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발간등록번호: 11-1480592-001153-01

어류 생식줄기세포를 이용한

활용기술 개발 2차년도

Development of Applied Technologies

using Fish Germline Stem Cells 2

2016

어류 생식줄기세포를 이용한

활용기술 개발 2차년도

생물자원활용부

이승기

Development of Applied Technologies

using Fish Germline Stem Cells 2

Seungki Lee

Biological and Genetic Resources Utilization Department

National Institute of Biological Resources

2016

소속 연구분야 담당자

유용자원분석과 연구사업 총괄이승기

(총괄연구책임자)

유전자 분석 배창환

세포 이식 및 어류 사육 최문숙

유용자원활용과 어류 확보 및 종 동정 김병직

참여 연구진

- i -

요 약 문

1. 제 목

어류 생식줄기세포를 이용한 활용기술 개발 2차년도

2. 목 적

주요 어류 생물자원에 생식줄기세포 활용기술을 접목하여 멸종위기 어류 종 복원

및 고부가가치 어류 대량생산을 위한 기반 기술로 활용

3. 연구내용 및 방법

가. 대상종 어류 4종 확보 및 형태학적 종 동정

나. 어류 생식줄기세포 동결보존기술 표준화

1) 세포막 침투성 동결보호제의 종류 및 농도조건 조사

2) 세포막 비침투성 동결보호제의 종류 및 농도조건 조사

3) 냉각속도 및 해동온도에 따른 생식줄기세포 생존율 분석

※ 대상종: 미호종개, 퉁사리, 감돌고기(멸종Ⅰ급), 뱀장어(고부가가치종)

다. 어류 생식줄기세포 이종간 이식기술 개발

1) 미호종개 생식줄기세포 이식용 최적 대리부모 선정을 위한 유전자 분석

2) 최적 대리부모의 발생단계 조사

3) 이식용 유리관의 최적 직경 조사를 통한 이식효율 조사

4) 미호종개의 생식줄기세포를 미꾸라지에 이식하여 세포의 생착·증식 능력 조사

라. 미꾸라지 대리부모로부터 증식된 개체에 대한 유전자·배수성 분석

1) 미토콘드리아 CO1 영역 분석을 통한 F1 개체의 종 판별

2) 유세포분석기(flow cytometry) 조사를 통한 F1 개체의 배수성 조사

- ii -

4. 연구결과

가. 어류 생식줄기세포 초저온 동결보존기술 표준화

미호종개(Cobitis choii)

퉁사리(Liobagrus

obesus)

감돌고기(Pseudopungtungia

nigra)

뱀장어(Anguillajaponica)

세포막 침투성

동결보호제의

종류 및 농도

최적조건

1.3M DMSO 1.5M methanol1.5M ethylene

glycol1.3M DMSO

세포막 비침투성

동결보호제의

종류 및 농도

최적조건

0.3M trehalose 1.3M trehalose 1.3M trehalose 1.0M trehalose

최적 냉각속도 -1℃/분 -1℃/분 -1℃/분 -1℃/분

최적 해동온도 26℃ 30℃ 30℃ 30℃

세포 생존율 60.8 ± 5.3% 56.0 ± 11.0% 62.4 ± 5.5% 68.5 ± 7.0%

나. 미호종개 생식줄기세포의 이종간 이식기술 개발

1) 부화 후 2일령 및 7개월령 미꾸라지에 50㎛ 유리관을 이용하여 생식줄기세포 이식

2) 미꾸라지의 생식융기에 생착된 미호종개의 생식줄기세포(75.5 ± 6.9%) 확인

3) 미꾸라지의 생식소에서 증식 중인 미호종개의 생식줄기세포(68.9 ± 7.4%) 확인

다. 미꾸라지 대리부모로부터 증식된 개체에 대한 유전자·배수성 분석

1) 미토콘드리아 CO1 영역 분석을 통해 모든 F1 개체(133/133)가 미호종개로 판별

2) 유세포분석기 분석을 통해 모든 F1 개체(60/60)가 정상 2배체로 확인

5. 연구성과 및 활용계획

가. 연구성과

1) 학술대회 발표 6건

가) 구두 발표: 한국어류학회 1건

나) 포스터 발표: 세계수산학회 2건, 한국발생생물학회 3건

- iii -

2) 학술논문 투고 및 게재 7편

가) 논문투고: Cryobiology 1편, Stem Cell Reports 1편

나) 논문게재: BBRC 1편, Cryobiology 2편, Mitochondrial DNA Part B 2편

나. 활용계획

1) 미호종개, 퉁사리, 감돌고기(멸종Ⅰ급) 생식줄기세포의 장기 동결보존 기술

및 이종간 이식 기술을 멸종위기 어류 증식·복원 연구에 활용

2) 뱀장어 생식줄기세포의 장기 동결보존 기술을 경제적 가치가 높은 어류를

대량생산하기 위한 기반 기술로 활용

- iv -

목 차

요약문 ································································································································· i

목차 ·································································································································· iv

표 목차 ·····························································································································v

그림 목차 ························································································································vi

Abstract ························································································································viii

Ⅰ. 서론 ····························································································································1

Ⅱ. 연구방법 ···················································································································4

1. 어류 생식줄기세포의 초저온 동결보존기술 표준화 ······································8

2. 미호종개 생식줄기세포의 이종간 이식기술 표준화 ··································10

Ⅲ. 연구결과 ·················································································································14

1. 어류 생식줄기세포의 장기보존기술 개발 ······················································14

가. 미호종개 생식줄기세포의 초저온 동결보존 조건 최적화 ······················14

나. 퉁사리 생식줄기세포의 초저온 동결보존 조건 최적화 ··························21

다. 감돌고기 생식줄기세포의 초저온 동결보존 조건 최적화 ······················22

라. 뱀장어 생식줄기세포의 초저온 동결보존 조건 최적화 ··························23

2. 미호종개 생식줄기세포의 이종간 이식기술 표준화 ··································26

가. 미호종개의 생식줄기세포를 이식하기 위한 대리모 선정 ······················26

나. 대리모의 대량 증식기술 확립 ······································································28

다. 대리모의 초기 먹이생물 및 사료조건 확립 ··············································37

라. 대리모 3배체의 불임화 기술 확립 ······························································37

마. 미꾸리과 어류 자어 미세현미주입 조건의 예비탐색 ······························42

바. 미호종개 생식줄기세포의 이종간 이식기술 개발 ····································51

Ⅳ. 고찰 및 결론 ·········································································································67

Ⅴ. 참고문헌 ·················································································································70

Ⅵ. 부록 ··························································································································73

- v -

표 목 차

표 1. 4종의 어류에 대한 초저온 동결보존 조건 총괄표 ·····································25

표 2. 알비노 미꾸리의 난 발생 단계별 경과시간 ·················································35

표 3. 점줄종개의 난 발생 단계별 경과시간 ···························································36

표 4. 수정 후 압력 처리 시간에 따른 수정률 및 부화율, 기형률, 3n수율 ····· 38

표 5. 수정 후 개시시간 및 압력조건에 따른 수정률, 부화율, 기형률, 3n수율 42

표 6. 미세현미주입용 미꾸리 자어의 마취 평가 ···················································43

표 7. 자어 발달 단계별 미세현미주입 needle 조건 평가 ····································45

표 8. 자어 발달 단계별 미세현미주입 용량 ···························································47

표 9. 자어 발달 단계별 미세현미주입 후 생존율 1차 평가 ·······························48

표 10. 자어 발달 단계별 미세현미주입 후 생존율 2차 평가 ·····························48

표 11. 세포 주입용 donor 개체 측정 자료 ·····························································49

표 12. 세포 미세현미주입 조건 ·················································································50

표 13. 세포 주입용 donor 미호종개 개체 측정 자료 ···········································52

표 14. 세포 미세현미주입 조건 1차 평가 ·······························································54

표 15. 세포 미세현미주입 조건 2차 평가 ·······························································55

- vi -

그 림 목 차

그림 1. Hydrostatic pressure shock를 위한 유압처리기 ····································10

그림 2. Flow cytometer(좌)와 실험을 통해 얻어진 histogram ························ 11

그림 3. 침투성 동해방지제의 종류 및 농도 최적화 ·············································15

그림 4. 비침투성 동해방지제의 종류 및 농도 최적화 ·········································17

그림 5. 비침투성 동해방지제의 종류 및 농도 최적화 ·········································18

그림 6. 냉각속도 최적화 ·····························································································19

그림 7. 해동온도 최적화 ·····························································································20

그림 8. 미호종개 정소 조직 동결-해동 후 정소 세포 생존율 측정 ·················21

그림 9. 미토콘드리아 유전체 염기서열을 이용한 계통관계 분석 ·····················26

그림 10. 미꾸리과 어류의 계통관계 분석(RAG1) ·················································26

그림 11. 미꾸라지(상), 알비노 미꾸리(중) 및 점줄종개(하) ·······························27

그림 12. 성숙유도를 위해 사용된 생사료 ·······························································28

그림 13. 성숙유도를 위해 사용된 생사료 ·······························································28

그림 14. 점줄종개(Cobitis lutheri)의 외형 및 암수 구분 ···································29

그림 15. 대리모 어류의 호르몬 주사, 채정, 채란, 수정 ······································30

그림 16. 유수식 부화 수조 ·························································································30

그림 17. 알비노 미꾸리의 난발생 과정 ···································································32

그림 18. 점줄종개의 난발생 과정 ·············································································34

그림 19. 수정 후 처리 개시시간에 따른 3배체 유도율 ·······································38

그림 20. 수정 후 3분 처리개시 시간에 따른 3배체 유도율 ·······························39

그림 21. 수정 후 4분 처리개시시간에 따른 3배체 유도율 ·································40

그림 22. 수정 후 3분(상) 및 4분(하) 처리 개시시간과 압력 처리조건에 따른

3배체 유도율 ································································································41

그림 23. Class-Ⅰ을 사용한 부화 직후 자어의 미세현미주입 ···························45

그림 24. Class-Ⅱ 및 Ⅲ을 사용한 day-1에서 3까지 자어의 미세현미주입 ·· 46

그림 25. 정소세포(미꾸라지) 미세현미주입(알비노 미꾸리 자어) ·····················50

그림 26. 세포 미세현미주입 후 자어의 생존율 ·····················································51

- vii -

그림 27. 백곡천에서 채집된 미호종개 ·····································································52

그림 28. 형광 염색된 미호종개의 정소세포 ···························································53

그림 29. 정소세포(미호종개) 미세현미주입(미꾸라지 자어) ·······························54

그림 30. 정소세포(미호종개) 미세현미주입(미꾸라지 준성어) ···························55

그림 31. 선별된 우수 생식집단 대리부모 미꾸라지 ·············································56

그림 32. 복부 압박법으로 대리모 미꾸라지 채란 ·················································57

그림 33. 대리부모 미꾸라지로부터 얻어진 수정란 ···············································57

그림 34. 대리부모 미꾸라지로부터 얻어진 발생 배아 ·········································58

그림 35. 대리부모 미꾸라지로부터 얻어진 부화자어의 유전자 분석 ···············66

- viii -

Abstract

A number of fish species are experiencing rapid population decline and

several species are already extinct. Long-term preservation of fish fertility

is, therefore, increasingly important for the conservation of endangered fish

species. The most common method to preserve genetic resources is raising

live individuals in captivity. However, this strategy involves several risks,

including facility accidents, infectious disease outbreaks, genetic drift, and

the reduced fitness within natural habitats of individuals raised in captivity.

Therefore, during the resultant prolonged periods of captive breeding, fish

can potentially lose genetic diversity and fitness for their natural habitats.

Cryopreservation of fish eggs or embryos would be a valuable preservation

tool, but suitable techniques have not yet been developed due to the large

size and high lipid content of these materials. Although androgenesis

performed by using frozen sperm and γ-ray–inactivated xenogeneic eggs

can regenerate live fish, their survival rate is extremely low, and resulting

offspring become nuclear-cytoplasmic hybrids. The loss of maternally

inherited materials including mitochondrial DNA makes this method

impractical. As an alternative, previous studies outlined a surrogate

broodstock technology used to produce donor-derived eggs and sperm by

transplanting germ cells into sterile triploid recipients in salmonids.

Intraperitoneally transplanted spermatogonial stem cells migrated toward,

and were eventually incorporated into, recipient gonads. The donor-derived

spermatogonial stem cells initiated either spermatogenesis or oogenesis in

the recipient gonads, depending on the sex of the recipient. Furthermore,

by mating the male and female recipients, viable offspring derived from the

cryopreserved germ cells were produced. An an extended study, we aimed

to develop the cryopreservation and transplantation techniques for the germ

cells obtained from four endangered fish species of Miiho spine

loach(Cobitis choii), Bullhead torrent catfish(Liobagrus obesus), Black

shinner(Pseudopungtungia nigra), and Japanese eel(Anguilla japonica).

- 1 -

Ⅰ. 서론

본 연구과제는 주요 어류 생물자원에 생식줄기세포 활용기술을 접목하여

멸종위기 어류 종 복원 및 고부가가치 어류 대량증식을 위한 기술 개발을 목표로

한다. 본 연구 사업은 총 3단계 단계별 3차년으로 구성되어 있다. 1단계 3년간

('15년∼'17년)의 연구목표는 다음과 같다. 1차년도(‘15년)는 생식줄기세포의

장기 동결보존기술 개발 3종(멸종위기 어류 1종과 고부가가치 어류 2종) 및

이종간 이식 기반기술 개발 1건을 목표로 하였다. 2차년도(’16년)는 생식줄기

세포의 장기 동결보존기술 개발 4종(멸종위기 어류 3종과 고부가가치 어류 1종)

및 이종간 이식 기술개발 1건을 목표로 하였다. 3차년도(‘17년)는 생식줄기세포의

장기 동결보존기술 개발 3종(멸종위기 어류 3종) 및 생태계교란 외래어종 저감

(불임화)을 위한 생식줄기세포 적용연구 1건을 연구 목표로 설정하였다.

현재 전 세계적으로 진행 중인 기후변화와 급속한 경제성장은 많은 생물

종을 지속적으로 위협하고 있다. 특히 인간 활동에 의해 야기되는 환경 스트

레스가 가장 많이 축적되는 생태계가 담수 수서생태계이기 때문에 멸종위기

어류 종을 효과적으로 증식·복원하기 위한 대책 마련이 절실한 시점이다. 그러나

인공 증식된 개체를 여러 세대에 걸쳐 계대 사육하는 경우 개체의 환경 적응력은

급격하게 감소하는 것으로 알려져 있다(Araki et al., 2007; Christie et al.,

2012). 또한, 유전적 부동, 사육시설 내 사고로 인한 개체의 손실, 전염성 질병의

발생(Gozlan et al., 2005; Krkošek et al., 2007) 등은 계대사육에 따른 맹점으로

지적된다. 따라서 멸종위기 어류 종 증식·복원 전략에 있어 이러한 약점을 보완

하고 유전자원을 안정적으로 장기보존하기 위한 대안이 필요하다.

-196.5℃ 액체질소 이하의 온도에서 재생 가능한 생물자원(생식세포, 체세포

및 줄기세포 등)을 초저온 동결보존 할 경우 유전물질의 반영구적 보존과 완전한

재생이 가능하다. 초저온 동결보존 기술은 어류 생물자원을 안정적으로 장기

보존하기 위한 기술로 활용가능하다(Mazur et al., 2008). 실제로, 어류 정자의

동결보존 기술은 상업적 어종을 중심으로 300여종 이상의 어류에서 이미 폭넓게

확립되어 있다(Tiersch et al., 2007; Cabrita et al., 2010). 그러나 어류의 알과

배아의 경우, 세포의 크기가 크고 난황물질을 다량으로 포함하고 있어 동결보존은

아직 불가능한 상태이다(Zhang and Lubzens, 2008; Asturiano et al., 2016).

따라서 현재의 초저온 동결보존 기술만으로는 어류의 모계 유전물질을 안정적

으로 장기 보존하는 것은 불가능하다. 그 대안으로 선행 연구자들은 동결보존

- 2 -

정자를 이용하여 유전적으로 불활성화된 이종의 알과 수정 후 수정란의 웅성

발생(androgenesis) 과정을 통해 개체를 발생시키는 방법을 개발했다(Babiak

et al., 2002). 그러나 이 경우 모계 유전되는 유전물질은 다른 종의 알에서 유

래하는 것으로 이들 핵-세포질 잡종(nuclear-cytoplasmic hybrid)을 자연 생태계로

방류하는 것은 바람직하지 않다. 또한, 어류의 동결보존 체세포를 이용한 핵

이식의 경우도 웅성발생과 마찬가지로 세포질의 유전물질은 다른 종의 알로부터

유래하기 때문에 생산 개체들은 핵-세포질 잡종일 수밖에 없다(Chenais et al.,

2013). 이를 극복하고자 선행 연구자들은 어류의 배아줄기세포(embryonic stem

cells)와 시원생식세포(primordial germ cells)를 동결보존한 뒤, 이식과정을 통해

개체를 발생시키는 방법을 고안했다(Kusuda et al., 2004; Takeuchi et al.,

2004). 이 방법은 초기 발생 배의 세포를 난황에서 단리하여 동결보존한 뒤 이

식하여 대리모 종으로부터 이식세포 유래의 배우자를 생산하기 위한 방법으로

어류 유전자원의 효율적인 보존법으로 기대된다. 그러나 발생 초기 세포는 이식

가능한 세포의 수가 상당히 적기 때문에 본 기술은 실험실 수준에 국한된다.

미성숙 어류의 복강에서 발견되는 시원생식세포(primordial germ cells)는

생리학적 성에 따라 암컷 개체의 난소 내에서는 난원세포(oogonia)로 수컷 개체의

정소 내에서는 정원세포(spermatogonia)로 분화한다(Takeuchi et al., 2004).

그리고 대부분의 어종에서 수컷 개체는 평생에 걸쳐 극히 다수의 정자를 지속

적으로 생산한다. 이점에 착안하여 정원세포의 일부는 자가복제능(self-renewal

potency)과 분화능(differentiation potency)을 갖는다는 가설 하에 Okutsu 등은

무지개송어의 정원세포를 3배체 불임 숙주의 복강 내로 이식하였다(Okutsu et

al., 2006). 그 결과, 이식된 정원세포는 숙주의 생식융기에서 분비하는 화학유인

물질(chemokine stromal derived factor-1)에 의해 유인되어 생식선에 융합되어

증식하였고 암컷의 난소에서는 난자로 수컷의 정소에서는 정자로 각각 분화하

였다. 그리고 얻어진 난자와 정자를 수정한 결과 유전적으로 완전한 개체로 발

생하였다. 또한, 다른 종의 복강 내로 이식된 정원줄기세포(spermatogonial

stem cells)도 이종의 대리부모에서 기능적인 알과 정자로 분화될 수 있음이

증명되었다(Okutsu et al., 2007; Yoshizaki et al. 2011). 선행연구 결과들은 생식

줄기세포를 이용한 멸종위기 어류 종 복원 및 고부가가치 어류 대량증식을 위한

기술 개발에 있어 큰 의미를 갖는다. 예를 들어, 인공증식 기술이 개발되지 않은

멸종위기 어류나 수컷 개체밖에 얻을 수 없는 경우, 해당 종의 생식줄기세포를

사육이 쉽고 성숙까지 필요한 기간이 비교적 짧은 대리모에 이식하면 멸종위기

어류의 알과 정자를 쉽고 단기간에 얻을 수 있을 것이다. 또한, 어류의 알은

세포가 크기 때문에 초저온 동결보존이 불가능한 반면 생식줄기세포는 직경이

- 3 -

10∼20㎛로 초저온 동결보존이 가능한 작은 세포 크기를 갖고 있다. 따라서

초저온 동결 생식줄기세포의 이식기술 개발은 멸종위기 어류의 유전자원 장기

보존에 있어 중요한 수단으로 활용될 수 있다. 본 연구과제는 선행연구 결과를

기반으로 두 가지 목적의 실험이 수행되었다. 첫째, 어류 유전자원 장기보존

기술을 확립하기 위해 멸종위기Ⅰ급 어류인 미호종개(Cobitis choii), 퉁사리

(Liobagrus obesus), 감돌고기(Pseudopungtungia nigra) 및 경제적 이용가치가

높은 뱀장어(Anguilla japonica) 총 4종의 어류에 대한 초저온 동결보존기술

개발 연구가 수행되었다. 다음으로 초저온 동결보존된 생식줄기세포가 이종의

배에서 성숙 생식세포로 분화되는지 여부를 판단하기 위해 미호종개(C. choii)의

생식줄기세포를 미꾸라지 대리부모 어류에 이종간 이식하는 실험이 수행되었다.

본 연구로부터 확립된 기술을 멸종위기 어류 증식·복원 연구와 경제적 가치가

높은 어류를 대량생산하기 위한 기반 기술로 활용하고자 한다.

- 4 -

Ⅱ. 연구방법

1. 대상종 어류 확보 및 형태학적 종 동정

본 연구에서는 미호종개(Cobitis choii), 퉁사리(Liobagrus obesus), 감돌고기

(Pseudopungtungia nigra), 뱀장어(Anguilla japonica) 총 4종의 어류를 실험어로

사용하였다. 이중 멸종위기 야생생물Ⅰ급 어류인 퉁사리(L. obesus), 감돌고기

(P. nigra)를 실험에 이용하기 위해 멸종위기 야생생물 훼손 허가신청서를 취득

하였다. 또한 멸종위기 야생생물Ⅰ급 어류이면서 천연기념물인 미호종개(C.

choii)는 문화재청으로부터 현상변경 및 허가변경을 승인·취득하였다. 해당 개체는

순천향대학교 어류 보전유전학 실험실 사육실에서 순치된 개체를 국립생물자원관

보존온실사육동 사육실로 이동하여 실험 전까지 사육하였다. 한편 뱀장어와 세포

이식을 위한 대리모 대상 어류인 미꾸라지(Misgurnus mizolepis), 미꾸리(M.

anguillicaudatus) 및 점줄종개(C. lutheri)는 어시장 또는 순천향대학교 어류 보전

유전학 실험실을 통해 확보하였다. 실험어는 국립생물자원관 사육실에서 온도

18℃, 광주기 10L/14D의 기본조건에서 유지되었으며 순환식 여과 수조에서 사육

되었고 최소 7일 이상 적응된 개체들을 실험에 사용하였다. 실험어는 형태학적

종 판별과정을 거쳐 종 동정한 뒤에 후속실험에 이용하였다. 본 연구에서 생식

줄기세포 실험을 위해 사용된 대상 어류의 특징 및 분포현황은 다음과 같다(국립

생물자원관 한반도의 생물다양성 참조).

(1) 미호종개 Cobitis choii (Kim and Son, 1984)

- 지정현황: 멸종위기 야생생물Ⅰ급, 천연기념물 제454호, 우리나라 고유종

(가) 개요

몸은 길고 옆으로 약간 납작하며 미병부가 가늘다. 주둥이는 뾰족하고 입은

아래쪽에 작게 있으며 아랫입술은 둘로 갈라져 있다. 두 눈 간격은 좁으며 오

목하다. 눈은 작고 아래 안하극은 끝이 둘로 갈라져 있다. 측선은 불완전하다.

몸은 담황색으로 체측 중앙 아래에는 12〜17개의 원형 혹은 삼각 모양의 갈색

반점이 일렬로 이어지며 위쪽에는 불규칙한 갈색 반점이 등쪽으로 이어진다.

수컷 가슴지느러미 기부의 골질반 안쪽에 톱니가 있다. 유속이 완만하고 수심이

얕은 곳의 모래 속에 몸을 파묻고 생활한다. 산란기는 4〜5월로 추정되나 생

활사는 알려지지 않았다. 금강 수계의 미호천과 금강의 인근 수역에만 분포하는

한국 고유종이다. 근래 서식지가 크게 파괴되어 서식 밀도가 현저히 낮아지고

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있으므로 보호가 요구된다.

(나) 형태적 특징

전체 길이는 7cm에 이르고, 몸의 중앙은 굵지만 앞쪽과 뒤쪽은 가늘고 길다. 머

리는 옆으로 납작하다. 주둥이는 길고 끝이 뾰족하며 입은 주둥이의 밑에 있다. 입가의

수염은 3쌍이다. 눈은 작고 눈의 아래에는 끝이 둘로 갈라진 가시가 있다. 옆줄은 불

완전하고 가슴지느러미의 기저를 넘지 않는다. 몸 색깔은 담황색 바탕에 갈색의 반

점이 있다. 머리의 옆면에는 주둥이 끝에서 눈에 이르는 암갈색의 줄무늬가 있다. 몸의

옆면 중앙에는 12〜17개의 원형 또는 삼각형 모양의 반점이 있으며, 그 위쪽

으로 불규칙한 반점이 등 쪽과 연결된다. 등지느러미와 꼬리지느러미에는 3줄의

가로무늬가 있고 꼬리지느러미 기부의 위쪽에는 작은 흑색 반점이 있다.

(다) 국내분포 및 생태적 특징

분포지는 금강 수계 미호천, 금강 인근 수역이다. 우리나라 고유종으로 금강

수계의 미호천과 금강의 인근 수역에만 분포한다. 근래 서식지가 크게 파괴되어

서식 밀도가 현저히 낮아지고 있으므로 보호가 요구된다. 유속이 완만하고 수심이

얕은 곳의 모래 속에 몸을 완전히 파묻고 생활한다. 산란기는 5〜6월로 추정

되지만 생활사는 알려져 있지 않다.

(2) 퉁사리 Liobagrus obesus Son, Kim and Choo, 1987

- 지정현황: 멸종위기 야생생물Ⅰ급, 우리나라 고유종

(가) 개요

몸길이 7〜10cm다. 큰 것은 약 12cm에 이른다. 몸은 길고, 옆으로 약간

납작하며 둥글다. 머리는 위아래로 납작하다. 입 주위에는 수염이 4쌍 있다.

위턱의 길이는 아래턱의 길이와 비슷하다. 가슴지느러미가시는 끝이 날카롭고

그 안쪽에 3〜5개의 톱니가 있다. 기름지느러미는 꼬리지느러미와 이어져 있다.

측선은 없거나 흔적만 남아 있다. 몸 빛깔은 전체가 주황색인데, 등쪽은 색이

짙고 배쪽은 옅다. 하천 중류의 유속이 다소 완만하고 자갈이 많은 곳에 서식

하며 야간에 수서곤충을 먹고산다. 산란기는 5월 초에서 6월 중순으로 추정되며

암컷은 돌 밑에 산란하고 산란장에 남아서 알을 보호한다. 금강 중류 지역, 웅

천천, 만경강 및 영산강 상류 지역에 제한적으로 분포하는 한국 고유종이다.


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전체 길이는 8〜10cm에 이른다. 몸은 약간 길고 납작하며 꼬리는 옆으로

심하게 납작하다. 머리와 주둥이는 수평으로 납작하며 눈의 뒷부분은 볼록 튀어

나왔다. 퉁가리나 자가사리보다 퉁퉁한 편이다. 눈은 작으며 머리의 위쪽에 치

우쳐 피막에 싸인다. 아래턱과 위턱은 거의 같은 길이이며, 몸에는 비늘이 없다.

입수염은 4쌍으로, 2쌍은 머리의 길이와 거의 같으며 다른 2쌍은 그보다 짧다.

옆줄은 흔적만 있거나 없다. 가슴지느러미 가시는 끝이 뾰족하고 가시의 안쪽

에는 3〜5개의 톱니 모양을 한 작은 돌기가 있는데 이 돌기는 성장할수록 수가

많아진다. 자가사리와는 턱 모양으로 쉽게 구분되며, 퉁가리와는 이 돌기의 수로

구분된다. 기름지느러미는 낮고 길며 꼬리지느러미와 연결된다. 몸은 짙은 황

갈색으로 전체적으로 균일하나 등 쪽은 다소 짙고 배 쪽은 담황색을 띤다. 배

지느러미는 전체적으로 황색이지만 배지느러미 이외의 각 지느러미 가장자리는

담황색을 띤다.


우리나라 고유종으로 금강의 중류 지역, 웅천천, 만경강 및 영산강 상류 지

역에 제한적으로 분포한다. 하천 중류의 유속이 다소 완만하고 자갈이 많은 곳

에서 서식하며, 밤에 수서곤충을 먹고산다. 산란기는 5월 초에서 6월 중순으로

추정되며 암컷은 돌 밑에 산란하고 산란장에 남아서 알을 보호한다.

