การพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณแบบกระดาษเพอการวเคราะหแบบรผลรวดเรว
ของฤทธตานอนมลอสระในอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาต
วมล แสงนาค
วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต
สาขาวชาเคมศกษา
คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา
สงหาคม 2558
ลขสทธเปนของมหาวทยาลยบรพา
การวจยนไดรบทนอดหนนการวจย
งบประมาณเงนรายไดจากเงนอดหนนจากรฐบาล (งบประมาณแผนดน) มหาวทยาลยบรพา
ประจาปงบประมาณ 2558
กตตกรรมประกาศ
วทยานพนธฉบบนสาเรจลงไดดวยความกรณาจาก ดร. ยภาพร สมนอย อาจารยทปรกษา
ทกรณาใหคาปรกษาแนะนาแนวทางทถกตอง ชวยเหลอในทกปญหาการวจยพรอมทงใหกาลงใจ
ตลอดจนแกไขขอบกพรองตาง ๆ ดวยความละเอยดถถวนและเอาใจใสดวยดเสมอมา ขาพเจารสก
ซาบซงเปนอยางยง จงขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ โอกาสน
ขอขอบพระคณ คณาจารยประจาภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา
ทกทาน ทชวยสอนวชาเคมในสวนของเนอหา และปฏบตการเคมอยางเขมขน เพอปลกฝงให
ขาพเจาเปนนกวทยาศาสตร และเปนครวทยาศาสตรทมความรในภาคทฤษฎ และภาคปฏบต
วชาเคมเปนอยางด
ขอกราบขอบพระคณ คณพอวเชยร แสงนาค คณแมสายทพย กลาศร และสมาชกใน
ครอบครวทกคนทใหกาลงใจ และสนบสนนขาพเจาเสมอมา
คณคาและประโยชนของวทยานพนธฉบบน ขาพเจาขอมอบเปนกตญ�กตเวทตาแด
บพการ บรพาจารย และผมพระคณทกทานทงในอดตและปจจบน ททาใหขาพเจาเปนผมการศกษา
และประสบความสาเรจมาจนตราบเทาทกวนน
วมล แสงนาค
บทท 1
บทนา
1.1 ความเปนมาและความสาคญของปญหา
อนมลอสระ (free radical) หมายถงสารทมอเลกตรอนโดดเดยวในอะตอมหรอโมเลกล
พบในสงแวดลอม เชน บรรยากาศ ควนบหร ในสงมชวตและในเซลล โดยเฉพาะอยางยง
กระบวนการผลตพลงงานภายในเซลล หรอกระบวนการเมทาบอลซม (metabolism) โดยมการ
เคลอนยายอเลกตรอนออกจากโมเลกลของออกซเจน ทาใหอเลกตรอนในโมเลกลออกซเจนไม
สมดลกลายเปนอนมลอสระและวองไวในการเขาทาปฏกรยา เมออยภายในรางกายสามารถทาลาย
ชวโมเลกลทกประเภท ทาใหเกดความเสยหายแกโมเลกลทไดรบผลกระทบ ซงเปนสาเหตทาให
เซลลตาย การเกดการกลายพนธของดเอนเอในเซลลและกอใหเกดโรคตาง ๆ เชน โรคชรา
โรคมะเรง โรคหลอดเลอดหวใจตบตน โรคความจาเสอม เปนตน ถาอนมลอสระปนเปอนอยใน
อาหาร จะทาใหอาหารมกลน สและรสชาตเปลยนแปลงไป เนองจากอนมลอสระสามารถเขาทา
ปฏกรยากบกรดไขมนในอาหารได
สารตานอนมลอสระ (antioxidants) เปนสารพวกเอนไซมหรอสารอนทสามารถชะลอ
หรอทาปฏกรยากบอนมลอสระโดยตรงเพอกาจดอนมลอสระใหหมดไปหรอหยดปฏกรยาลกโซ
ไมใหดาเนนตอไป โดยปกตแลวในรางกายของคนเราจะสรางเอนไซมตานอนมลอสระขนมา
ควบคมปรมาณสารอนมลอสระใหอยในภาวะสมดล แตถารางกายอยในพนททเสยงจะทาให
รางกายผลตอนมลอสระมากเกนไป เกดภาวะเครยดออกซเดชน (oxidative stress) ซงจะทาใหเกด
โรคตาง ๆ ผทอยในภาวะเสยงจาเปนตองไดรบสารตานอนมลอสระจากภายนอกเขาไปดวยเปน
ประจา ซงสารดงกลาวอยใน ผก ผลไมและสมนไพร นอกจากนทางดานเศรษฐกจ ธรกจสงออก
อาหารไดนาสารตานอนมลอสระมาใชในการชะลอการเนาเสยของอาหาร ดวยเหตนสารตานอนมล
อสระจงมความสาคญ ปจจบนจงมการศกษาคนควาเกยวกบสารตานอนมลอสระเพอเปนขอมลแก
ผบรโภค อตสาหกรรมเกยวกบการผลตยารกษาโรคและธรกจสงออกอาหาร
ปจจบนไดมการศกษาเกยวกบการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระเชงคณภาพและเชง
ปรมาณ วธการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระเชงคณภาพทนยม ไดแก การตรวจวดสารโพลฟนอล
ชนดตาง ๆ โดยการทาใหเกดส โครมาโตกราฟแบบชนบาง (TLC) และการตรวจหาสารตานอนมล
อสระชนดตางๆ โดยใชเครอง HPLC สวนวธการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระเชงปรมาณทนยม
ไดแก วธ FRAP assay, วธ ABTS radical cation decolorization assay และ วธ DPPH radical
2
scavenging assay ซงวธ DPPH radical scavenging assay เปนวธทใชทดสอบฤทธตานอนมลอสระ
อยางกวางขวาง เพราะเปนวธททงาย สามารถรผลฤทธตานอนมลอสระไดอยางรวดเรว เนองจาก
ปฏกรยาทใชในการวเคราะหจะเกยวของกบ DPPH และสารตานอนมลอสระในตวอยางเทานน
วธ DPPH radical scavenging assay แบบดงเดม เปนการทดสอบโดยใชสารอนมลอสระ
ดพพเอช (DPPH • , 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical) ซงเปนสารสมวงทาปฏกรยากบสารตาน
อนมลอสระในสารละลายเอทานอล เปนระยะเวลาประมาณ 30 นาท สมวงของดพพเอชจะจางลง
ทาใหสามารถหาการเปนสารตานอนมลอสระไดโดยวดสทจางลงดวยเครองสเปกโตโฟโตรมเตอร
(spectrophotrometer) ทความยาวคลน 515 นาโนเมตร ขอเสยของวธ DPPH radical scavenging
assay แบบดงเดมคอ ตองใชสารตวอยางและรเอเจนทปรมาตรมากในการวเคราะหแตละตวอยาง
และใชเวลานานในการวเคราะห
ตอมาไดมการพฒนาการวเคราะหสารตานอนมลอสระดวยการวเคราะหบนถาดหลม
(96 well microtiter plate) โดยใสสารละลายดพพเอชผสมกบตวอยางสารตานอนมลอสระบนถาด
แลวใชเครอง microplate reader spectrophotometer วเคราะหสทจางลงของสารละลายดพพเอช ซง
สามารถวเคราะหครงเดยวไดหลายตวอยาง แตเครอง microplate reader spectrophotometer เปน
เครองมอเฉพาะ มราคาแพง และผใชตองมความรในการใช
เทคโนโลยของไหลจลภาค (microfluidic technology) เปนเทคโนโลยทสามารถนามา
ประยกตใชในการตรวจวเคราะหเชงชวเคม หรอทางการแพทยไดอยางมประสทธภาพเนองจากม
ขอดคอใชปรมาณสารตวอยางในการตรวจวเคราะหในปรมาณตา ระยะเวลาในการตรวจวเคราะห
สน อกทง ณ ปจจบน กระดาษกรอง (filter paper) เปนวสดทไดรบความสนใจในการนามาสราง
อปกรณตรวจวดของไหลจลภาค เนองจากเปนวสดทมราคาถก
ในงานวจยนจะไดพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอวเคราะหแบบ
รผลเรวของความสามารถการตานอนมลอสระในตวอยางทสนใจ โดยอปกรณทพฒนาขนม
คณสมบต ไดแก ทดสอบตวอยางไดหลายๆตวอยางในคราวเดยวกน ใชสารตวอยางและรเอเจนท
ในการวเคราะหปรมาณนอย ใชเวลาการวเคราะหนอย มคาการวเคราะหถก และใชเครองมอการ
ตรวจวดสญญาณทไมแพง อกทงใหผลการวเคราะหสารตานอนมลอสระในตวอยางมความถกตอง
และแมนยา
3
1.2 วตถประสงคของงานวจย
เพอพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอการวเคราะหคณสมบต
ในการตานอนมลอสระในตวอยางทสนใจ
1.3 ขอบเขตของงานวจย
1.พฒนาวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอการวเคราะหคณสมบตในการ
ตานอนมลอสระของสารตานอนมลอสระมาตรฐาน (gallic acid , trolox, caffeic acid, quercetin
และ L-ascorbic acid)โดยใชเอทานอลเปนตวทาละลาย
2. ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวย DPPH assay บน
อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ สภาวะทศกษา ไดแก ความเขมขนของ DPPH เรมตนทเหมาะสม
เวลาในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH และสารตานอนมลอสระ (gallic Acid และ trolox)ท
เหมาะสม โดยสภาวะทดจะตองสามารถตรวจวดความสามารถในการตานอนมลอสระไดรวดเรว
แมนยา มความไวสง และมอตราการเกดปฏกรยาทรวดเรว
3.ทดสอบประสทธภาพของวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
ทพฒนาขนดวยสารมาตรฐานทมฤทธตานอนมลอสระ(gallic acid , trolox, caffeic acid, quercetin
และ L-ascorbic acid) โดยหาคาการวเคราะห (analytical feature) ไดแก ชวงความเปนเสนตรง
(linear range) ความสามารถในการทาซ า
(reproducibility, %RSD) ขดจากดการตรวจวด (limit of detection)
4. เปรยบเทยบประสทธภาพความสามารถในการวดความสามารถในการตานอนมล
อสระในอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาตระหวางวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษท
พฒนาขน กบวธดพพเอชแบบดงเดม โดยใชตวอยางใบชาแหง
1.4 ประโยชนทคาดวาจะไดรบจากงานวจย
1. วธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ เปนประโยชนแกหนวยงานทตองการ
ทดสอบฤทธตานอนมลอสระของอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาตทคนพบ เพอนาไปรกษา
สภาพผกผลไมทสงออก
2.วธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ เปนประโยชนแกประชาชนทตอง
การทราบถงคณสมบตสารตานอนมลอสระทมอยในผกและผลไมทวไป
4
1.5 นยามศพทเฉพาะ
1. วธดพพเอช (DPPH assay) หมายถง วธการวเคราะหความสามารถในการเปนสาร
ตานออกซเดชน (antioxidant) ซงใช รเอเจนต คอ 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
2. Intensity หมายถง คาความเขมสทไดจากการวเคราะหในโปรแกรม ImageJ
3. อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (A microfluidic paper-based analytical device,
microPAD) หมายถงตวตรวจวดของไหลจลภาคททามาจากกระดาษกรอง whatman เบอร 1
สรางบรเวณสวนกนทไมชอบน า (hydrophobic barrier) ดวยการตดกระดาษกรองขนาด
1 cm. x 1 cm. และเคลอบกระดาษกรองดงกลาวดวยพลาสตกเคลอบบตรทมการเจาะรขนาดเสน
ผานศนยกลาง 0.5 cm.ไวสาหรบในการวเคราะหสาร
ภาพท 1-1 แสดงอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
พลาสตกเคลอบบตร กระดาษกรองขนาด
1cm.x1cm.
