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呼吸酵素系の組織化学的並に生化学的研究

第3編

チ トク ロー ム酸 化 酵 素 系 の組 織 化 学 的 研究

岡山大学医学部病理学教室(指 導:妹 尾左知丸教授)

岡 崎 博 明

〔昭和34年5月4日 受稿〕

チ トク ロ ーム酸 化 酵 素 の 組 織 化 学 的 検 出 には,従 来

か らNadi反 応1)が 屡 々 用 い られ て来 た.こ の反 応 は

ヂ メチ ルパ ラ フエ ニ レ ンヂ ア ミ ン と αナ フ トールか ら

酸 化 に よつ て イ ン ドフ エ ノ ール ブ リユ-と い う青 色 の

色素 を形 成 す る反 応 で あつ て,生 化 学 の 分 野 で は こ の

反応 を触 媒 す る酵 素 は イ ン ドブエ ノ ー ル オ キ シ ダ ー

ゼ2)と 呼 ばれ, Keilin及 びHartree (1938)3)に よ

って それ は チ トク ロ ーム オ キ シ ダ ー ゼ と固 定 され た.

と ころが 組 織 化 学 の 分 野 で はNadi反 応 を用 い て 検 出

され る酵 素 に2種 類 の酵 素が 知 られ て い た.そ の 一 つ

はM-Nadiオ キ シ ダ ーゼ(Graff, 1922)4)或 い は 安

定 オ キ シ ダ ーゼ(von Gierke, 1911)5)と 称 され る も

ので あつ て,フ オ ル マ リ ンで固 定 され た 骨 髄 性 白血

球6)や そ の他 数 種 の組 織 細胞7)に 検 出 され,そ れ は 現

今 では酸 化酵 素 では な くして ベ ル ドペ ル オ キ シ ダ ー

ゼ8～9)で あ るとみ な され て い る.他 の 一 つ はG-Nadi

オキ シ ダ ー ゼ(Graff, 1922)4)或 い は不 安 定 オ キ シ ダ

ーゼ(von Gierke, 1911)5)と 称 され る もの で大 部 分

の新鮮 組 織 細 胞 内 に 検 出 され る. Lison (1936)10)は

G-Nadiオ キ シ ダ ーゼは イン ドブエ ノ ール オ キ シ ダ ー

ゼ,或 い はWarburgの 呼 吸 酵 素 に 違 い な い と い う意

見 を発表 したlD.又Brachet (1944)12)はNadi反

応 は チ トク ロ ーム 酸 化酵 素 の作 用 で起 るであ ろ うが,

同時 に その 反 応 生 成物 は脱 水素 酵 素 の作 用 で 白色 体 に

還 元 され るで あ ろ うか ら酸 化 酵 素 の正 確 な分 布 像 は 本

反 応 では 得 られ ない と述 べ て い る.更 に 周知 の如 く本

反 応 は酵 素 が 存 在 しな くて も空 気 中 や溶 液 中の 酸 素 に

よ る 自然 酸 化13)或 い は過 酸 化 脂 質11) 14) 15)な ど に よ

つ て容 易に 起 り,又 そ の反 応 生 成 物 は2次 的 に極 め て

容 易 に脂 質,そ の 他 の組 織 成 分 を染 色 す る13) 14).従

つ て本 反応 を,チ トク ロ ーム酸 化 酵 素 の 組 織 化 学 的 検

出に用 うるこ とに 対 し ては 多 くの反 対 が あ る13) 16).

著 者 は 前編17～18)に お い て,パ ラ フェ ニ レ ンヂ ア ミ

ンを基 質 とし,チ トク ロ ームCを 添 加 し,或 い は添 加

しないで組織ホモヂネイトのチ トクロームC酸 化酵素

及びチ トクロームCチ トクローム酸化酵素系の新たな

活性度測定法を記載した.本 編においては前編の理論

に基いて本酵素の組織化学的検出法とその成績につい

て述べる.

材 料 及 び 方 法

材料としては断頭によつて 屠 殺 し たマウスの新鮮

心,肝,腎,脾,脳,骨 格筋組織及びラツ トの腹水肝癌細

胞などを用いた.反 応は厚さ1～2mmの 新鮮組織塊,

厚さ10～20μ の凍結切片或いは浮游細胞で行つた.