(3) 감돌고기 Pseudopungtungia nigra Mori, 1935

- 지정현황: 멸종위기 야생생물Ⅰ급, 우리나라 고유종

(가) 개요

몸길이 7〜10cm로, 12cm 이상 되는 개체는 볼 수 없다. 몸은 길고 옆으로

납작하다. 머리는 작고 원뿔형에 가깝다. 돌고기와 비슷하나 두 눈 사이가 좁고,

주둥이 끝이 뾰족하다. 주둥이의 길이는 눈 뒤쪽의 머리 길이보다 길다. 입은

주둥이 아래쪽에 있고 말굽 모양이며 입수염은 짧다. 눈은 작다. 측선(옆줄)은

완전하고 앞부분이 배쪽으로 휜다. 등지느러미는 뒷지느러미보다 크고 살이 7,

8개이며 바깥 가장자리는 조금 밖으로 둥글다. 배지느러미는 등지느러미와 거의

같은 수직선상에 있고 꼬리지느러미는 비교적 깊이 갈라지며 두 조각의 크기나

모양은 거의 같다. 맑은 물이 흐르는 자갈 바닥에 서식하며 각다귀 등의 수서

곤충과 부착조류를 주로 먹고산다. 산란 시기는 5〜6월로 수심이 30〜90cm이고

유속이 완만한 곳의 돌 밑이나 바위틈에 산란한다. 꺽지의 산란장에 알을 낳아

기르게 한다는 최근 연구 결과가 있다. 충청남도 금강 중·상류, 전라북도 만경강

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등에 분포하는 한국 고유종이다.


전체 길이는 7〜10cm에 이른다. 몸은 길고 옆으로 약간 납작한 원통형이며

꼬리자루는 옆으로 납작하다. 머리는 원추형에 가깝고 위아래로 납작하다. 입은

작고 말굽 모양이지만 돌고기처럼 입술 가장자리가 두껍지 않으며, 아래턱이

위턱보다 짧아 주둥이 끝의 아래쪽에 있다. 입가에는 짧은 입수염이 있다. 옆

줄은 완전하며 거의 직선이다. 몸의 옆면에는 구름 모양의 흑갈색 반문이 있

으며, 몸색은 거의 검은색 바탕으로 옆줄 아래 부분까지는 검지만 배 쪽은 약간

옅다. 몸 옆가운데에는 주둥이 앞끝에서부터 눈을 지나 꼬리자루 끝까지 폭이

넓은 암갈색의 줄무늬가 있다. 등지느러미, 뒷지느러미, 꼬리지느러미, 배지느

러미에는 두 줄의 검은 띠가 있어 돌고기와 잘 구별된다.


한국 고유종으로 금강 중상류, 만경강, 웅천천에 서식하고 있으나, 최근 웅

천천은 하천 생태계의 변화로 본 종의 서식이 확인되지 않는다. 수서곤충과 부

착조류를 주로 섭식한다. 산란 시기는 5〜6월로 수심이 30〜90cm이고 유속이

완만한 곳의 돌 밑이나 바위틈에 산란한다.

(4) 뱀장어 Anguilla japonica Temminck and Schlegel, 1846

- 지정현황: IUCN 적색목록에서 멸종위기 종으로 지정, 고부가가치 종

(가) 개요

몸길이는 60cm가량으로 매우 길며 가늘다. 비늘은 피부 속에 묻혀 있고 배

지느러미는 없다. 등은 청회색이며 배는 흰색이나 노란색을 띤다. 육식성으로 주로

저서성 무척추동물을 잡아먹으며 야간에 활동한다. 봄~여름에 알을 낳는다. 알

에서 부화한 유생(렙토세팔루스)은 대나무 잎 모양인데 해류를 타고 이동하다가

실뱀장어로 변하여 하천으로 올라가서 성장한다. 거의 일생을 하천에서 보내다가

성어가 되면 바다로 내려가 태평양의 마리아나 해구 근처에서 산란하다. 우리나라

하천과 하구역에 서식한다. 일본 북해도 이남, 중국 등에 분포한다. 주로 양념구

이로 이용하며, 스태미나 식품으로 알려져 있다. 흔히 장어라고 부르며 바다에

서식하는 장어류와 구분하기 위해 민물장어라고도 한다. 바다에서 하천으로 올

라오는 실뱀장어를 3〜6월에 포획하여 성어로 양식한다. 뱀과 비슷하게 생긴 물

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고기라 하여 뱀장어라고 부른다.


몸에는 타원형의 미세한 비늘이 있지만 살갗에 묻혀서 없는 것처럼 보이

기도 한다. 아래턱이 위턱보다 앞으로 튀어나와 있다. 배지느러미가 없고, 등

지느러미와 뒷지느러미, 꼬리지느러미는 하나로 연결되어 있고 끝이 뾰족하다.

옆줄에 있는 감각공(sensory pore: 감각을 느낄 수 있는 구멍)이 뚜렷이 보인다.

몸 색깔은 사는 장소나 시기에 따라서 약간씩 차이가 나서, 민물에서 바다로

이동할 때에는 짙은 검은색으로 변한다.


삼척 오십천 이북의 동해안으로 유입되는 하천을 제외한 우리나라 전 하천에

서식한다. 해외에는 일본, 중국, 대만 및 베트남 등지에도 분포한다. 크고 작은

하천, 호수 및 저수지 등 모든 담수 온난한 수역에서 서식한다. 육식성으로 새우,

게, 수서곤충, 실지렁이, 어린 물고기 등 모든 수중동물을 탐식한다. 낮에는 굴속,

돌 밑, 진흙 속에 숨어 있고 주로 밤에 활동한다.

2. 어류 생식줄기세포의 초저온 동결보존기술 표준화

실험어류는 200ppm 농도의 MS-222(Sindel, Canada)에 침지하여 마취한 뒤

해부하여 정소를 적출하였으며, 각각의 개체는 표준체장(standard length), 어체중

(body weight) 및 생식소 중량(testis weight)을 통해 생식소-체중 지수

(gonad-somatic index)를 구하였다. 생식소-체중 지수는 생식소의 성숙단계를

추정하기 위해 사용되었다. 적출된 정소조직은 실험에 사용하기 전까지 10%

(v/v) Fetal bovine serum (FBS)와 1% (v/v) penicillin & streptomycin 혼합용

액이 함유된 1 ml의 Leibovitz L-15 배지에 침지시켰다. 정소에 묻은 이물질을

닦고 500 μl의 동결액이 함유된 1.2 ml cryovial에 정소가 충분히 잠기도록 침지

시켰다. 동결액은 35.2%의 extender가 기본적으로 함유되며 실험 디자인에 따라

침투성 동해방지제[dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG),

propylene glycol (PG), glycerol (GLY) 및 methanol (MET)] 또는 비침투성 동

해방지제[FBS, egg yolk, bovine serum albumin(BSA), raffinose, trehalose,

glucose 및 lactose]가 요구되는 농도에 따라 첨가되었다.

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Extender의 조성은 다음과 같다.

- 55.27 mM Hepes, 375.48 mM NaCl, 7.28 mM KCl, 23.10 mM ,

3.82 mM , 3.64 mM sodium pyruvate, 2.6 mM · ,

and 1.4 mM ·6 pH 7.8 in distilled water

상술한 동결보호제 1ml를 포함하는 2ml cryovials(Corning, Sigma-Aldrich)에

적출된 정소를 침지시켜 1시간 동안 평형화(equilibrium) 단계를 거쳤다. 완만동결의

적정 냉각속도에 따른 정소세포의 생존율을 구하기 위해 샘플들은 computer

-controlled rate freezer(IceCube 14S; SY-LAB)를 사용하여 −0.5°C/min, −

1°C/min, −10°C/min, −20 °C/min의 냉각속도에서 −80 °C까지 냉각되었다. 완

전하게 냉각된 이후 액체질소 안으로 침지되었고 최소 1일간 초저온 동결과정이

진행되었다. 그 뒤, 여러 수온조건(10°C, 20°C, 30°C, 40°C)에서 샘플들을 해동하여

최적의 세포 생존율을 구하였다. 해동된 정소는 10% FBS를 포함하는 L-15

medium(Life Technologies, −0.5°C, pH 7.8)에서 세 차례에 걸친 재수화 과정을

거쳐 세포막 침투성 동결보호제가 유출되도록 하였다.

정소세포의 생존율을 구하기 위해 정소는 트립신 처리과정을 통해 단일세포화

과정을 거쳤다. 얻어진 세포현탁액은 42-μm 나일론 매쉬(N-No. 330T; Tokyo

Screen Company, Japan)를 이용하여 투과시킴으로써 세포막 등의 클럼프를 제거

시켰다. 그리고 CytoSoft software(Guava Technologies, USA)를 사용하여 생

세포를 카운트하기 위해 Guava ViaCount(GVC) reagent(Guava Technologies,

USA)로 처리하였다. 또한, 얻어진 세포의 일부는 세포의 생존율을 구하기 위해

trypan blue (TB) exclusion test를 거쳤다. 1마리의 개체에서 좌우 정소조식의

줄기세포 수는 유의적으로 거의 동일한 것으로 알려져 있기 때문에 좌우 정소는

동결세포의 생존율을 얻기 위해 이용되었다. 즉, 한쪽 정소는 동결구로 사용되었

으며 다른 쪽의 정소는 비동결구로 사용되어 양쪽 정소세포의 생존율이 비교되었다.

생존율 조사를 위한 공식은 다음과 같다.

- 정소세포 생존율(%)=[(동결 정소에서 GVC-positive + TB-negative 세포)/

(비동결 정소에서 GVC-positive 세포)] × 100

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3. 미호종개 생식줄기세포의 이종간 이식기술 표준화

생식줄기세포를 이용한 멸종위기 어류 미호종개의 대량증식을 성공적으로

수행하기 위해서는 미호종개 생식줄기세포를 성숙된 생식세포로 발생시킬 수

있는 대리모 시스템이 필요하다. 따라서 미꾸리과 근연종을 대상으로 문헌조사

및 실험적 접근을 통해 이종 간 이식 후 미호종개 생식줄기세포의 성숙/발생을

지지할 수 있고 검정교배 이후 유전적 분석 없이 가시적으로 대리모 개체와 미

호종개를 구분할 수 있는 최적 대리모를 선정했다. 선정된 대리모를 효율적으로

적용하기 위해서는 대리모의 전반적인 사육 및 생산 시스템의 구축을 통해 지속

적인 대리모 공급이 가능해야 하므로 대리모의 친어관리, 암수 구별 및 산란유도

조건 확립, 대리모의 최적 부화방법 및 초기생활사 규명, 대리모의 초기 먹이 생물

및 사료 조건 등의 최적 조건 확립이 필요하다. 또한, 3배체 유도 시 생식세포

발생 저해에 의한 불임 개체를 형성할 수 있고, 불임 개체 내 생식줄기세포를 이식할

경우 세포 간 경쟁의 최소화를 통해 이식된 생식 줄기세포의 효율적인 생식세포

발생 유도가 가능하다. 따라서 본 연구에 해당 기술을 적용하기 위해 기 보고된

3배체 유도 기술을 기반으로 본 연구에서 선정된 대리모 대상의 3배체 불임화

유도 기술을 확립했다. 3배체 유도는 선행 연구에서 이용된 Cold shock 및

Pressure shock을 이용하였으며(그림 1), 3배체 검증을 위해서 적혈구 세포크기

측정 및 Flow cytometer(Guava Technologies, USA)를 이용하였다(그림 2).

<그림 1> Hydrostatic pressure shock를 위한 유압처리기

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<그림 2> Flow cytometer(좌)와 실험을 통해 얻어진 histogram

선정한 대리모 어류인 점줄종개(Cobitis lutheri), 미꾸라지(Misgurnus

mizolepis) 및 알비노 미꾸리(M. anguillicaudatus) 자어와 성체를 대상으로 미세

현미주입을 원활히 수행할 수 있도록 미세현미주입 시 요구되는 기본적인 취급

조건들을 다음의 조건으로 최적화하였다.

- 자어 holding platform 및 수용 hole

미세현미주입 중 자어의 움직임을 최소화 할 수 있는 지지 기반을 마련함.

한천배지(agarose)의 다양한 농도를 이용하여, 자어 holding, 자어 관찰,

자어 생존율 등을 고려하여 최적 농도와 platform 두께를 결정함.

- 자어 마취 조건

미세현미주입 직전에 자어의 움직임을 방지하기 위해서 다양한 마취제와

농도를 비교 평가하여, 신속한 마취, 마취 지속 기간, 그리고 안전한 회복이

가능한 마취 조건을 조사함.

- 미세현미주입 후 자어 관리

미세현미주입 후 자어의 처치와 관련하여, 마취 회복 및 이후 관리 방법을

최적화하고, 안정적인 생존율과 원활한 성장이 가능한 조건을 마련함.

다음 실험으로 미세현미주입 관련 기술적 조건들에 대한 예비 탐색 및 조사를

위해 미세현미주입 기술과 관련한 세부 요인들을 아래와 같이 탐색하고, 적정

조건들을 구축하였다.

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- Injection needle 조건

미세현미주입에 사용하는 microneedle의 구경(끝부분 지름), 끝 부분의

모양(경사도 유무) 등에 따른 미세현미주입의 용이성, 자어의 생존율,

주입 성공률 등을 평가함. 이때 자어의 발달 단계(부화 후)에 따라 그

조건이 달라질 수 있음을 고려하여 발달 단계 별 needle의 구경 등에

대한 예비 평가를 실시함.

- Injection 주입 용량

기존에 알려진 부위(장관막과 난황 사이)에 주입 가능한 injection

volume을 평가함. 주입 용량은 주입 가능한 세포의 수를 결정하게 되므로,

향후 세포 이식 효율과도 밀접한 관계가 있음. 그러나 부화자어의 일자 별

발달 정도에 따라서 주입 가능한 용액의 용량이 달라지므로 부화 당일

부터 부화 3일(시원생식세포 정착 예상 시기)까지 주입 가능한 용량을

예비 평가함. 정확한 주입이 되었음을 검증하기 위해서 지시약으로서

methylene blue를 이용하고, 이때 자어의 생존율과 발달에 심각한 부정

적인 영향 없이 미세현미주입 성공 여부를 쉽게 판단할 수 있는 최적

농도를 선정함.

상기 자어 취급 및 미세현미주입 예비 조건을 탐색함에 있어, 부화 자어

(day-0)에서 부화 3일째(난황흡수 완료)까지의 발달 단계를 일자별로 구분하여

평가함으로써, 자어의 발달단계에 따라 차등의 처리 초건들이 필요한 지 여부를

관찰하였다. 아울러 알비노 미꾸리에서 얻어진 예비 결과들을 토대로 다른 미꾸

리과 어류 자어에도 적용 가능한지의 여부를 조사하였다. 인공산란 유도를 통해

제공된 미호종개(Cobitis choii) 자어 및 점줄종개(Cobitis lutheri) 자어를 대상

으로 본 기술조건의 작동 여부를 확인하였다. 세포 주입 예비 평가를 위해 상기

각 세부 항목별로 적정하다고 판단되는 미세현미주입 예비 조건들을 취합하여

1차 최적 프로토콜을 준비하고, 이를 기반으로 실제 정소 세포 현탁액을 자어에

미세현미주입 함으로써 선정된 조건들의 적정성을 검증하였다.

- 실험 설계 및 실험어

대리모로서 사용한 알비노 미꾸리의 경우, 체색 형질(색소 침착)이 멘델

유전의 열성(recessive) 유전을 따르므로, 해당 대리모 자어에 일반(wild

type) 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)의 정자 세포 현탁액을 미세현미

주입하도록 실험을 설계함. 만일 성공적으로 이식되어 배우자가 대리모

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로부터 형성된다면, 알비노 개체에서 얻은 배우자와의 수정을 통해서 그

성공 여부를 확인 가능(일반 체색의 잡종 유도)하였다.

- 세포 이식 및 예비 평가

일반 미꾸라지(wild type)의 정소로부터 세포 현탁액을 준비하고, 계수

후 부화 2-3일째 알비노 미꾸리 자어에게 미세현미주입을 실시함. 미세현

미주입 과정 중 앞서의 예비 선정 조건들이 적절히 작동하는지를 검증하고,

주입 후 누적 생존율을 평가함. 생존 개체들을 대상으로 성체까지 사육

하고, 다음 실험으로 생식세포 이식 여부 평가에 이용하였다.

미호종개의 생식줄기세포를 이식하기 위한 실험으로 부화 자어 또는 성체에

이식하여 숙주 생식선에서의 생착능력 및 증식능력이 조사되었다. 최적화된 동결

보존 조건에서 확보된 정원줄기세포는 세포막을 염색시약(PKH26 Cell Linker

Kit, Sigma-Aldrich)으로 형광염색한 후 바로 대리부모의 복강 내로 이식되었다.

염색방법은 제조사에서 제시한 방법을 따랐다. 간략하게 서술하면, 세포단일화

과정을 거친 세포현탁액을 배양액에서 2회 세척한 후, PKH26 Cell Linker로 3

〜5분간 차광 염색하였다. 염색한 직후, DW에서 1회 세척한 뒤 바로 10%

FBS를 포함하는 L-15 medium(Life Technologies, pH 7.8)에 이동시켰다. 염

색된 세포는 형광현미경(BX-53, Olympus)을 통해 형광 염색되었는지 관찰되

었다. 이식 실험은 동결이식구, 비동결이식구, 비이식구로 수행되었다. 형광 염

색된 이식세포의 이동 및 증식 양상 숙주를 해부하여 생식소를 형광현미경을

통해 관찰하였다.

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Ⅲ. 연구결과

1. 어류 생식줄기세포의 초저온 동결보존기술 표준화

어류 유전자원 장기보존법 개발을 위해 미호종개(Cobitis choii), 퉁사리

(Liobagrus obesus), 감돌고기(Pseudopungtungia nigra), 뱀장어(Anguilla japonica)

총 4종의 어류로부터 추출한 생식줄기세포의 초저온 동결보존 실험이 수행되

었다. 멸종위기 야생생물 Ⅰ급 어류로 법적 보호를 받는 미호종개, 퉁사리, 감

돌고기의 경우 희생을 최소화하기 위해 해당 종의 근연종 어류 중에서 수집이

용이하고 생활사가 잘 규명되어 있는 미꾸라지(Misgurnus mizolepis), 퉁가리

(L. andersonii), 돌고기(Pungtungia herzi)를 이용하여 기본 실험을 수행하고

멸종위기 종에 적용하는 방식으로 실험이 이루어졌다. 생식줄기세포의 동결보

존을 위해 생식소(정소) 조직을 동결하였으며, 동결 효율을 평가하기 위하여

동결-해동 후 정소 조직에서 유래되는 정소 세포들의 생존율을 측정하였다.

정소조직의 동결을 위해 완만동결(slow-freezing) 기법이 적용되었고 성공적인

완만 동결에 필수적인 조건인 세포막 침투성 및 비침투성 동해방지제의 종류와

농도, 그리고 냉각속도 및 해동온도를 최적화하기 위한 실험이 진행되었다.

가. 미호종개 생식줄기세포의 초저온 동결보존 조건 최적화

최적 침투성 동해방지제를 결정하기 위해 침투성 동해방지제로서 잘 알려져

있는 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol

(PG), glycerol (GLY), methanol (MET)을 이용하여 생식소 동결을 실시하였다.

이 실험에서 사용된 모든 동해방지제의 농도는 1.3 M로 고정하였고, 동결 절차

및 정소 세포 생존율 측정은 상기 제시된 방법에 따라 진행되었다.

각 동해방지제가 함유된 동결액에서 동결-해동된 정소 조직 유래 정소 세

포의 생존율을 측정한 결과, DMSO, EG, PG, GLY, MET 각각에 대해 56.94

± 7.4%, 50.47 ± 5.56%, 40.9 ± 3.64%, 40.54 ± 10.95%, 33.8 ± 8.56%의 세포

생존율이 측정되었다(그림 3A). 통계 분석 결과, DMSO 및 EG가 함유된 동결액

에서 정소 조직이 동결되었을 경우, 다른 동해방지제를 이용하여 동결되었을

경우에 비해 유의적으로 높은 해동 후 세포 생존율을 나타내었다.

DMSO 및 EG의 최적 농도를 결정하기 위해, 서로 다른 농도의 DMSO와

EG를 각각 함유하는 동결액을 제조하여 정소 조직 동결을 실시하였다. 그 결과,

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1.0, 1.3, 1.6 M DMSO와 1.0, 1.3, 1.6 M EG를 함유하는 동결액 각각에 대해

49.19 ± 8.2%, 60.54 ± 8.01%, 55.28 ± 10.75%, 48.29 ± 6.14%, 42.24 ± 3.35%,

42.46 ± 6.75%의 해동 후 정소 세포 생존율이 측정되었다(그림 3B). 통계 분석

결과, 1.3 M DMSO가 함유된 동결액에서 동결되었을 경우, 농도에 관계없이

EG가 함유된 동결액보다 유의적으로 높은 해동 후 세포 생존율을 나타내었으며,

서로 다른 DMSO 농도 간에서는 해동 후 세포 생존율에 대한 유의적인 차이는

나타나지 않았지만, 1.3 M DMSO에서 가장 높은 해동 후 세포 생존율이 측정

되었다.

A

B

<그림 3> 침투성 동해방지제의 종류 및 농도 최적화.

(A) 침투성 동해방지제 종류에 따른 정소 동결-해동 후 정소세포의 생존율 측정.

(B) 침투성 동해방지제 DMSO와 EG의 농도에 따른 정소 동결-해동 후

정소세포의 생존율 측정

- 16 -

앞선 실험으로부터 최적 침투성 동해방지제의 종류와 농도가 1.3 M

DMSO 인 것으로 확인되었다. 정소 조직의 동결-해동 후 세포 생존율을 더욱

증대시키기 위해, 1.3 M DMSO 조건 하에 비침투성 동해방지제를 추가하여

동결 효율을 조사하였다. 본 실험은 두 단계로 진행되었고, 첫 번째 단계에서 잘

알려진 세 종류의 비침투성 동해방지제인 fetal bovine serum(FBS), egg yolk,

bovine serum albumin(BSA)을 각각 추가하여 최적 종류 및 농도를 조사하였고,

두 번째 단계에서는 raffinose, trehalose, glucose, lactose를 각각 추가하여 최적

종류 및 농도를 조사하였다.

1.3 M DMSO에 추가하여 1.5% FBS, 1.5% BSA, 10% egg yolk 가 각각

추가된 동결액에서 동결-해동된 정소 조직 유래 정소 세포의 생존율을 측정한

결과, 무 첨가, FBS 첨가, BSA 첨가, egg yolk 첨가군 각각에 대해 60.32 ±

3.56%, 65.89 ± 4.96%, 54.18 ± 2.17%, 54.01 ± 3.08%의 세포 생존율이 측정되

었다(그림 4A). 통계 분석 결과, FBS가 첨가된 실험군의 해동 후 세포 생존율이

BSA와 egg yolk가 첨가된 실험군에 비해 유의적으로 높은 것을 확인하였다.

비침투성 동해방지제 FBS의 최적 농도를 결정하기 위해, 1.3 M DMSO와

서로 다른 농도의 FBS를 각각 함유하는 동결액을 제조하여 정소 조직 동결을

실시하였다. 그 결과, 0, 1.5, 3, 6, 12% FBS를 함유하는 동결액 각각에 대해

58.19 ± 2.08%, 57.31 ± 2.00%, 60.95 ± 3.58%, 61.4 ± 2.10%, 57.42 ± 2.01%의

해동 후 정소 세포 생존율이 측정되었다(그림 4B). 통계 분석 결과, 각 실험구

간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

A

(계속)

- 17 -

(계속)B

<그림 4> 비침투성 동해방지제의 종류 및 농도 최적화.

(A) 비침투성 동해방지제 종류에 따른 정소 동결-해동 후 정소세포의

생존율 측정. (B) 비침투성 동해방지제 FBS의 농도에 따른 정소

동결-해동 후 정소세포의 생존율 측정

앞선 실험에서 비 침투성 동해방지제 FBS의 무 첨가 및 농도별 첨가에 따른

동결-해동된 정소 조직 유래 정소 세포의 생존율에 유의적인 차이를 나타내지

않았지만, 추가 조사될 비 침투성 동해방지제들과의 조합 시 나타날 수 있는

상승효과를 고려하여, 1.3 M DMSO 하에서 FBS와 raffinose, trehalose,

glucose 및 lactose의 조합 효과를 조사하였다.

1.3 M DMSO만이 함유된 동결액과 1.3 M DMSO에 1.5% FBS 및 6%

FBS가 각각 추가로 함유된 세 종류의 동결액을 제조하였고 세 종류의 동결액

각각에 다시 0.1 M의 raffinose, trehalose, glucose, lactose를 각각 추가하여 총

12 종류의 서로 다른 동결액을 제조하였다. 각 동결액에서 동결-해동된 정소

조직 유래 세포의 생존율을 측정한 결과, 6% FBS에 0.1 M raffinose 및 0.1 M

trehalose가 첨가된 실험 군에서 각각 68.83 ± 3.69% 및 71.74 ± 4.32%의 높은

해동 후 세포 생존율이 관찰되었다(그림 5A).

비침투성 동해방지제 raffinose와 trehalose의 최적 농도를 결정하기 위해,

1.3 M DMSO와 6% FBS가 함유된 동결액에 서로 다른 농도의 raffinose 및

trehalose를 각각 함유하는 동결액을 제조하여 정소 조직 동결을 실시하였다.

그 결과, 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M raffinose 및 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M trehalose를 함

- 18 -

유하는 동결액 각각에 대해 59.88 ± 0.83%, 65.51 ± 3.50%, 66.30 ± 3.04%,

60.75 ± 5.61%, 64.68 ± 2.80%, 72.03 ± 0.97%의 해동 후 정소 세포 생존율이

측정되었다(그림 5B). 통계 분석 결과, 0.3 M trehalose가 첨가된 실험구가 나

머지 실험구들에 비해 유의적으로 높은 해동 후 세포 생존율을 나타내었다.

A

B

<그림 5> 비침투성 동해방지제의 종류 및 농도 최적화.

(A) 비침투성 동해방지제 종류에 따른 정소 동결-해동 후 정소세포의

생존율 측정. (B) 비침투성 동해방지제 raffinose와 trehalose의 농도에

따른 정소 동결-해동 후 정소세포의 생존율 측정

- 19 -

앞서 제시된 실험 결과들을 기반으로 정소 조직 동결을 위한 최적 동결액

조성은 1.3 M DMSO, 6% FBS, 그리고 0.3 M trehalose인 것으로 확인되었다.

그 다음으로 최적 냉각속도를 조사하기 위하여, 최적 동결액 조성 하에서 네

개의 다른 냉각속도로 정소 조직을 동결하고 해동 후 정소 세포의 생존율을

측정하였다. 그 결과, -0.5℃/min, -1℃/min, -5℃/min, -10℃/min의 냉각속도에

따라 69.09 ± 0.46%, 75.46 ± 2.44%, 65.95 ± 2.95%, 63.18 ± 3.47%의 해동 후

세포 생존율이 측정되었다(그림 6). 통계 분석 결과, -1℃/min의 속도로 정소

조직을 동결하였을 때, 다른 냉각속도로 동결하였을 경우와 비교하여 유의적

으로 높은 해동 후 세포 생존율을 나타내었다.

<그림 6> 냉각속도 최적화.

서로 다른 냉각속도에 따른 정소 동결-해동 후 정소세포의 생존율 측정

동결 조건 최적화를 위한 마지막 단계로서 해동온도에 따른 동결-해동된

정소 조직 유래 정소 세포의 생존율을 조사하였다. 최적 동결액 조성에서 -

1℃/min의 냉각속도로 동결된 정소 조직을 21℃, 26℃, 31℃, 36℃의 온도에서

각각 해동하였고 세포 생존율을 조사한 결과, 각각의 해동온도에 따라 69.08

± 3.78%, 72.02 ± 4.21%, 64.61 ± 1.61%, 62.28 ± 4.07%의 세포 생존율을 나

타내었다(그림 7). 통계 분석 결과, 26℃에서 해동된 실험구가 31℃ 및 36℃에서

해동된 실험구들에 비해 유의적으로 높은 세포 생존율을 나타내었고, 21℃에서

해동된 실험구와는 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

- 20 -

<그림 7> 해동온도 최적화.

서로 다른 해동온도에 따른 정소 동결-해동 후 정소세포의 생존율 측정

미꾸라지 정소조직 동결 조건 최적화 실험을 통해 1.3 M DMSO, 6%

FBS, 0.3 M trehalose를 함유한 동결액, -1℃/min의 냉각속도, 그리고 26℃

해동온도가 최적 동결 조건인 것으로 확인되었고, 최종적으로 미호종개의 생식

줄기세포 동결보존을 위해 미꾸라지에서 확립된 최적 동결 조건을 미호종개에

적용하는 실험을 진행하였다.