สวนทชอบน าสาหรบวเคราะหสาร
บทท 2
เอกสารและงานวจยทเกยวของ
การวจยครงนไดศกษาเอกสารและงานวจยทเกยวของเพอนามาประกอบการดาเนนการ
ตามลาดบดงน
2.1 อนมลอสระและสารตานอนมลอสระ
2.2 Diphenylpicryhydrazyl (DPPH) Radical Scavenging Assay
2.3 อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper based device)
2.4 ขอมลเกยวกบใบชาแหง
2.5 งานวจยทเกยวของ
2.1 อนมลอสระและสารตานอนมลอสระ
บหรน พนธสวรรค (2556,หนา 277-279) ไดกลาวถงอนมลอสระและสารตาน
อนมลอสระไวดงน
อนมลอสระ (free radicals) หมายถง สารทมอเลกตรอนโดดเดยว (unpaired
electrons) ในอะตอมหรอโมเลกล พบไดทกแหงทงในสงแวดลอม ในสงมชวต และในเซลล
โดยเฉพาะอยางยงกระบวนการผลตพลงงานภายในเซลล หรอจากกระบวนการเมทาบอลซม
(metabolism) โดยมการเคลอนยายอเลกตรอนออกจากโมเลกลของออกซเจนทาใหอเลกตรอนใน
โมเลกลออกซเจนไมสมดลกลายเปนอนมลอสระและวองไวในการเขาทาปฏกรยามาก และสามารถ
ดงอเลกตรอนจากโมเลกลอนมาแทนทอเลกตรอนทขาดหายไปเพอใหตวเองเกดความสมดลหรอ
เสถยร ซงปฏกรยานจะเกดขนอยางตอเนองเปนปฏกรยาลกโซ และเกดขนในเซลลตลอดเวลา
ดงสมการ 1 และ 2
สมการ 1 : R• + O2 ROO•
สมการ 2 : ROO• + RH ROOH + R•
นอกจากนอนมลอสระสามารถทาลายชวโมเลกลทกประเภททงในเซลลและ
สวนประกอบของเซลลสงมชวต ซงเปนสาเหตใหเซลลตาย การเกดการกลายพนธของดเอนเอ
ในเซลล และกอใหเกดโรคตาง ๆ ไดแก โรคชรา (aging)โรคมะเรง (cancer) โรคหวใจขาดเลอด
(coronary heart disease) โรคความจาเสอม (Alzheimer’s disease) โรคขออกเสบ (arthritis) โรค
ภมแพ(allergies) โรคความดนโลหต โรคเหงอก โรคเกยวกบสายตา ความผดปกตของปอดและ
ระบบประสาท โรคเกยวกบทางเดนหายใจ โรคเกยวกบความผดปกตของผวหนง และโรคลาไส
6
อกเสบ เปนตน อนมลอสระนอกจากจะเกดภายในสงมชวตแลวอนมลอสระสามารถเกดจาก
ภายนอกสงมชวตหรอในสงแวดลอม ไดแก การไดรบเชอโรค เชน การตดเชอโรคไวรสหรอเชอ
แบคทเรย โรคเกยวกบภมคมกน (immune diseases) เชน ขออกเสบ รมาตอยด เปนตน จากรงส เชน
รงสอลตราไวโอเลต รงสเอกซ รงสแกมมา จากมลภาวะ เชน ควนบหร แกสจากทอไอเสย
เชน ไนตรสออกไซด ไนโตรเจนไดออกไซด เขมาจากเครองยนต ฝ นจากกระบวนการประกอบ
อาหาร เชน การยางเนอสตวทมสวนประกอบของไขมนสง การนาน ามนทใชทอดอาหารทม
อณหภมสง ๆ กลบมาใชอก การทาใหเกดอาหารประเภทเกรยม ไหม หรอเกดจากการปงยาง จากยา
บางชนด เชน โดโซรบซน (doxorubicin) เพนนซลลามน (penicillamine) พาราเซตามอล
(paracetamol)
สารตานอนมลอสระ (antioxidants) เปนสารทมความสาคญตอกระบวนการออกซไดซ
อนมลอสระ หรอสามารถยบย งปฏกรยาออกซเดชน โดยในสงมชวตจะมระบบการปองกนการ
ทาลายเซลลและเนอเยอจากอนมลอสระ ประกอบดวยสารตานอนมลอสระมากมายหลายชนดททา
หนาทแตกตางกนไป โดยสารตานอนมลอสระเหลานมกลไกการทางานตานอนมลอสระดวยกน
หลายแบบ เชน ดกจบอนมลอสระ(radical scavenging) การยบย งการทางานของออกซเจนทขาด
อเลกตรอน (singlet oxygen quenching) จบกบโลหะทสามารถเรงปฏกรยาออกซเดชนได (metal
chelation) หยดปฏกรยาการสรางอนมลอสระ (chain-breaking) เสรมฤทธ (synergism) และยบย ง
การทางานของเอนไซม (enzyme inhibition) ทเรงปฏกรยาอนมลอสระ เปนตน ตวอยางแสดงการ
ดกจบอนมลอสระดงสมการ 3 และ 4
สมการ 3 : R• + AH RH + A•
สมการ 4 : RO• + AH ROH + A•
โดย R• และ RO• คอ อนมลอสระ และ AH คอ สารตานอนมลอสระ
แหลงทมาของสารตานอนมลอสระม 2 แหลง ไดแก สารตานอนมลอสระสงเคราะห
(synthetic antioxidants) และสารตานอนมลอสระจากธรรมชาต (natural antioxidants) ซงสารตาน
อนมลอสระสงเคราะหเกดจากการกระบวนการสงเคราะหทางเคม โดยเปนสารประกอบฟนอลก
ไดแก propylgallate, 2-butylated hydroxyanisole, 3-butylatehydroxyanisole, BHT (butylated
hydroxytoluene) และ tertiary butylhydroquinone สารสงเคราะหดงกลาวนยมนามาใชใน
อตสาหกรรมอาหารเพอยบย งการเกดปฏกรยาออกซเดชนของไขมนทเปนสาเหตททาใหอาหารม
กลน ส และรสชาตเปลยนแปลงไป สารสงเคราะหนมสภาพคงตวกวาสารตานอนมลอสระจาก
ธรรมชาตแตมขอจากดในดานความปลอดภยในการบรโภค ขณะทสารตานอนมลอสระจาก
ธรรมชาตสามารถพบไดในสงมชวตทงพชและสตว ซงเปนไดทงเอนไซม วตามนและสารอน ๆ
7
ตวอยางของสารตานอนมลอสระทเปนวตามน เชน vitamin C (เปนสารตานอนมลอสระทไซโต
พลาซม) vitamin E (เปนสารตานอนมลอสระทเมมเบรน) และglutathione (เปนสารตานอนมล
อสระทปองกนอนตรายจากอนมลอสระทไซโตพลาซมและเมมเบรน) สวนสารตานอนมลอสระ
ทเปนเอนไซมไดแก glutathione peroxidase (GPX), glutathionereductase และ glutathione
transferase ซงทาหนาททาใหโมเลกลของไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) เปนออกซเจนและน า
สวนเอนไซม superoxid dismutase(SOD) สามารถเปลยน O2•- เปน H2O2 สารตานอนมลอสระอน
ๆ ไดแก carotenoids และ ubiquinones เปนสารตานอนมลอสระสามารถปองกนอนมลอสระ
ออกซเจนทงภายในเซลลและภายนอกเซลล
ในภาวะปกตรางกายของคนเราจะมการปองกนการสะสมสารอนมลอสระโดยการสราง
เอนไซมตานอนมลอสระขนมาควบคมปรมาณสารอนมลอสระใหอยในภาวะทสมดล และอกสวน
ไดจากสารตานอนมลอสระทรางกายรบประทานเขาไปจาพวกวตามน เบตาแคโรทน และแคโรท
นอยด รวมทงสารประกอบโพลฟนอล ซงสารดงกลาวไดจากพชผกและผลไม ตวอยางอาหารท
มเบตาแคโรทนสง ไดแก ผกใบเขยว เชน ตาลง และผกบง อาหารทมสเหลอง เชน แครอท มะละกอ
สก มะมวงสก มะเขอเทศ ฟกทอง อาหารทมวตามนซ (vitamin Cหรอ ascorbic acid) สง ไดแก พช
ผกสเขยว และผลไมรสเปรยว เชน ตาลง ผกบง พรกหยวก ฝรง มะขามปอม สม มะนาว สบปะรด
(วตามนซจากพชผกดงกลาวมฤทธตอตานอนมลอสระทแรงมากและละลายน าไดด) วตามนอ
(vitamin E หรอtocopherol) ละลายไดดในน ามน โดยวตามนอมในน ามนจากเมลดพชชนดตาง ๆ
เชน ราละเอยดในพวกธญพชทไมขดขาว ขาวโพด ขาวกลอง ถวแดง ถวเหลอง ผกกาดหอม เมลด
ทานตะวน งา น ามนรา
2.2 Diphenylpicryhydrazyl (DPPH) Radical Scavenging Assay
เปนการทดสอบดวยวธทางเคมโดยใชอนมลอสระดพพเอช (DPPH•,diphenyl-
picryhydrazyl radical) (Pisoschi และ Negulescu ; 2011) ซงเปนสารสงเคราะหทอยในรปอนมล
อสระทเสถยรและมสมวง สามารถดดกลนแสงไดสงสดโดยใชเครองสเปกโตโฟโตรมเตอร
(spectrophotometer) ทความยาวคลน 515 นาโนเมตร เมอ DPPH• ทาปฏกรยากบสารตานอนมล
อสระ (สารทใหอเลกตรอน) DPPH จะกลายเปนโมเลกลทเสถยร ซงจะทาใหสมวงจางลงจนเปนส
เหลอง ดงสมการ 5
8
สมการ 5 :
สมวง สเหลอง
ทาใหสามารถหาการเปนสารตานอนมลอสระของสารตวอยางได โดยสรางกราฟมาตรฐานระหวาง
คาการดดกลนแสงทลดลงกบความเขมขนของสารตานอนมลอสระ ซงมการนาวธดงกลาวไป
ประยกตใชวเคราะหหาปรมาณสารตานอนมลอสระในสารสกดของผลไมและน าผลไม
โดยสารมาตรฐานทใชในการเทยบฤทธตานอนมลอสระ คอ โทรลอกซ (trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-
tetramethylchlorman-2-carboxylic acid) แสดงคาเปน TEAC (trolox equivalent antioxidant
capacity) มหนวยเปน mM/mg หรอ µM/mg และรายงานผลเปนคา µM TE/fresh mass
หรอกรดแกลลก (gallic acide) แสดงคาเปน GAE (gallic acid equivalent) ซงมหนวยคลายคา
TEAC ขอดของวธน คอ เปนวธทสามารถวเคราะหฤทธตานอนมลอสระไดงาย สะดวก และรวดเรว
กวาวธอนๆ เนองจากการวเคราะหเกยวของกบรเอเจนทเพยงตวเดยวคอ DPPH จงนยมใชเปนวธ
ทดสอบฤทธตานอนมลอสระเบองตนแบบคดกรองของสารตวอยางทสนใจ สวนขอเสย คอDPPH•
คอนขางเสถยรไมไวตอปฏกรยาเหมอนอนมลอสระทเกดขนในรางกายจรง จงทาใหเกดปฏกรยาได
ชา ทาใหคาการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระทวดไดนอยกวาความเปนจรง และตองวดในปฏกรยา
ทเปนแอลกอฮอล
2.3 อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper based device)
อปกรณตรวจวดของไหลจลภาคแบบกระดาษ หรออปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
(microfluidic paper-based analytical device, µPADs) เปนเทคโนโลยทางเลอกหนงของการสราง
อปกรณตรวจวนจฉยโรคทางคลนก ททาไดงาย ตนทนตา พกพาได สามารถใชแลวทง สาหรบใช
ในประเทศกาลงพฒนา
Martine et al.(2008) ไดกลาววาการผลตอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทาไดโดยสราง
สวนทไมชอบน า (hydrophobic barrier) ตามรปแบบทตองการลงบนกระดาษ ซงมผคดคน รเรมคอ
Whiteside Group ในป ค.ศ. 2007โดยไดสรางสวนทไมชอบน าดวยวธการฉายแสง
(photolithography) ผานเขาไปในพอลเมอรทมความวองไวแสง (photoresist polymer) และกระดาษ
โครมาโทรกราฟ (chromatography paper)
9
ในปจจบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถสรางสวนทไมชอบน าใหเปนลวดลาย
ตาง ๆไดดวยเทคนคตาง ๆ เชน การฉายแสง (photolithography) (Martine et al., 2008) การพมพ
ดวยไข (wax printing) (Carrilho et al., 2009) การวาดดวยปากกากนนา (permanent marker
plotting) (Jana et al., 2012) การฉาบเคลอบ (screen-printing)( Dungchai et al.,2011)และการใชมด
ตด (cutting knives) (Fenton et al., 2009) เปนตน รปแบบลวดลายของอปกรณตรวจวดแบบ
กระดาษมอยสองแบบ ไดแก แบบชองการไหลดานขาง (lateral flow) ดงภาพท 2-1 (A) ซงสาร
ตวอยางสามารถไหลไปบนแผนกระดาษในทอการไหลดวยแรงแคปปลลาร (capillary action) เรยง
ตามเยอกระดาษไปยงบรเวณตรวจวด (test zone) แลวเกดปฏกรยาระหวางสารตวอยางกบรเอเจนท
และแบบหลม (well) (Lisowski & Zarzycki, 2012) ดงภาพท 2-1(B) วเคราะหไดโดยการนาสาร
ตวอยางผสมกบรเอเจนทหยดลงไปในบรเวณทชอบน าของกระดาษ การวเคราะหปฏกรยาทเกดขน
ระหวางสารตวอยางกบรเอเจนท สามารถทาไดโดยการถายภาพ จากนนนาเขาโปรแกรมประมวล
ภาพ ImageJ แลววดคาความเขมส ซงคาความเขมสจะแปรผนตรงกบปรมาณสารทมอยในตวอยาง
(A) (B)