チ トクロームC酸 化酵素の為の反応液としては燐酸

緩衝液(0.1M, pH 7.6),ネ オテ トラソリウム液(0.2

%),パ ラフェニレンヂアミン液(0.2M),及 びチ トク

ロームC液(10-4M)を 夫々0.2ml.づ つ反応直前に

混和した液を用 う.チ トクロームCチ トクローム酸化

酵素系の為の反応液としては上記反応液中からチ トク

ロームC液 を除き同量の緩衝液を加える.基 質対照と

しては夫々パラフエニレンヂアミン或いはパラフェニ

レンヂアミンとチ トリクロームCと を除き同量の蒸溜

水を加う.チ トクロームCよ り低位の系(主 にDPNH

脱水素酵素系のフラボプロテ イン)に 共範 して起る内

元性脱水素酵素反応17) 19)が新鮮組織塊や新鮮細胞で

は多少現れるが,組 織をあらかじめ-20℃ で5～10分

凍結しておくと可成 り減弱せしめることが出来 る.又

前編18)に 述べた如 く反応を定量的に行 う為には 反応

液量に対して適当量の組織を用うることが必要である

ので,例 えばマウス肝では約40mgの 組織塊又は組織

切片全部を0.8m1.の 反応 液中 に 入れて反 応せしめ

た.

反応は37℃ で好気的或いは嫌気的に30分 ないし1

時間行つた.そ の後浮游細胞は塗抹し,組 織塊の一部

は捺印標本とし,フ ォルマ リン蒸気固定した.組 織切

片や組織塊は生理的食塩水,又 は0.33M庶 糖液で洗

3616　 岡 崎 博 明

い,切 片はスライドグラスに載せて,組 織塊はそのま

ま10%フ オルマ リン水で固定した.組 織塊は凍結切片

又はカーボックス包埋片とした.大 部分の標本は後染

色せずグリセ リン浸として鏡検した.こ れらの標本は

長期間保存に耐える.一 部はヘマ トキシリンエオヂン

で極 く軽度に,或 いはサフラニンOで 後染色した.組

織に着いたパラフェニレンヂアミン又はその酸化物 を

完全に除 く為には,標 本を固定後0.1～1Mの 硫酸水

で洗えばよい.

成 績 並 に 考 按

浮游生細胞や組織塊で反応した場合には反応は細胞

質内で略 ミトコンドリアに一致して,顆 粒 状 な いし

楕円形の紫色顆粒として出現する.凍 結切片で反応し

た場合には生細胞や組織塊で反応した場合より反応が

弱 く,且 つ細胞内微細構造との関係が稍々不明瞭であ

る.何 れの場合にも反応は核内には全く陰性である.

反応を定量的にする為には先に述べた如 く反応液と組

織の量とが一定の割合の範囲内にある必要があり,凍

結切片の場合は特に注意しなければならない.切 片少

量を大量の反応液中で反応せしめると反応の強さは著

しく減弱する.従 つて一定量の組織切片全部を反応液

中に入れて反応を行 う必要がある.

種々な組織細胞における酵素活性の分布については

附図説明に記載する.