미호종개로부터 적출된 정소 조직을 미꾸라지에서 확립된 최적 동결 조건에서

동결하였고, 해동 후 세포 생존율을 조사하였다. 동결 효율의 비교를 위해 일부

정소 조직의 경우 침투성 동해방지제(1.3 M DMSO)만 첨가된 동결액에서 동결

하고 해동 후 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 1.3 M DMSO만 첨가된 동

결액에서 동결보존된 정소 조직의 경우, 51.18 ± 0.82%의 해동 후 세포생존율을

나타내었고, 미꾸라지에서 확립된 최적 동결조건에서 동결보존된 정소조직의

경우, 60.79 ± 5.30%의 해동 후 세포 생존율을 나타내었다(그림 8). 통계분석

결과, 최적 동결액에서 동결되었을 경우, 1.3 M DMSO만 함유된 동결액에서

동결되었을 경우와 비교하여 유의적으로 높은 세포 생존율을 나타내었다.

- 21 -

<그림 8> 미호종개 정소 조직 동결-해동 후 정소 세포 생존율 측정

나. 퉁사리 생식줄기세포의 초저온 동결보존 조건 최적화

멸종위기 야생생물 Ⅰ급 어류인 퉁사리(Liobagrus obesus)의 생식줄기세포에

대한 초저온 동결보존 조건을 최적화하기 위하여 해당 종의 근연종 어류 중에

서 수집이 용이한 퉁가리(L. andersonii)를 이용하여 연구가 수행되었다. 실험

방법은 미호종개에서 수행된 실험 절차에 따라 수행되었다. 첫 번째 실험으로

침투성 동해방지제로서 잘 알려져 있는 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene

glycol (EG), propylene glycol (PG), glycerol (GLY), methanol (MET)을 이용

하여 생식소 동결을 실시하였다. 실험 결과 최적 침투성 동해방지제의 종류와

농도가 1.5 M MET 인 것으로 확인되었다. 정소 조직의 동결-해동 후 세포

생존율을 더욱 증대시키기 위해, 1.5 M MET 조건 하에 비침투성 동해방지제를

추가하여 동결 효율을 조사하였다. 본 실험은 두 단계로 진행되었고, 첫 번째

단계에서 잘 알려진 세 종류의 비침투성 동해방지제인 fetal bovine

serum(FBS), egg yolk, bovine serum albumin(BSA)을 각각 추가하여 최적

종류 및 농도를 조사하였고, 두 번째 단계에서는 raffinose, trehalose, glucose,

lactose를 각각 추가하여 최적 종류 및 농도를 조사하였다. 실험 결과들을 기반

으로 정소 조직 동결을 위한 최적 동결액 조성은 1.5 M MET, 10% FBS, 1.3 M

trehalose인 것으로 확인되었다. 그 다음으로 최적 냉각속도를 조사하기 위하여,

최적 동결액 조성하에서 네 개의 다른 냉각속도로 정소 조직을 동결하고 해동

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후 정소 세포의 생존율을 측정하였다. -0.5℃/min, -1℃/min, -5℃/min, -10℃

/min의 냉각속도에 따라 세포 생존율을 측정한 결과 -1℃/min의 해동 속도

조건에서 46.28 ± 3.01%의 가장 높은 세포 생존율이 측정되었다. 동결 조건

최적화를 위한 마지막 단계로서 해동온도에 따른 동결-해동된 정소 조직 유래

정소 세포의 생존율을 조사하였다. 최적 동결액 조성에서 -1℃/min의 냉각속도로

동결된 정소 조직을 10℃, 20℃, 30℃, 40℃의 온도에서 각각 해동하였고 세포

생존율을 조사한 결과, 30℃의 해동온도에서 58.61 ± 7.30%의 세포 생존율을

나타내었다.

퉁가리 정소조직 동결 조건 최적화 실험을 통해 1.5 M MET, 10% FBS,

1.3 M trehalose를 함유한 동결액, -1℃/min의 냉각속도, 그리고 30℃ 해동온도가

최적 동결 조건인 것으로 확인되었고, 최종적으로 퉁사리의 생식줄기세포 동결

보존을 위해 퉁가리에서 확립된 최적 동결 조건을 퉁사리에 적용하는 실험을

진행하였다.

퉁사리로부터 적출된 정소 조직을 퉁가리에서 확립된 최적 동결 조건에서


정소 조직의 경우 침투성 동해방지제(1.5 M MET)만 첨가된 동결액에서 동결

하고 해동 후 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 1.5 M MET만 첨가된 동결액

에서 동결보존된 정소 조직의 경우, 44.90 ± 3.05%의 해동 후 세포생존율을

나타내었고, 퉁가리에서 확립된 최적 동결조건에서 동결보존된 정소조직의 경우,

56.03 ± 11.02%의 해동 후 세포 생존율을 나타내었다. 통계분석 결과, 최적 조건의

동결액에서 동결되었을 경우, 1.5 M MET만 함유된 동결액에서 동결되었을

경우와 비교하여 유의적으로 높은 세포 생존율을 나타내었다.

다. 감돌고기 생식줄기세포의 초저온 동결보존 조건 최적화

멸종위기 야생생물 Ⅰ급 어류인 감돌고기(Pseudopungtungia nigra)의 생식

줄기세포에 대한 초저온 동결보존 조건을 최적화하기 위하여 해당 종의 근연

종 어류 중에서 수집이 용이한 돌고기(Pungtungia herzi)를 이용하여 연구를

수행하였다. 실험방법은 미호종개에서 수행된 실험 절차에 따라 수행되었다.

첫 번째 실험으로 침투성 동해방지제로서 잘 알려져 있는 dimethyl sulfoxide

(DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG), glycerol (GLY),

methanol (MET)을 이용하여 생식소 동결을 실시하였다. 실험 결과 최적 침투성

동해방지제의 종류와 농도가 1.5 M EG 인 것으로 확인되었다. 정소 조직의

동결-해동 후 세포 생존율을 더욱 증대시키기 위해, 1.5 M EG 조건 하에 비

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침투성 동해방지제를 추가하여 동결 효율을 조사하였다. 본 실험은 두 단계로

진행되었고, 첫 번째 단계에서 잘 알려진 세 종류의 비침투성 동해방지제인

fetal bovine serum(FBS), egg yolk, bovine serum albumin(BSA)을 각각 추

가하여 최적 종류 및 농도를 조사하였고, 두 번째 단계에서는 raffinose,

trehalose, glucose, lactose를 각각 추가하여 최적 종류 및 농도를 조사하였다.

실험 결과들을 기반으로 정소 조직 동결을 위한 최적 동결액 조성은 1.5 M

EG, 10% FBS, 그리고 1.3 M trehalose인 것으로 확인되었다. 그 다음으로 최적

냉각속도를 조사하기 위하여, 최적 동결액 조성하에서 네 개의 다른 냉각속도로

정소 조직을 동결하고 해동 후 정소 세포의 생존율을 측정하였다. -0.5℃/min,

-1℃/min, -5℃/min, -10℃/min의 냉각속도에 따라 세포 생존율을 측정한 결과

-1℃/min의 해동 속도 조건에서 50.77 ± 4.29%의 가장 높은 세포 생존율이

측정되었다. 동결 조건 최적화를 위한 마지막 단계로서 해동온도에 따른 동결

-해동된 정소 조직 유래 정소 세포의 생존율을 조사하였다. 최적 동결액 조성

에서 -1℃/min의 냉각속도로 동결된 정소 조직을 10℃, 20℃, 30℃, 40℃의 온

도에서 각각 해동하였고 세포 생존율을 조사한 결과, 30℃의 해동온도에서

59.06 ± 5.29%의 세포 생존율을 나타내었다.

돌고기 정소조직 동결 조건 최적화 실험을 통해 1.5 M EG, 10% FBS, 1.3 M

trehalose를 함유한 동결액, -1℃/min의 냉각속도, 그리고 30℃ 해동온도가 최적

동결 조건인 것으로 확인되었고, 최종적으로 감돌고기의 생식줄기세포 동결보존을

위해 돌고기에서 확립된 최적 동결 조건을 감돌고기에 적용하는 실험을 진행

하였다.

감돌고기로부터 적출된 정소 조직을 돌고기에서 확립된 최적 동결 조건에서


정소 조직의 경우 침투성 동해방지제(1.5 M EG)만 첨가된 동결액에서 동결하고

해동 후 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 1.5 M EG만 첨가된 동결액에서

동결보존된 정소 조직의 경우, 47.20 ± 5.15%의 해동 후 세포생존율을 나타내

었고, 돌고기에서 확립된 최적 동결조건에서 동결보존된 정소조직의 경우,

62.44 ± 5.53%의 해동 후 세포 생존율을 나타내었다. 통계분석 결과, 최적 동결액

에서 동결되었을 경우, 1.5 M EG만 함유된 동결액에서 동결되었을 경우와 비교하여

유의적으로 높은 세포 생존율을 나타내었다.

라. 뱀장어 생식줄기세포의 초저온 동결보존 조건 최적화

뱀장어(Anguilla japonica)의 생식줄기세포에 대한 초저온 동결보존 조건을

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최적화하기 위해 침투성 동해방지제, 비침투성 동해방지제, 냉각속도 및 해동

온도에 대한 조건 검토 실험이 수행되었다. 첫 번째 실험으로 침투성 동해방지제로서

잘 알려져 있는 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene

glycol (PG), glycerol (GLY), methanol (MET)을 이용하여 생식소 동결을 실시

하였다. 실험 결과 최적 침투성 동해방지제의 종류와 농도가 1.3 M DMSO인

것으로 확인되었다. 정소 조직의 동결-해동 후 세포 생존율을 더욱 증대시키기

위해, 1.3 M DMSO 조건 하에 비침투성 동해방지제를 추가하여 동결 효율을

조사하였다. 본 실험은 두 단계로 진행되었고, 첫 번째 단계에서 잘 알려진 세

종류의 비침투성 동해방지제인 fetal bovine serum(FBS), egg yolk, bovine

serum albumin(BSA)을 각각 추가하여 최적 종류 및 농도를 조사하였고, 두

번째 단계에서는 raffinose, trehalose, glucose, lactose를 각각 추가하여 최적

종류 및 농도를 조사하였다. 실험 결과들을 기반으로 정소 조직 동결을 위한

최적 동결액 조성은 1.3 M DMSO, 10% FBS, 그리고 1.0 M trehalose인 것으로

확인되었다.

그 다음으로 최적 냉각속도를 조사하기 위하여, 최적 동결액 조성하에서

네 개의 다른 냉각속도로 정소 조직을 동결하고 해동 후 정소 세포의 생존율을

측정하였다. -0.5℃/min, -1℃/min, -5℃/min, -10℃/min의 냉각속도에 따라 세포

생존율을 측정한 결과 -1℃/min의 해동 속도 조건에서 61.05 ± 6.88%의 가장

높은 세포 생존율이 측정되었다. 동결 조건 최적화를 위한 마지막 단계로서 해동

온도에 따른 동결-해동된 정소 조직 유래 정소 세포의 생존율을 조사하였다.

최적 동결액 조성에서 -1℃/min의 냉각속도로 동결된 정소 조직을 10℃, 20℃,

30℃, 40℃의 온도에서 각각 해동하였고 세포 생존율을 조사한 결과, 30℃의 해동

온도에서 68.53 ± 7.04%의 세포 생존율을 나타내었다.

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미호종개, 퉁사리, 감돌고기, 뱀장어 총 4종의 어류에 대한 초저온 동결보존

결과 총괄표는 다음과 같다(표 1).

<표 1> 4종의 어류에 대한 초저온 동결보존 조건 총괄표

미호종개(Cobitis choii)

퉁사리(Liobagrus obesus)

감돌고기(Pseudopungtungia

nigra)

뱀장어(Anguilla japonica)

침투성동해방지제의종류 및 농도

최적조건

1.3M DMSO 1.5M methanol 1.5M ethyleneglycol

1.3M DMSO

비침투성동해방지제의종류 및 농도

최적조건

0.3M trehalose 1.3M trehalose 1.3M trehalose 1.0M trehalose

최적 냉각속도 -1℃/분 -1℃/분 -1℃/분 -1℃/분

최적 해동온도 26℃ 30℃ 30℃ 30℃

세포 생존율 60.8 ± 5.3% 56.0 ± 11.0% 62.4 ± 5.5% 68.5 ± 7.0%

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2. 미호종개 생식줄기세포의 이종간 이식기술 표준화

가. 미호종개의 생식줄기세포를 이식하기 위한 대리모 선정

미호종개 생식줄기세포를 성숙된 생식세포로 발생시킬 수 있는 대리모 시스템

구축을 위해, 미꾸리과 근연종을 대상으로 미토콘드리아 유전체 염기서열을

이용한 계통 유연관계 분석이 수행되었다. 이를 위해 분석, 확보된 미꾸리과

주요 어종(미꾸라지, 미꾸리, 점줄종개 및 미호종개)에 대한 미토콘드리아 유전체

염기서열과 계통관계 분석결과(그림 9,10)는 다음과 같다.

<그림 9> 미토콘드리아 유전체 염기서열을 이용한 계통관계 분석

<그림 10> 미꾸리과 어류의 계통관계 분석(RAG1)

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실험적 접근의 용이성, 사육환경 및 형태적 차이 등을 고려하여 유전적 분

석 없이 표현형만으로 대리모와 미호종개를 쉽게 구분할 수 있는 최적 대리모를

조사한 결과, 미꾸라지(Misgurnus mizolepis), 알비노 미꾸리(M. anguillicaudatus)

및 점줄종개(Cobitis lutheri)로 후보를 선정하였다(그림 11).

<그림 11> 미꾸라지(상), 알비노 미꾸리(중) 및 점줄종개(하)

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나. 대리모의 대량 증식기술 확립

대리모로써 선정된 미꾸라지, 알비노 미꾸리, 점줄종개 친어 개체는 순환

여과식 수조에서 수온 25 ± 1℃로 유지하여 사육을 실시하였고, 성숙유도를

위해 단백질 함량이 높은 생사료를 매일 4차례 이상 공급 하였다(그림 12, 13).

사육수의 환수는 매일 1회 실시하였다.

<그림 12> 성숙유도를 위해 사용된 생사료.

냉동 브라인 쉬림프(좌), 냉동 곤쟁이(우)

<그림 13> 성숙유도를 위해 사용된 생사료. 냉동 물벼룩(좌상),

냉동 블러드웜(우상), 화이트웜(좌하), 실지렁이(우하)

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대리모 친어의 암․수 구별은 미꾸리과 어류의 외형적 특성에 따라 쉽게

구분할 수 있는데, 수컷의 가슴지느러미 모양과 골질반을 이용하여 암컷과 수컷의

구별이 가능하였다(그림 14).

<그림 14> 점줄종개(Cobitis lutheri)의 외형 및 암수 구분

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성숙된 대리모의 산란유도를 위해 암컷과 수컷의 복강에 Ovaprim (Sindel,

US)과 HCG(Human Chorionic Gonadotropin, 대상미생물연구소, 한국)를 각

0.5 ml/kg, 10 IU/g의 농도로 주사한 후, 10〜12시간 이후에 복부 압박법으로 채정

및 채란을 실시하였다(그림 15). 성숙난에 100배 희석한 정액을 건식법으로 수정

시켰으며, 수온 25℃를 유지시킨 채 유수식으로 관리하였다(그림 16).

<그림 15> 대리모 어류의 호르몬 주사, 채정, 채란, 수정

<그림 16> 유수식 부화 수조

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여러 부화조건을 실험한 결과, 최적의 부화방법은 산소와 사육수 공급이

원활한 유수식 방법으로 수조 내에 수정란이 부착된 페트리디쉬를 위치시키고,

히터를 이용해 25 ± 1℃를 유지시켰다. 알비노 미꾸리의 수정란은 수정 후 10분

이내로 난막과 난황이 분리되기 시작하였고(그림 17A), 수정 후 30분이 경과

하면 동물극에 배반(Blastodisc)이 형성되었다(그림 17B). 45분 경과 후 배반의

중앙이 수직 이등분되었으며, 2세포기로 이행하였고(그림 17C), 1시간 10분경과

후 4세포기에 도달하였다(그림 17D). 수정 후 1시간 15분 후에는 8세포기로

이행하였고(그림 17E), 1시간 30분 후에는 16세포기에 도달하였다(그림 17F).

수정 후 1시간 55분에는 32세포기로 이행하였으며(그림 17G), 2시간 10분 후

에는 64세포기에 도달하였고(그림 17H), 이 후 계속 발생이 진행되어 2시간

35분 후에는 상실기에 접어들어 할구가 작아지고 조밀해졌으며, 이후 난할의

발생속도가 느려졌다(그림 17I). 수정 후 4시간 5분에 포배기(blastula)에 달하

였으며(그림 17J), 수정 6시간 40분 후에 배반이 난황의 1/2를 덮어 내려와 낭

배기(gastrula)에 도달하였다(그림 17K). 9시간 5분 후에는 배반이 난황의 대

부분을 덮었다(그림 17L). 11시간 20분 후에는 난황 위에 유백색의 배체

(embryo)가 형성되어 엷게 나타났으며, 12시간 35분 후에 근절이 9〜10개가

생기고 안포가 형성되었다(그림 17M). 13시간 30분 전 후에는 안포 뒤에 이포가

생기면서 근절도 17〜18개로 증가하였다(그림 17N). 17시간 30분 후에는 배체가

간헐적으로 운동을 시작하였으며, 근절은 28-30개로 증가되었고 꼬리 부분이

난황으로부터 떨어져 연장되기 시작하였다(그림 17O). 20시간 전후로 난황 앞

쪽에 심장이 형성되어 서서히 고동하는 것을 관찰할 수 있었으며 배체는 난막

내를 활발하게 회전 운동하였고, 난황 등 쪽에 가슴지느러미의 원기가 나타나며

꼬리부분이 난황으로부터 분리되었다(그림 17P). 수정 후 25시간을 전후하여

머리 부분부터 난막을 뚫고 부화되기 시작하였다(그림 17Q). 부화 직후의 자어는

전장이 3 mm로서 무색투명 하였으며 입과 항문도 아직 열려있지 않는 모습을

보였다. 부화 후 1일째의 자어는 전장이 3.8 mm로 입과 항문 역시 아직 열려

있지 않은 상태였으며 미꾸리과 자어의 특성인 외새가 3쌍 출현하였다. 부화

후 2일째의 자어는 전장이 4.2 mm로 외새가 5쌍으로 늘어났고, 가슴지느러미가

발달하였으며 한 쌍의 입수염이 나타났다. 부화 후 3일째의 자어는 전장이 4.5

mm로 두부가 발달하였고 입과 항문이 발달하였다. 부화 후 4일째의 자어는 전

장이 입과 항문이 완전히 열려 초기사료인 rotifer를 섭식하기 시작하였고 외

새는 짧아지고 입수염은 2쌍으로 증가하였다. 부화 후 5일째의 자어는 외새가

아가미뚜껑 인근에 머물렀고 입수염은 3쌍으로 증가하였다. 부화 후 6일째의

자어는 전장이 6.5 mm로 artemia를 섭식하기 시작하였고 외새는 사라졌다.

- 32 -

부화 후 7일째의 자어는 전장이 7.4 mm로 이 시기의 자어는 거의 완전한 유영

능력을 지니고 있으며 rotifer와 artemia를 다량 섭식하는 것이 관찰되었다. 부화

후 9일째의 자어는 전장이 8.3 mm로 꼬리지느러미가 발달하기 시작하였다.

부화 후 10일째의 자어는 아가미 뚜껑의 기능이 완전해지며, 꼬리지느러미가

발달하여 10개 이상의 줄기가 발생하였으며, 입수염의 분화가 뚜렷해졌다. 부화

후 13일째의 자어는 전장이 15 mm로 막지느러미로부터 모든 지느러미가 발

달하기 시작하였다. 등지느러미의 기조수가 5-6개 나타났으며, 막지느러미가

거의 소실되어 각 지느러미가 분리되기 시작하였고 입수염이 4쌍으로 나타났다.

부화 후 18일째의 자어는 전장이 23 mm로 막지느러미가 완전히 소실되어 각

지느러미가 분화되어 치어기로 이행하였다.

<그림 17> 알비노 미꾸리의 난발생 과정

- 33 -

점줄종개의 수정란은 수정 후 15분 이내로 난막과 난황이 분리되기 시작

하였고(그림 18A), 수정 후 45분이 경과하면 동물극에 배반(Blastodisc)이 형성

되었다(그림 18B). 1시간 경과 후 배반의 중앙이 수직 이등분되었으며, 2세포기로

이행하였고(그림 18C), 1시간 10분 경과 후 4세포기에 도달하였다(그림 18D).

수정 후 1시간 30분 후에는 8세포기로 이행하였고(그림 18E), 1시간 45분 후에는

16세포기에 도달하였다(그림 18F). 2시간 경과 후에는 32세포기로 이행하였으며

(그림 18G), 2시간 10분 후에는 64세포기에 도달하였고(그림 18H), 이 후 계속

발생이 진행되어 2시간 35분 후에는 상실기에 접어들어 할구가 작아지고 조밀해

졌으며, 이후 난할의 발생속도가 느려졌다(그림 18I). 수정 후 4시간에 포배기

(blastula)에 도달하였으며(그림 18J), 수정 8시간 후에 배반이 난황의 1/2를

덮어 내려와 낭배기(gastrula)에 도달하였다(그림 18K). 9시간 후에는 배반이

난황의 대부분을 덮었다. 10시간 10분 후에는 난황 위에 유백색의 배체

(embryo)가 형성되어 엷게 나타났으며(그림 18L), 12시간 후에 근절이 4〜6개가

생겼다.(그림 18M). 13시간 15분 전 후에는 안포 뒤에 이포가 생기면서 근절도

16-18개로 증가하였다(그림 18N). 15시간 15분 후에는 배체가 간헐적으로 운

동을 시작하였으며, 근절은 28-30개로 증가되었고 꼬리 부분이 난황으로부터

떨어져 연장되기 시작하였다(그림 18O). 28시간 전후로 난황 앞쪽에 심장이

형성되어 서서히 고동하는 것을 관찰할 수 있었으며 배체는 난막 내를 활발하게

회전 운동하였고, 난황 등 쪽에 가슴지느러미의 원기가 나타나며 꼬리부분이

난황으로부터 분리되었다(그림 18P). 수정 후 40시간을 전후하여 머리 부분부터

난막을 뚫고 부화되기 시작하였다(그림 18Q). 부화 직후의 자어는 전장이 4 mm로

눈에 색소가 착색되지 않았고 난황을 두부가 감싸는 형태를 띄었다. 부화 후

1일째의 자어는 전장이 4.5 mm로 미꾸리과 자어의 특성인 외새가 3쌍 출현하

였고 몸에 흑색소포체가 나타났으며 안경은 검정색으로 착색되었다. 부화 후

2일째의 자어는 전장이 5.2 mm로 외새가 6쌍으로 늘어났고, 가슴지느러미가

발달하였으며 난황이 1/2 흡수되었고 입수염이 발달하였다. 부화 후 3일째의

자어는 전장이 5.7 mm로 두부가 발달하였고 입과 항문이 발달하였으며 외새가

줄어들고 입수염의 길이가 증가하였다. 부화 후 4일째의 자어는 전장이 6.1 mm로

입과 항문이 완전히 열려 초기사료인 rotifer를 섭식하기 시작하였고 외새는

아가미 뚜껑 인근에 머물렀고 입수염은 2쌍으로 증가하였다. 부화 후 5일째의

자어는 전장이 6.5 mm로 외새가 아가미뚜껑 안으로 들어갔고 입수염은 3쌍으로

증가하였다. 부화 후 7일째의 자어는 전장이 8 mm로 artemia를 섭식하기 시작

하였고 외새는 꼬리지느러미가 발달하였다. 부화 후 8일째의 자어는 전장이

8.5 mm로 꼬리지느러미가 발달하여 10개 이상의 줄기가 발생하였으며 입수염이

- 34 -

뚜렷하게 분화되었다. 부화 후 10일째의 자어는 전장이 10 mm로 막지느러미

로부터 등지느러가 발달하기 시작하여 10개 이상의 줄기가 발생하였다. 부화

후 11일째의 자어는 막지느러미가 수축하기 시작하여 등지느러미의 형태가 외부로

돌출되었으며 뒷지느러미가 발달하였다. 부화 후 14일째의 자어는 전장이 15 mm로

몸의 측면에는 감베타 반문이 나타나기 시작하였고 막지느러미로부터 배지느러미가

분화되었다. 부화 후 19일째의 자어는 전장이 25 mm로 막지느러미가 완전히

소실되어 각 지느러미가 분화되어 치어기로 이행하였다.

<그림 18> 점줄종개의 난발생 과정

- 35 -

알비노 미꾸리와 점줄종개의 난 발생과정을 간단하게 다음 표로 나타내었다

(표 2, 3).

<표 2> 알비노 미꾸리의 난 발생 단계별 경과시간

Stage Elapsed Figure 17

Zygote period

Fertilization 00h 00m

Swelling 00h 10m A

Blastodisc 00h 30m B

Cell cleave period

2 cells 00h 45m C

4 cells 01h 10m D

8 cells 01h 15m E

16 cells 01h 30m F

32 cells 01h 55m G

64 cells 02h 10m H

Morula (256 cells) 02h 35m I

Blastula 04h 05m J

Gastrula period

Early gastrulation 06h 40m K

Middle gastrulation 08h 00m

Late gastrulation 09h 05m L

Embryoric period

Formation of the embryo

9-10 myotomes 12h 35m M

17-18 myotomes 13h 30m N

28-30 myotomes 17h 30m O

Formation of heart 20h 00m P

Hatching period Q

- 36 -

<표 3> 점줄종개의 난 발생 단계별 경과시간

Stage Elapsed Figure 18

Zygote period

Fertilization 00h 00m

Swelling 00h 15m A

Blastodisc 00h 45m B

Cell cleave period

2 cells 01h 00m C

4 cells 01h 10m D

8 cells 01h 30m E

16 cells 01h 45m F

32 cells 02h 00m G

64 cells 02h 10m H

Morula (256 cells) 02h 35m I

Blastula 04h 00m J

Gastrula period

Early gastrulation 06h 30m

Middle gastrulation 08h 00m K

Late gastrulation 09h 00m

Embryoric period

Formation of the embryo 10h 10m L

4-6 myotomes 12h 00m M

16-18 myotomes 13h 15m N

28-30 myotomes 15h 15m O

32-40 myotomes 18h 45m

Formation of heart 28h 00m P

Hatching period 40h 00m Q

- 37 -

다. 대리모의 초기 먹이생물 및 사료조건 확립

- Rotifer 섭이

부화 후 3일이 지난 자어는 입과 항문이 열리고 섭이활동을 개시한다.

따라서 3일을 기점으로 Rotifer와 같은 윤충류를 장 발달의 효율성을 높

이기 위해 1일 3회씩 10일 이상 공급하였다. 자치어 사육밀도는 3,000

마리/㎡로 수용하며 사육수온은 세균성질병을 예방하기 위해 25℃의

3-5 psu로 관리하였다.

- Artemia sp. 부화유생 공급

먹이의 자연스러운 교체를 위해 첫 급이 2〜3일 간은 rotifer와 동시에

공급하며 20일 이상 공급하였다. 자치어의 사육밀도는 1,500마리/㎡로

수용하며 사육수온은 25℃의 3-5 psu로 관리하였으며 Artemia sp. 부화

유생 공급 시부터 사육수를 1일 2회 50%씩 환수시켜주었다.

- 배합사료 공급

첫 배합사료 공급 시 적응을 위해 Artemia sp. 부화유생과 배합사료를

2〜3일간 동시에 공급하였고 배합사료의 단백질함량은 최소 50% 이상인

것으로 공급하였다. 이 시기에 소화불량으로 폐사율이 높은 시기이므로

소화효소제를 사료에 흡착하여 1일 2회 공급하였으며 사육밀도는 500

마리/㎡로 수용하였다. 이 시기부터 순환여과와 유수식 방식을 병행하

였으며 배합사료는 순차적으로 입 크기에 맞게 공급하였다.

라. 대리모 3배체의 불임화 기술 확립

수정 후 압력처리 개시 조건을 구명하기 위하여 예비실험을 통해 얻은

100% 3배체 유도 압력조건인 9,000, 9,500 PSI 1분 30초로 고정하였으며, 수정

후 처리개시 시간에 따른 3배체 유도율을 분석하기 위하여 수정 후 1〜5분까지

1분 간격으로 3반복 실험을 진행하였다.