ภาพท 2-1 แสดงรปแบบของอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทสรางสวนทไมชอบน า (hydrophobic
barrier) ลงบนกระดาษ (A) แบบชองการไหลดานขาง (lateral flow) (B) แบบหลม (well)
(Jokerst et al., 2012)
2.4 ขอมลเกยวกบใบชาแหง
พชรย พรบดเวช (2552) ไดกลาวถงชาเกยวกบลกษณะทวไป และสรรพคณไวดงน
ชามชอสามญ คอ Tea ชอวทยาศาสตร คอ Camellia sinensis ชาแบงไดเปน 6 ประเภท ไดแก ชา
ขาว ชาเหลอง ชาเขยว ชาอหลง ชาดา และชาผเออร แตทพบเหนไดทวไป ไดแก ชาขาว ชาเขยว ชา
อหลง และชาดา ซงชาทกชนดสามารถทาไดจากตนชาตนเดยวกน แตผานกรรมวธแตกตางกน
ออกไป องคประกอบทางเคมในยอดใบชาสดจะประกอบดวยความชนประมาณ 75-80 % สวนท
10
เหลอเปนของแขงทงหมด องคประกอบทางเคมในสวนทเปนของแขงทงหมดแสดงดงตารางท 2-1
ซงองคประกอบเหลานจะสงผลตอคณภาพของชา
ตารางท 2-1 แสดงองคประกอบทางเคมของยอดใบแหงชา
Components Dry weight (%)
Flavanois
(-)-EGCG
(-)-EGC
(-)-ECG
(-)-EC
(+)-GC
(+)-C
Flavonal glucosides
Proanthocyanidins
Caffeine
Amino acids
Carbohydrates
Organic acids
Saponins
Pigments
Vitamins
Soluble minerals
Cellulose
Lignin
Polysaccharides
Lipids
Volatiles
18-32
9-14
4-7
2-4
1-3
1-2
0.5-1
3-4
2-3
3-4
2-4
3-5
0.5-2
0.04-0.07
0.5-0.8
0.6-1.0
2-4
6-8
4-6
4-10
2-4
0.01-0.02
11
ภาพท 2-2 แสดงลกษณะยอดใบชาและ ใบชาแหง (http://www.icontea.com/article-49.html)
ภาพท 2-3 แสดง13โครงสรางของคาเทชนทพบในใบชา
(-)-Epicatechin (EC)
(-)-Epigallocatechin gallate (EGCG)
(-)-Epicatechin gallate (ECG) (-)-Epigallocatechin (EGC)
(+)-catechin (C) (+)-Gallocatechin (GC)
(-)-catechin gallate(CG) (-)-Gallocatechin gallate(GCG)
O
OHOH
HO
OH
OH
OH
O
OOH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
OOH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
OHOH
HO
OH
OH
O
OHOH
HO
OH
OH
OH
O
OOH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
OHOH
HO
OH
OH
O
OOH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
12
ในยอดใบชาจะมปรมาณโพลฟนอล (polyphenols) ทงหมดประมาณ 10-35% (dry
weight) โดยสารประกอบโพลฟนอลนสวนใหญเปนสารในกลมฟลาโวนอยด (Flavonoids) ฟลาโว
นอยดเปน secondary metabolite ทแบงได 6 กลมคอ Flavones, flavanones, isoflavones, flavonols,
flavanols และ anthocyanins กลมของฟลาโวนอยดทพบมากทสดในชาคอ Flavanols ซงเรยกวา
Catechins (คาเทชน)
คาเทชน (Catechins) เปนชอเรยก Flavanols ในชา ซงมประมาณ 60-70% ของโพลฟ
นอลทงหมด กลมของ Catechins ทพบมากในชา ไดแก (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG),
(-)-Epigallocatechin (EGC), (-)-Epicatechin-3-gallate (ECG) และ (-)-Epicatechin (EC)
โดย Catechins เหลานมอยประมาณ 90% ของคาเทชนทงหมด กลมของ Catechins ทพบในปรมาณ
นอยลงมาไดแก (-)-Gallocatechin (GC), (+)-Catechin (C), (-)-Gallocatechin gallate (GCG)
และ (-)-Catechin gallate (CG) คาเทชนเปนสารไมมส ละลายน าได ใหรสขม และฝาด
ในชาประกอบดวยสารตานอนมลอสระประเภทฟลาโวนอยด ททรงพลงหลายชนด
โดยเฉพาะสาร Epigallocatechin gallate (EGCG) ซงเปนสารตานอนมลอสระทมฤทธแรง โดยม
ฤทธมากกวาวตามนอถง 20 เทา คาเทชนเปนสารตานอนมลอสระ สามารถจบกบอนมลอสระทเปน
สาเหตของโรคหลายชนด เชน โรคมะเรง โรคหวใจ และภาวะไขมนในเลอดสง เปนตน
2.5 งานวจยทเกยวของ
Fenton et al. (2009, pp. 124-129) ไดสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษรปแบบชองการ
ไหลดานขางใชสาหรบวเคราะหสารชวภาพทหลากหลาย โดยสรางอปกรณแบบกระดาษดวย
วธการตดดวยเครองตดอตโนมต (craft cutting machine) เคลอบกระดาษดวยพลาสตกใส
(larmination) ซงอปกรณทสรางมขอดไดแก ชวยลดการระเหยของรเอเจนท ชวยปองกนไมให
พนผวทจะทาการทดสอบปนเปอนและไมใหสารตวอยางและรเอเจนทรวออกจากอปกรณ มราคา
ถก เหมาะสาหรบไปใชในประเทศทกาลงพฒนา ผลตอปกรณไดครงละหลายอปกรณ
Zhang et al. (2006, pp. 219-224) ไดใชวธ 96-well microplate method วเคราะหหา
ปรมาณสารโพลฟนอล (polyphenol) ในสาหราย ณ ประเทศแคนนาดา ดวยวธ DPPH ทาการ
วเคราะหโดยผสมสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยางลงใน 96-well microplate แลววดสท
จางลงของ DPPH ดวยเครอง microplate reader จากการทดลองพบวา การวเคราะหดวยวธ96-well
microplate method จะใชเวลาในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระของสารไดนอย วเคราะหไดครง
ละหลายตวอยางและสามารถทาซ าไดด
13
Piletska et al. (2012, pp. 2038-2043) ไดพฒนารปแบบใหมของ Microtiter Plate
สาหรบตรวจวเคราะหทางการแพทย ซงพฒนาโดยมการตรงสารชวภาพและรเอเจนทไวทกระดาษ
ดงภาพท 2-4(A) แลวนาไปไวทถาดหลมทเปดแลววเคราะหการเกดปฏกรยาดวย microtiter plate
readers 7โดยไมมขนตอนอน ๆ เพมเตม แนวคดดงกลาวสามารถประยกตใชกบการวเคราะหได
หลากหลาย เชน การตรวจสอบสารบงชชวภาพชนดตางๆโดยอาศยปฏกรยาทางเอนไซม เชน การ
วเคราะหกลโคส และกรดยรก การตรวจสอบโปรตน การวเคราะหคา pH และการวเคราะหสาร
ตานอนมลอสระ การวเคราะหดวยวธนสามารถทาไดงายโดย7มเพยงขนตอนการเตมสารและ
ขนตอนการตรวจวด จงทาใหสามารถคดกรองสารตวอยางไดรวดเรวเหมาะสาหรบการวเคราะห
ทางการแพทยทตองวเคราะหสารหลายๆอยางในคราวเดยวกน อยางไรกตามวธวเคราะหดงกลาว
จาเปนตองทาในหองปฏบตการ (laboratory based analysis) เนองจากเครอง microplate reader เปน
เครองมอทมขนาดใหญไมสามารถพกพาไปตรวจวดภาคสนามได
(A)
(B)
ภาพท 2-4 (A) แสดงรปรางของกระดาษกรองทตรงดวยสารรเอเจนท (B) แสดงการใชอปกรณ
microtiter plate ททางานรวมกบกระดาษในการทดสอบฤทธตานอนมลอสระ
ของ Gallic acid ดวย DPPH assay
14
Sharpe et al. (2012) ไดพฒนาอปกรณตรวจสอบแบบพกพาสาหรบวเคราะหสารตาน
อนมลอสระในตวอยางอาหารโดยใชการตรงอนภาคนาโนซเรย (Ce)ไวทกระดาษ ซงมลกษณะ7
คลายคลงกบ7เซนเซอรขนาดเลก อปกรณดงกลาววเคราะหไดโดยวดการเปลยนแปลงสทเกดขน
ของปฏกรยารดอกซระหวางสารตานอนมลอสระกบพนผวของอนภาคนาโนซเรย ซงจะเปลยนจาก
สเหลองกลายเปนสน าตาล อปกรณแบบพกพาดงกลาวนาไปวเคราะหสารตานอนมลอสระ เชน
ascorbic acid, gallic acid, vanillic acid, quercetin, caffeic acid, epigallocatechin gallate และได
นาไปวเคราะหกบสารตวอยางจรง ไดแก ชาและเหด ซงไดผลการวเคราะหเชนเดยวกบการ
วเคราะหแบบดงเดม แตวธนมขอด คอ สามารถทดสอบไดโดยไมตองใชเครองมอทมราคาแพง
เนองจากมการใชโปรแกรมประมวลภาพแทน microplate reader spectrophotometer จงมศกยภาพ
ในการวเคราะหในสถานททนอกเหนอจากหองปฏบตการ
ภาพท 2-5 แสดง กราฟมาตรฐานแสดงทไดจากการพลอตความเขมสของอนภาคนาโนซเรยท
เปลยนไปเมอเพมความเขมขนของสารมาตรฐาน และ gallic acid (GA)
และ epigallocatechin gallate(EGCG)
Kriengsak (2006) ไดวเคราะหหาสารตานอนมลอสระของสารสกดผลฝรง ดวยวธ
DPPH assay วดการลดลงของ DPPH ดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลน 515 nm โดย
ใช trolox เปนสารตานอนมลอสระมาตรฐาน ดวยวธนสามารถสรางกราฟมาตรฐานของ trolox ทม
ชวงความเปนเสนตรงระหวาง 25 -800µM จากนนวเคราะหตวอยางโดยเจอจางสารตวอยางใหม
ความเขมขนทใหสญญาณการวเคราะหอยในชวงความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐาน
รายงานผลการวเคราะหในรปของ µMTE/g fresh mass
15
พชรย พรบดเวช (2552) ไดศกษาฤทธการตานอนมลอสระของสารสกดชา พบวาสาร
สกดชามฤทธตานอนมลอสระสง เนองจากมปรมาณสารฟนอลสง ซงการทดลองพบวา ชาเขยวม
ฤทธการตานอนมลอสระสงทสด รองลงมา คอ ชาสฤด ชาอหลงกานออน ชาพนธ ชาเขยวอหลง
และชาอหลง ตามลาดบ
บทท 3
วธดาเนนการวจย
3.1 เครองมอ อปกรณ และสารเคม
3.1.1 เครองมอและอปกรณ
1. กระดาษกรอง Whatman เบอร 1 (Whatman, China)
2. พลาสตกเคลอบบตร ขนาด A4 216mm x 303mm 100 micron
3. ไมโครปเปต ขนาด 10, 20, 200, 1000 ไมโครลตร
4. มดคตเตอร
5. กรรไกร
6. ทเจาะกระดาษแบบรเดยว
7. เครองเคลอบบตร
8. ขวดสชาขนาด 5 มลลลตร
9. บกเกอรขนาด 50 มลลลตร
10. ปเปตทป
11. ปเปตขนาด 10 มลลลตร
12. เครองปรนพรอมสแกน (Epson รน L210)
13. เครองชง 4 ตาแหนง (METTLER TOLEDO AG 204)
3.1.2 สารเคม
1. gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid) (M.W. 170.12 g/mol, Sigma
Aldrich CAS 149-91-7)
2. trolox (106-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-Carboxylic Acid) (M.W.
250.29 g/mol, Sigma Aldrich CAS53188-07-1)
3.caffeic acid (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid) (M.W. 180.16
g/mol, Sigma Aldrich CAS 331-39-5)
4. L-ascorbic acid (2-oxo-L-threo-hexono-1,4- lactone-2,3-enediol )
(M.W. 176.12 g/mol, Sigma Aldrich CAS 50-81-7)
17
5. quercetin(2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-
one)(M.W. 302.24 g/mol, Sigma Aldrich CAS 117-39-5)
6. DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) (M.W. 394.32 g/mol,
Sigma Aldrich CAS 1898-66-4)
7. เอทานอล (ethanol) (M.W. 46.07 g/mol, Emsure CAS 64-17-5)
3.1 3 สารตวอยางในการทดลอง
ใบชาแหงชนดผง ไดแก ชาอหลงตรา ชาระมงค, ชาลปตน, ชาดาปรงสาเรจ
กลนเลมอน, กรนท(ใบชาเขยวตราจสอะมนท), ชาเขยวมะลตราบานไร 5 ดาว, ชาเขยวจน ตรา
Tops, ชาเขยวญป น ตรา Tops, ชาเขยวกลนขาวคว (ฟจเกนมยชะ) และชาเขยวคาเมลเลย
3.2 แผนการดาเนนการวจย
ภาพท 3-1 แผนผงขนตอนการทาวจย
สรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
ศกษาความเขมขนเรมตนของ DPPH ทเหมาะสม
วเคราะหสารตานอนมลอสระ
- เวลาทเหมาะสม
- ชวงความเปน
เสนตรง,LOD
- %RSD
สารตวอยาง
(ใบชาเขยว
อหลงแหง)
วธ DPPH
แบบดงเดม
เปรยบเทยบ µMGAE/g tea
สารตานอนมลอสระมาตรฐานตาง ๆ ไดแก gallic acid,
trolox, caffeic acid, quercetin และ L-ascorbic acid
18
3.3 วธการทดลอง
3.3.1 การเตรยมสารละลาย
3.3.1.1 การเตรยมสารละลาย DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)
เตรยม stock DPPH ความเขมขน 6.590 mM ปรมาตร 1mLโดยชง DPPH
0.0026 g ละลายในเอทานอล 1 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 0.1, 0.4, 0.7, 1.0, 1.5,
2.0, 2.5, 3.0, 3.5 และ 4.0 mM
3.3.1.2 การเตรยมสารละลาย gallic acid
เตรยม stock gallic acid ความเขมขน 1763 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง
gallic acid 0.0030 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20, 40,
50, 60, 80, 100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM
3.3.1.3 การเตรยมสารละลาย trolox
เตรยม stock trolox ความเขมขน 1199 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง trolox
0.0030 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20, 40, 50, 60, 80,
100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM
3.3.1.4 การเตรยมสารละลาย caffeic acid
เตรยม stock caffeic acid ความเขมขน 1665 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง
caffeic acid 0.0030 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20, 40,
50, 60, 80, 100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM
3.3.1.5 การเตรยมสารละลาย L-ascorbic acid
เตรยม stock L-ascorbic acid ความเขมขน 1703 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง
L-ascorbic acid 0.0030 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20,
40, 50, 60, 80, 100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM
3.3.1.6 การเตรยมสารละลาย quercetin
เตรยม stock quercetin ความเขมขน 1654 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง
quercetin 0.0050 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20, 40, 50,
60, 80, 100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM
3.3.1.7 การเตรยมสารละลายตวอยาง (ใบชาแหง)
ตมน ากลน ปรมาตร 200 mL บนแทนใหความรอนทอณหภม 80 องศา
เซลเซยสแลวจงใสผงชาบดหนก 2 g ลงในบกเกอร ตมเปนระยะเวลา 5 นาท จากนนนาบกเกอรลง
19
จากแทนใหความรอนรอใหสารละลายเยน กรองเอากากออกแลวนาสวนทเปนสารละลายไปใช
วเคราะห
3.4 การสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
วธทใชสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษจะสรางบรเวณสวนกนทไมชอบน า
(hydrophobic barrier) ดวยการตดและเคลอบดวยพลาสตก มขนตอนการสรางโดยเตรยมกระดาษ
กรอง Whatman เบอร 1 ตดใหขนาด 1 cm. x 1 cm. เตรยมพลาสตกเคลอบบตรโดยใชทเจาะ
กระดาษเจาะแผนพลาสตกดานบนมลกษณะเปนวงกลมทมเสนผานศนยกลาง 0.5 cm. ดงภาพท3-2
หลงจากนนนากระดาษกรองทเตรยมไว มาจดเรยงบรเวณพลาสตกทเปนรแลวเขาเครองเคลอบบตร
ดงภาพท3-3
ภาพท 3-2 แสดงการเตรยมกระดาษกรองและแผนพลาสตกเคลอบบตร
ภาพท 3-3 แสดงขนตอนการสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
20
3.5 การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH โดยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
3.5.1 การศกษาความเขมขนเรมตนของ DPPH ทเหมาะสม
เตรยมสารละลาย DPPH ความเขมขน 0.1, 0.4, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5
และ 4.0 mM แลวหยดสารละลาย DPPH ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษโดยในแตละหลม
หยดปรมาตร 0.5 µL และในแตละความเขมขนหยดจานวน 3 หลม จากนนสแกนแตละความ
เขมขนแลวนาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดความเขมของสมวงทเกดขน แลวนา
คาความเขมสมาสรางกราฟมาตรฐาน ซงพลอตระหวางความเขมขน DPPHและคาความเขมส แลว
เลอกความเขมขน DPPH ทเหมาะสมสาหรบใชในการทดสอบดวยวธ DPPH บนอปกรณตรวจวด
แบบกระดาษ
3.5.2 การวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐานดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
3.5.2.1 สารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid
- ศกษาเวลาในการเกดปฏกรยา
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสาร
ตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 0, 40, 100, 150, 200 µM ในเอทานอล ทาการ
ทดสอบโดยหยดสารละลาย gallic acid ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลม
ละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL จากนนสแกนภาพ
โดยสแกนทกๆ 3 นาทเปนเวลา 39 นาท นาภาพไปเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอ
ตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางระยะเวลาและคาความเขมส แลวเลอกเวลา ท
เหมาะสมสาหรบใชในการทดสอบดวยวธ DPPH บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
-ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารตานอนมลอสระของสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน gallic acid
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตาน
อนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 200, 300,
400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 µM ในเอทานอล ทาการทดสอบโดยหยดสารละลาย gallic acid
ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจาก
นนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท แลวนาไปสแกนภาพ
นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส พลอตกราฟระหวางความ
เขมขน gallic acid และคาความเขมสเพอใชสาหรบหาชวงความเปนเสนตรงของ gallic acid
21
- ศกษาความสามารถในการทาซา (reproducibility)
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสาร
ตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 60 และ100 µM ในเอทานอลทาการทดสอบ
โดยหยดสารละลาย gallic acid ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5
µL (n=10) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปน
เวลา 30 นาท แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขม
ส หลงจากนนคานวณคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (percentage of relative standard
deviation, %RSD)
- ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (Limit of detection)
ขดจากดการตรวจวดของวธการวเคราะหดวย DPPH คอความเขมขนของ
สารตานอนมลอสระททาใหสญญาณของ DPPH ตาวาสญญาณเรมตนเปนสามเทาของคาเบยงเบน
มาตรฐานของแบลงค นาคาความเขมสของของการวเคราะห 0 µM gallic acid (blank) ดวยวธ
DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด gallic acid จากความสมพนธ (Arinbruster และคณะ,
1994)
ILOD = I0 -3SDblank
เมอ ILOD คอคาความเขมสของ DPPH เมอเตม gallic acid ทความเขมขนระดบขดจากดการ
ตรวจวด
I0 คอคาความเขมสของ DPPH ทไมไดเตม gallic acid (blank)
SDblank คอคาเบยงเบนมาตรฐานของคาความเขมสของ DPPH
การคานวณคาขดจากดการตรวจวด gallic acid
จาก ILOD = - mxLOD + c
เมอ m และ c คอ ความชนและจดตดแกนในกราฟมาตรฐาน ตามลาดบ
xLOD คอ ขดจากดการตรวจวด
22
3.5.2.2 สารตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox
- ศกษาเวลาในการเกดปฏกรยา
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสาร
ตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox ความเขมขน 0, 25, 100, 400, 625 µM ในเอทานอล ทาการ
ทดสอบโดยหยดสารละลาย trolox ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ
0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL จากนนสแกนภาพ
โดยสแกนทกๆ 3 นาทเปนเวลา 39 นาท นาภาพไปเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอ
ตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางระยะเวลาและคาความเขมส แลวเลอกเวลา ท
เหมาะสมสาหรบใชในการทดสอบดวยวธ DPPH บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
-ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารตานอนมลอสระของสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน trolox
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตาน
อนมลอสระมาตรฐาน trolox ความเขมขน 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 200, 300, 400,
500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 µM ในเอทานอล ทาการทดสอบโดย
หยดสารละลาย trolox ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3)
ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท
แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส พลอตก
ราฟระหวางความเขมขน trolox และคาความเขมสเพอใชสาหรบหาชวงความเปนเสนตรงของ
trolox
-ศกษาความสามารถในการทาซา (reproducibility)
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสาร
ตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox ความเขมขน 60 และ100 µM ในเอทานอลทาการทดสอบโดย
