componentes ópticos del monocromador 1-10

Fuentes de energía 1-3Fuentes de luz 1-3Monocromador 1-11Selección de la longitud de onda 1-3

ExtraerCubeta de flujo 4-15Módulo de la lámpara 4-17

FFase móvil, para el apagado 3-11Fase móvil, preparar 3-6Filtro amplio 1-4Filtro de segundo orden 1-8, 1-9Filtros

Botella de eluyentes 4-4Erbio 1-8Segundo orden 1-8, 1-9

Filtros de luz 1-3Finalidad y destinatarios vFluorescencia 1-2

Cromatografía 1-2Proceso de detección 1-2Unidades normalizadas 1-6

Formación de precipitados, prevención 3-10

Fotomultiplicador PMT 1-5, 1-9Calibración 1-12Parámetro de ganancia 1-19Sensibilidad 1-12

Fuente de alimentación de CC 1-14Fuente de alimentación,

conexiones 2-16Fuentes de energía, excitación 1-3Fuentes de luz, excitación 1-3Funcionamiento, teoría y principios de

la fluorescencia 1-1Fusibles, sustituir 4-22

GGráfico de diferencias 1-16

HHardware, preparar 3-1

Índice-2

IIndicaciones de uso del equipo iv, A-6Indicador LED

Alimentación 3-4Lámpara 3-4, 3-5Supervisar 3-4

InstalarBandeja de recogida para múltiples

detectores 2-9Cubeta 3-9Detector 2-3Lámpara 4-21

LLámpara

Control de encendido/apagado 3-5Energía 1-18Funcionamiento 1-18Indicador LED 3-4, 3-5Instalar 4-21Módulo, extraer 4-17Sustituir 4-17Tiempo de enfriamiento 4-18

Lámpara de mercurio-xenónComponentes ópticos 1-9

Limpiar, superficie exterior del detector 4-23

Longitud de ondaEspecificaciones de exactitud B-2Especificaciones de intervalo B-2Mensaje de fallo de

verificación 1-14Selección

Emisión 1-5Excitación 1-3

Seleccionar 1-24

MMantenimiento

Consideraciones 4-3

I

Sensor de fugas 4-4Sistemático 4-4

MaxPlot (Cromatograma de máxima intensidad) 1-16

Método de prueba, crear 3-7Modo

3D 1-8, 1-16Espectro lambda-lambda 1-8Lambda-lambda 1-17Longitud de onda múltiple 1-16Monocanal 1-15Multicanal 1-16Reposo 1-8

MonocromadorEmisión 1-11Excitación 1-11Generalidades 1-3

Muestra, excitación 1-4Multicanal

Funcionamiento 1-5Modo 1-16

OÓptica

Especificaciones de los componentes B-3


Optimización del método 1-20Orificio de canalización del drenaje 2-3

PPanel de control, descripción

general 3-4Peligro de descarga eléctrica del

espectrómetro de masas A-4Principios de funcionamiento 1-1Pruebas diagnósticas de puesta en

marcha 1-23

Índice-3

QQuimioluminiscencia 1-2

RRanuras

Entrada 1-9Salida 1-9

Red de difracción 1-9Difracción 1-9Monocromador 1-3

Regulador, contrapresión 2-8Representante autorizado en la CE viRepuestos 4-3Ruido, filtración 1-12

SSales, prevención del precipitado 3-10Seguridad

Consideraciones, mantenimiento 4-3

Selectividad 1-5Sensibilidad 1-5Sensor de fugas 2-7, B-3

Mantenimiento 4-4Solucionar errores 4-5Sustituir 4-9

SímbolosAdvertencia A-2Eléctricos A-7Manejo A-8Precaución A-5

Sistema de control de goteo, colocación correcta 2-3

Supervisar, indicadores LED de los módulos del sistema 3-4

SustituirCubeta de flujo 4-15Filtros de la botella de

eluyentes 4-4Fusibles 4-22Lámpara 4-17

TTarjeta CPU 1-14Tarjeta personalizada 1-13Tarjeta preamplificadora 1-13Teoría de funcionamiento 1-1Tubo fotomultiplicador 1-5, 1-9

Calibración 1-12Parámetro de ganancia 1-19Sensibilidad 1-12

UUnidades de energía 1-7Unidades normalizadas de

fluorescencia 1-6Uso previsto v

Índice-4

detector de fluorescencia acquity uplc - guía de inicio rápido...v destinatarios y finalidad la...

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