실험 결과 수정 후 1분부터 5분까지 각 20%, 66.6%, 90%, 98.2%, 69%로

3분과 4분에서 90%과 98.2%로 높은 3배체 유도율을 보였으며, 각 처리군 평균

간의 유의차를 검정하기 위해 분산분석을 통해 P<0.05 수준에서 유의성을 분석한

결과 3분과 4분은 유의차가 없었다(그림 19).

- 38 -

<그림 19> 수정 후 처리 개시시간에 따른 3배체 유도율

대조군의 수정률은 72 ± 7.8%, 부화율은 64 ± 8.5%로 나타나 최상은 아니나

양질의 난자와 정자를 사용한 것으로 판단되었으며, 압력처리를 실시하는 실

험군의 수정률은 평균 30%의 차이를 보였으며 수정 후 압력처리 개시 시간에

따른 수정률의 유의적 차이는 보이지 않았다. 그러나 압력 개시 시간이 늦은

수정 후 4분과 5분 그룹은 기형률이 각각 22.3 ± 3.5%, 39.0 ± 15.6%로 압력

개시 시간이 빠른 실험군보다 높은 경향을 보였다. 그러나 각 처리 실험군 간에도

높은 표준편차를 보이는 것으로 보아 처리강도 증가에 따른 기형률 차이라기

보다는 난질 차이에 기인한 것으로 판단된다(표 4).

<표 4> 수정 후 압력 처리 시간에 따른 수정률 및 부화율, 기형률, 3n수율

수정률(%) 부화율(%) 기형률(%) 3n 수율(%)

Control 72±7.8 64±8.5 3±1.5

수정 후 1분 57±15.6 12.7±4.9 15.7±3.3 0.8±1.1

수정 후 2분 54±8.5 17.4±18.0 18.1±4.4 11.8±12.7

수정 후 3분 51±12.7 20.3±2.3 16.9±13.6 15.7±4.5

수정 후 4분 56±5.7 28.7±4.1 22.3±3.5 22.1±2.1

수정 후 5분 61±4.2 18.3±5.6 39.0±15.6 5.4±3.8

- 39 -

수정 후 압력처리 시간은 3배체 유도율이 95%가 넘는 4분과 유의차가 없는

3분이 압력처리에 가장 적합한 시간으로 판단되었고, 이후의 실험은 수정 후

3분과 4분을 고정하여 실시하였다. 압력처리강도 조건은 8,500, 9,000, 9,500

PSI로 진행하였으며, 압력처리 시간은 1분과 1분 30초 두 구간으로 나누어 진행

하였다.

실험결과 수정 후 3분에 압력별 1분 처리구간은 1분30초 처리구간에 비해

현저히 낮은 3배체 유도율을 보였다. 압력의 강도가 세거나 처리시간이 길어

질수록 높은 3배체 유도율을 보였고, 9,000과 9,500 PSI 1분 30초 처리군에서

100% 3배체 유도율이 확인되었다.

수정 후 4분에서도 압력강도가 세지고 처리시간이 길어질수록 높은 유도

율의 경향을 보였고, 수정 후 3분에 처리한 실험군보다 대체적으로 90% 이상의

더 높은 3배체 유도율을 보였다. 수정 후 4분 실험군에서는 9,500 PSI 1분 처리군,

9,000과 9,500 PSI 1분 30초 처리군에서 100% 3배체가 유도되었다. 1분 대에

서는 100% 유도가 되지 않는 것으로 보아 압력을 가하는 시간에 차이가 결과에

영향을 미치는 것으로 판단된다(그림 20, 21).

<그림 20> 수정 후 3분 처리개시 시간에 따른 3배체 유도율

- 40 -

<그림 21> 수정 후 4분 처리개시시간에 따른 3배체 유도율

- 41 -

수정 후 압력처리 시간이 길어지거나 압력처리 강도가 높을수록 3배체 유

도율은 향상됐지만 부화율이 낮아졌으며, 기형률은 압력처리 시간과 처리 강도에

비례해서 높게 나타나는 경향을 보였다. 수정 후 처리개시시간 4분에서는 압력

처리 시간과 처리강도에 비례해서 높게 나타나는 경향을 보였으나 3분의 경우는

비례하는 경향이 보이지 않았고, 같은 조건 실험군 내에서도 기형률의 편차가

컸기 때문에 압력처리 조건보다도 난질이 기형률에 더 많은 영향을 받는 것으로

판단된다. 100% 3배체 유도를 위하여 이후의 실험은 압력처리 시간을 1분 30초

고정 실시하였다(그림 22).

<그림 22> 수정 후 3분(상) 및 4분(하) 처리 개시시간과 압력

처리조건에 따른 3배체 유도율

- 42 -

난질은 기형률 뿐만 아니라 수정률과 부화율에도 영향을 미쳤으나 수정률과

부화율의 비례관계는 비슷하게 나타나는 경향을 보였다. 압력처리 조건을 1분

30초로 고정하여 진행한 실험결과 대조군의 수정률은 81%, 부화율은 73%, 기

형률은 4.4%로 대조군으로서 적합한 양질의 난으로 판단되었으며, 압력이 커

질수록 부화율이 낮아지는 경향을 보였다. 특히 수정 후 처리개시시간 4분에서

3분보다 확연한 수정률과 부화율에 차이를 보였으며, 수율은 압력 처리 조건이

높을수록 유도율은 높지만 부화율과 기형율에 영향을 주기 때문에 더 낮게 나

타났다(표 5).

<표 5> 수정 후 개시시간 및 압력조건에 따른 수정률, 부화율, 기형률, 3n수율

수정률(%) 부화율(%) 기형률(%) 3n 수율(%)

Control 81 73 4.4 -

수정 후

3분

8,500 PSI 1.5분 50.3 42.3 7.7 0

9,000 PSI 1.5분 44.5 30.9 5.5 25

9,500 PSI 1.5분 57.1 32.9 7.8 25

수정 후

4분

8,500 PSI 1.5분 67.0 58.9 5.1 43.5

9,000 PSI 1.5분 38.9 23.7 5.5 19

9,500 PSI 1.5분 43.5 22.6 7.7 15

마. 미꾸리과 어류 자어 미세현미주입 조건의 예비탐색

미세현미주입 예비 조건 및 기술적 요인들의 조사와 최적화를 위해 자어

holding platform 조건의 최적화, 자어 마취 및 기타 취급 조건들의 평가,

injection needle 조건의 평가, post-injection 자어 관리 및 생존율 평가 및 정

소 세포 주입 예비 평가가 다음과 같이 수행되었다.

- 자어 holding platform 조건의 최적화

한천배지(agarose) 배지의 농도를 0.5%∼1.5% 범위에서 미세현미주입의

용이성을 평가한 결과, 수분, 자어 관찰, 자어 회수 등을 고려할 때

0.7% 내외의 농도가 미세현미주입 시 가장 용이하였고, 한천배지를 녹

- 43 -

이기 위해 사용하는 용액의 경우, 증류수 및 Tris-Acetate-EDTA (pH.

7.0)를 비교하였으나 두 용액 간 미세현미주입 및 자어에 미치는 영향은

큰 차이 없이 유사하였다.

아울러 자어를 일정한 위치에 고정하기 위해서 자어를 수용할 수 있는

hole을 다양한 방법으로 제작 후, 미세현미주입의 용이성을 검토한 결과,

미꾸리 자어의 경우 지름 1.5 mm x 길이 4.0 mm의 원통형 hole을 이

용할 때 미세현미주입 및 자어의 회수 등이 용이하였다. 또한 자어를

한천배지 platform에 옮길 경우 함께 옮겨지는 잉여의 물을 제거하기

위해서 한천배지 내 물을 쉽게 제거할 수 있는 수로용 홈을 만들어 이

용할 경우, 미세현미주입 시 자어의 취급이 보다 용이하였다.

- 자어 마취 및 기타 취급 조건들의 평가

자어의 움직임을 방지하기 위해서 다양한 마취 방법을 조사한 결과, 자어의

마취 속도, 마취 지속 기간, 마취로부터의 회복 시간 및 마취 처리에 따른

생존율을 고려할 때, 미꾸리 자어의 경우 MS-222 마취제가 가장 안정적인

마취제라고 판단되었다(표 6).

<표 6> 미세현미주입용 미꾸리 자어의 마취 평가

마취제 온도/농도신속한 마취

정도

마취 지속기간의적정성

회복까지소요시간

생존율

저온 처리 0∼1℃ +++ + +++ +++

리도카인 100 ppm ++ ++ +++ +++

Clove oil 100 ppm ++ ++ ++ +++

MS-222 100 ppm +++ +++ +++ +++

+++, 매우 우수, ++, 사용가능, +, 효과 미흡

- 44 -

앞서 표에서 보듯이 저온 처리의 경우 마취를 위해 특정 화합물을 사용하지

않아도 되고, 신속한 마취가 가능하다는 장점은 있으나, 미세현미주입을 위해

저온에서 상온으로 자어를 이송시킬 경우, 마취 지속 기간이 너무 짧다는 단

점이 있었다. 또한 염산리도카인은 마취 지속기간이 짧아 미세현미 주입 중에

대상 생물이 깨어난다는 단점이 있다. 그리고 클로버 오일(clove oil)은 다른

마취 방법에 비해 마취 후 회복 기간이 길다는 단점이 관찰되었다. 반면,

MS-222의 경우 비교적 빠른 마취효과와 마취 회복 효과가 있음에도 불구하고

미세현미주입에 충분히 필요한 마취 지속 기간을 제공할 수 있는 것으로 나타나,

본 어종의 자어를 대상으로 가장 적정한 마취제라고 판단되었다.

그러나 MS-222의 경우 마취 유효 농도가 미꾸리 자어의 발달 단계별로

차등하게 나타났는데, 즉 부화 직후(day-0)에서 부화 2일까지의 자어는 100

ppm 농도에서 충분한 마취가 이루어졌으나, 부화 3일째부터는 본 농도에서

마취까지의 소요 기간이 크게 증가하였다. 따라서 농도의 순차적인 증가를 통해

조사한 결과 부화 3일째 자어의 경우 200 ppm의 농도 이상에서 신속한 마취가

가능하였다. MS-222를 이용할 경우, 부화 직후 자어 및 부화 1일째 자어의

경우 30초 이내 빠른 마취가 가능하였고, 회복 역시 1.5분에 거의 대부분 자어

들이 마취에서 회복하였고. 반면 부화 2일 이상의 자어들은 1분 이내의 마취

시간 및 2-3분의 마취 회복 시간이 필요한 것으로 나타났다.

미꾸리 자어의 경우 상기 언급한 마취 방법들에 대해서 생존율에 민감한

영향을 받지 않았으며, MS-222는 물론 그외 사용한 방법들 모두에서 유의적인

폐사 등은 관찰되지 않았고, 모두 99% 이상의 생존율을 보였다. 마취 및 미세현미

주입 후 자어들은 25℃ 항온 플라스틱 수조(40 L 용량)로 옮겨 순환여과식 방법으로

관리하였다. 이때 물리적 여과 효율을 높이기 위해서 사육수를 200-um 거름

망으로 1차 거른 후 여과조를 통과토록 하였다. 자어의 일반적인 관리는 상술한

방법과 조건 대로 실시하였다.

- Injection needle 조건의 평가

용이한 미세현미주입을 위해 요구되는 needle의 구경은 자어의 발달 단계에

따라 차등으로 나타났으며, 그 결과를 요약하면 아래와 같다(표 7).

하기 표 7에서 보듯이 부화 직후 자어는 class-I 구경의 바늘은 손쉽게 미세

현미주입이 가능하였다(그림 23). 그러나, 자어의 크기가 작고 아직 장관막과

난황사이의 공간이 협소하여 class-II에서는 미세현미주입이 다소 어려웠으며

- 45 -

그 이상의 구경을 갖는 경우에는 미세현미주입의 정확도와 자어의 생존율에

큰 부정적인 영향을 나타내었다.

<표 7> 자어 발달 단계별 미세현미주입 needle 조건 평가

부화 후

일자

Needle diameter

Class-I(10〜15 μm)

Class-II(20〜25 μm)

Class-III(30〜35 μm)

Day-0 +++ + -

Day-1 +++ ++ +

Day-2 +++ +++ ++

Day-3 +++ +++ ++

+++ 용이, ++ 가능, + 어려움, - 매우 어려움

<그림 23> Class-Ⅰ을 사용한 부화 직후 자어의 미세현미주입

- 46 -

반면 Day-1에 도달한 자어의 경우 미세현미주입이 훨씬 용이하여

class-II에서도 미세현미주입이 가능하였고, 어려움은 있으나 적절한 바늘 끝의

모양이 확보된 다면 class-III 역시 미세현미주입에 이용될 가능성이 있다. 이후

Day-2 및 Day-3에서는 조사한 모든 구경에서 미세현미주입에 큰 장애는 관

찰되지 않은 것으로 나타났다(그림 24).

Day-1, Class-II Day-2, Class-II Day-3, Class-III

<그림 24> Class-Ⅱ 및 Ⅲ을 사용한 day-1에서 3까지 자어의 미세현미주입

본 예비 평가는 지시약(methylene blue)을 이용한 평가이기 때문에 실제

세포 현탁액을 주입할 경우, 별도의 추가적인 세부 조정이 필요할 수 있다. 즉

정소 현탁액에 있는 목적 세포들의 크기가 약 10 um 정도임으로 고려할 때,

class-I의 경우 needle의 막힘 등으로 인해 고농도의 세포 현탁액을 이식하는

것은 현실적으로 어렵다고 예상된다. 따라서 최소 class-II 이상의 needle 구경을

이용하여 최적화 과정을 시작하는 것으로 판단되었다. 특히, 시원생식세포의

출현과 정착이 미꾸리과 어류의 경우 부화 후 빠른 시일 내 완성된다는 점을

고려할 때 부화 직후 자어에서 class II 등의 needle을 이용할 수 있는 개선이

필요할 것으로 생각되며, 이는 needle 끝의 날카로운 경사면 확보를 통해서 얻어질

수 있으므로 이에 대한 보완이 필요할 것으로 판단된다.

- 47 -

Injection 위치의 경우 부화 직후 자어에서는 난황과 장관막 사이의 영역이

매우 협소하여 충분한 용액의 정확한 주입이 다소 어려웠으나, 부화 12시간째

부터 해당 공간이 선명하게 구분되어 미세현미주입에 큰 문제점은 관찰되지

않았다. 주입 용량은 본 공간이 충분히 채워질 만큼의 주사 시에도 자어의 생존

율에는 큰 영향을 미치지 않았으며, 가능한 주입 용량은 자어의 발달 단계에

따라 증가하였다(표 8).

<표 8> 자어 발달 단계별 미세현미주입 용량

부화 후 일수 평균 주입 용량(㎕) 조사마리 수

Day-0 (부화 직후) 20 ∼ 30 213 미

Day-1 60.5 168 미

Day-2 70.5 297 미

Day-3 80.0 50 미

주입 용량을 평가하기 위해서 해당 공간에 정확한 미세현미 주입이 이루어

졌는지를 보다 용이하게 평가하기 위해서 지시약으로서 methylene blue를 이용

하였다. 생존율에 영향을 미치지 않으며 확인이 용이한 유효 농도를 평가하기

위해 10 ppm∼50,000 ppm의 농도 범위에서 조사를 실시한 결과, 본 어종의

자어를 대상으로 할 경우 250 ppm의 농도를 이용할 경우 주입 성공여부를 손

쉽게 확인 가능하였고, 생존율에도 영향을 전혀 미치지 않았다.

부화 일자(자어 발달 단계)에 따른 미세현미주입 용량을 조사한 결과는 아

래와 같다. 아래 표에서 보듯이 부화 직후 30 ㎕ 이하의 용량이 주입되는 것

으로 관찰되었으며, 부화 시점의 차이에 따라서 개체 간 편차가 관찰되었다.

부화 1일째 및 2일째에는 그 주입 용량이 크게 증가하여 자어 당 60∼70 ㎕의

주입이 가능하였고, 부화 3일째에는 더욱 증가하였다.

- Post-injection 자어 관리 및 생존율 평가

상기 미세현미주입 조건들을 대상으로 미세현미주입 후 자어의 생존율을

평가하였다. 1차 평가는 부화 직후, 부화 1일차, 2일차, 3일차 및 4일차에

미세현미주입(지시약)을 실시한 후 미세현미 주입 후 3일까지의 폐사

- 48 -

개체들을 매일 확인하였음. 부화 직후의 미세현미주입은 needle 직경 10

〜15 um로, 부화 1일 및 2일차는 20〜25 um, 그리고 3일차 및 4일차에는

30〜35 um의 직경을 가진 needle을 이용하여 실시하였다. 2차 평가는

부화 1일차와 2일차에 미세현미주입한 수 생존율을 4일까지 측정하였다.

이때 부화 1일차에는 needle 직경 20〜25 um을 이용하여 미세현미주입

하였고 부화 2일차에는 직경 30〜35 um를 이용하여 미세현미주입을 실시

하였다.

1차 평가 결과, 미세현미주입구 모두에서 85% 이상의 생존율(미세현미

주입 후 3일까지)을 나타내었음(표 9). 부화 1일째 실시한 그룹의 경우

3일차에 86%를, 그 외 그룹들에서는 모두 90% 이상의 생존율이 관찰되

었지만, 자어 발달 단계에 따른 특이적인 차이라고 판단하기는 어렵다.

이에 대한 재확인을 위해서 2차 평가를 실시한 결과, 부화 1일째 주사

그룹에서도 97% 이상의 높은 생존율을 보임으로써 자어 발달 단계 또는

needle 직경 조건이 미세현미주입 자어의 생존율에 유의적인 영향을 미

치지는 않는 것으로 판단된다(표 10).

<표 9> 자어 발달 단계별 미세현미주입 후 생존율 1차 평가

주입

시기

Needle 직경

(um)

주입

마리 수

생존율 (%)

1-DPM 2-DPM 3-DPM

0 DPH 10-15 118 97.5 97.5 97.5

1 DPH 20-25 272 87.1 87.1 85.7

2 DPH 20-25 128 96.1 96.1 94.5

3 DPH 30-35 133 100.0 100.0 98.5

4 DPH 30-35 88 100.0 95.5 93.2

<표 10> 자어 발달 단계별 미세현미주입 후 생존율 2차 평가

주입

시기

Needle 직경

(um)

주입

마리 수

생존율 (%)

1-DPM 2-DPM 3-DPM 4-DPM

1 DPH 20-25 38 100.0 100.0 97.4 97.4

2 DPH 30-35 47 100.0 100.0 100.0 100.0

DPH: days post-hatching (부화 후 일수)

DPM: days post-microinjection (미세현미주입 후 일수)

- 49 -

상기 실험 조건들을 이용하여 알비노 미꾸리외 다른 미꾸리과 어종에도

유사한 방법으로 미세현미주입을 시범적으로 실시하였으며 미꾸라지, 점줄종개

에서도 알비노 미꾸리에서와 유사한 정도의 미세현미주입 시험이 가능 할 것

으로 판단되었다. 부화 자어의 크기에 따라 needle의 크기 및 주입 용량 등에

대해 추가적으로 세부 조정이 필요할 것으로 생각된다.

- 실험어(도너 및 대리모)

정소 조직을 제공하는 donor는 wild type 미꾸라지 수컷 개체로서 사육

하고 있는 개체 3마리를 이용하였다(표 11). 반면 대리모는 인공산란 유도된

알비노 선발 계통 간 교배를 통해 얻은 미꾸리 자어를 우선적으로 이용하였다.

수컷 번호 체중 체장 생식소 무게 생식소 길이

1 8.60 g 12.4 cm 0.01 g 2.6 cm

2 16.71 g 14.7 cm 0.04 g 3.2 cm

3 12.98 g 13.0 cm 0.01 g 2.9 cm

<표 11> 세포 주입용 donor 개체 측정 자료

- 세포 시료 준비

정소로부터 성체 줄기세포를 포함하리라 예상되는 세포 현탁액을 준비

하기 위해서 세절된 정소에 trypsin 처리를 통해 세포 균질액을 만들었다.

균질액으로부터 debris를 제거하기 위해서 42 um filter를 이용하여 여과를

수행하였고, 원심분리를 통해 농축 후 세포 수를 측정하였다. 아울러 세포

수 측정 시 trypan blue 염색을 통해 살아있는 세포의 빈도가 98.5% 임을

확인 후 실험에 이용하였다.

- 50 -

- 자어 미세현미 주입

미세현미주입은 20〜25 um의 직경을 가진 needle을 이용하여 실시하였고

아래와 같은 조건으로 세포 이식을 실시하였다(그림 25, 표 12).

<그림 25> 정소세포(미꾸라지) 미세현미주입(알비노 미꾸리 자어)

현탁 용액 Saline or PBS

자어 당 평균 주입 용량 60 nl

자어 당 평균 주입 세포 수 60,000 cells

미세현미주입 처리 시도 마리 수 342미

미세현미주입 성공 마리 수 310미(90.6%)

<표 12> 세포 미세현미주입 조건

- 51 -

미세현미주입 후 4일간 누적 폐사 개체를 측정하여 세포 이식이 대리모

자어의 생존에 미치는 영향 정도를 평가하였다. 아래 그래프에서 보듯이 주입

3일째까지 일부 자어들의 폐사가 관찰되었으나 4일째 이후 안정화되기 시작하여

더 이상 유의적인 폐사 경향을 보이지 않았다. 주입 4일째 누적 생존율은

93.2%로 나타났다(그림 26).

<그림 26> 세포 미세현미주입 후 자어의 생존율

바. 미호종개 생식줄기세포의 이종간 이식기술 개발

상기 확보된 이식기술을 기반으로 멸종위기 어류 미호종개의 생식줄기세포를

미꾸라지의 복강 내로 이식하기 위한 연구가 수행되었다.

- 실험어 (도너 및 대리모)

도너 어류 미호종개는 현상변경 허가에 따라 2016년 6월 중순, 충북 진천군

백곡면 사송리 소재 백곡천 일대에서 암․수 총 20개체를 채집하였으며

(그림 27), 순천향대학교 어류보전유전학 실험실의 사육실에서 관리하다가

실험에 이용하였다. 정소 조직 세포를 제공하는 미호종개 수컷 개체로서

사육하고 있는 개체 3마리를 이용하였다(표 13). 반면 대리모 어류 미꾸라지는

인공산란 유도를 얻어진 3배체 자어와 준성어를 이용하였다.

- 52 -

<그림 27> 백곡천에서 채집된 미호종개

수컷 번호 체중 체장 생식소 무게

1 11.59 g 11.8 cm 0.01 g

2 10.20 g 13.5 cm 0.02 g

3 12.81 g 12.6 cm 0.01 g

<표 13> 세포 주입용 donor 미호종개 개체 측정 자료

- 53 -

- 세포 시료 준비

정소로부터 성체 줄기세포를 포함하리라 예상되는 세포 현탁액을 준비

하기 위해서 세절된 정소에 trypsin 처리를 통해 세포 균질액을 만들었다.

균질액으로부터 debris를 제거하기 위해서 42 um filter를 이용하여 여

과를 수행하였고, 원심분리를 통해 농축 후 세포 수를 측정하였다. 아울러

세포 수 측정 시 trypan blue 염색을 통해 살아있는 세포의 빈도가

98% 이상임을 확인 후 실험에 이용하였다. 이식한 이후 세포의 행동

양상을 파악하기 위해 PKH26 Cell Linker Kit (Sigma)를 이용하여 세

포막을 형광 염색하였다(그림 28).

<그림 28> 형광 염색된 미호종개의 정소세포

- 54 -

- 자어 미세현미 주입

미세현미주입은 20〜25 um의 직경을 가진 needle을 이용하여 실시하였고

아래와 같은 조건으로 형광세포 이식을 실시하였다(그림 29, 표 14).

<그림 29> 정소세포(미호종개) 미세현미주입(미꾸라지 자어)


자어 당 평균 주입 용량 60 nl

자어 당 평균 주입 세포 수 약 50,000 cells

미세현미주입 성공 마리 수 205미

<표 14> 세포 미세현미주입 조건 1차 평가

- 55 -

- 준성어 미세현미 주입

자어에 대한 이식 실험과 함께 7개월령 3배체 미꾸라지에 대한 미세현미

주입이 병행 수행되었다. 이식 전 busulfan(Sigma) 처리를 통해 면역거부

반응을 억제시켰다. 미세현미주입은 20〜25 um의 직경을 가진 needle을

이용하여 미세현미 주입하였고 아래와 같은 조건으로 형광세포 이식을

수행하였다(그림 30, 표 15).

<그림 30> 정소세포(미호종개) 미세현미주입(미꾸라지 준성어)


어류 당 평균 주입 용량 약 200 ml

어류 당 평균 주입 세포 수 약 50,000 cells

미세현미주입 성공 마리 수 272미

<표 15> 세포 미세현미주입 조건 2차 평가

- 56 -

- 준성어로 미세현미 주입된 생식줄기세포 확인

이종간이식의 성공 여부는 이식 후 20일째 형광 염색된 세포가 대리모

미꾸라지의 생식선에서 관찰되는지 유무로 판별되었다. 확인결과 동결-

해동된 미호종개의 생식줄기세포가 68.9 ± 7.4% (183마리/267마리) 증식

중인 것으로 확인되었다. 반면 동일 세포를 부화자어에 이식한 경우

74.9 ± 5.9%의 생식줄기세포가 증식 중인 것으로 확인되었다. 두 방법에

이식효율은 부화 자어 이식법이 높았으나 두 방법 간에 이식효율의 유의적

차이는 관찰되지 않았다.

- 호르몬 측정을 통한 우수 생식집단 선별

생식줄기세포가 이식된 개체 중 성숙 생식세포의 생산 가능성이 높은

우수 생식집단을 선별하기 위한 실험이 진행되었다. 준성어에 이식한 이후

65일째 대리부모 미꾸라지 개체들을 대상으로 암수 각각의 개체에 대해

17β-estradiol과 testosterone 호로몬 농도를 ELISA kit(Sigma)를 이용

하여 측정하였다. 실험 결과 암컷 24개체 와 수컷 29개체가 선별되었다

(그림 31). 대리모 친어의 암컷과 수컷은 가슴지느러미 모양과 골질반

관찰을 통해 확인하였다.

<그림 31> 선별된 우수 생식집단 대리부모 미꾸라지

- 57 -

- 미호종개의 생식줄기세포가 이식된 3배체 미꾸라지의 성성숙

7개월령 대리부모 미꾸라지의 산란유도를 위해 암컷과 수컷의 복강에

Ovaprim(Sindel, US)과 HCG(Human Chorionic Gonadotropin, 대상미생물

연구소, 한국)를 각 0.5 ml/kg, 10 IU/g의 농도로 주사하였다. 10〜12시간

이후에 복부 압박법(그림 32)으로 확인한 결과 암컷 개체 23마리 중 4

마리, 수컷 개체 26마리 중 6마리가 배란 및 배정하는 것으로 확인되었다.

성숙난에 100배 희석한 정액을 건식법으로 수정시켰으며, 수온 25℃를

유지시킨 채 유수식으로 관리하였다(그림 33).

<그림 32> 복부 압박법으로 대리모 미꾸라지 채란

<그림 33> 대리부모 미꾸라지로부터 얻어진 수정란

- 58 -

3배체 대리부모 미꾸라지로부터 얻어진 수정란은 수정 후 15분 이내로

난막과 난황이 분리되기 시작하였고, 수정 후 45분이 경과하면 동물극에

배반(Blastodisc)이 형성되었다. 1시간 경과 후 배반의 중앙이 수직 이

등분되어 2세포기로 이행하였고, 1시간 10분경과 후 4세포기에 도달하

였다. 수정 후 1시간 30분 후에는 8세포기로 이행하였고, 1시간 45분 후

에는 16세포기에 도달하였다. 2시간 경과 후에는 32세포기로 이행하였으며,

2시간 10분 후에는 64세포기에 도달하였고, 이 후 계속 발생이 진행되어

2시간 35분 후에는 상실기에 접어들어 할구가 작아지고 조밀해졌으며,

이후 난할의 발생속도가 느려졌다. 수정 후 4시간에 포배기(blastula)에

도달하였으며, 수정 8시간 후에 배반이 난황의 1/2를 덮어 내려와 낭배기

(gastrula)에 도달하였다. 9시간 후에는 배반이 난황의 대부분을 덮었다.

10시간 10분 후에는 난황 위에 유백색의 배체(embryo)가 형성되어 엷게

나타났으며, 12시간 후에 근절이 4〜6개가 생겼다. 13시간 15분 전 후에는

안포 뒤에 이포가 생기면서 근절도 16-18개로 증가하였다(그림 34A).