หยดสารละลาย trolox ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL
(n=10) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา
30 นาท แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส
หลงจากนนคานวณคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (percentage of relative standard
deviation, %RSD)
23
- ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (Limit of detection)
ทาการศกษาขดจากดการตรวจวดของสารตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox
คลายกบการศกษาในการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid
3.5.2.3 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐานตวอน ๆ
ทาการศกษาการวเคราะห caffeic acid, quercetin และ L-ascorbic acid และ คลายกบการศกษา
gallic acid และ trolox
3.5.3 การวเคราะหตวอยางสารตานอนมลอสระ(ใบชาแหง) ดวยอปกรณตรวจวดแบบ
กระดาษ
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตาน
อนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 และ 600 µM ในเอ
ทานอลเพอใชในการสรางกราฟมาตรฐาน gallic acid ทาการทดสอบโดยหยดสารละลาย gallic
acid ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาท
หลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท แลวนาไป
สแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ แลวสรางกราฟมาตรฐานพลอตระหวางคาความ
เขมขน gallic acid และคาความเขมส
หาปรมาณสารตานอนมลอสระ (ใบชาแหง) โดยเตรยมสารละลายตวอยางใบชา
ตาม 3.3.1.7 จากนนนามาตรวจวดบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ ทาการทดสอบโดยหยด
สารละลายตวอยางใบชาลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาท
หลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท แลวนาไป
สแกนภาพ วเคราะหฤทธตานอนมลอสระของสารตวอยาง โดยการตรวจวดคาความเขมสเทยบกบ
กราฟมาตรฐาน gallic acid และคานวณปรมาณสารตานอนมลอสระในรปของคา µmol GA/g tea
3.6 การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระแบบดงเดม
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมล
อสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 และ 600 µM ในเอทานอล
เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐาน gallic acid โดยผสม DPPH 1.5 mM ปรมาตร 100 µL กบ
สารละลาย gallic acid 20 µL และ เอทานอล 2 mL ตงทงไวในทมด 30 นาท วดดวยเครอง
spectrophotometer ทความยาวคลน 515 nm
24
หลงจากนนผสมสารละลาย DPPH ทเตรยมไวปรมาตร 100 µL กบเอทานอล 2 mL วด
ดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลน 515 nm เพอทาเปน blank แลวใสสารสารละลาย
ตวอยางใบชาปรมาตร 20 µL รอใหเกดปฏกรยาโดยการเกบไวในทมด 30 นาทหลงจากนนนาไป
วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 515 nm วเคราะหหาปรมาณโดยใชกราฟมาตรฐานของ
gallic acid และถาสารตวอยางทวเคราะหวดคาไดนอกเหนอจากเสนตรง ตองนาสารละลายทไดมา
เจอจางแลววดคาใหม รายงานผลการวเคราะหในรปของ µmol GAE/g tea
3.7 การวเคราะหความเขมสดวยโปรแกรม ImageJ
1. เปดโปรแกรม ImageJ
2. เลอก open แลวเลอกรปทตองการประมวลผล
ภาพท 3-4 แสดงการเปดโปรแกรม ImageJ
25
3. Set scale ของบรเวณทตรวจวด
ภาพท 3-5 แสดง Set scale ของบรเวณทตรวจวดในโปรแกรม ImageJ
4. ปรบรปใหเหลอเฉพาะสทตองการโดยไปท Image--> adjust-->color threshold จะ
ปรากฏ box ขนมาดงรป เลอก pass ทงหมด เลอก Threshold color : White, Color space : RGB
ปรบสโดยเลอน scale บรเวณ Hue = 191 สวน scale อนใหปรบตามภาพท3-6
ภาพท3-6 แสดงการปรบสในโปรแกรม ImageJ
26
5. ปรบเปนส gray โดยไปท Image--> 8 bit
ภาพท3-7 แสดงการปรบเปนส gray ในโปรแกรม ImageJ
6. ปรบใหเปน gray intensity โดยเลอก Edit--> invert
ภาพท3-8 แสดงการปรบเปน gray intensity ในโปรแกรม ImageJ
7. ตงคาวดความเขมสโดยไปท set measurements จะปรากฏ box ดงรปใหเลอก Are,
Mean gray value, limit to threshold และ display label (ทาเฉพาะครงแรกทใชโปรแกรม) แลวคลก
OK
27
ภาพท3-9 แสดงการ set measurements ในโปรแกรม ImageJ
8. เลอกบรเวณทตองการวด intensity โดยเลอก shortcut ตามแบบรปทตองการ
จากนนลากครอบบรเวณทตองการวด เมอไดบรเวณแลวใหไปท Analyze Measurement หรอใช
Crtl+M ไดเลย คา Mean ทปรากฏคอคา mean gray scale intensity ทไดจากการประมวลภาพ
ภาพท3-10 แสดงการ Analyze Measurement ในโปรแกรม ImageJ
บทท 4
ผลการวจยและอภปราย
4.1 การศกษาความเขมขนเรมตนของ DPPH ทเหมาะสม
เนองดวยการศกษาฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH เปนการวดการลดลงของ
สญญาณของ DPPH เมอทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระแลว การศกษาความเขมขนเรมตนของ
DPPH ในการนาไปวเคราะหจงเปนปจจยสาคญ โดยความเขมขนเรมตนทเหมาะสมจะตองเปน
ความเขมขนเรมตนทใหสญญาณทสงและนอกจากนนยงตองสามารถเหนการเปลยนแปลงของ
สญญาณทลดลงไดอยางรวดเรวเมอเตมสารตานอนมลอสระลงไปเพยงเลกนอย งานวจยน
ทาการศกษาความเขมขนเรมตนของ DPPH ทเหมาะสมสาหรบใชในการทาปฏกรยากบสารตาน
อนมลอสระมาตรฐาน ศกษา DPPH เรมตนทความเขมขนตาง ๆ ตงแต 0.1-4 mM โดยเตรยม
สารละลาย DPPH ความเขมขนตาง ๆ ในตวทาละลายเอทานอล จากนนหยดสารละลาย DPPH แต
ละความเขมขนปรมาตร 0.5 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (n=3) ปลอยไวในทมดเปน
เวลา 30 นาท แลวนาอปกรณทไดไปสแกนแลวนาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวด
ความเขมของสมวงทเกดขน (ตารางท 4-2 ภาคผนวก) นาคาความเขมสมาสรางกราฟ โดยพลอต
แสดงความสมพนธระหวางความเขมขน DPPH และคาความเขมสจะไดกราฟดงแสดงในภาพท 4-1
ภาพท 4-1 (A) แสดงสของสารละลาย DPPH ทความเขมขนตาง ๆ (B) กราฟพลอตระหวางคา
ความเขมสและความเขมขนของสารละลาย DPPH (n=3)
29
จากกราฟมาตรฐานทแสดงความสมพนธระหวางความเขมขนและความเขมสของ DPPH
พบวาเมอเพมความเขมขนของ DPPH เพมขน ความเขมสของ DPPH กเพมขนตามไปดวย จดท
สญญาณเรมตนมการเปลยนแปลงมากทสดคอความเขมขนของ DPPH ประมาณ 1.5 mM ในการ
ทดลองนจงเลอก DPPH ทมความเขมขน 1.5 mM เปนความเขมขนทเหมาะสมทจะใชเปนความ
เขมขนเรมตนในการทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ เนองจากจะสามารถเหนการเปลยนแปลง
สญญาณไดอยางชดเจนเมอ DPPH ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระเพยงเลกนอยและความ
เขมขนของ DPPH ลดตาลง
4.2 การศกษาเวลาทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH และสารตานอนมล
อสระมาตรฐาน gallic acid และ trolox
ศกษาเวลาทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH และสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน gallic acid และ trolox ทาการทดสอบโดยหยดสารละลายสารตานอนมลอสระมาตรฐาน
ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจาก
นนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL จากนนสแกนภาพโดยสแกนทก ๆ 3 นาทเปนเวลา 39
นาท นาภาพไปเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟ
ระหวางระยะเวลาและคาความเขมส จากการศกษาเวลาในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH และสาร
ตานอนมลอสระมาตรฐานทงสองชนดคอ gallic acid และ trolox ทความเขมขนตางๆ ไดผลการ
ทดลองดงแสดงในกราฟทพลอตระหวางความเขมสของ DPPH กบเวลาในการเกดปฏกรยาดงภาพ
ท 4-2 (A) และ 4-2 (B) สาหรบการวเคราะห gallic acid และ trolox ตามลาดบ
30
ภาพท 4-2 การศกษาเวลาในการเกดปฏกรยาบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษระหวาง DPPH กบ
สารตานอนมลอสระมาตรฐาน (A) gallic acid (n=3) (B) trolox (n=3)
จากการศกษาเวลาในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH 1.5 mM กบสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน gallic acid และ trolox ทมความเขมขนตาง ๆ พบวา การศกษาในสารตานอนมลอสระ
ทงสองใหผลคลายคลงกนกลาวคอสญญาณของ DPPH จะคอย ๆ ลดลงเมอเวลาเพมขนแสดงให
เหนถงการเกดปฏกรยาระหวางสารตานอนมลอสระทงสองกบ DPPH และคาความเขมสจะคงทเมอ
เกดปฏกรยาเปนระยะเวลา 30 นาท เปนตนไปในทกๆความเขมขนทศกษา แสดงวาระยะเวลา 30
นาท เปนระยะเวลาทเหมาะสมสาหรบการวเคราะหสารตานอนมลอสระดวยวธ DPPH บนอปกรณ
ตรวจวดแบบกระดาษทไดพฒนาขนซงสอดคลองกบวธ DPPH ทมระบบตรวจวดความเขมสดวย
เครองสเปกโตรโฟโตมเตอรทไดมการศกษากอนหนาน (Cheng et al., 2006; Mishra et al., 2012 ;
Noipa et al., 2011)
4.3 ศกษาคาทางการวเคราะห (Analytical features) ของอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ
ทพฒนาขนในการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน
4.3.1 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid
gallic acid เปนกรดอนทรยทาหนาทเปนสารตานอนมลอสระ ชวยปองกนเซลลจาก
ปฏกรยาออกซเดชน (oxidation reaction) ชวยปองกนเซลลจากความเครยดเมออายมากขนซงชวย
31
ลดโรคหวใจและโรคมะเรงในผสงอาย โดยสามารถพบไดในอาหาร เชน บลเบอรร แอปเปล ใบชา
วอลนท (Pulugurtha, 2011; Tremblay, 2011)
ภาพท 4-3 แสดงโครงสรางทางเคมของ gallic acid
ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะห gallic acid โดยเตรยมสาระลาย DPPH
ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ชวงความ
เขมขน 0-100 µM ในเอทานอล ทาการทดสอบโดยหยดสารละลาย gallic acid ความเขมขนตางๆลง
บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย
DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาทไดผลดงแสดงในภาพท 4-4 และตารางท
2 ภาคผนวก จะเหนวา เมอความเขมขนของ gallic acid เพมขน ความเขมสของ DPPH มคาลดลง
เนองจากอนมลอสระ DPPH ทมสมวง ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ gallic acid สงผลใหส
จางลงเมอความเขมขนของสารตานอนมลอสระมคาเพมขนและกราฟดงแสดงในรปท 4-4B มชวง
ความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ gallic acid เทากบ 0-600 µM R² = 0.9879
ภาพท 4-4 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ gallic acid ความเขมขนตาง ๆ
ระยะเวลา 30 นาท (B) แสดงคาความเขมส (color intensity) หลงจากการทาปฏกรยา
ระหวางสารละลาย DPPH กบ gallic acid ความเขมขนตาง ๆ ทระยะเวลา 30นาท (n=3)
32
ศกษาความสามารถในการทาซ า (reproducibility) ของการวเคราะหสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน gallic acid โดยศกษาทความเขมขนของ gallic acid ในชวงความเปนเสนตรงคอ 50 และ
250 µM ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาคาเบยงเบนมาตรฐานของการวเคราะหซ าทง 2 ความเขมขน ม
คาใกลเคยงกน และจากการคานวณใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (percentage of
relative standard deviation, %RSD) เทากบ 5.88 และ 17.30 ตามลาดบ (ตารางท 4-4 ภาคผนวก) จะ
เหนวาท gallic acid ความเขมขนตา จะมคา %RSD ตา เนองจากสญญาณทไดจากการวเคราะหมคา
สง แตทความเขมขนของ gallic acid ทสงจะใหคา %RSD สงเนองจากสญญาณเฉลยมคาต า (วธการ
คานวณแสดงในภาคผนวก) อยางไรกตามเมอพจารณาทคาเบยงเบนมาตรฐานแลวจะเหนวาวธ
DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการวเคราะหสารมาตรฐาน gallic acid
ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (limit of detection) โดยนาคาความเขมสของของการ
วเคราะห 0 µM gallic acid (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด gallic acid
(วธการคานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ gallic acid ทต าทสดทวธ DPPH บน
อปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 2.90 µM ซงพบวามคาใกลเคยงกบ
คาทมรายงานกอนหนาน (Piletska et al., 2012)
4.3.2 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox
trolox เปนอนพนธของวตามนอ ทดดแปลงโครงสรางโดยการเปลยนอลเคนเปนหม
คารบอกซลก ทาใหสามารถละลายน าไดดขน จงทาใหการออกฤทธเรวกวาวตามนอ พบวาวตามนอ
ตองใชเวลานานเปนชวโมงหรอเปนวน แต trolox ออกฤทธเกอบจะทนทในหลายโมเดล (ณฏฐา
รชตะนาวน, 2547) ดงนนในงานวจยจงไดศกษาการวเคราะหสารมาตรฐาน trolox ดวยอปกรณท
พฒนาขน
ภาพท 4-5 แสดงโครงสรางทางเคมของ trolox
ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox โดย
เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระ
33
มาตรฐาน trolox ความเขมขน 0-1500 µM ในเอทานอล ทาการทดสอบโดยหยดสารละลาย trolox
ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจาก
นนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท แลวนาไปสแกนภาพ
ไดผลดงแสดงในภาพท 4 - 6 จะเหนวา เมอเพมความเขมขนของ trolox จะพบวาความเขมสของ
DPPH มคาลดลง ดงแสดงในภาพท 4 - 6 (A) นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคา
ความเขมส (ตารางท 4-6 ภาคผนวก) จากนนพลอตกราฟแสดงความสมพนธระหวางความเขมส
มวงกบความเขมขนของ trolox พบวาสญญาณมคาลดลงเมอ trolox เพมขนดงภาพท 4 – 6 (B) และ
กราฟดงกลาวมชวงความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ trolox เทากบ
0-1000 µM R² = 0.9905
ภาพท 4 - 6 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ trolox ความเขมขนตาง ๆ
ระยะเวลา 30 นาท (B) แสดงคาความเขมส (Color Intensity) หลงจากการทาปฏกรยา
ระหวางสารละลาย DPPH กบ trolox ความเขมขนตาง ๆ ทระยะเวลา 30นาท (n=3)
ศกษาความสามารถในการทาซ า (reproducibility) ของการวเคราะหสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน trolox โดยศกษาทความเขมขนของ trolox ในชวงความเปนเสนตรงคอ 50 และ 500 µM
ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (Percentage of relative
34
standard deviation, %RSD) เทากบ 2.22 และ 7.64 ตามลาดบ (ตารางท 4-7 ภาคผนวก) ผลการ
ทดลองดงกลาวแสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการวเคราะห
สารมาตรฐาน trolox (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก)
ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (limit of detection) โดยนาคาความเขมสของของการ
วเคราะห 0 µM trolox (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด trolox (วธการ
คานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ trolox ทต าทสดทวธ DPPH บนอปกรณ
ตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 67.56 µM ซงพบวามคาใกลเคยงกบคาทเคย
ไดรายงานกอนหนาน (Cheng et al., 2006)
4.3.3 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน caffeic acid
caffeic acid สามารถพบไดในสวนตาง ๆ ของพช มสมบตตานปฏกรยาออกซเดชน ชวย
ปองกนการเกดโรคหวใจและยบย งการดดซม Cu2+ ทมสวนไปเรงใหเกดปฏกรยาออกซเดชน
ของไลโพโปรตนทมความหนาแนนตา (low density lipoprotein) ในรางกายมนษย (Gorinstein
et al., 2001)
ภาพท 4-7 แสดงโครงสรางทางเคมของ caffeic acid
ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะห caffeic acid โดยเตรยมสาระลาย DPPH
ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระมาตรฐาน caffeic acid ความ
เขมขน 0-1000 µM ในเอทานอล ทาการวเคราะหคลายกบการศกษา gallic acid และ trolox ไดผลดง
แสดงในภาพท 4-8 จะเหนวา เมอความเขมขนของ caffeic acid เพมขน ความเขมสของ DPPH มคา
ลดลง เนองจากอนมลอสระ DPPH ทมสมวง ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ caffeic acid
สงผลใหสจางลงเมอความเขมขนของสารตานอนมลอสระมคาเพมขนดงแสดงในภาพท 4-8 (A)
แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส (ตารางท
35
4-9 ภาคผนวก) พบวาใหกราฟทพลอตระหวางความเขมสและความเขมขนของ caffeic acid ดง
ภาพท 4-8 (B) และกราฟดงกลาวมชวงความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ caffeic acid
เทากบ 0-800 µM R² = 0.9919
ภาพท 4 - 8 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ caffeic acid ความเขมขนตาง ๆ
ระยะเวลา 30 นาท (B) แสดงคาความเขมส (Color Intensity) หลงจากการทาปฏกรยา
ระหวางสารละลาย DPPH กบ caffeic acid ความเขมขนตาง ๆ ทระยะเวลา 30นาท
(n=3)
ศกษาความสามารถในการทาซ า (reproducibility) ของการวเคราะหสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน caffeic acid โดยศกษาทความเขมขนของ caffeic acid ในชวงความเปนเสนตรงคอ 50
และ 300 µM ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (percentage
of relative standard deviation, %RSD) เทากบ 1.50 และ 2.87 ตามลาดบ (ตารางท 4-10 ภาคผนวก)
แสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการวเคราะหสารมาตรฐาน
caffeic acid (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก)
ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (limit of detection) โดยนาคาความเขมสของของการ
วเคราะห 0 µM caffeic acid (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด caffeic
36
acid (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ caffeic acid ทต าทสดทวธ DPPH
บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 7.01 µM
4.3.4 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน quercetin
quercetin เปนสารเคมทพบไดในพช มกจะอยตามเปลอกไมและผลไม เชน แอปเปล, ชา,
หวหอม และไวนแดง เปนไบโอฟลาโวนอยดทมประสทธภาพตอตานอนมลอสระและลดอาการ
อกเสบ ซงทาใหนามาใชชวยบารงสขภาพไดมากมาย เชน ใชลดอาการแพไดเนองจากชวยลดการ
ปลอยฮสตามนจากเซลลมาสโตไซทได (วนย ดะหลน, 2550)
ภาพท 4-9 แสดงโครงสรางทางเคมของ quercetin
ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะห quercetin โดยเตรยมสาระลาย DPPH
ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระมาตรฐาน quercetin ความ
เขมขน 0-1000 µM ในเอทานอล ทาการวเคราะหคลายกบการศกษา gallic acid และ trolox ไดผลดง
แสดงในภาพท 4-10 จะเหนวา เมอความเขมขนของ quercetin เพมขน ความเขมสของ DPPH มคา
ลดลง เนองจากอนมลอสระ DPPH ทมสมวง ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ quercetin สงผล
ใหสจางลงเมอความเขมขนของสารตานอนมลอสระมคาเพมขนดงแสดงในภาพท 4-10 (A) แลว
นาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส (ตารางท 4-12
ภาคผนวก) พบวากราฟทไดจากการพลอตระหวางความเขมสกบความเขมขนของ quercetin ม
ลกษณะดงภาพท 4-10 (B) และกราฟดงกลาวมชวงความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ
quercetin เทากบ 0-800 µM R² = 0.9951
37
ภาพท 4 - 10 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ quercetin ความเขมขนตาง ๆ
ระยะเวลา 30 นาท (B) แสดงคาความเขมส (Color Intensity) หลงจากการทาปฏกรยา
ระหวางสารละลาย DPPH กบ quercetin ความเขมขนตาง ๆ ทระยะเวลา 30นาท
(n=3)