15시간 15분 후에는 배체가 간헐적으로 운동을 시작하였으며, 근절은

28〜30개로 증가되었고 꼬리 부분이 난황으로부터 떨어져 연장되기 시작

하였다. 28시간 전후로 난황 앞쪽에 심장이 형성되어 서서히 고동하는

것을 관찰할 수 있었으며 배체는 난막 내를 활발하게 회전 운동하였고,

난황 등 쪽에 가슴지느러미의 원기가 나타나며 꼬리부분이 난황으로부터

분리되었다. 수정 후 40시간을 전후하여 머리 부분부터 난막을 뚫고 부화

되기 시작하였다(그림 34B).

<그림 34> 대리부모 미꾸라지로부터 얻어진 발생 배아

- 59 -

Donor

미호종개

AATATTAAGCCATAAGTGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTTTTAAAAGA

ACATCACGGACAACACTATGAAAACTAGTGCTCGAAGGAGGATTTAGTAGTAA

AAAGGAAATAGAGTGTCCTTTTGAACCCGGCTCTGAGGCGCGTACACCCTGTGA

AGGACTAATAGTAAGCAGAGTGGATAAAATCCAAAACGTCAGGTCGAGGTGTA

GCGAACGAAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTTTTAAAAGAACATCACGG

ACAACACTATGAAAACTAGTGCTCGAAGGAGGATTTAGTAGTAAAAAGGAAA

TAGAGTGTCCTTTTGAACCCGGCTCTGAGGCGCGTACACACCGCCCGTCACTCT

부화 직후의 자어는 전장이 4 mm로 눈에 색소가 착색되지 않았고 난황을

두부가 감싸는 형태를 띄었다. 부화 후 1일째의 자어는 전장이 4.5 mm로

미꾸리과 자어의 특성인 외새가 3쌍 출현하였고 몸에 흑색소포체가 나

타났으며 안경은 검정색으로 착색되었다. 부화 후 2일째의 자어는 전장이

5.2 mm로 외새가 6쌍으로 늘어났고, 가슴지느러미가 발달하였으며 난황이

1/2 흡수되었고 입수염이 발달하였다. 부화 후 3일째의 자어는 전장이

5.7 mm로 두부가 발달하였고 입과 항문이 발달하였으며 외새가 줄어들고

입수염의 길이가 증가하였다. 부화 후 4일째의 자어는 전장이 6.1 mm로

입과 항문이 완전히 열려 초기사료인 rotifer를 섭식하기 시작하였고 외새는

아가미 뚜껑 인근에 머물렀고 입수염은 2쌍으로 증가하였다. 부화 후 5

일째의 자어는 전장이 6.5 mm로 외새가 아가미뚜껑 안으로 들어갔고

입수염은 3쌍으로 증가하였다. 부화 후 7일째의 자어는 전장이 8 mm로

artemia를 섭식하기 시작하였고 외새는 꼬리지느러미가 발달하였다. 부화

후 8일째의 자어는 전장이 8.5 mm로 꼬리지느러미가 발달하여 10개 이

상의 줄기가 발생하였으며 입수염이 뚜렷하게 분화되었다. 부화 후 10

일째의 자어는 전장이 10 mm로 막지느러미로부터 등지느러가 발달하기

시작하여 10개이상의 줄기가 발생하였다. 부화 후 11일째의 자어는 막

지느러미가 수축하기 시작하여 등지느러미의 형태가 외부로 돌출되었으며

뒷지느러미가 발달하였다. 부화 후 14일째의 자어는 전장이 15 mm로

몸의 측면에는 감베타 반문이 나타나기 시작하였고 막지느러미로부터

배지느러미가 분화되었다. 부화 후 19일째의 자어는 전장이 25 mm로

막지느러미가 완전히 소실되어 각 지느러미가 분화되어 치어기로 이행

하였다.

- 대리부모 미꾸라지로부터 생산된 F1 개체에 대한 유전자 분석

수정 실험 직후 대리부모 미꾸라지 수컷 6개체로부터 얻어진 정자에 대한

미토콘드리아 CO1 영역 유전자 분석이 수행되었다. 분석 결과는 다음과

같다.

- 60 -

CCCCGCCAAATAGCGACAACTGTTGTTAACACACAAGCATAAATGAGGGGAGG

CAAGTCGTAACATGGTAAGTGTACCGGAAGGTGCACTTGGATCAAATCAGGGT

GTGGCTGAGATAGTTAAGCATCTCCCTTACACCGAGAAGACATCCATGCAAGT

TGGATCACCCTGAGCTAAATAGCTAGCTTAACTACTATACTAAATTAACAACA

TAAATAAATTGATAAAGCCTAAAACTATTAATCAAATCATTTTTCCACCTTA

GTACGGGAGACGAAAAAGGTTCCATAAGCAATAGAAAAAGTACCGCAAGGGAA

AGCTGAAAGAGCAATGAAATAAGTCATTTAAGCACAAAAAAGCAGAGACTAA

AACTCGTACCTTTTGCATCATGATTTAGCAAGTATACAACAAGCAAAGAGACC

TTTAGTTTGTTACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGGGACAGCCTAAAAGGGC

CAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGAGTGGGAAGATCCCCGGGTAGAGGTGACAGAC

CTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCT

CACGTCCCCTTTAGTCATATTAGTTATATCTAGGTTAGACATGAGAGAAGCAT

GAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTAACCAAGGGTACAACTTTACCA

GGAGGATAGGGATTATAGTTTTAAAAATTCATTGTTTCAGTGGGCCTAAAAGC

AGCCATCTGTTCAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAATAAAAAATTTATTATTTC

AATAGCATATCCCATTCCCCTAATCTTATTAGGCCGCTCCATGACATCATGGA

AGAGACCATGCTAATATGAGTAACAAGAGACAATATTTCTCTCCAGGCATAAG

TGTAAGCCAGCCCGGATAAACCACCGGCAATTAACGAACCCAACAAAAGAGGG

TAGTATAATTAATATAATATACAAGAAAAGCATATAAACCCCAATCGTTAAA

CCCACACTGGAGTGCCCACAGGAAAGACTAAAAGGAAGGGAAGGAACTCGGCA

AACACAAGCCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCTCCTGCAAAATTCAAGGTA

TAGGAGGTCCAGCCTGCCCAGTGACCACAAGTTCAACGGCCGCGGTATTTTGAC

CGTGCAAAGGTAG

Male 1
























- 61 -







CGTGCAAAGGTAG

Male 2






























CGTGCAAAGGTAG

Male 3











- 62 -




















CGTGCAAAGGTAG

Male 4



























- 63 -




CGTGCAAAGGTAG

Male 5

















CAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGAGTTGGAAGATCCCCGGGTAGAGGTGACAGAC













CGTGCAAAGGTAG

Male 6








CCCCGCCAAATAGCGACAACTGTTGTTAACACACAAACATAAATGAGGGGAGG






- 64 -
















TAGGAGGTCCAGCCTGCTCAGTGACCACAAGTTCAACGGCCGCGGTATTTTGAC

CGTGCAAAGGTAG

대리부모 미꾸라지 수컷 6개체로부터 얻어진 정자에 대한 미토콘드리아

CO1 영역 유전자 분석 결과 6개체 모두가 미호종개인 것으로 분석되었다.

이 결과는 미호종개의 동결 생식줄기세포가 미꾸라지에 이식하였을 때,

생착된 세포들은 정상적으로 증식하고 정자형성과정(spermatogenesis)을

거쳐 성숙 정자로 분화되었음을 시사한다. 다음으로 3배체 대리부모 미꾸

라지로부터 얻어진 부화 자어 402개체 중 133개체에 대한 미토콘드리아

CO1 영역 유전자 분석 실험이 수행되었다. 실험 결과 133개체 모두가

미호종개인 것으로 판별되었다(그림 35). 또한 유세포분석기 분석을 통한

실험 결과 모든 F1 개체(60/60)가 정상적인 2배체인 것으로 확인되었다.

- 65 -

<그림 35> 대리부모 미꾸라지로부터 얻어진 부화자어의 유전자 분석

(계속)

- 66 -

(계속)

<그림 35> 대리부모 미꾸라지로부터 얻어진 부화자어의 유전자 분석

- 67 -

Ⅳ. 고찰 및 결론

멸종위기Ⅰ급 어류인 미호종개(Cobitis choii), 퉁사리(Liobagrus obesus),

감돌고기(Pseudopungtungia nigra)는 법적 보호를 받고 있으나, 환경변화와

기후변화에 따른 영향으로 유전적 다양성이 소실될 위험성이 크다. 고부가가치

어종인 뱀장어(Anguilla japonica)는 태평양의 마리아나 해구 근처에서 산란한

뒤 우리나라 하천으로 이동하는 개체를 포획하여 이용하기 때문에 유전자원을

안정적으로 장기보존하기 위한 기술 개발이 중요하다. 따라서 본 연구에서 확립된

해당 종에 대한 초저온 동결보존 기술은 멸종위기 어류의 보전뿐만 아니라 고부가

가치 어류의 유전자원을 안정적으로 장기보존하기 위해 중요한 활용가치를 갖는다.

또한, 생식줄기세포의 이종간 이식기술은 사육이 쉽고 성숙까지 필요한 기간이

비교적 짧은 숙주에 이식하여 원하는 어류의 배우자(알과 정자)를 쉽고 단기간에

얻을 수 있다는 측면에서 중요하다.

금년도 연구에서는 미호종개, 퉁사리, 감돌고기, 뱀장어 4종의 어류에 대한

유전자원 장기보존 기술을 개발하기 위해 세포막 침투성 동결보호제의 종류와

농도조건, 세포막 비침투성 동결보호제의 종류와 농도조건, 냉동속도 및 해동

온도에 따른 생식줄기세포의 초저온 동결보존 최적조건을 확립하였다. 미호종개의

생식줄기세포는 1.3 M DMSO, 0.3 M 트레할로스를 포함하는 동결보호제에

이용하여 -1℃/분로 냉각하고 26℃에서 해동할 때 가장 높은 세포 생존율이

얻어졌다. 퉁사리, 감돌고기, 뱀장어는 생식줄기세포를 각각 1.5 M 메탄올, 1.5 M

에탄올 및 1.3 M DMSO의 동결보호제에 이용하여 -1℃/분로 냉각하고 30℃에서

해동할 때 가장 높은 세포 생존율이 얻어졌다. 이 결과를 통해 생식줄기세포를

위한 동결보호제 조건은 종별 특성에 따라 다르지만, 냉각속도와 해동온도는

동일한 조건에서 최적 생존율을 얻을 수 있음이 확인되었다. 동결보호제의 최적

조건이 종 특이적이라는 결과는 어류 정자를 이용한 다수의 선행연구를 통해

논의되었다(Hagedorn et al., 1996). 반대로 계통간의 유연성에 따라 최적 동결

보호제 조건이 큰 차이가 없다라는 연구 결과도 보고된바 있다(Zhang and

Lubzens, 2008). 따라서 향후 연구에서 어류 생식줄기세포에 대한 동결보호제의

최적조건 실험이 면밀히 수행되어야 할 것으로 판단된다. 금년도 조사된 4종의

어류 모두에서 냉각속도와 해동온도는 분당 -1℃씩 온도를 낮추고 26〜30℃에

서 해동할 때 생식줄기세포의 최적 생존율이 확보되었다. 1차년도 연구사업에

서 수행된 연어과 냉수성 어종의 경우도 분당 -1℃씩 온도를 낮추고 30℃에서

해동할 때 생식줄기세포의 최적 생존율이 확보되었다. 포유류의 경우 세포의

- 68 -

특성에 따라 냉각속도와 해동온도가 일정한 패턴을 유지하는 것으로 알려져

있다(Mazur et al., 2008). 어류의 생식줄기세포의 경우 분당 -1℃의 냉각속도와

30℃의 해동온도가 최적 세포 생존을 위해 일반적 경향성을 보이는지 여부는

향후 면밀한 조사가 필요하다.

미호종개의 생식줄기세포를 미꾸라지의 복강 내로 이식하기 위한 needle의

적정 직경은 20〜25 um이였으며 미세현미주입구 모두에서 85% 이상의 생존

율을 나타내었다. 부화 1일째 실시한 그룹의 경우 3일차에 86%를, 그 외 그룹

들에서는 모두 90% 이상의 생존율이 관찰되었지만, 자어 발달 단계에 따른

특이적인 차이라고 판단하기는 어렵다. 이에 대한 재확인을 위한 실험에서도

부화 1일째 주사 그룹에서도 97% 이상의 높은 생존율을 보임으로써 자어 발달

단계 또는 needle 직경 조건이 미세현미주입 자어의 생존율에 유의적인 영향을

미치지는 않는 것으로 판단된다. 이는 연어과 어류에서 수행된 선행연구

(Yoshizaki et al., 2011, 2012) 결과와 유사하였다.

본 연구에서는 미호종개의 생식줄기세포 이식을 위해 부화 자어 이식법과

미성어 이식법 두 가지 방법이 사용되었다. 실험 결과, 이식 세포의 증식율을

기준으로한 이식 효율은 부화 자어 이식법(74.9 ± 5.9%)과 미성어 이식법(68.9

± 7.4%) 간에 유의적 차이를 보이지 않았다. 선행연구(Lacerda et al. 2010;

Majhi et al. 2009; Silva et al. 2016)는 미성어 이식법을 사용할 경우 부화 자어

이식법과 비교해 보다 빠르게 F1 개체를 얻을 수 있음을 증명하였다. 또한

Okutsu 등은 무지개송어의 생식줄기세포를 3배체 불임 대리부모의 복강 내에

이식하는 방법을 통해 이식 세포 유래의 F1 개체만을 얻을 수 있는 장점이

있다고 보고했다(Okutsu et al., 2006, 2007). 본 연구에서는 3배체 미성어에

생식줄기세포를 이식하여 보다 빠르게 F1 개체만을 얻기 위한 실험이 시도되

었다. 실험 결과 이식 후 약 4개월 만에 F1 개체만을 성공적으로 유도할 수

있었지만 3배체 미성어를 이용한 F1 개체 확보율은 정상 대리부모 미꾸라지의

약 2〜5%에 불과하여 두 가지 이식 방법에 대한 비교 연구가 필요할 것으로

판단된다.

본 과제는 2차년도 연구사업으로 멸종위기 어류 3종(미호종개, 퉁사리, 감

돌고기)과 고부가가치 어류 1종(뱀장어)의 생식줄기세포 동결보존기술 확립

및 미호종개의 생식줄기세포를 미꾸라지에 이종간 이식하기 위한 기반기술 확보를

연구목표로 하였다. 미호종개의 생식줄기세포로부터 유도된 F1 개체의 자연

생태계로의 방류를 고려할 때 유전적 안전성 검증과 대리부모 미꾸라지로부터

F1 개체를 고효율로 얻을 수 있는지 내년도 사업에서 추가적으로 조사되어야

- 69 -

한다. 본 연구결과를 통해 확보된 기술은 멸종위기 어류의 보전뿐만 아니라

경제적 가치가 높은 어류의 대량생산을 위한 상용화 기술로 활용될 수 있을

것으로 판단된다.

- 70 -

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> Misgurnus mizolepis mitochondrial DNA, complete sequence

CACGTAGCTTAAAATAAAGCATAGCACTGAAGATGCTAAGATGGGCCCTAGAAAGCCCCGTCT

GCACAAAGGCTTGGTCCTGACTTTACCATCAGCTTTAGCCCAATTTACACATGCAAGTCTCCG

CGAACCCGTGAGAATGCCCTCAATCCCCCACCCGGGGACGAGGAGCAGGCATCAGGCACAAATT

TTAGCCCAAGACGCCTTGCCACGCCACACCCCCAAGGGAATTCAGCAGTGATAAATATTAAGC

CATAAGTGAAAACTTGACTTAGTTAGGGATAAGAGGGCCGGTAAAACTCGTGCCAGCCACCGC

GGTTATACGAGAGGCCCCAGTTGATGGACACGGCGTAAAGGGTGGTTAAGGTTTAGTAAAAA

TAAAGCCAAAAGACCTCTTGGCTGTCATACGCCCCTGAGTCTCCGAAGCCCACATACGAAGGT

AGCTTTAATACTATATTTACCTGACCCCACGAAAGCTGAGAAACAAACTGGGATTAGATACC

CCACTATGCTCAGCCATAAACTTAGGCGTTATTTTACAATTAACGCCCGCCAGGGTACTACGA

GCATTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCTTAGACCCCCCTAGAGGAGCCTGTTCTA

GAACCGATAACCCCCGTTAAACCTCACCACTTCTGGCCATCCCCGCCTATATACCGCCGTCGTC

AGCTTACCCTGTGAAGGATAAATAGTAAGCAAAGTGAATATAATCCAAAACGTCAGGTCGAG

GTGTAGCGAACGAAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTTTAATAAGAATATTACGGACAA

CACTATGAAAACTTAGTGCTTGAAGGAGGATTTAGTAGTAAAAAGGAAATAGAGTGTCCTTT

TGAACCTGGCTCTGAGGCGCGTACACACCGCCCGTCACTCTCCCCGCCAATAGCAACAAATGTT

AATAACATATAAGCACAAATAAGGGGAGGCAAGTCGTAACATGGTAAGTGTACCGGAAGGTG

CACTTGGATCAAATCAGGGCGTGGCTGAGATAGTTAAGCATCTCCCTTACACCGAGAAGACAT

CCATGCAAATTGGATCGCCCTGAGCTAAATAGCTAGCTTAAACATCACATTAAATTGACAAT

ATAAATAAAGTAGTAAAACCTAAAATTATTAATTAAACCATTTTTCCACCTTAGTACGGGAG

ACGAAAAAGGTTCTGTAAGCAATAGAGAAAGTACCGCAAGGGAATGCTGAAAGAGCAATGAA

ACAAGTCATTTAAGCATAAAAAAGCAGAGACTAAAACTCGTACCTTTTGCATCATGATTTAG

CAAGCATACAACAGGCAGAGAGACCTTTAGTCTGTTACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGG

GACAGCCTTATAAGGGCCAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGCGTGGGAAGAGCCCCGGGTAGAGG

TGACAGACCTACCGAACTCGGTGATAGCTGGTTGCTTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCG

TGCCCCTTTAATTAAATAAGTAATATCTGATTTAAAAATATAAGAGAAACATGAGAGTTAG

CTGAAGGGGGTACAGCCCCTTCAATTAAGGATACAACTTTACCAGGAGGATAGGGATTATAA

TTATAAAGATTTATTGCTTCAGTGGGCCTAAAAGCAGCCATCTGCACAGAAAGCGTTAAAGC

TCAAGCACTACAAAATTTATTATCCTAATAAAATATCCCACTCCCCTAAATATATTAAGCCG

TTCCATGATATCATGGAAGAGATTATGCTAAAATGAGTAACAAGAGATAATATTTCTCTCCA

AGCATAAGTGTAAGCCAGCCCGGATAAGCCGCTGGCAATTAACGAACCCAATAAAAGAGGGCA

GTGTAACTATAAAAAACACAAGAAAATTATACAACCCCTAATCGTTAACCCCACACTGGAAT

GCCCAAAGGAAAGACTAAAAGGAAAGGAAGGAACTCGGCAAACACAAGCCTCGCCTGTTTACC

AAAAACATCGCCTCCTGCAAAACTCAAAGTATAGGAGGTCCAGCCTGCCCAGTGACCACAAGT

TCAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCAAAGGTAGCGCAATCACTTGTCTTTTAAATGAAGAC

CTGTATGAATGGCTAAACGAGGGCTTAGCTGTCTCCCTTTCCAAGTCAGTGAAATTGATCTGC

CCGTGCAGAAGCGGACATAAAAATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGGTTCAAGCC

CAACCGCATCAAACAACTTTCTTAATAAGAACTAAACCTTAGCGGATGATGGAGCTTTACCT

TCGGTTGGGGCGACCACGGAGAAAAATATATCCTCCAAGTGGATTGGGTAATAAACCTAAAA

CTAAGAAAGACATTTCTAAGTCACAGAAAATCTGACCAACAATGATCCGGCCTATAGGCCGA

TCAACGGACCAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTCTCCCAGAGTCCATATCGACGAG

GGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGTTCG

TTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGCAATCCAGGTCAGTTTC

Ⅵ. 부록

- 74 -

TATCTGTAAATGTCACTTTTCCTAGTACGAAAGGACCGGAAAAGAAAGGCCCATGCTAAAAG

TATGCCTTACCCTTAATTAATGAAGACAACTAAATTAAACAAATGGAGGACCTTCAATCTAG

GCAAAGATAAAGCCATACTAAGATGGCAGAGCATGGTAATTGCAAAAGGCCTAAGCCCTTTC

AGCCAGAGGTTCAAATCCTCTTCTTAGTTTATGCTAAACACTCTCTTAATCCACTTAATTAA

CCCTCTCGCGTACATCGTTCCTGTTCTCCTAGCGGTAGCATTCCTCACACTAATTGAACGAAA

AGTCCTAGGTTATATACAACTACGTAAAGGCCCAAATATTGTTGGACCCTATGGCCTCCTTCA

ACCAATTGCAGATGGGGTAAAATTATTTATTAAAGAGCCCATCCGCCCATCTTCATCATCCCC

CTTTCTATTTCTAGCCACCCCTATACTTGCACTAACATTAGCCATAACACTATGAGCCCCAAT

TCCCATACCTCACCCCGTCATAGACCTCAACCTAGGTATCTTATTTATTCTAGCCCTCTCTAG

CCTTGCCGTATACTCAATTCTTGGATCAGGCTGAGCCTCAAATTCAAAATATGCATTAATTGG

TGCCCTACGGGCTGTAGCCCAAACAATCTCCTATGAAGTAAGTCTAGGATTAATCCTTCTCTC

AGTGGTAATTTTCTCAGGTGGTTATACACTACAAACATTTAACATCACACAAGAAGGCATCT

GACTCCTTATTCCATCCTGACCACTAGCAGCAATATGATATATCTCAACTTTAGCAGAGACTA

ACCGAGCCCCTTTTGACCTAACTGAAGGTGAATCCGAATTAGTATCAGGATTTAATGTAGAG

TATGCAGGAGGACCTTTCGCCCTATTCTTCCTGGCTGAATATGCTAACATTTTGTTAATAAA

TACTCTGTCAGCCGTCCTCTTTCTTGGTGCCTCACATATTCCAACCTTTCCCGAATTAACAAC

AATTAATTTAATAACCAAAGCCGCACTTCTTTCAATAGTATTTTTATGAGTTCGAGCCTCAT

ATCCACGATTCCGCTATGACCAGTTAATACACCTGGTATGAAAAAACTTCTTACCCCTGACCC

TGGCCTTAGTTTTATGACACACTGCCCTCCCAATTGCATTTGCAGGCCTCCCTCCACAACTCTA

ACAAACAGGAACCGTGCCTGAATGCCCAAGGACCACTTTGATAGAGTGGCTTATGAGGGTTAA

AGCCCCTCCAGTTCCTAGAAAGAAGGGAATCGAACCCATACTCAGGAGATCAAAACTCCTGGT

GCTTCCTCTACACCACTTTCTATGATAAGGTCAGCTAATTAAGCTTTCGGGCCCATACCCCGA

ATATGATGGTTAAAATCCCTCCCCTATCAATGAACCCTTATGTACTAGTTATCTTATTGTCC

AGCCTAGGACTAGGAACCACATTAACCTTCGCAAGCTCCCACTGACTGCTAGCCTGAATAGGA

TTAGAAATTAATACCCTAGCAATTATTCCCCTCATAGCACAGCAGCATCACCCACGAGCAGTT

GAAGCTACTATCAAATATTTTCTTACACAAGCAACAGCCGCAGCCATAATTTTATTTGCAGCC

ACAACAAATGCATGAATAATAGGAGAATGAGACATTAACAATTTATCCCACCCATTAGCCTC

GACCTTGGTAATCATAGCACTAGCACTAAAAATTGGCTTAGCCCCTCTACACTTCTGATTACC

GGAAGTCCTTCAAGGCCTAAGCCTAACAACAGGTCTAATCCTATCAACATGACAAAAACTAGC

ACCATTCGCACTAATTATTCAAGTAGCCCCCACAATTGACCCCTACCTACTCTCTTCATTAGG

TCTTTTATCCACCCTTATTGGGGGATGAGGCGGCCTAAACCAAGTTCAATTACGAAAAATCCT

AGCTTACTCCTCCATTGCACATATGGGCTGAATAATTATTGTCCTACAATTTGCCCCCCAACT

AACCCTCCTAGCGCTAGGGACATATATTTTTATAACTACTACAGCATTCCTCTCATTTAAAA

TATCATCAGCCACTAAAATTAATACGCTTTCTTTAGCATGAGCAAAAACACCAACTCTTATA

GCTACAACAGCCTTAGCCCTCCTCTCCCTAGGAGGACTCCCCCCACTAACTGGGTTTATACCTA

AATGATTAATTTTACAAGAACTGGCAAAGCAAGAACTACCCCTCACAGCAACAGTCATAGCCC

TAACAGCCCTATTAAGCTTATATTTTTACCTACGCCTGTGTTATGCAATAGCCTTAACAATT

TCACCCGCCACAATTAATTCCATAATACCCTGACGAAGCTCCAACACTCAATCAACCCTTATT

TTAGCCCTATCCACTACAATTACCCTGGGCCTTCTTCCAATCACCCCTGCCATTATAGCATTA

ATTACCTAGGGGCTTAGGATAACTTAGACCAAGAGCCTTCAAAGCTCTAAGCAGGAGTTAAA

ATCTCCTAGCCCCTGATAAGACTTGCGGGACTCTATCCCACATCTTCTGAATGCAAATCAGAC

ACTTTAATTAAGCTAAAGCCTTTCTAGATGAGAAGGCCTCGATCCTACAAACTCTTAGTTAA

CAGCTAAGCGCCCAAACCAGCGAGCATTCATCTACTTTCCCGCCGTCAGGCGAGCAAGGCGGGA

AAGCCCCGGCAGACGTCAGTCTGCGTCTTTGGATTTGCAATCCAATGTGTTCTCCACCACGGG

GCTTGATAGGAAGAGGACTTAAACCTCTATCTACGGGGCTACAACCCGCCACCTAACTTCGGC

CATCCTACCTGTGGCAATCACGCGCTGACTTTTCTCTACTAATCACAAAGATATTGGCACCCT

- 75 -

TACCTTGTATTCGGTGCCTGGGCCGGAATGGTTGGAACTGCTCTCAGCCTCCTCATTCGTGCTG

AACTTAGTCAACCCGGGTCCCTCCTCGGAAATGATCAAATTTATAATGTTATTGTTACTGCAC

ATGCCTTTGTCATGATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTCTTATTGGTGGGTTTGGTAATTGA

CTTGTTCCTTTAATGATTGGGGCACCAGACATGGCATTTCCGCGTATAAATAACATAAGCTTC

TGACTCTTACCACCCTCATTCCTCCTCTTGCTGGCATCTTCTGGCGTTGAAGCTGGAGCCGGAA

CAGGTTGAACCGTTTACCCACCTCTAGCTGGCAACCTCGCCCATGCGGGTGCATCTGTAGACCT

TACCATCTTCTCCTTACATTTAGCAGGGGTTTCATCTATTCTAGGAGCAATTAATTTTATTA

CTACAACAATTAACATAAAACCTCCAGCCATCTCGCAATACCAAACCCCCTTGTTTGTCTGAG

CAGTTCTTGTAACTGCCGTTCTTCTTTTACTATCCCTGCCTGTTCTAGCTGCTGAATTACAAT

ACTCTTAACAGACCGGAACCTAAACACCACCTTTTTTGACCCGGCAGGTGGAGGAGACCCTAT

TCTATACCAACACTTGTTCTGATTCTTTGGCCACCCAGAAGTTTACATTTTAATTTTACCGGG

GTTTGGCATTATCTCACATGTTGTAGCTTACTACGCGGGCAAAAAAGAACCCTTTGGATATA

TGGGGATAGTTTGAGCTATAATAGCCATCGGCCTCCTGGGCTTCATTGTATGAGCTCACCACA

TGTTCACAGTCGGAATAGATGTTGATACTCGTGCATACTTTACATCTGCTACAATAATTATC

GCCATCCCAACGGTGTAAAAGTCTTTAGCTGATTAGCCACACTTCATGGGGGCTCAATCAAAT

GAGAAACCCCTATGCTGTGAGCCCTTGGATTTATCTTCCTATTTACAGTGGGAGGATTAACTG

GGATTGTCCTAGCTAATTCATCCATCGATATTATGCTCCACGACACATATTATGTAGTTGCTC

ATTTCCACTACGTACTCTCAATAGGAGCAGTCTTTGCCATTATGGCTGGCTTTGTCCACTGAT

TCCCATTATTCACAGGGTATACTCTGCACAGCACTTGAACTAAAATTCACTTTGCAGTCATGT

TCTTAGGTGTAAACCTCACCTTTTTCCCACAGCATTTCCTCGGCCTTGCAGGAATGCCCCGACG

ATACTCAGATTATCCAGACGCCTACACCCTATGAAATACAATTTCATCAATTGGGTCAATAA

TTTCTCTAGTGGCTGTAATTATGTTCCTATTCATTTTATGAGAAGCCTTTGCCTCTAAACGG

GAAGTTCTATCTGTAGAACTTACTGCAACAAATGCTGAGTGACTTCACGGATGCCCTCCACCT

TACCACACATTTGAGGAACCAGCATTCGTCCAAGTCCAATCAAATTAATCGAGGAAAGGAGG

AATTGAACCCCCATGTGCTGGTTTCAAGCCAGCCGCATAACCACTCTGCCACTTCCTTCTAAG

ACATTAGTAAATTTGTAATTACATCACTTTGTCAAGGTGAAATTGTGGGTTAAATTCCCGCA

TGTCTTAAGCTTAAAGCTTAATGGCACATCCCTCACAACTAGGATTCCAAGACGCGGCATCAC

CCGTTATAGAAGAACTTCTTCACTTTCATGACCATGCGCTAATAATTGTATTTTTAATTAGC

ACCCTTGTACTTTACATTATCGTCGCCATAGTCTCCACAAAATTAACTAATAAGTACATTTT

AGACTCTCAGGAAATTGAGATTGTGTGAACTGTTTTACCGGCTGTAATTCTTGTTTTAATTG

CCCTTCCCTCTCTTCGTATTCTGTATCTTATAGATGAGATTAATGACCCCCACCTTACTATTA

AAGCCATAGGCCACCAATGATACTGAAGCTATGAATATACTGACTACGAGGACTTAGGCTTT

GACTCGTATATAATTCCAACAAAAGACTTAACCCCTGGCCAGTTCCGACTTCTAGAGGCTGAT

TTCCGAATAGTGGTTCCAATAGAGTCACCAATTCGTGTACTAGTCTCTGCTGAGGATGTGCTT

CATTCTTGAGCTGTTCCATCTCTCGGGGTTAAAATAGACGGTGTCCCTGGCCGCCTAAATCAA

ACTGCCTTTATTGCCTCTCGCCCAGGAGTATTTTATGGACAATGTTCCGAAATTTGTGGAGCT

AATCATAGCTTTATGCCAATTGTTGTTGAAGCCGTTCCACTTGAGCACTTTGAATTTTGATC

TTCAGTTTTGCTAGAAATAGCAACTATGGAAGAAGTTACACTTATAATAGACGAGGACATAT

GCTAAAAACCCGTACTTATACTAAAACCGCCTCATCAGGAAGCTAAACTTGGGTTACAGCGTT

GGCCTTTTAAGCCAAAGATTGGTGCCTCCCAACCACCCCTGATGAAATGCCACAATTGAACCC

CGCCCCCTGATTTGCAATTTTATTATTCTCATGATTAATTTTCTTAATTATTATTCCTACAA

AAGTTCTAAACCATGTTTCCCCCCATGAACCAACTCCGTTTAGCACAGAAGAGCATAAAACTC

AACCCTGAGACTGACCATGGCAATAAGCTTCTTTGACCAATTTGCAAGCCCATCGTACCTAGG

AGTTCCACTAATTGCCATTGCTATTGCCTTACCCTGAGTAATGTACCCCACTCCCTCAACCCG

ATGAATTAATAACCGCCTAATTACTATTCAAGGCTGACTAATTAATCGCTTCACCAACCAAT

TGATACTACCACTAAATGTAGGTGGACACAAATGGGCCCTACTACTCACCTCCTTAATAATCT

- 76 -

TCTTGATTACAATTAATATACTAGGACTCCTACCATATACTTTTACTCCCACAACACAACTG

TCCTTAAATATGGGATTTGCAGTTCCACTATGACTAGCCACAGTTCTTATTGGAATACGTAA

CCAACCAACAGTTGCACTAGGCCACCTCTTACCAGAAGGGACCCCCATCCCACTAATTCCCATC

TTAATTATTATCGAAACAATTAGTCTATTTATTCGTCCATTAGCTTTAGGTGTTCGATTAAC

AGCCAACTTAACTGCCGGACATCTATTAATTCAGTTAATTGCTACCGCTGTGTTTGTACTACT

TCCTATGATACCTATAGTAGCAATCTTAACTGCCACCGTTTTATTCCTATTAACCCTGCTTGA

GGTGGCCGTAGCCATAATTCAGGCATATGTATTTGTTCTTCTATTAAGCTTATACCTTCAAG

AAAACGTCTAATGGCCCACCAAGCACATGCGTATCATATGGTTGATCCAAGCCCATGACCACT

AACTGGCGCAGTCGGAGCCCTATTAATAACATCCGGCCTAGCAATCTGATTCCACTTCCACTC

CACCACACTGTTAACCCTCGGGTTAATTCTGCTTCTCCTGACCATATATCAATGATGGCGAGA

CATTATTCGCGAAGGAACCTTTCAAGGTCACCATACTCCCCCAGTTCAAAAGGGTTTACGGTA

TGGTATAATTCTTTTCATCACATCAGAAGTATTCTTCTTCCTGGGGTTTTTCTGAGCCTTTT

ACCACTCAAGCCTAGCACCTACTCCTGAGCTAGGAGGATGCTGACCACCCACAGGAATTACACC

CCTAGACCCCTTTGAAGTTCCTCTGCTTAATACAGCTGTTCTATTGGCATCGGGGGTGACAGT

AACATGAGCACACCACAGTATCATAGAAGGCGAACGAAAACAGGCCATTCAATCCCTCGCACT

TACCATTATTCTAGGACTTTATTTTACAGCCCTACAAGCAATAGAATATTATGAGGCCCCCT

TTACTATTGCTGATGGTGTCTATGGCTCAACATTTTTTGTGGCCACAGGCTTCCACGGCCTTC

ACGTAATTATTGGATCCTCCTTCTTGGCCGTCTGTCTTCTCCGCCAAATCCAATACCACTTTA

CATCTGAACACCACTTTGGCTTTGAAGCTGCCGCCTGATACTGACACTTCGTCGACGTTGTCT

GACTATTTCTTTATGTATCAATTTACTGATGAGGCTCATATCTTTCTAGTATCTAAAGTTAG

TACGAGTGACTTCCAATCACCTAGTCTTGGTTAAACCCCAAGGAAAGATAATGAATCTAGTT

CTTACCATTATAGTTATTTCAATAACCCTATCATTGATTTTAGCAATTGTTTCTTTCTGGCT

ACCACAAATGAATCCGGACGCAGAAAAACTCTCACCCTATGAATGTGGGTTTGATCCCCTTGG

ATCTGCCCGATTACCATTCTCAATCCGATTTTTCTTAGTTGCCATTCTTTTTCTTCTCTTCGA

CCTAGAAATTGCACTTCTACTCCCCCTGCCCTGAGGAGACCAACTCCTCAACCCCGCTGGAACC

CTTCTCTGAGCCTCAGCCGTATTAATTCTCCTAACATTAGGCTTGGTTTATGAATGAATTCAA

GGGGGTCTAGAATGAGCAGAATAGGGTGTTAGTCCAAAGAAAGACCTCTGATTTCGGCTCAG

AAGACCGTGGTTCAACTCCATGACTCCCTTATGACACCCGTACACTTCAGCTTCAGCTCTGCCT

TTATTCTAGGATTAATAGGCCTAACATTCCACCGCACCCATCTCCTATCTGCCCTGCTATGTC

TAGAAGGAATGATATTATCATTGTTTATTGCACTAGCCCTCTGAACCCTACAATTTGAAATA

ACAGGATTTTCCGCAGCACCTATACTTCTACTGGCGTTCTCAGCCTGCGAAGCCAGCGCAGGT

TTAGCATTACTTGTTGCCACAGCTCGAACCCATGGAACTGACCGCCTACAAAACCTCAATCTC

CTACAATGCTAAAAGTATTAATTCCCACAATTATGTTATTTCCAACAATCTGGTTGTCATCA

GCAAAATGATTATGACCTCTAACAATTATACATAGTCTTCTAATTGCCCTAACCAGCATATT

ATGGCTATGTTGGACATCTGAAACAGGCTGATCCGCCTCTAATTATTATATAGCCACAGACCC

ACTATCCACCCCCCTTCTAGTTCTCACGTGCTGACTTCTCCCATTAATAATTTTAGCCAGTCA

AAACCACATTAACCCGGAGCCCATCAACCGCCAACGACTTTATATTACCCTCCTAGTATCACT

ACAAACTTTCCTAATTATAGCATTTGGTGCCACGGAAATTATTATATTTTATATTATATTTG

AAGCCACCCTCATCCCCACGTTAATTATTATTACTCGATGAGGAAATCAGACCGAACGCCTAA

ATGCAGGAACTTATTTTCTATTTTATACACTAGCAGGATCATTACCCCTCCTAGTAGCACTTC

TACTCCTCCAGCATTCCACCGGAACTCTCTCAATATTAATCCTGCAATACTCACAACCTCTAG

CCCTACACTCCTGAGGTCATATATTCTGATGGGCCGGATGTTTACTAGCATTTCTTGTTAAAA

TACCCCTCTATGGTGTTCACCTCTGACTACCTAAAGCACATGTTGAAGCCCCTGTGGCAGGAT

CCATAGTCCTTGCCGCAGTCCTCCTGAAACTAGGGGGATATGGTATAATGCGAATAATGGTTA

TACTAGACCCACTCTCTAAAGAACTAGCCTACCCCTTTATTATTTTAGCCCTATGGGGTATTA

TCATGACAGGCTCAATTTGCCTCCGACAAACAGACTTGAAATCCTTAATTGCCTACTCATCCG

- 77 -

TCAGTCACATAGGCTTGGTGGCTGGGGGTATTCTAATTCAAACTCCATGAGGATTTACAGGAG

CAATTATTTTAATAATTGCTCATGGACTAGTATCATCCGCACTATTCTGCTTAGCCAATACC

ACTTACGAGCGAACACACAGCCGAACTATAATTCTTGCTCGAGGGTTACAAATAATTTTCCCA

CTAACGGCCACCTGATGATTTATTGCTAATCTGGCTAATCTGGCACTTCCCCCCTTACCAAAC

CTTATAGGAGAATTAACCATCATTTCTTCCTTATTTAACTGATCCCCCTGAACCATCATTCTT

ACAGGAACTGGTACCCTAATTACAGCTGGTTACTCCCTATATCTTTTCCTTATATCACAACGA

GGTCCAACACCTCCACACATTACTGGTCTCCCACCATTTCATACCCGAGAACATCTATTATTG

GCCCTCCACCTTATTCCGGTCATCCTCTTAATTACAAAACCTGAACTCATGTGAGGCTGATGT

TTCTAGTAAGTATAGTTTAAACAAAATATTAGATTGTGATTCTAAAGACAGGGGCTAAAAT

CCCCTTACTCACCGAGGAAGGCCCGAGGCAATAAGTACTGCTAATCCTTATAGTCCACGGTTA

AACTCCGTGGTTTCCTCGCGCTTTTAAAGGATAACAGCTCATCCATTGGTCTTAGGAACCAAA

AACTCTTGGTGCAAATCCAAGTAAAAGCTATGCACCTAACTACTCTAATCCTCTCCTCCTCAC

TAATCCTAGTGATTGCTATTCTTATTTACCCGCTCCTAACTACTCTTAACCCTAATCCACAAG

ATCAAAAATGAGCAATCACGCATGTTAAAACCTCTGTAAAAGCTGCATTTTTAATAAGCCTG

CTTCCACTAATAATTTTCCTTGACCAGGGGACCGAAACTATTATTACAAATTGACACTGAAT

AAACACCACCCCCTTTGATATTAACATTAGCTTCAAATTTGACCACTACTCCATCATCTTTAC

ACCCATTGCCCTCTACGTAACTTGATCCATCCTTGAATTTGCGTCCTGATATATGCACTCTGA

CCCATTAATAAACCGATTCTTTAAATATTTACTTCTATTTCTTGTAGCCATAATTTTACTCG

TCTCAGCAAATAATATATTTCAACTTTTCATTGGTTGGGAAGGAGTAGGAATTATGTCCTTC

CTACTAATTGGCTGATGATACGGACGAGCAGATGCTAATACAGCAGCCCTACAGGCTGTCTTA

TATAATCGAGTAGGTGATATTGGCTTAATTATGGCCATAGCCTGACTTGCAATAAATCTCAA

CTCGTGAGAGATTCAACAAATTTTTTTCTTATCAAAAAACTTTGATATAACCTTGCCCCTCA

TTGGCCTAATCCTAGCCGCAACAGGAAAATCAGCCCAATTTGGGCTGCATCCTTGACTACCAT

CTGCCATGGAGGGCCCCACACCAGTTTCTGCCCTACTCCACTCCAGCACTATAGTAGTAGCTGG

GATCTTCCTTCTCATCCGCCTTCACCCCCTCATGGAAAATAACAATATTGCATTAACAACTTG

TCTCTGCTTAGGTGCCCTAACAACCCTATTTACAGCAGCCTGTGCTCTTACCCAAAATGACAT

CAAAAAAATTGTTGCATTTTCCACATCAAGTCAACTCGGGCTTATAATAGTCACTATTGGAC

TCAATCAACCACAACTGGCATTCCTTCACATCTGTACTCACGCCTTTTTTAAGGCCATATTAT

TTCTATGCTCAGGATCAATTATCCACAGCCTAAATGACGAACAAGATATTCGTAAAATAGGA

GGACTACAAAACCTAATACCAATAACCTCAACCTGCTTAACAATTGGTAGCCTAGCACTAACA

GGGACCCCCTTTTTAGCGGGCTTTTTTTCAAAAGACGCTATTATTGAAGCCCTTAATACCTCC

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TTCCGCGTGGTATATTTTGTTACAATAGGGACTCCCCGATTCCTGCCCCTATCACCCATTAAT

GAAAATAACCCCTCAGTTATTAACCCTATCAAACGACTTGCCTGAGGAAGTATTATTGCTGGG

TTAATTATTACATCAAATTTCCTACCCTCAAAAACGCCCATTATGAGTATGCCACTTACCCTA

AAACTGGCTGCCCTATTAGTTACAATTATTGGCCTACTTACAGCCTTAGAACTAACCGCTATA

ACAAACAAGCAATTTAAAATTACCCCCACAATCCCCCTTCACCACTTTTCAAACATACTCGGT

TATTTCCCCGCAATTATTCACCGATTGACCCCTAAACTTAACTTAAGTCTAGGCCAATCGATT

GCCACCCAACTAATTGATCAAACATGATTTGAAGCCACAGGCCCCAAAGGAGTATCCTCACTT

CAAGTAAAAATAGCTAAAACTGTAAGTGATGCACAACAAGGTATAATTAAAACATATCTTAC

AATTTTCCTTTTAACCACAACTATTGCTATTCTCCTAACTATAATTTAAACTGCTCGAAGAG

AGCCTCGGCTTAACCCTCGAGTTAGTTCAAGAACCACAAATAAAGTTAAAAGCAATACCCATG

CACAAATTACTAATATACCTCCCCCCAACGAATATATTATAGCTACACCACTAATATCTCCTC

GTAGCATACTAAATTCCTTAAAAGTATCAATAATTATTCAAGAACCCTCATACCACCCCCCAC

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CGATCCCCTCAAGACTCCGGAAACGGTTCAGCGGCCAGAGCTGCTGAATAAGCAAACACCACA

- 78 -

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TAGTACACCACACCCAACCCCAGCCGCCACCACTAATCCTAAAGCAGCAAAATAGGGTGCCGGA

TTAGAAGCCACAGCAACCAACCCAACAATTAATGCAATTAATAGTAAAGACACTAGATAAGT

CATAATTTTTACTCGGATTTTAACCGAGACCAGTGACTTGAAGAACCACCGTTGTTATTCAA

CTATAAAAACCCCTTAATGGCAAGCCTACGAAAAACACACCCCTTAATTAAAATTGCTAATG

ATGCACTAGTTGACCTCCCAGCCCCCTCTAATATTTCAGTATGATGAAATTTTGGCTCACTAT

TGGGATTATGCTTAATTACTCAAATCTTAACGGGACTATTCCTAGCCATACATTATACATCT

GATATCACCACTGCTTTCTCATCCGTAGCCCACATCTGCCGTGACGTAAACTACGGATGACTT

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CGAGGACTATATTATGGATCTTATCTTTATAAAGAAACTTGAAACATTGGGGTGGTCCTTCT

CCTGCTTGTTATAATAACAGCATTCGTCGGCTACGTCCTACCATGAGGACAAATATCCTTCTG

GGGGGCCACAGTCATTACCAATCTTTTATCTGCGGTGCCCTATGTAGGAAACACTTTAGTTCA

ATGAATTTGAGGCGGGTTCTCAGTAGATAATGCAACATTAACACGATTCTTCGCCTTCCACTT

CCTTTTTCCTTTTATTATCGCCGCGGCCACTATTTTACATCTACTCTTCCTCCACGAAACAGG

CTCAAATAACCCCATGGGGTTGAATTCAGACGCAGATAAAGTATCGTTTCACCCCTATTTTTC

ATACAAGGATCTACTAGGCTTCGCAGCGGTCCTCCTAGCCTTAACCTCACTTTCACTATTTTC

TCCTAATCTTCTAGGAGACCCCGACAACTTTACTCCCGCAAACCCTCTAGTTACACCCCCTCAT

ATTAAACCAGAATGATACTTTTTATTTGCTTATGCTATCCTTCGATCAATCCCTAATAAATT

GGGGGGTGTTCTAGCCCTACTGTTCTCAATCCTAATTTTAATAGTAGTACCAATTCTCCACAC

ATCAAAACAACGAGGCCTAGCATTCCGACCAATCACCCAACTCCTCTTTTGAACCCTAGTCGC

CGACATACTTATTCTTACATGAATTGGAGGGATGCCAGTAGAACATCCATTTATTATCATTG

GACAACTTGCATCTGTCCTATACTTTACATTGTTTCTAGTACTATTTCCACTGGCAGGGTGAC

TAGAAAACAAGGCATTAGAGTGAGCTTGCCCTAGTAGCTTAGTCTTAAAGCATCGGTCTTGT

AATCCGAAGATCGGAGGTTAAAGTCCTCCCTAGCGCCAGAAAAAGGAGATTTTAACTCCCACC

ACTGGCTCCCAAAGCCAGTATTCTAAATTTAACTATTTTCTGCTTATGGTATAGTACATATT

ATGCATAATAATACATTAATGGATTAGTACATTAATGTATTATCACCTATTAAATAAATAG

ACCATAAAGCATGTAATAATAACTAAGGTATACATAAACCATATTAATATTATACCCCATAT

TATCCAACTACAACTAAGTGATTTACTCCCCTACTAAATTTGACCTCCAAATTTTCCTTGAA

TAACTCAACTTACATTTGTACGTCAAATATTAATGTAGTAAGAAACCACCAACCAGTATATA

TAAAGGCATATCATTCATGATAGGGTCAGGGACAATAATTGTGGGGGTAACACTTAGTGAAC

TATTACTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGGACATAACTGCGTAACCCCACATACGGATAATTA

TATCTGGCATCTGATTAATGGTGTAGTACATACGACTCGTTACCCACCATGCCGGGCATTCTC

TTATATGCATAACGTTCTCTTTTTTGGTCTACCTTTCCTATACATCTCAGAGTGCAGGCACAA

CTGGTAAATTAAGGTGGAACATTTTTCTTGCATGCAGTTTATGTGATTGAATGTTGGAAAGA

CATAATCTTAAGCATTGCATAATTAGAATTCAAGTGCATAACATACCTTTATTCAACACAGC

TTTATACTATATGCCCCCTTTTTGGTTTTTGCGCGGCAAACCCCCCTACCCCCTACGTTAGGCG

ATTCCTGTTTATCCTTGTCAAACCCCGAAACCAAGGAAGACTCGACTAAGCGCATCAAAATCA

ACAAATTGCAGTAGGTGTTGACTTATGCCACCACATTATATATATATATATCACACAAAATT

TTATATATAACAATTTTTACAAGCCTAAAAGTTAGGACTAAATTTTAGAAAAATAACTTCA

ACCCTGACATATCAGATAATAAAATAGGCT

> Misgurnus anguillicaudatus mitochondrial DNA, complete sequence

GCTCACGTAGCTTAAAATAAAGCATAGCACTGAAGATGCTAAGATGGGCCCTAGAAAGCCCCG

TCTGCACAAAGGCTTGGTCCTGACTTTACCATCAGCTTTAGCCCAATTTACACATGCAAGTCT

CCGCGAACCCGTGAGAATGCCCTCAATCCCCCACCCGGGGACGAGGAGCAGGCATCAGGCACAA

ATTTTAGCCCAAGACGCCTTGCCACGCCACACCCCCAAGGGAATTCAGCAGTGATAAATATTA

- 79 -

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CGCGGTTATACGAGAGGCCCCAGTTGATGGGCACGGCGTAAAGGGTGGTTAAGGTTTAGTAAA

AATAAAGCCAAAAGACCTCTTGGCTGTCATACGCCCCTGAGTCTCCGAAGCCCACATACGAAG

GTAGCTTTAATACTGTATTCACCTGACCCCACGAAAGCTGAGAAACAAACTGGGATTAGATA

CCCCACTATGCTCAGCCATAAACTTAGGCGTTATTTTACAATTAACGCCCGCCAGGGTACTAC

GAGCATTAGCTTAAAACCCAAAGGACTTGGCGGTGCCTTAGACCCCCCTAGAGGAGCCTGTTC

TAGAACCGATAACCCCCGTTAAACCTCACCACTTCTGGCCATCCCCGCCTATATACCGCCGTCG

TCAGCTTACCCTGTGAAGGATAAATAGTAAGCAAAGTGAATATAATCCAAAACGTCAGGTCG

AGGTGTAGCGAACGAAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTTTAATAAGAATATTACGGAC

AACACTATGAAAACTTAGTGCTTAAAGGAGGATTTAGTAGTAAAAAGGAAATAGAGTGTCCT

TTTGAACCTGGCTCTGAGGCGCGTACACACCGCCCGTCACTCTCCCCGCCAATAGCAACAAGTG

TTAATAACATATAAGCACAAATAAGGGGAGGCAAGTCGTAACATGGTAAGTGTACCGGAAGG

TGCACTTGGATCAAACCAGGGCGTGGCTGAGATAGTTAAGCATCTCCCTTACACCGAGAAGAC

ATCCATGCAAATTGGATCGCCCTGAGCTAAATAGCTAGCTTAAACATCACATTAAATTGACA

ATATAAATAAAGTAGTAAAACCTAAAATTATTAATTAAACCATTTTTCCACCTTAGTACGGG

AGACGAAAAAGGTTCTGTAAGCAATAGAAAAAGTACCGCAAGGGAATGCTGAAAGAGCAATG

AAACAAGTCATTTAAGCATAAAGAAGCAGAGACTAAAACTCGTACCTTTTGCATCATGATTT

AGCAAGCATACAACAGGCAGAGAGACCTTTAGTCTGTTACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCC

GGGACAGCCTTATAAGGGCCAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGCGTGGGAAGAGCCCCGGGTAGA

GGTGACAGACCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCTTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCC

TCGTGCCCCTTTAATTAAATAAGTAATATCTGATTTAAAAATATAAGAGAAACATGAGAGT

TAGCTGAAGGGGGTACAGCCCCTTCAATTAAGGATACAACTTTACCAGGAGGATAGGGATTA

TAATTATAAAGATTTATTGCTTCAGTGGGCCTAAAAGCAGCCACCTGCACAGAAAGCGTTAA

AGCTCAAGCACTACAAAATTTATTATCCCAATAAAATATCCCACTCCCCTAAATATATTAAG

CCGTTCCATGATATCATGGAAAAGATTATGCTAAAATGAGTAACAAGAGATAATATTTCTCT

CCAAGCATAAGTGTAAGCCAGCCCGGATAAGCCGCTGGCAATTAACGAACCCAATAAAAGAGG

GCAGTGTAACTAATAAAAAACACAAGAAAATTATACAACCCCTAATCGTTAACCCCACACTG

GAATGCCCAAAGGAAAGACTAAAAGGAAGGGAAGGAACTCGGCAAACACAAGCCTCGCCTGTT

TACCAAAAACATCGCCTCCTGCAAAACTCAAAGTATAGGAGGTCCAGCCTGCCCAGTGACCAC

AAGTTCAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCAAAGGTAGCGCAATCACTTGTCTTTTAAATGA

AGACCTGTATGAATGGCTAAACGAGGGCTTAGCTGTCTCCCCTTCCAAGTCAGTGAAATTGAT

CTGCCCGTGCAGAAGCGGACATAAAAATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGGTTCA

AGCCCAACCGCATCAAACAACTTTCTTAATAAGAACTAAACCTTAGCGGATAATGGAGCTTT

ACCTTCGGTTGGGGCGACCACGGAGAAAAATATATCCTCCAAGTGGATTGGGTAATAAACCTA

AAACTAAGAAAGACATTTCTAAGTCACAGAAAATCTGACCAACAATGATCCGGCCTATAGGC

CGATCAACGGACCAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTCTCCCAGAGTCCATATCGAC

GAGGGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGT

TCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGCAATCCAGGTCAGT

TTCTATCTGTAAATGTCACTTTTCCTAGTACGAAAGGACCGGAAAAGAAAGGCCCATGCTAA

AAGTATGCCTTACCCTTAATTAATGAAGACAACTAAATTAAACAAATGGAGGACCTTCAATC

CAGGCAAAGATAAAGCCATACTAAGATGGCAGAGCATGGTAATTGCAAAAGGCCTAAGCCCT

TTCAGCCAGAGGTTCAAATCCTCTTCTTAGTTTATGCTAAACACTCTCTTAATCCACTTAATT

AACCCTCTCGCGTACATCGTTCCTGTTCTCCTAGCGGTAGCATTCCTCACACTAATTGAACGA

AAAGTCCTAGGTTATATACAACTACGTAAAGGCCCAAATATTGTTGGGCCCTATGGCCTCCTT

CAACCAATTGCAGATGGGGTAAAATTATTTATTAAAGAGCCCATCCGCCCATCTTCATCATCC

CCCTTTCTATTTCTAGCCACCCCCATACTTGCACTTACATTAGCCATAACACTATGAGCCCCA

- 80 -

ATTCCCATACCTCACCCCGTCATAGACCTCAACCTGGGTATCTTATTTATTCTAGCCCTCTCT

AGCCTTGCCGTATACTCAATTCTTGGGTCAGGCTGAGCCTCAAACTCAAAATATGCATTAATT

GGTGCCCTACGGGCTGTAGCCCAAACAATCTCCTATGAAGTAAGCCTGGGATTAATCCTTCTC

TCAGTGGTGATTTTCTCAGGTGGTTATACACTACAAACATTTAACATCACACAAGAAGGCAT

CTGACTCCTTATTCCATCCTGACCACTAGCAGCAATATGATATATCTCAACTTTAGCAGAGAC

TAACCGAGCCCCTTTTGACCTAACTGAAGGTGAATCCGAATTAGTATCAGGATTTAATGTAG

AGTATGCAGGAGGACCTTTCGCCCTATTCTTCCTAGCTGAATATGCTAACATTTTGTTAATA

AATACTCTGTCGGCCGTCCTCTTTCTTGGCGCCTCACATATTCCAACCTTTCCCGAATTAACA

ACAATTAATTTAATAACCAAAGCCGCACTTCTTTCAATAGTATTTTTATGAGTTCGAGCCTC

ATATCCACGATTCCGCTATGACCAGTTAATACACCTGGTATGAAAAAACTTCTTACCCCTGAC

CTTGGCCTTAGTCCTATGACACACTGCCCTCCCAATTGCATTTGCAGGCCTCCCTCCACAACTC

TAACAAACAGGAACCGTGCCTGAATGCCCAAGGACCACTTTGATAGAGTGGCTTATGGGGGTT

AAAGCCCCCCCAGTTCCTAGAAAGAAGGGAATCGAACCCATACTCAGGAGATCAAAACTCCTG

GTGCTTCCTCTACACCACTTTCTACGATAAGGTCAGCTAATTAAGCTTTCGGGCCCATACCCC

GAATATGATGGTTAAAATCCCTCCCCTATCAATGAACCCTTATGTACTAGTTATCTTATTGT

CCAGCCTAGGACTAGGAACCACATTAACCTTCGCAAGCTCCCACTGACTGCTAGCCTGGATAG

GATTAGAAATTAATACCCTAGCAATTATTCCCCTCATAGCACAGCAGCATCACCCACGAGCAG

TTGAAGCTACTATCAAATATTTTCTTACACAAGCAACAGCCGCAGCCATAATTTTATTTGCA

GCCACAACAAATGCATGAATAATAGGAGAATGAGACATTAACAATTTATCCCACCCATTAGC

CTCGACCTTAGTAATCATAGCACTAGCACTAAAAATTGGCTTAGCCCCTCTACACTTCTGATT

ACCGGAAGTCCTTCAAGGCCTAAGCCTAACAACAGGTCTAATCCTATCAACGTGACAAAAACT

AGCACCATTCGCATTAATTATTCAAGTAGCCCCCACAATTGACCCCTACCTCCTCTCTTCATT

AGGTCTTTTATCCACCCTTATTGGGGGATGAGGCGGCCTAAACCAAGTTCAATTACGAAAAAT

CCTAGCTTATTCCTCCATTGCACATATGGGCTGAATAATTATTGTTCTACAATTTGCCCCCCA

ACTAACCCTCCTAGCGCTAGGGACATATATTTTTATAACTACTACAGCATTCCTCTCATTTAA

AATATCATCAGCCACTAAAATTAATACACTTTCTTTAGCATGAGCAAAAACACCAACTCTTA

TAGCTACGACAGCCTTAGCCCTTCTCTCCCTAGGAGGACTCCCCCCACTAACTGGGTTTATACC

CAAATGATTAATTTTACAAGAACTGGCAAAGCAAGAACTACCCCTCACAGCAACAGTCATAG

CCCTAATAGCCCTATTAAGCTTATATTTTTACCTACGCCTGTGTTATGCAATAGCCTTAACAA

TTTCACCCGCCACAATTAATTCCATAATACCCTGACGAAGCTCCAACACTCAATCAACTCTTA

TTTTAGCCCTATCCACTACAATTACCCTAGGCCTTCTTCCAATCACCCCTGCCATCATAGCAT

TAATTACCTAGGGGCTTAGGATAACTTAGACCAAGAGCCTTCAAAGCTCTAAGCAGGAGTTA

AAATCTCCTAGCCCCTGATAAGACTTGCGGGACTCTATCCCACATCTTCTGAATGCAAATCAG

ACACTTTAATTAAGCTAAAGCCTTTCTAGATGAGAAGGCCTCGATCCTACAAACTCTTAGTT

AACAGCTAAGCGCCCAAACCAGCGAGCATTCATCTACTTTCCCGCCGTCGGGCGAGCAAGGCGG

GAAAGCCCCGGCAGACGTTAGTCTGCGTCTTTGGATTTGCAATCCAATGTGTTCTCCACCACG

GGGCTTGATAGGAAGAGGACTTAAACCTCTATCTACGGGGCTACAACCCGCCACCTAACTTCG

GCCATCCTACCTGTGGCAATCACGCGCTGACTTTTCTCTACTAATCACAAAGATATTGGCACC

CTTTACCTTGTATTCGGTGCCTGGGCCGGAATGGTTGGAACTGCTCTCAGCCTCCTCATTCGT

GCTGAACTTAGTCAACCCGGGTCCCTCCTCGGAAATGATCAAATTTATAATGTCATTGTTACT

GCACATGCCTTTGTCATGATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTCTTATTGGTGGATTTGGTAA

TTGACTTGTTCCTTTAATGATTGGAGCACCAGACATGGCATTTCCACGTATAAATAACATAA

GCTTCTGACTCTTACCACCCTCATTCCTCCTCTTGCTAGCATCTTCTGGCGTTGAAGCTGGGGC

CGGAACAGGTTGAACCGTCTACCCACCTCTAGCTGGCAACCTCGCCCATGCGGGTGCATCTGTA

GACCTTACCATCTTCTCCTTACATTTAGCAGGGGTTTCATCTATTCTAGGAGCAATTAATTTT

ATTACTACAACAATTAACATAAAACCTCCAGCCATCTCGCAATACCAAACCCCCTTGTTTGTT

- 81 -

TGAGCAGTTCTTGTAACTGCCGTTCTTCTTTTACTATCCCTGCCTGTCCTAGCTGCTGGAATT

ACAATACTCTTAACAGACCGGAATCTAAACACCACCTTTTTTGACCCGGCAGGCGGAGGAGAC

CCTATTTTATACCAACACTTGTTCTGATTCTTTGGCCACCCAGAAGTTTACATTTTAATTTT

ACCGGGGTTTGGCATTATCTCACATGTTGTAGCTTACTACGCGGGCAAAAAAGAACCCTTTGG

GTATATGGGGATAGTTTGAGCTATAATAGCCATCGGCCTCCTGGGCTTCATTGTATGAGCTCA

CCACATGTTCACAGTCGGAATAGATGTTGATACTCGTGCATACTTTACATCTGCTACAATAA

TTATCGCCATCCCAACAGGTGTAAAAGTCTTTAGCTGATTAGCCACACTTCATGGGGGCTCAA

TCAAATGAGAAACCCCCATGCTGTGAGCCCTTGGATTTATCTTCCTATTTACAGTGGGAGGAT

TAACTGGAATTGTCCTAGCTAACTCATCCATCGATATTATGCTCCACGACACATATTATGTAG

TTGCTCATTTCCACTACGTACTCTCAATAGGAGCAGTCTTTGCCATTATGGCTGGCTTTGTCC

ACTGATTCCCATTATTCACGGGGTATACTCTGCACAGCACTTGAACTAAAATTCACTTTGCAG

TCATGTTCTTAGGTGTTAACCTCACCTTTTTCCCACAGCATTTCCTCGGCCTTGCAGGAATGC

CCCGACGATACTCAGATTATCCAGACGCCTATACCCTATGAAATACAATTTCATCAATTGGGT

CAATAATTTCTCTAGTGGCTGTAATTATGTTCCTATTCATTTTATGAGAAGCCTTTGCCTCT

AAACGGGAAGTTCTATCTGTAGAACTTACTGCAACAAATGCTGAATGACTCCACGGATGCCCT

CCACCTTACCACACATTTGAGGAACCAGCATTCGTCCAAGTCCAATCAAATTAATCGAGGAAA

GGAGGAATTGAACCCCCATGTGCTGGTTTCAAGCCAGCCGCATAACCACTCTGCCATTTCCTT

CTAAGACATTAGTAAATTTGTAATTACATCACTTTGTCAAGGTGAAATTGTGGGTTAAACTC

CCGCATGTCTTAAGCTCAAAGCTTAATGGCACATCCCTCACAACTAGGATTCCAAGACGCGGC

ATCACCCGTTATAGAAGAACTTCTTCACTTTCATGACCATGCGCTAATAATTGTATTTTTAA

TTAGCACCCTTGTACTTTACATTATCGTCGCCATAGTCTCCACAAAATTAACTAATAAGTAC

ATTTTAGACTCTCAGGAAATTGAGATTGTGTGAACTGTTCTACCGGCTGTAATTCTTGTTTT

AATTGCCCTTCCCTCTCTTCGTATTCTGTATCTTATAGATGAGATTAATGACCCCCACCTTAC

TATTAAAGCCATAGGCCACCAATGATACTGAAGCTATGAATATACTGACTACGAGGACTTAG

GCTTTGACTCATATATGATTCCAACAAAAGACTTAACCCCCGGCCAGTTCCGACTTCTAGAGG

CTGATTTCCGAATAGTAGTTCCAATAGAGTCACCAATTCGTGTACTAGTCTCTGCTGAGGATG

TGCTTCATTCTTGAGCTGTTCCGTCTCTTGGGGTTAAAATAGACGGTGTCCCCGGCCGCCTAA

ATCAAACTGCCTTTATTGCCTCTCGCCCAGGAGTATTTTATGGACAATGTTCCGAAATTTGTG

GAGCTAATCATAGCTTTATGCCAATTGTTGTTGAAGCCGTTCCACTTGAGCACTTTGAATTT

TGATCTTCAGTTTTGCTAGAAATAGCAACTATGGAAGAAGTTACACTTATAATAGACGAGGA

CATATGCTAAAACCCCGTACTTATACTAAAACCGCCTCATCAGGAAGCTAAACTTGGGTTACA

GCGTTGGCCTTTTAAGCCAAAGATTGGTGCCTCCCAACCACCCCTGATGAAATGCCACAATTG

AACCCCGCCCCCTGATTTGCAATTTTATTATTCTCATGATTAATTTTCTTAATTATTATTCC

TACAAAAGTTCTAAACCATATTTCCCCCCATGAACCAACTCCGTTTAGCACAGAAGAGCATAA

AACTCAACCCTGAGACTGACCATGGCAATAAGCTTCTTTGACCAATTTGCAAGCCCATCGTAC

CTAGGAATTCCACTAATTGCCATTGCTATTGCCTTACCCTGAGTAATGTACCCCACCCCCTCA

ACCCGATGAATTAATAACCGCCTAATTACTATTCAAGGCTGACTAATTAATCGCTTCACCAAC

CAATTAATACTACCACTAAATGTAGGTGGACACAAATGGGCCCTACTACTTACCTCCTTAATA

ATCTTCTTGATTACAATTAATATACTAGGACTCCTACCATATACTTTTACTCCCACAACACA

ACTGTCCTTAAATATGGGATTTGCAGTTCCACTATGACTAGCCACAGTTCTTATTGGAATAC

GTAACCAGCCAACAGTTGCACTAGGCCACCTCTTACCAGAAGGGACCCCCATCCCACTAATCCC

CATCTTAATTATTATCGAAACAATTAGTCTATTTATTCGTCCATTAGCTTTAGGTGTTCGAT

TAACAGCCAACTTAACTGCCGGACATCTATTAATTCAGTTAATTGCTACCGCTGTGTTTGTTC

TACTTCCTATGATACCCATAGTAGCAATCTTAACTGCTACCGTTTTATTCCTATTAACCTTGC

TTGAGGTGGCCGTAGCCATAATTCAGGCATATGTATTTGTTCTTCTATTAAGCTTATACCTT

CAAGAAAACGTCTAATGGCCCACCAAGCACATGCGTATCATATGGTTGATCCAAGCCCATGAC

- 82 -

CACTAACTGGCGCAGTCGGAGCCCTATTAATAACATCCGGCCTAGCAATCTGATTCCACTTCC

ACTCCACCACACTGTTAACCCTCGGGTTAATTCTGCTTCTCCTGACCATATATCAATGATGAC

GAGACATTATTCGCGAAGGAACCTTTCAAGGTCACCATACTCCCCCAGTTCAAAAGGGTTTAC

GGTATGGTATAATTCTTTTCATCACATCAGAAGTATTCTTCTTCCTGGGGTTTTTCTGAGCCT

TTTACCACTCAAGTCTAGCACCTACTCCTGAGCTAGGAGGATGCTGACCACCCACAGGAATTA

CACCCCTAGACCCCTTTGAAGTTCCTCTACTTAATACAGCTGTTCTATTGGCATCGGGGGTGA

CAGTAACATGAGCACACCACAGTATCATAGAAGGCGAACGAAAACAAGCCATTCAATCCCTCG

CACTTACCATTATTCTAGGACTTTATTTTACAGCCCTACAAGCAATAGAATACTATGAGGCCC

CCTTTACTATTGCTGATGGTGTCTATGGCTCAACATTTTTTGTGGCCACAGGCTTCCACGGCC

TTCACGTAATTATTGGATCCTCCTTCTTGGCCGTCTGTCTTCTCCGCCAAATCCAATACCACT

TTACATCTGAACACCACTTTGGCTTTGAAGCTGCCGCCTGATACTGACACTTCGTCGACGTAG

TCTGACTATTTCTTTATGTATCAATTTACTGATGAGGCTCATATCTTTCTAGTATCTAAAGT

TAGTACGAGTGACTTCCAATCACCTAGTCTTGGTTAAACCCCAAGGAAAGATAATGAATCTA

GTTCTCACCATTATAGTCATTTCAATAACCTTATCATTGATTTTAGCAATTATTTCTTTCTG

ATTGCCACAAATGAATCCGGACGCAGAAAAACTCTCACCCTATGAATGTGGGTTTGATCCCCT

TGGATCTGCCCGATTACCATTCTCAATCCGATTTTTCTTAGTTGCCATTCTTTTTCTTCTCTT

CGACTTAGAAATTGCACTTCTACTCCCCCTGCCCTGAGGAGACCAACTCCTCAACCCCGCTGGA

ACCCTTCTCTGAGCCTCAGCCGTATTAATTCTCCTAACATTAGGCTTGGTTTATGAATGAGTT

CAAGGGGGTCTAGAATGAGCAGAATAGGGTGTTAGTCCAAAGAAAGACCTCTGATTTCGGCTC

AGAAGACCGTGGTTCAACTCCATGACTCCCTTATGACACCCGTACACTTCAGCTTCAGCTCTG

CCTTTATTCTAGGATTAATAGGCCTAACATTCCACCGCACCCATCTCCTATCTGCCCTGCTAT

GTCTAGAAGGAATGATATTATCACTGTTTATTGCACTAGCCCTCTGAACCCTACAATTTGAA

ATAACAGGATTTTCCGCAGCACCTATACTTCTACTGGCGTTCTCAGCCTGCGAAGCCAGCGCA

GGCTTAGCATTACTTGTTGCCACAGCTCGAACCCATGGGACTGACCGCCTACAAAACCTCAAT

CTCCTACAATGCTAAAAGTATTAATTCCCACAATTATGTTATTTCCAACAATCTGGTTGTCA

TCAGCAAAATGATTATGACCACTAACAACTATACATAGCCTTCTAATTGCCCTAACCAGCAT

ATTATGGCTATGTTGAACATCTGAAACAGGCTGATCCACCTCTAATTATTATATAGCCACAG

ACCCACTATCCACCCCCCTTTTAGTTCTCACATGCTGGCTTCTCCCATTAATAATTTTAGCTA

GTCAAAACCATATTAACCCAGAGCCCATCAACCGCCAACGACTTTATATTACCCTCCTAGTAT

CACTACAAACCTTCCTAATCATAGCATTTGGCGCCACAGAAATTATTATATTTTATGTTATA

TTTGAAGCCACCCTCATCCCCACGTTAATTATTATCACTCGATGAGGAAATCAAACCGAACGC

CTAAATGCAGGAACTTATTTTCTATTTTATACACTAGCAGGATCATTACCCCTCCTAGTAGC

ACTTCTACTCCTCCAGCATTCCACCGGAACTCTCTCAATATTAATCCTGCAATACTCACAACC

TCTAGCCCTACACTCCTGAGGTCATATATTCTGATGGGCCGGATGTTTACTAGCATTTCTTGT

TAAAATACCCCTCTATGGTGTTCACCTCTGACTACCTAAAGCACATGTTGAAGCCCCTGTGGC

AGGATCCATAGTCCTTGCCGCAGTCCTCTTGAAACTAGGGGGATATGGTATAATGCGAATAAT

GGTTATACTAGACCCACTCTCTAAAGAACTAGCCTACCCCCTTATTATTTTAGCCCTATGGGG

TATTATCATGACAGGCTCAATTTGCCTCCGACAAACAGACTTGAAATCCTTAATTGCCTACTC

ATCCGTCAGTCACATAGGCTTGGTAGCTGGGGGTATTTTAATTCAAACTCCATGAGGATTTAC

AGGAGCAATTATTTTAATAATTGCCCATGGACTAGTATCATCCGCACTATTCTGCCTAGCCAA

TACCACTTACGAGCGAACACATAGCCGAACTATAATTCTTGCTCGAGGGTTACAAATAATTT

TTCCACTAACGGCCACCTGATGATTTATTGCTAATCTGGCTAATCTGGCACTTCCCCCCCTACC

AAACCTTATAGGAGAATTAACCATCATTTCTTCCTTATTTAACTGATCCCCCTGAACCATCAT

TCTTACAGGAACTGGCACCCTGATTACAGCTGGTTACTCCCTATATCTCTTCCTTATATCACA

ACGAGGTCCAACACCTCCACACATTACTGGTCTCCCACCATTTCATACCCGAGAACATCTATT

ATTGGCCCTCCACCTTATTCCGGTCATCCTCTTAATTACAAAACCTGAACTCATGTGAGGCTG

- 83 -

ATGTTTCTAGTAAGTATAGTTTAAACAAAATATTAGATTGTGATTCTAAAGACAGGGGCTA

AAATCCCCTTACTCACCGAGGAAAGCCCGAGGCAATAAGTACTGCTAATCCTTATAGTCCACG

GTTAAACTCCGTGGTTTCCTCGCGCTTTTAAAGGATAACAGCTCATCCATTGGTCTTAGGAAC

CAAAAACTCTTGGTGCAAATCCAAGTAAAAGCTATGCACCTAACTACTCTAATCCTCTCCTCC

TCACTAATCCTAGTGATTGCTATTCTTATTTATCCGCTCCTAACTACTCTTAACCCTAACTCA

CAAGATCAAAAATGAGCAATCACGCATGTTAAAACCTCTGTAAAAGCTGCATTTTTAATAAG

CCTGCTTCCACTAATAATTTTCCTTGACCAGGGGACCGAAACTATTATTACAAATTGACACTG

AATAAACACCGCCCCCTTTGATATTAATATTAGCTTCAAATTTGACCACTACTCCATCATCTT

TACACCCATTGCCCTCTACGTAACTTGATCCATCCTTGAATTTGCATCCTGATATATGCACTC

TGACCCATTAATAAACCGATTCTTTAAATATTTACTTCTATTTCTTGTAGCCATAATTTTAC

TCGTCTCAGCAAATAATATATTTCAACTTTTTATTGGTTGAGAAGGAGTAGGAATTATGTCC

TTCCTACTAATTGGCTGATGGTACGGACGAGCAGATGCTAATACAGCAGCCCTACAGGCCGTC

TTATATAATCGAGTAGGTGATATTGGCTTAATTATGGCCATAGCCTGACTTGCAATAAATCT

CAACTCGTGAGAAATTCAACAAATTTTTCTCTTATCAAAAAACTTTGATATAACCTTACCCC

TCATTGGCCTAATCCTAGCCGCAACAGGAAAATCAGCCCAATTTGGGCTGCATCCTTGACTAC

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- 84 -

> Cobitis lutheri mitochondrial DNA, complete sequence

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- 85 -

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ACAGACCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTGAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCATA

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CAGCCAGAGGTTCAAATCCTCTTCTTAGTTCATGTTAAACACTCTACTAACGCATTTAATTA

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- 86 -

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AATCTCCTAGCCCCTGATAAGACTTGCGGGATTCTATACCACATCTTCTGAATGCAAATCAGA

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GGCTTGATAGGAAGAGGACTTAAACCTCTATATATGGGGCTACAACCCACCACCTGACTTCGG

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- 87 -

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GCTAGAGAAACGCACTTAAACTAAAAGACGCCTCACCAGGAAGCTAAATTTGGGCTACAGCGT

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CTCTACAACACTAATAACCCTCGGGTTAATTTTACTTCTTCTAACTATGTATCAATGATGAC

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- 88 -

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CTTTACATCTGAACACCACTTCGGCTTTGAAGCTGCTGCATGATACTGACACTTCGTTGACGT

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GTTAGTACGAGTGACTTCCAATCACCTAGTCTTGGTTAAACCCCAAGGAAAGATAATGAATT

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TGACTTCCACAAATGAACCCAGATGCAGAAAAACTCTCACCCTATGAATGTGGATTTGATCCC

CTTGGATCTGCCCGACTACCATTTTCAATCCGATTCTTTTTAGTTGCCATTCTCTTCCTTCTC

TTTGACCTAGAAATTGCACTCCTACTCCCTCTACCCTGAGGAGACCAACTCTTTAACCCCGCCG

GAACTCTTCTCTGAGCCTCAGCCATTTTAATTCTCCTAACACTAGGCTTAGTATATGAATGAA

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TCAGAAGACCGTGGTTCAACTCCATGACTCCCTTATGACACCCGTACACTTCAGCTTTAGCTC

CGCCTTTATTCTAGGACTAATAGGCCTAACATTTCACCGCACCCACCTCCTATCTGCACTACT

ATGCCTAGAGGGTATAATATTATCACTATTTATTGCACTGGCCCTCTGGGCCTTGCAGTTTGA

AATAACAGGATTCTCCGCAGCACCTATACTCCTACTAGCATTTTCGGCCTGCGAAGCCAGCGC

AGGTTTGGCACTACTTGTTGCCACAGCTCGAACACATGGAACTGACCGCCTACAAAACCTTAA

TCTCCTACAATGCTAAAAGTACTAATCCCTACAATTATGCTGTTTCCAACAATCTGGTTATC

ATCACCAAAATGATTATGGCCATTAACAACTGCCTATAGCCTCCTAATTGCACTAACCAGTAT

ATTATGACTGTGCTGAGTATCTGAGACAGGCTGGTCCACCTCTAATCTTTATTTAGCCACAGA

CCCGCTATCCACACCACTATTAGTTCTCACATGCTGGCTTCTCCCACTAATAATTCTAGCCAGC

CAAAATCATATTAATCCAGAACCCATTAACCGCCAACGACTCTATATTACCCTCCTAGTATCC

TTACAAGCCTTCCTGATTATAGCATTTGGTGCCACAGAAATTATTATATTTTATGTTATATT

TGAAGCCACCCTCATCCCCACCTTAATTATTATTACCCGATGGGGTAATCAGACCGAACGCCT

AAATGCAGGAACTTACTTTCTTTTTTATACTCTAGCAGGATCATTACCACTTTTAGTGGCAC

TTCTGCTTCTTCAGCACTCCACCGGAACTCTTTCAATATTTATTTTGCAATACTCGCAACCCT

TGACCCTTCACTCTTGAGGTCATATATTTTGATGGGCCGGATGCTTAATCGCATTTCTTGTTA

AAATACCTCTATACGGCGTTCACCTCTGACTACCTAAAGCGCATGTCGAAGCCCCTGTAGCAG

GATCCATGGTCCTTGCCGCAGTCCTCTTAAAACTCGGGGGGTATGGTATAATACGAATAATAG

TTATGTTAGACCCTCTTTCTAAAGAACTCGCCTACCCTTTTATTATTTTAGCCTTGTGGGGCA

TTATTATAACAGGCTCAATCTGCCTCCGGCAAACAGACCTAAAATCCCTAATTGCTTACTCAT

CCGTTAGTCACATAGGCCTAGTAGCCGGGGGAATTTTAATTCAAACCCCATGAGGTTTTACAG

GTGCAACTATTTTGATAATTGCTCATGGGCTAGTATCATCCGCATTATTCTGCCTAGCCAACA

CCGCCTATGAACGAACCCATAGCCGAACTATAATTCTTGCTCGAGGACTACAAATAATCTTCC

CATTAACAGCTGCCTGATGATTCATTGCTAACCTGGCCAACCTAGCACTCCCACCTTTACCTA

ACCTCATAGGAGAATTAACTATTATCTCCACTTTATTTAATTGATCTCCTTGAACCATCCTT

CTTACAGGAATTGGCACCCTAATTACAGCTGGTTATTCTTTATACCTTTTCCTAATATCACA

ACGAGGTCCCACACCCCCGCACATCACTGGTCTTCCACCATTTCACACCCGAGAACACCTACTA

CTGACCCTTCATCTTGTCCCGGTTATTCTCTTAATTGCAAAACCGGAACTTATATGAGGCTGG

TGCTTTTAGTAAGTATAGTTTAAATAAAATATTAGATTGTGATTCTAAAGACAGGGGCTAA

AATCCCCTTACTCACCGAGGAAAGCCCGAGGCAATAAGTTCTGCTAATCCTTACAACCCACGG

TTAAACTCCGTGGTTTCCTCGCGCTTTTGAAGGATAACAGCTCATCCATTGGTCTTAGGAACC

AAAAACTCTTGGTGCAAATCCAAGTAAAAGCTATGCACCCAACAACTCTGATCCTTTCCTCCT

CACTGATTCTAGTAATTGCCATCCTTACCTATCCGCTTCTAACCACTCTTAATCCTAATCCCC

AGGACCAAAAATGAGCAGTTACACATGTAAAAACCTCTGTAAGCACTGCATTCCTAGTAAGC

CTACTTCCATTAATAATTTTTCTTAATCAAGGAACCGAGACTATTGTTACTAACTGACACTG

AATAAACATCGCCCCTTTTGATATTAATATTAGCTTCAAATTTGATCACTACTCTATCATCT

- 89 -

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CTGACCCATTTATTAACCGATTTTTCAAATATTTACTTCTATTTCTTGTAGCCATAATTTTA

CTCGTTACAGCAAATAATATATTTCAACTTTTTATTGGCTGAGAGGGAGTAGGAATTATATC

CTTCCTCCTAATCGGCTGATGATATGGACGGGCAGATGCTAATACAGCAGCTCTACAGGCCGT

CTTATATAATCGAGTGGGCGACATCGGCCTAATTATGACCATAGCCTGACTTGCAATAAATCT

TAACTCATGAGAAATTCAACAAATTTTCTTCTTATCAAAAAACTTTGATATAACCCTTCCCC

TCCTTGGCCTAATCCTAGCCGCAACGGGGAAATCAGCCCAATTTGGACTACATCCTTGACTGC

CCTCTGCTATAGAGGGTCCCACACCAGTCTCTGCCCTACTTCACTCCAGCACTATGGTTGTAGC

TGGGATCTTTCTCTTAATTCGCCTTCACCCCCTTATAGAAGATAACAATATTGCATTAACAAC

TTGTCTTTGCCTAGGTGCTTTAACGACCCTATTCACAGCAGCCTGTGCCCTAACCCAAAATGA

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GGCTAAATCAACCACAACTGGCATTTCTTCATATCTGTACGCACGCCTTTTTTAAAGCTATAT

TATTCTTATGCTCAGGGTCAGTTATTCATAGCCTATATGACGAACAAGATATTCGTAAAATG

GGAGGATTACAAAACTTAATACCAGTAACCTCAACCTGTCTTACAATTGGCAGCCTAGCCCTA

ACAGGCACTCCCTTTTTAGCCGGCTTTTATTCAAAAGACGCTATTATTGAAGCCCTAAATACC

TCTCACCTAAACGCCTGAGCCCTGATTCTTACACTTATTGCTACCTCTTTCACTGCAGTATAT

AGCTTCCGCGTGGTATATTTTGTTACTATGGGAACACCTCGATTCCTGCCTTTATCACCTATT

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GGATTAATTATTTCATCAAACTTTTTACCCTTAAAAACACCTGTTATAAGTATACCGCCTAT

CCTTAAATTAGCTGCCCTCTTGGTAACAATTCTTGGCCTACTCGCAGCCTTAGAATTAACTGC

TTTAACAAACAAACAATTTAAAATTACCCCCACAATTTCTCCACACCATTTCTCAAATATAC

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CAATTGCCACTCAACTAGTTGATCAAACATGATTTGAAGCTATAGGCCCAAAAGGGACATCT

TCACTTCAAGTAAAAATAGCTAAAACTGTTAGTGATATACAGCAAGGTATAATTAAAACTT

ACTTAATAATTTTCCTTTTAACCACAACCGTTGCCATTCTTCTAGTTATAGCTTAGACTGCTC

GAAGAGAACCTCGACTCAGCCCTCGAGTTAGCTCAAGAACCACAAACAAGGTTAAAAGCAATA

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- 90 -

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GCATTCTTTTATATGCATAGCGTTCTCTTTTTTTGGTTTCCTTTCCTATACATCTCAGAGTGC

AGGCTCAACTAGTAAATTAAGGTGGAACATTTTTCTTGCATGTGATTAATGTGAATGAATGA

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> Cobitis choii mitochondrial DNA, complete sequence

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CTTAGCTAGAGTTAAGAGGGCCGGTAAAACTCGTGCCAGCCACCGCGGTTATACGAGAGGCCC

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ACCTGACCCCACGAAAGCTGAGAAACAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGCTCAGCCGTAA

ACCTAGACGTTATTTCACACAAACGTCCGCCAGGGTACTACGAGCATTAGCTTAAAACCCAAA

GGACTTGGCGGTGCCTTAGACCCCCCTAGAGGAGCCTGTTCTAGAACCGATAACCCCCGTTAA

ACCTCACCACTTCTGGTCATCCCCGCCTATATACCGCCGTCGTCAGCTTACCCTGTGAAGGACT

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AGAAATGGGCTACATTTTCTTTTAAAAGAACATCACGGACAACACTATGAAAACTAGTGCTC

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TACACACCGCCCGTCACTCTCCCCGCCAAATAGCGACAACTGTTGTTAACACACAAGCATAAA

TGAGGGGAGGCAAGTCGTAACATGGTAAGTGTACCGGAAGGTGCACTTGGATCAAATCAGGGT

GTGGCTGAGATAGTTAAGCATCTCCCTTACACCGAGAAGACATCCATGCAAGTTGGATCACCC

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AATAGAAAAAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGCAATGAAATAAGTCATTTAAGCACAAA

AAAGCAGAGACTAAAACTCGTACCTTTTGCATCATGATTTAGCAAGTATACAACAAGCAAAG

AGACCTTTAGTTTGTTACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGGGACAGCCTAAAAGGGCCAAC

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- 91 -

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TTATATCTAGGTTAGACATGAGAGAAGCATGAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTA

ACCAAGGGTACAACTTTACCAGGAGGATAGGGATTATAGTTTTAAAAATTCATTGTTTCAGT

GGGCCTAAAAGCAGCCATCTGTTCAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAATAAAAAATTTATTAT

TTCAATAGCATATCCCATTCCCCTAATCTTATTAGGCCGCTCCATGACATCATGGAAGAGACC

ATGCTAATATGAGTAACAAGAGACAATATTTCTCTCCAGGCATAAGTGTAAGCCAGCCCGGA

TAAACCACCGGCAATTAACGAACCCAACAAAAGAGGGTAGTATAATTAATATAATATACAAG

AAAAGCATATAAACCCCAATCGTTAAACCCACACTGGAGTGCCCACAGGAAAGACTAAAAGG

AAGGGAAGGAACTCGGCAAACACAAGCCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCTCCTGCAAAA

TTCAAGGTATAGGAGGTCCAGCCTGCCCAGTGACCACAAGTTCAACGGCCGCGGTATTTTGAC

CGTGCAAAGGTAGCGCAATCACTTGTCTTTTAAATGAAGACCTGTATGAATGGCTAAACGAG

GGCTTAGCTGTCTCCCCTTTTGAGTCAGTGAAATTGATCTGCCCGTGCAGAAGCGGACATATA

ATTACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGGTTCAAGCCCAACCGCGTTAAATAACTTAC

TAAATAAGAACTAAACCTAGCGGATAATGGAGCTTTACCTTCGGTTGGGGCGACCACGGAGA

AAAATATATCCTCCGAGTGGACTGGGTTAATAAACCTAAAACCAAGAAAGACATTTCTAGGC

CACAGAAAATCTGACCAATAATGATCCGGCCAACGGGCCGATCAACGGACCAAGTTACCCTAG

GGATAACAGCGCAATCCTCTCCCAGAGTCCATATCGACGAGGGGGTTTACGACCTCGATGTTG

GATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT

ACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGCAATCCAGGTCAGTTTCTATCTGTAACGTTACTTTTCCT

AGTACGAAAGGACCGGAAAAGAGAGGCCCATGCCAAAAGTACGCCTCACCCCTAATTAATGAA

GACAACTCAATTAAACAAATGGAGGACCTGCAACCCGGGCAAAGATAAAGCCACACTAAGAT

GGCAGAGCATGGTAATTGCAAAAGGCCTAAGCCCTTTTAGCCAGAGGTTCAAATCCTCTTCTT

AGTTTATGTTAAACACTTTACTTATTTATTTAATCAATCCCCTCGCATATATCATCCCTGTT

CTCTTAGCTGTAGCATTTCTTACACTTATTGAACGAAAAGTCTTAGGTTATATACAACTACG

TAAGGGCCCAAATATTGTAGGGCCATATGGCCTCCTTCAGCCAATTGCTGATGGAGTTAAATT

ATTCATTAAAGAGCCCATCCGCCCGTCCACATCATCCCCATTTTTATTTTTAGCCACCCCCAT

ACTTGCATTTACACTAGCCATAACCTTATGAGCCCCTATCCCTATACCCCACCCAGTCACAGA

TTTAAATCTGGGTGTCCTATTTATCTTAGCCCTGTCAAGCCTCGCAGTATATTCAATCCTCGG

ATCTGGATGAGCCTCAAATTCGAAATATGCATTAATTGGTGCCCTACGAGCCGTAGCTCAAAC

AATCTCTTATGAAGTAAGTCTAGGGCTAATTCTTCTTTCAATTATTATTTTCACGGGGGGCT

ATACACTACAAATATTTAATATTACTCAAGAAGGTATTTGACTACTTATTCCAGCCTGACCT

CTAGCTGCAATGTGATATATTTCCACTCTAGCAGAAACAAACCGAGCACCCTTTGACCTCACT

GAGGGTGAATCTGAACTAGTCTCTGGGTTTAACGTAGAATATGCAGGAGGGCCATTTGCCCTC

TTCTTTCTAGCTGAATATGCCAACATTTTATTAATAAATACCCTGTCAGCCGTCCTCTTTCTT

GGTGCCACCAATCTCCCAGCCCTTCCTGAATTAACTACAATTAACCTAATGATTAAAGCTGCA

CTTCTCTCCATGGCCTTCCTATGAATCCGAGCATCCTATCCTCGATTTCGTTATGATCAACTA

ATACATCTAGTATGAAAAAACTTTTTGCCTCTAACCCTGGCCCTAGTATTATGACACACCGCT

CTTCCCATTGCATTTGCAGGCCTTCCCCCCCAACTTTAATTAACAGGAACCGTGCCTGAATGCC

TAAGGACCACTTTGATAGAGTGGCTTATGAGGGTTAAAGCCCCTCCAGTTCCTAGAAAGAAGG

GAATCGAACCCATACCCAGGAGATCAAAACTCCTAGTGCTTCCTCTACACCACTCTCTAAGAT

AAGGTCAGCTAATTAAGCTTTCGGGCCCATACCCCGAACATGACGGTTAAAATCCCTCCCCTA

TCAATGAACCCTTATGTATTAATAATTTTGTTGTCTAGCCTCGGACTGGGAACTACACTAAC

CTTCGCAAGTTCCCACTGACTATTGGCCTGAATGGGTTTAGAAATTAATACCCTGGCAATTAT

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AATGAGACATTAACAGCCTCTCCCACCCACTAGCCTCAACCCTAGTAATTGCAGCCCTATCAC

- 92 -

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TAACTGGACTAATTTTATCCACATGACAAAAACTAGCACCATTTGCACTAATTATCCAAGTA

GCTCCAACAATTGATCCCCACCTCCTTATATCCATAGGCCTCCTATCAACCCTAGTAGGAGGA

TGAGGCGGTCTAAATCAAACTCAACTACGAAAAATCCTAGCCTACTCCTCTATTGCACATATA

GGCTGAATAATCATTATTCTGCAGTTCTCCCCACAATTAACACTCCTAGCACTAGGAATATAT

ATTTTCATAACGGCCACAGCTTTCCTTTCATTTAAAATATCAATAGCCACAAAAATTAATAC

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CTAGGAGGACTTCCCCCACTAACCGGGTTTATACCTAAATGACTTATTTTACAAGAGATATCA

AAACAAGGATTACCCCTCACCGCAACAATTATGGCCCTAGCAGCTTTGCTAAGTTTATACTTT

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ACCATGACGAACCTCCAATTCCCAATCGACACTTACCCTGGCCCTAACCACCACAGTTGCCCTG

GGACTCCTTCCAATTACCCCCGCTATCCTAGCATTAACCACCTAGGGGCTTAGGATAATTTAG

ACCAAGGGCCTTCAAAGCCCTAAGTAGGAGTTAAAATCTCCTAGCCCCTGCTAAGACTTGCGG

GACATTATCCCACATCTTCTGAATGCAAGCCAGACACTTTAATTAAGCTAAAGCCTTCCTAGA

TGAGAAGGCCTCGATCCTACAAACTCTTAGTTAACAGCTAAGCGCTCAAACCAGCGAGCATTC

ATCTACTTTCCCGCCACTAGGCGAGCAAGGCGGGAAAGCCCCGGCAGACGTCAATCTGCGTCTT

TGGATTTGCAATCCAATGTGTACTCCACCACGGGGCTTGATAGGAAGAGGACTTAAACCTCTA

TCTTCGGGGCTACAACCCGCCACCTGGCTTCGGCCATCCTACCTGTGGCAATCACACGCTGATT

CTTCTCTACTAACCACAAAGATATTGGCACCCTTTACCTTGTATTCGGTGCCTGAGCCGGAAT

GGTTGGAACCGCCCTTAGCCTCTTAATTCGTGCCGAGCTTAGCCAACCCGGGTCTCTCCTTGGG

GATGACCAAATTTATAATGTTATTGTTACTGCACATGCATTTGTTATGATTTTCTTTATAGT

AATACCTATCCTCATCGGTGGGTTCGGCAACTGACTTATTCCACTAATGATTGGCGCCCCCGA

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ACTAGCCTCCTCCGGAGTTGAAGCTGGAGCCGGGACGGGCTGAACTGTTTATCCCCCACTAGCC

GGTAACCTCGCCCACGCAGGTGCATCCGTCGACCTTACAATCTTCTCTCTGCACCTGGCAGGAG

TTTCATCTATTCTAGGGGCTATTAATTTTATTACTACTACGATCAATATGAAGCCGCCTGCC

ATCTCACAATACCAAACACCCCTATTTGTATGGGCAGTTCTTGTAACAGCTGTTCTTCTACTT

TTATCCCTGCCTGTTCTAGCCGCAGGAATTACTATACTCCTGACGGACCGGAACCTAAATACT

ACATTCTTTGACCCGGCGGGAGGGGGAGACCCCATCCTTTATCAACATCTGTTCTGATTCTTT

GGGCACCCTGAAGTCTATATTTTAATTTTACCCGGATTTGGAATTATCTCCCATGTTGTAGCC

TACTATGCAGGCAAAAAAGAACCTTTCGGATACATGGGGATGGTATGAGCCATGATGGCTAT

TGGCCTCCTGGGCTTTATTGTCTGAGCCCACCACATGTTCACCGTCGGCATAGATGTTGATAC

TCGTGCATACTTTACATCTGCCACAATAATTATTGCTATCCCCACAGGCGTAAAAGTCTTTAG

CTGACTGGCCACGCTCCATGGGGGCTCTATTAAATGAGAGACCCCTATACTCTGAGCACTCGGC

TTTATTTTCCTTTTTACAGTAGGAGGTCTAACCGGAATTGTTTTAGCTAATTCATCTATTGA

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AGTGTTTGCAATTATGGCCGGCTTTGTTCACTGATTTCCCCTATTTACGGGATATACCCTACA

CAGCACATGAACTAAAATCCACTTTGCAGTAATGTTCTTAGGTGTCAATCTTACTTTTTTCCC

GCAGCACTTCCTCGGCCTTGCAGGTATACCGCGACGATACTCAGATTATCCAGATGCCTACACC

CTATGAAACACAGTCTCATCTATTGGGTCAATGATCTCACTTGTAGCCGTAATTATATTCTT

ATTCATTTTATGAGAAGCCTTTGCCTCTAAGCGAGAAGTTTTATCCGTAGAACTAACCGCAA

CAAATGCTGAGTGACTCCACGGTTGTCCTCCTCCTTACCACACATTTGAGGAACCAGCATTTG

TCCAAGTTCAATCAAATTAAGCGAGGAAGGGAGGAATTGAACCCCCATATGCTGGTTTCAAGC

CAGCCGCGTAACCACTCTGCCACTTCCTTTTAAGACATTAGTAAATCAGTAATTACATCACTT

TGTCAAGGTGAAATTGTAGGTTAAACCCCTGCATGTCTTAAGCTTTGAGCTTAATGGCACAT

CCCACACAATTAGGATTCCAAGACGCGGCATCACCCGTTATAGAAGAACTTCTTCACTTCCAT

- 93 -

GATCACGCACTAATAATTGTATTTTTAATTAGCACACTTGTACTTTACATTATTGTTGCCAT

AGTTTCTACAAAACTTACTAATAAATATATTCTAGACTCTCAAGAGATTGAGATTGTATGAA

CAGTACTACCAGCAGTTATTCTTGTTTTAATTGCTCTGCCCTCCCTTCGAATTCTTTACCTTA

TAGATGAGATTAATGATCCCCACCTTACTATTAAGGCCATAGGCCACCAATGATACTGAAGCT

ATGAATATACGGACTATGAGGACTTAGGTTTTGACTCATATATGATTCCAACTCAGGACCTA

AACCCCGGCCAATTTCGACTACTGGAAACAGATCATCGAATAGTAGTTCCAATAGAGTCCCCC

ATCCGTGTATTGATCTCTGCTGAAGATGTTCTTCACTCTTGGGCTGTCCCATCCCTTGGCATC

AAAATAGACGGAGTTCCGGGCCGTCTTAACCAAACTGCCTTCATTGCCTCTCGCCCTGGGGTA

TTCTACGGACAATGCTCCGAAATTTGTGGAGCGAACCACAGCTTCATGCCAATCGTTGTTGAA

GCCGTTCCACTCGAACACTTTGAGCGCTGATCCTCATTAATACTAGAAGACGCCTCACCAGGA

AGCTAAATTTGGGCTACAGCGTTGGCCTTTTAAGCCAAAGATTGGTGCCTCCCAACCACCCCT

AGTGAAATGCCACAATTAAATCCAGCCCCCTGATTTGCAATTTTATTATTTTCGTGGTTAAT

TTTCTTAACCATTATCCCCACAAAAATTCTTAATCATGTTTCTCCCAATGAACCATCTCCATT

TAGCACAGAAGAACATAAAGCCCAACCCTGAGACTGACCATGGCAATAAGCTTCTTTGACCAA

TTTGCAAGCCCCTCATATCTAGGGATTCCCCTAATTGCTATTGCTATTGCCCTACCTTGAGTA

ATATATCCCACCCCCTCAACTCGATGAATTAATAATCGTCTAATTACGATTCAAGGCTGATT

AATTAACCGATTTACAAATCAACTGATACTCCCACTAAATGTTGGTGGGCATAAGTGAGCCT

TATTACTAGCCTCCCTAATAATTTTCTTAATTACAATTAATATATTAGGACTCCTACCATAC

ACCTTCACCCCCACAACACAACTATCTCTAAATATGGGATTTGCAGTTCCTTTATGGCTCGCC

ACGGTCCTTATTGGCATGCGTAACCAACCAACAGTAGCACTAGGCCATCTTCTACCAGAAGGG

ACCCCCATTCCTCTTATTCCCGTCTTAATTATTATTGAAACAATTAGCCTATTTATTCGCCCC

CTGGCCTTAGGAGTACGATTAACAGCCAATTTAACCGCCGGACATCTATTAATTCAATTAAT

TGCCACTGCTGTATTTGTTCTTCTTCCAATAATGCCCACGGTAGCTATTTTAACTGCCGCTGT

CTTGTTCTTATTGACCCTGCTGGAAGTAGCTGTGGCTATAATCCAAGCATATGTATTTGTTCT

TCTTCTAAGCCTCTACCTCCAAGAAAACGTCTAATGGCCCACCAAGCACATGCGTATCATATG

GTTGATCCAAGCCCATGACCACTAACCGGCGCAGTCGGAGCCCTTTTAATAACATCCGGCCTA

GCAATCTGATTCCACTTTCACTCAATCACTCTTATAACCCTCGGGTTAATTTTACTGCTCCTC

ACCATGTACCAATGATGACGAGACATTATCCGCGAGGGGACCTTCCAAGGCCATCACACACCT

CCAGTACAAAAAGGCCTACGATATGGAATAATCCTTTTTATTACATCAGAAGTATTCTTTTT

TCTAGGCTTCTTCTGAGCCTTTTATCACTCAAGCCTGGCACCAACCCCAGAACTTGGAGGTTG

CTGGCCTCCTACAGGGATTACACCTCTGGACCCCTTTGAAGTCCCCCTACTTAATACAGCCGTC

CTCTTAGCATCAGGCGTAACAGTGACATGAGCCCACCACAGCCTTATAGAAGGTGAACGGAAA

CAAGCTATCCAATCTCTTGCACTTACCATTCTTTTAGGGTTCTACTTCACAGCCCTCCAAGCA

ATAGAATATTACGAAGCCCCTTTCACAATTGCAGACGGCGTTTACGGATCCACATTTTTTGTA

GCTACAGGCTTCCACGGACTCCATGTAATTATTGGATCTTCTTTCTTGGCTGTCTGCCTTCTT

CGCCAAATCCAATACCACTTTACATCTGAGCACCACTTCGGCTTTGAAGCCGCCGCATGATAC

TGACACTTCGTTGATGTAGTATGACTATTCCTTTATGTATCAATCTACTGATGAGGCTCATA

TCTTTCTAGTATCTAAAGCTAGTACGAGTGACTTCCAATCACCTAGTCTTGGTTAAACTCCAA

GGAAAGATAATGAACTTAATTATTACTATTTTATTTATTTCAATTACATTATCAGTAATTC

TAGCTGTTGTATCGTTCTGGCTCCCGCAAATAAACCCGGATGCAGAAAAACTATCACCATATG

AATGTGGGTTTGATCCCCTCGGATCTGCTCGACTACCATTTTCTATTCGATTTTTTCTGGTTG

CTATTCTTTTTCTTCTCTTCGACCTGGAAATTGCTCTTCTACTTCCTCTACCCTGAGGAGACC

AACTTTTTAACCCCGTAGGAACTCTTCTTTGGGCCTCAGCCGTATTAGTTCTTCTAACACTAG

GCCTAGTCTATGAATGAACTCAAGGGGGCCTAGAATGAGCAGAATAAGGGTGTTAGTCCAAA

GCAAGACCTCTGATTTCGGCTCAGAAGACCGTGGTTCAACTCCACGACCCCCTTATGACACCCG

TACATTTCAGCTTTAGCTCTGCCTTTATTTTAGGGCTTATAGGTTTAACATTTCACCGTACAC

- 94 -

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CTTTGAGCCTTACAATTTGAAATAACTGGATTTTCAACGGCACCAATACTTCTTCTAGCATT

CTCAGCCTGTGAGGCAAGTGCAGGTCTAGCACTACTTGTTGCCACAGCCCGAACCCACGGAACA

GACCGACTACAAAACCTTAATCTTCTACAATGCTAAAAGTACTAATACCCACAATAATGCTA

TTTCCAACAATTTGATTATCATCGCCAAAATGATTATGATCAACAACAATTGCCCACAGCCT

GCTAATTGCCATCACCAGCATATCATGACTATATTGAACATCTGAAACGGGCTGGTCTTCGTC

TAATCAGTATATAGCCACAGACCTATTATCCACCCCCCTATTAGTTCTCACTTGCTGGCTTCT

TCCTCTAATAATTTTAGCCAGTCAGAATCACATTAACCCAGAGCCTGTTAATCGTCAGCGACT

CTATATTACTCTCCTAGTATTTTTACAAACATTCTTAATTATAGCATTTGGTGCCACAGAAA

TTATTATATTTTATGTTATATTTGAAGCCACCCTCATCCCCACCTTAATTATTATTACCCGA

TGAGGAAACCAAACCGAACGCCTCAACGCAGGAACCTACTTCCTATTTTATACACTAGCAGGA

TCCCTGCCCCTCCTAGTGGCTCTTCTACTCCTTCAACACTCAACCGGGACTCTTTCAATGTTAA

TTTTGCAATATTCACAACCCCTGACTCTTAACACCTGAGGCCATAAAATTTGATGAGCTGCAT

GCCTAATTGCATTTCTTGTTAAAATACCCCTTTACGGTGTTCATCTGTGACTCCCCAAAGCAC

ATGTTGAGGCCCCCGTAGCAGGATCAATAGTCCTTGCTGCAGTGCTCCTAAAATTAGGGGGAT

ATGGAATAATACGAATAATAGTTATACTTGACCCACTTTCTAAAGAGCTAGCTTATCCTTTT

ATTATTCTAGCCCTATGGGGCATCATCATAACAGGCTCAATTTGCCTCCGGCAGACAGACTTA

AAATCCTTAATCGCCTATTCATCAGTTAGCCACATGGGCTTAGTGGCGGGGGGAATTTTAATT

CAAACCCCCTGAGGTTTTACAGGCGCAATTATTCTTATAGTTGCACATGGTCTGGTATCGTCC

GCACTATTCTGCCTGGCCAATACTGCCTACGAACGGACCCACAGCCGAACCATAATCCTTGCAC

GAGGATTACAAATAATTTTCCCTTTAACAGCAGTCTGATGATTTATTGCAAATCTAGCCAAT

CTGGCACTCCCCCCCCTACCTAATTTAATAGGAGAATTAACCATTATTTCCACTTTATTTAAT

TGATCACCCTGAACCATCCTGCTTACAGGAACTGGCACTTTAATTACAGCCGGCTACTCACTA

TATCTTTTCCTGATGACTCAACGAGGACCCTCACCAACCCACATCACAGGCCTCCCACCATTCC

ACACACGAGAACACCTATTAATGGCCCTTCATCTCATCCCGGTTATTCTTCTTATTGCTAAGC

CTGAACTTATATGAGGCTGATGCTACTAGTAAGTATAGTTTAAATAAAATATTAGATTGTG

ATTCTAAAGACAGGGGCTAAAATCCCCTTACTCACCGAGGAAGGCCCGAGGCAGTAAGAACTG

CTAATTCTTATAACCCACGGTTAAACTCCGTGGTTTCCTCGGGCTTTTAAAGGATAATAGCTC

ATCCGTTGGTCTTAGGAACCAAAAACTCTTGGTGCAAATCCAAGTAAAAGCTATGCACCCAAC

AACCCTAATTTTATCCTCCTCATTAATTCTAGTAATTGCCATTCTTATTTACCCGCTCATATC

CACCCTTAACCCTCACCCCCAAAACCAAAAATGAGCAATTTCACATGTTAAAACCGCTGTGAG

CACTGCATTCCTGGTGAGCCTCTTACCACTAATAATTTTTCTTGATTGTGGGGCTGAAACTAT

TGTTACAAATTGACACTGAATAAACACCACCCTCTTTGATATTAATATCAGTTTTAAATTTG

ACCACTATTCAATTATCTTTACACCTATTGCCCTTTACGTGACTTGGTCCATCCTTGAATTTG

CATCCTGATATATACACTCTGATCCATTTATAAACCGATTCTTTAAGTACTTACTTCTATTT

CTTGTAGCCATGATTATACTTGTTACAGCCAATAATATATTTCAACTCTTCATCGGCTGAGA

GGGGGTAGGAATTATATCTTTCCTCCTCATCGGCTGATGGTACGGACGAGCCGATGCTAATAC

AGCAGCCCTACAGGCCGTCTTATATAATCGAGTGGGTGATATTGGCCTGATCATGACTATAGC

TTGACTTGCCATAAATTTTAATTCATGGGAAATTCAACAAATATTCTTCCTGTCAAAAAACT

TTGATATAACCCTCCCCCTCCTTGGCCTAATTCTAGCCGCAACCGGAAAGTCTGCTCAATTTG

GGCTCCATCCCTGGCTACCCTCTGCCATGGAGGGCCCCACACCAGTATCTGCCCTACTTCATTC

CAGCACCATAGTAGTAGCTGGAATTTTTCTTCTTATTCGCCTTCACCCCCTTATAGAAGACAA

TAGCCTTGCACTAACAACCTGTCTCTGCCTAGGCGCCCTCACAACCCTATTTACGGCAGCCTGC

GCCCTCACCCAAAATGATATTAAAAAAATTGTTGCATTTTCTACATCTAGTCAACTTGGATT

AATGATAGTTACTATTGGGTTAAATCAACCCCAACTAGCATTCCTTCATATTTGTACACACG

CCTTTTTTAAGGCTATACTATTCTTATGCTCGGGGTCTATTATTCACAGTTTAAATGATGAA

- 95 -

CAAGACATCCGTAAAATGGGGGGCCTCCAAAACCTGATACCACTAACCTCAACATGTTTAACA

ATTGGCAGCCTAGCACTAACAGGCACCCCCTTCTTGGCCGGCTTTTTCTCAAAAGATGCTATC

ATTGAAGCCCTAAATACCTCTCACCTAAACGCCTGAGCCCTTATTCTTACACTTATTGCCACC

TCTTTTACCGCAGTTTATAGCTTCCGCGTGGTATATTTTGTTACTATGGGTACACCCCGATTC

CTGCCTTTATCACCTATTAATGAGAACAACCCCTCAGTAATTAACCCTATTAAACGACTCGCC

TGAGGAAGTATCGTTGCCGGACTAATTATCACATCAAATTTTCTCCCATCAAAAACACCAATC

ATGAGTATACCACTTACCCTAAAATTAGCTGCTCTACTAGTTACAATTCTAGGCCTGCTAACA

GCCCTAGAATTAACTGCTATAACCAACAAACAATTTAAAGTAACACCTATTATTCCCCTCCAC

CACTTTTCAAATATACTAGGATTCTTCCCCGCAGTTATTCACCGACTAGCCCCCAAACTTAAC

CTAACCTTGGGGCAGTCAATTGCTACTCAGCTAGTAGATCAAACATGATTTGAAGCCACGGGC

CCCAAAGGAGTATCATCCCTTCAAGTAAAAATAGCTAAAACTGTGAGTGATATACAACAAGG

TATAATTAAAACATATCTTACCATTTTTCTTTTAACTACTGCCATTGCTATTCTCTTGGCCA

TAGCTTAAACAGCTCGAAGAGAACCTCGACTCAACCCTCGAGTTAATTCTAAAACCACAAATA

AAGTCAAAAGTAATACCCACGCACAAATTACTAACACACCTCCCCCCGAAGAGTATATTATAG

ACACACCACTAACATCCCCTCGCAATATAGAAAACTCCTTAAAAGTATCAACAACTATCCAAG

AGCCCTCATATCAACCCTCTAAGAAGAAACTTATTACTAATCCTACCCCAACTAAATAAATCA

AAACATACCCTAACACAGAGCGATCCCCCCAAGACTCAGGAAATGGCTCAGCAGCCAAGGCTG

CCGAATAAGCAAACACCACCAGCATTCCCCCCAAATAAATTAAAAAAAGAACTAAAGACAAA

AAAGACCCCCCATGGCTAATTAATACACCACACCCAACCCCCGCCGCTACTACTAATCCCAAAG

CAGCAAAATAAGGTGCCGGATTAGAAGCTACGGCAACCAATCCAACAATTAAAGCTATCAAC

AGTAAAGATACTAAGTAAGTCATAATTTTTACCCGGATTTTAACCGGGACCAGTGACTTGAA

GAACCACCGTTGTTATTCAACTATAAAAACCCCCTTAATGGCAAGCCTACGAAAAACACACCC

CTTAATTAAAATTGCTAATGATGCACTAGTCGACCTCCCGGCCCCCTCCAACATTTCAGTATG

ATGAAATTTTGGCTCGCTCTTAGGATTATGTCTAATCACTCAAATCTTAACAGGACTATTTC

TAGCCATGCACTATACATCTGATATTACTACTGCCTTCTCATCCGTGGCCCACATCTGCCGAG

ATGTAAACTATGGATGACTAATCCGAAATATTCACGCAAATGGAGCATCATTCTTCTTTATC

TGCATTTACATTCACATTGCTCGAGGGTTATATTATGGATCCTATCTCTACAAAGAAACCTG

AAACATCGGAGTTGTTCTCCTTCTACTTGTAATGATAACAGCATTTGTAGGCTATGTTCTTC

CATGAGGACAAATATCCTTTTGAGGTGCCACAGTAATTACTAATCTTTTATCTGCAGTCCCCT

ACGTAGGAAACGCCCTAGTTCAATGAATCTGAGGGGGATTCTCAGTTGATAACGCCACATTAA

CACGATTCTTTGCCTTCCATTTTTTATTACCTTTTATTATTGCTGCAGCCACCATCCTACACC

TTCTTTTCCTCCACGAAACAGGCTCAAATAATCCCATAGGACTAAACTCCGACGCAGATAAAG

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어류 생식줄기세포를 이용한 활용기술 개발 2차년도 -...

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