ศกษาความสามารถในการทาซ า (reproducibility) ของการวเคราะหสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน quercetin โดยศกษาทความเขมขนของ quercetin ในชวงความเปนเสนตรงคอ 50 และ
400 µM ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (Percentage of
relative standard deviation, %RSD) เทากบ 3.32 และ 6.82 ตามลาดบ (ตารางท 4-13 ภาคผนวก)
แสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการวเคราะหสารมาตรฐาน
quercetin (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก)
ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (limit of detection) โดยนาคาความเขมสของของการ
วเคราะห 0 µM quercetin (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด quercetin
(วธการคานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ quercetin ทต าทสดทวธ DPPH บน
อปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 0.90 µM
4.3.5 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน L-ascorbic acid
L-ascorbic acid เปนรปทออกฤทธของวตามนซ วตามนซมลกษณะเปนผลกสขาว ท
สามารถละลายน าไดดมาก คงตวในอากาศเมออยในสภาวะบรสทธและแหง แตสลายตวอยาง
38
รวดเรวเมอโดนความชนและแสง (ณฏฐา รชตะนาวน, 2547) วตามนซแสดงสมบตเปนสารตาน
ปฏกรยาออกซเดชนโดยทาหนาทยบย งการเกดอนมลอสระทเกดขน บรเวณพนธะคของกรดไขมน
โดยทาลายอนมลอสระทเกดขนดวยการเปลยนไฮโดรเจนเปอรออกไซดทเกดขนจากปฏกรยา
ออกซเดชนไปเปนสารทมความเสถยรมากขน (Mitsumoto et al.,1991) และจบกบโลหะไอออนท
เปนสารเรงปฏกรยาออกซเดชน (Frankel, 1996)
ภาพท 4-11 แสดงโครงสรางทางเคมของ L-ascorbic acid
ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะห L-ascorbic acid โดยเตรยมสาระลาย
DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระมาตรฐาน L-ascorbic
acid ความเขมขน 0-1000 µM ในเอทานอล ทาการวเคราะหคลายกบการศกษา gallic acid และ
trolox ไดผลดงแสดงในภาพท 4-12 จะเหนวา เมอความเขมขนของ L-ascorbic acid เพมขน ความ
เขมสของ DPPH มคาลดลง เนองจากอนมลอสระ DPPH ทมสมวง ทาปฏกรยากบสารตานอนมล
อสระ L-ascorbic acid สงผลใหสจางลงเมอความเขมขนของสารตานอนมลอสระมคาเพมขนดง
แสดงในภาพท 4-12 (A) แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวด
คาความเขมส (ตารางท 4-15 ภาคผนวก) พบวาคาความเขมสมคาลดลงเมอ L-ascorbic acid
เพมขนดงภาพท 4-10 (B) และกราฟดงกลาวมชวงความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ L-
ascorbic acid เทากบ 0-900 µM R² = 0.9934
39
ภาพท 4 - 12 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ L-ascorbic acid ความ
เขมขนตาง ๆ ระยะเวลา 30 นาท (B) แสดงคาความเขมส (Color Intensity) หลงจาก
การทาปฏกรยาระหวางสารละลาย DPPH กบ L-ascorbic acid ความเขมขนตาง ๆ
ทระยะเวลา 30นาท (n=3)
ศกษาความสามารถในการทาซ า (reproducibility) ของการวเคราะหสารตานอนมลอสระ
มาตรฐาน L-ascorbic acid โดยศกษาทความเขมขนของ L-ascorbic acid ในชวงความเปน
เสนตรงคอ 50 และ 400 µM ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐาน
สมพทธ (percentage of relative standard deviation, %RSD) เทากบ 0.52 และ 2.23 ตามลาดบ
(ตารางท 4-16 ภาคผนวก) แสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการ
วเคราะหสารมาตรฐาน L-ascorbic acid (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก)
ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (limit of detection) โดยนาคาความเขมสของของการ
วเคราะห 0 µM L-ascorbic acid (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด
L-ascorbic acid (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ L-ascorbic acid
ทต าทสดทวธ DPPH บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 37.23 µM
40
จากการวเคราะหสามาตรฐานทง 5 ชนดดวยอปกรณทพฒนาขนสามารถสรปคาทางการ
วเคราะห (analytical features) ไดดงน
ตารงท4-1คาทางการวเคราะห (analytical features) จากการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน
ดวยอปกรณดพพเอชแบบกระดาษ
Antioxidant standards Linear range Reproducibility
(%RSD)
LOD
(µM) µM R2
gallic acid 0-600 0.9879 5.88-17.30 2.90
trolox 0-1000 0.9905 2.22-7.64 67.56
caffeic acid 0-800 0.9919 1.50-2.87 7.01
quercetin 0-800 0.9951 3.32-6.82 0.90
L-ascorbic acid 0-900 0.9934 0.52-2.23 37.23
4.4 การวเคราะหตวอยางสารตานอนมลอสระ (ใบชาแหง) ดวยอปกรณตรวจวดแบบ
กระดาษและวธ DPPH แบบดงเดม
จากการศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid, trolox, caffeic
acid, quercetin และ L-ascorbic acid พบวาสามารถทาไดโดยใชสารตานอนมลอสระมาตรฐาน
ปรมาตร 0.5 µL และDPPH ความเขมขน 1.5 mM ปรมาตร 0.5 µL ทาปฏกรยากนใชระยะเวลา 30
นาท สามารถวเคราะหตวอยางไดครงละหลายตวอยางพรอมกนและใชสารในการวเคราะหเพยง 1
µL ใหคาการวเคราะหทมความเทยงสง แสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนสามารถ
ใชวเคราะหไดจรง ขนตอนตอไปจงทาการเปรยบเทยบระหวางการวเคราะหตวอยางสารตานอนมล
อสระในใบชาแหง ดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (paper-based assay) และวธ DPPH แบบ
ดงเดม (spectrophotometric assay) โดยใชตวอยางชาชงทงหมด 9 ชนด แสดงฤทธตานอนมลอสระ
ของตวอยางชาในคา gallic acid equivalent (GAE) มหนวย µmol gallic acid equivalent/g tea ซง
หมายถงความสามารถในการตานอนมลอสระเทยบเทา µmol gallic acid ตอหนงกรมของชา จาก
การวเคราะหไดผลการทดลองดงแสดงภาพท 4-13 (แสดงขอมลการวเคราะหตารางท 4-17, 4-18
และแสดงวธการคานวณในภาคผนวก)
41
ภาพท 4 - 13 แผนภมแทงแสดง GAE ในหนวย µmol GA/g tea ของการวเคราะหตวอยางชา
sample 1-9 ดวยวธทพฒนาขน(paper-based assay) และวธ DPPH แบบดงเดม
(spectrophotometric assay)
จากการวเคราะหตวอยางชาทง 9 ชนดนาคาจาการทดลองไปเปรยบเทยบคาทางสถตโดย
ใช linear regression ในการวเคราะหความแตกตางของการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระทไดจาก
วธทงสอง ทาไดโดยพลอตกราฟคาฤทธตานอนมลอสระทวเคราะหไดจากวธดงเดม
(spectrophotometric assay) เทยบกบคาทไดจากการวเคราะหดวยวธทพฒนาขน (paper-based
assay) หากการวเคราะหตวอยางดวยวธทงสองมคาไมแตกตางกน จะไดคา slope และ intercept
ของกราฟ ใกลเคยง 1 และ 0 ตามลาดบ (Miller et al., 2000)
ดงแสดงภาพท 4-14
42
ภาพท 4 – 14 กราฟ linear regression แสดง GAE ในหนวย µmol GA/g tea ของการวเคราะห
ตวอยางชา sample 1-9 ระหวางวธทพฒนาขน (paper-based assay) และวธ DPPH
แบบดงเดม (spectrophotometric assay)
จากสมการ y = 1.1018 (±0.0653)x + 3.4085(±16.6245), R2 = 0.9956 กราฟมคา
intercept เทากบ 3.4085 (±16.6245) คาใกลเคยง 0 และกราฟมคา slope เทากบ 1.1018 (±0.0653)
ซงเปนคาทใกลเคยงกบ 1 ทระดบความเชอมน 95% แสดงใหเหนวาคา GAE ทวเคราะหไดระหวาง
วธทพฒนาขน (paper-based assay) และวธ DPPH แบบดงเดม (spectrophotometric assay) มคาไม
แตกตางกนอยางมนยสาคญ เปนการยนยนวาวธทพฒนาขนสามารถวเคราะหฤทธตานอนมลอสระ
ไดแมนยาเทยบเทากบวธวเคราะหแบบดงเดม นอกจากนนจะเหนวาวธทพฒนาขน (paper-based
assay) เปนวธทใชปรมาตรสารตวอยางและรเอเจนทปรมาตรรวมเพยง 1 µL ซงนอยกวาปรมาตรท
ใชในการวเคราะหแบบดงเดมถง 2000 เทา สามารถลดของเสยทเกดขนภายหลงจากการวเคราะห
ไดมาก อปกรณสามารถวเคราะหไดพรอมกนทละหลาย ๆ ตวอยาง (>20 ตวอยางตอครง) ใช
อปกรณแบบกระดาษทมราคาถกในการวเคราะหและใชสแกนเนอรรวมกบโปรแกรมประมวลผล
ภาพเปนระบบตรวจวดสญญาณ ทาใหการวเคราะหสามารถทาไดในสถานททไมมเครองมอใน
43
หองปฏบตการ อปกรณมแนวโนมสามารถตรวจวดฤทธตานอนมลอสระในสารตวอยางทสนใจ
คราวละมาก ๆ ไดเปนอยางด
บทท 5
สรปผลการวจย
ในงานวจยนไดพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอวเคราะหแบบร
ผลเรวของความสามารถการตานอนมลอสระในตวอยางทสนใจโดยอปกรณทพฒนาขนมคณสมบต
ไดแก ทดสอบตวอยางไดหลายๆตวอยางในคราวเดยวกน ใชสารตวอยางและรเอเจนทในการ
วเคราะหปรมาณนอย ใชเวลาการวเคราะหนอย มคาการวเคราะหถก และใชเครองมอการตรวจวด
สญญาณทไมแพงอกทงใหผลการวเคราะหสารตานอนมลอสระในตวอยางมความถกตองและ
แมนยา
จากการทดลองไดสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษโดยสรางบรเวณสวนกนทไมชอบ
น า (hydrophobic barrier) ดวยการตดและเคลอบดวยพลาสตก มลกษณะบรเวณวเคราะหเปนแบบ
หลม พบวาอปกรณทพฒนาขนสามารถใชวเคราะหสารละลายสารตานอนมลอสระทมเอทานอล
เปนตวทาละลายไดด บรเวณทไมชอบน าสามารถกนสารละลายทใชวเคราะหใหอยภายในหลมได
เปนอยางด การศกษาสภาวะทเหมาะสมโดยการใชอปกรณตรวจวดแบบกระดาษวเคราะหฤทธตาน
อนมลอสระดวยวธ DPPH ในสารตานอนมลอสระมาตรฐาน ไดแก gallic acid, trolox, caffeic acid,
quercetin และ L-ascorbic acid พบวา DPPH ทมความเขมขน 1.5 mM เปนความเขมขนทเหมาะสม
ทจะใชเปนความเขมขนเรมตนในการทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ เนองจากจะสามารถเหน
การเปลยนแปลงสญญาณไดอยางชดเจนเมอ DPPH ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระเพยง
เลกนอยและความเขมขนของ DPPH ลดตาลง ระยะเวลา 30 นาท เปนระยะเวลาทเหมาะสมสาหรบ
การวเคราะหสารตานอนมลอสระดวยวธ DPPH บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทไดพฒนาขน
เนองจากคาความเขมสจะคงทเมอเกดปฏกรยาเปนระยะเวลา 30 นาท เปนตนไปในทก ๆ ความ
เขมขนทศกษา ซงในการศกษาสภาวะทเหมาะสมโดยการใชอปกรณตรวจวดแบบกระดาษวเคราะห
ฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH ในสารตานอนมลอสระมาตรฐานนน สามารถทาไดโดยหยด
สารตานอนมลอสระ 0.5 µL หลงจากนนหยดสารละลาย DPPH 1.5 mM ปรมาตร 0.5 µL ปลอยทง
ไวใหสารตานอนมลอสระทาปฏกรยากบ DPPH เปนเวลา 30 นาทแลวนาไปสแกนและวเคราะห
ผลดวยโปรแกรม ImageJ ผลการทดสอบประสทธภาพของวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบ
กระดาษ พบวาใหผลการวเคราะหทด มความสามารถในการทาซ าไดด และมขดจากดการตรวจวด
ตา เมอวเคราะหสารตานอนมลอสระในตวอยางชาทง 9 ชนดระหวางวธทพฒนาขน(paper-based
assay) และวธ DPPH แบบดงเดม (spectrophotometric assay) พบวาคา GAE ทวเคราะหไดทงสอง
45
วธมคาไมแตกตางกนอยางมนยสาคญ นอกจากนวธทพฒนาขน(paper-based assay)เปนวธทใช
ปรมาตรสารตวอยางและรเอเจนทปรมาตรรวมเพยง1µLซงเปนปรมาตรรวมในการวเคราะหทนอย
กวาการวเคราะหแบบดงเดมถง2000เทาอปกรณถกออกแบบใหสามารถวเคราะหไดพรอมกนทละ
หลายๆตวอยาง (>20ตวอยางตอครง) เหมาะกบการวเคราะหแบบรผลรวดเรว (high throughput
analysis) สามารถนาไปใชวเคราะหแบบคดกรอง (screening) ในการศกษาฤทธตานอนมลอสระใน
ตวอยางอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาตทสนใจได อปกรณแบบกระดาษเปนอปกรณทมมราคา
ถกและใชสแกนเนอรรวมกบโปรแกรมประมวลผลภาพเปนระบบตรวจวดสญญาณไมจาเปนตอง
พงพาเครองมอราคาแพงในการวเคราะห อปกรณสามารถพกพาไปตรวจวดภาคสนามไดเนองจากม
ขนาดเลกและน าหนกเบา จากงานวจยนชใหเหนวาอปกรณทพฒนาขนสามารถตรวจวดฤทธตาน
อนมลอสระในสารตวอยางทสนใจไดจรง
บรรณานกรม
ณฎฐา รชตะนาวน. (2547). สารตานอนมลอสระ. แสงแดด และผวหนง, 433-449.
บหรน พนธสวรรค, ไมตร สทธจตต และสพกตร พวงบางโพ. (2553). ฤทธตานอนมลอสระของ
กะทกรก ทองพนชง ผกหวานปาเพกา และมะระขนก ในพนทมหาวทยาลยนเรศวร
พะเยา. รายงานวจย, มหาวทยาลยนเรศวรพะเยา.
ปรยนนท บวสด. (2549). การตรวจสอบความสามารถในการเปนสารแอนตออกซแดนทของ
เครองดมชาโดยวธไซคลกโวลแทมเมตร. ปรญญานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต,
สาขาวชาเคม, คณะวทยาศาสตร, มหาวทยาลยศลปากร.
เสาวนย เหลาสงห, ศรธร อางแกว และมะลวรรณ อมตธงไชย. (2554). เทคนคตรวจวด
ความสามารถตานอนมลอสระโดยรวมแบบใหมดวยเทคนคแอมเพอรโรเมทรในระบบ
ทมการไหลทขวไฟฟากลาสซคารบอนทดดแปรดวยคารบอนนาโนทวบ. ปรญญานพนธ
วทยาศาสตรมหาบณฑต, สาขาวชาเคม, คณะวทยาศาสตร, มหาวทยาลยอบลราชธาน.
Apak, R., Güçlü, K., Özyürek, M., & Karademir, S. E.(2004). Novel total antioxidant capacity
index fordietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing
capability in the presence15of neocuproine: CUPRAC method. Journal of agricultural
and food chemistry, 52(26), 7970-7981.
Benzie, I. F., & Strain, J.(1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of
“antioxidant power”: the FRAP assay. Analytical biochemistry, 239(1), 70-76.
Bortolomeazzi, R., Verardo, G., Liessi, A., & Callea, A.( 2010). Formation of
dehydrodiisoeugenol and dehydrodieugenol from the reaction of isoeugenol and
eugenol with DPPH radical and their role inthe radical scavenging activity. Food
Chemistry 2010, 118(2), 256-265.
Cao, G., Verdon, C. P., Wu, A., Wang, H., & Prior, R. L.(1995). Automated assay of oxygen
radical absorbance capacity with the COBAS FARA II. Clinical Chemistry, 41(12),
1738-1744.
Chevion, S., Roberts, M. A., & Chevion, M.(2000). The use of cyclic voltammetry for the
evaluation of antioxidant capacity. Free Radical Biology and Medicine , 28(6),
860-870.
47
Cheng, Z., Moore, J., &Yu, L. (2006). High-throughput relative DPPH radical scavenging
capacity assay. Journal of agricultural and food chemistry, 54(20), 7429-7436.
Dungchai, W., Chailapakul, O., & Henry, C. (2011). A low-cost, simple, and rapid fabrication
method for paper-based microfluidics using wax screen-printing. Analyst, 136(1),
77-82.
Hung, P. V., Maeda, T., Miyatake, K., & Morita, N. (2009). Total phenolic compounds and
antioxidantcapacity of wheat graded flours by polishing method. Food Research
International , 42(1), 185-190.
Halliwell, B. (1999). Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the
beginning). Free radical research , 31(4), 261-272.
Katsube, T., Tabata, H., Ohta, Y., Yamasaki, Y., Anuurad, E., Shiwaku, K., & Yamane, Y.
(2004). Screening for antioxidant activity in edible plant products: comparison of
low-density lipoprotein oxidation assay, DPPH radical scavenging assay, and
Folin-Ciocalteu assay. Journal of agricultural and food chemistry, 52(8), 2391-2396.
Kedare, S. B., & Singh, R. (2011). Genesis and development of DPPH method of antioxidant
assay. Journal of food science and technology , 48(4), 412-422.
Kriengsak, T. (2006). Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating
antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and
Analysis, 19 (7), 669–675.
Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., & Whitesides, G. M. (2008). Patterned paper as a
platform for inexpensive, low‐volume, portable bioassays. Angewandte Chemie
International Edition, 46(8), 1318-1320.
Miller, J. C., & Miller, J. N. (2000). Statistics and chemometrics for analytical chemistry (4th ed.).
England: Pearson Education.
Miller, N. J., Rice-Evans, C., Davies, M. J., Gopinathan, V., & Milner, A. (1993). A novel
method formeasuring antioxidant capacity and its application to monitoring the
antioxidant status in prematureneonates. Clinical science, 84, 407-407.
Molyneux, P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for
estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol , 26(2), 211-219.
48
Mulholland, C. W., & Strain, J. J. (1991). Serum total free radical trapping ability in acute
myocardialinfarction. Clinical Biochemistry , 24(5), 437-441.
Nakabeppu, Y., Sakumi, K., Sakamoto, K., Tsuchimoto, D., Tsuzuki, T., & Nakatsu, Y. (2006).
Mutagenesis and carcinogenesis caused by the oxidation of nucleic acids. Biological
chemistry , 387(4), 373-379.
Piletska, E. V., Piletsky, S. S., Whitcombe, M. J., Chianella, I., & Piletsky, S. A. ( 2012).
Development of aNew Microtiter Plate Format for Clinically Relevant Assays.
Analytical Chemistry, 84(4), 2038-2043.
Pisoschi1, A .M., & Negulescu, G. (2011). Methods for Total Antioxidant Activity
Determination: A Review. Biochem & Anal Biochem, 1(106).
Prior, R. L., & Wu, X. ( 2005). Schaich, K., Standardized methods for the determination of
antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of
agricultural and food chemistry, 53(10), 4290-4302.
Sies, H., & Stahl, W.(1995). Vitamins E and C, beta-carotene, and other carotenoids as
antioxidants. The American journal of clinical nutrition , 62(6), 1315S-1321S.
Sharpe, E., Frasco, T., Andreescu, D., & Andreescu, S. (2013). Portable ceria nanoparticle-based
assay for rapid detection of food antioxidants (NanoCerac). Analyst 2012, 138(1),
249-262.
Shapoval, G., & Gromovaia, V. (2003). Mechanism of antioxidant protection of an organism
from oxidative stress]. Ukrainskiĭ biokhimicheskiĭ zhurnal, 75(2), 5.
Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., & Telser, J. (2007). Free radicals
and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The
international journal of biochemistry & cell biology , 39(1), 44-84.
Velioglu, Y., Mazza, G., Gao, L., & Oomah, B. (1998). Antioxidant activity and total phenolics in
selected fruits, vegetables, and grain products. Journal of agricultural and food
chemistry , 46(10), 4113-4117.
Zhang, Q., Zhang, J., Shen, J., Silva, A., & Dennis, D. A. (2007). A simple 96-well microplate
method for estimation of total polyphenol content in seaweeds. In C. J., Barrow. (Ed.),
Eighteenth International Seaweed Symposium, Springer (pp.219-224).
65
ประวตยอของผวจย
ชอ-สกล นางสาววมล แสงนาค
วน เดอน ป เกด 7 กรกฎาคม พ.ศ. 2529
สถานทเกด จงหวดนนทบร
สถานทอยปจจบน บานเลขท 28 หม 12 ตาบลหนองเพรางาย
อาเภอไทรนอย จงหวดนนทบร
ตาแหนงและประวตการทางาน
พ.ศ. 2553-ปจจบน ขาราชการครโรงเรยนนวลนรดศวทยาคม
รชมงคลาภเษก กรงเทพมหานคร
ประวตการศกษา
พ.ศ. 2552 การศกษาบณฑต (เคม) มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ
พ.ศ. 2558 วทยาศาสตรมหาบณฑต (เคมศกษา) มหาวทยาลยบรพา