反応の特異性については前編において組織ホモヂネ

イ トについて既に証明したので,詳 細は省 くが,組 織

化学的反応について吟味した結果 を略記すれば次の如

くである. 0.1Mの 第1燐 酸ソーダでpH 7.6に したシ

アンカカリ(10-8M)を 酵素反応液に添加すると,パ

ラフェニレンヂアミンを基質とする組織のネオテ トラ

ゾリウム塩還元反応はチ トクロームCを 添加した場合

も添加しない場合も共に僅かな内元性脱水素酵素反応

を差引けぱ殆んど完生に阻止される.組 織を80℃,

5分 間保てば完全に不活性化される.マ ロン酸 ソーダ

やアンチマイシンAを 添加しても反応は全然阻害され

ない。嫌気的条件下では好気的条件下より多少反応が

増強する.パ ラフェニレンヂアミンの代りにアスコル

ビン酸 を基質としても反応が起るが前者の方が優れて

い る.内 元性脱水素酵素反応は凍結切片では殆んど現

れないが浮游細胞や組織塊で反応 した場合は軽度に現

れる.然 しその反応の強 さはパラフエニレンヂアミン

を基質として加えた場合の反応より遙かに弱い.内 元

性脱水素酵素反応はアンチマ イシンAで もシアンでも

阻害されないので,前 編17)に 述べた如 く ミトコン ド

リアの終末電子伝達系列のアンチマイシンAで 阻害さ

れるステップより低位のステップ,主 としてDPNH

脱水素酵素系のフラボプロテイン及びアンチマイシン

Aで 阻害されない他の還元系に共軛して起 るものと考

えられるが,組 織を反応前に凍結しておけば或 る程度

減弱せしめ得 る.チ トクロームCは 生きた細胞内には

充分入 り難いので,新 鮮組織塊や浮游細胞での組織化

学的反応によつては内元性のチ トクロームCの 量或い

は活性に無関係にチ トクロームC酸 化酵素活性のみを

選択的に証明することは困難であろう.従 つてパラフ

ェニレンヂアミンの存在下における生細胞によるネオ

テ トラゾリウム塩還元反応はチ トクロームCを 添加し

てもしないでも全てチ トクロームCチ トクローム酸化

酵素系活性を示すものと考えられる.こ の場合パラフ

ェニレンヂアミンが固在のチ トクロームCを 還元し,

還元されたチ トクロームCが チ トクロームC酸 化酵素

の働きによつてネオテ トラゾリウムを還元するもので

あるり,こ の反応は細胞内のチ トクロームCと チ トク

ロームC酸 化酵素との共同の働きによつて 起 るの で

ある.凍 結切片の場合ではチ トクロームCの 添加によ

つて反応が可成 り増強するので,前 編に述べた如 く充

分量のチ トクロームCを 添加すれば反応の強弱は細胞

内のチ トクロームC酸 化酵素活性に支配されその活性

度を知 ることが出来る.然 し固在のチ トクロームCを

完全に除 くことは困難であるから,固 在のチ トクロー

ムCに 関係なくチ トクロームC酸 化酵素活性のみを選

択的に検査したい場合にはチ トクロームCを 添加しな

い対照標本における反応と充分比較検討することが望

ましい.

結 論

パラブェニレンヂアミンの存在下においてチ トクロ

ームCを 添加し或いは添加しないで,ネ オテ トラゾリ

ウム塩を用いて夫々チ トクロームC酸 化酵素或いはチ

トクロームCチ トクローム酸化酵素系の新たな組織化

学的及び細胞化学的証明法を記載 した.

本法は新鮮浮游細胞や組織塊では好気的条件下にお

いて反応は細胞質内のミ トコンドリアに門致して紫色

の鮮明な桿状ないし球状顆粒として出現し,細 胞化学

的レベルにおいて酵素活性の存在部位とその活性度を

知ることが出来る.凍 結切片では稍々鮮明さを缺ぐが

種々な組織内における酵素活性の分布と強弱を知るこ

とが出来る.

又本法による組織化学的ないし細胞化学的酵素反応

施行標本と,前 編に記載した比色法による酵素活性度

測定法を併用すれば組織或いは細胞内の活性度を定量

的に測定す ることが出来 る.

呼吸酵素系の組織化学的並に生化学的研究　 3617

更に本法を用いてマウスの主要臓器組織及び癌細胞

などにおけるチ トクロームC酸 化酵素活性或いはチ ト

クロームCチ トクローム酸化酵素活性の分布を調べた

成績を記載した.

本研究の要旨は小田と共に昭和34年3月31日,第15

回日本医学会総会分科会,第48回 日本病理学会総会

(於東京)に おいて発表した.

終始御懇切な御指導 と御校閲を戴いた恩師妹尾教授

に深甚の感謝の意を表す.

文 献

1) Ehrlich, P.: Das Sauerstoffbedurfnis der

Organismen. Hirschwald, Berlin, 1885.

2) Keilin, D.: Proc. Roy, Soc. Biol., 121, 165

-172, 1936.

3) Keilin, D. and Hartree, E. F.: Proc. Roy.

Soc. Biol., 125, 171-186, 1936.

4) Gruff, S: Abderhalden Handb. Abt. IV, Teil

1, Heft 1, 93-142, 1922.

5) Gierke, E. V.: Munch. med. Woschr., 58,

2315-2317, 1911.

6) Winckler, F: Fol. Haem., 4, 323-328, 1907.

7) Schultze, W. H.: Ziegler Beitr., 45, 127-15

3, 1909.

8) Anger, K: Acta Physiol., Scand., II, Suppl.,

8, 1, 1941.

9) Shimizu, M.: Acta Haem. Jap., 21, Suppl.

381-385, 1958.

10) Lison, L.: Soc. Chim. Biol., 18, 185, 1936,

(11)か ら引 用.

11) Lison, L.: Histochimie et cytochimie

animales, principles et mdthodes. 2nd. ed.

Guathier-Villars, Paries, 1953.

12) Brachet, J: Embryologie chimique. Mas

son, Paris, 1944.

13) Dietrich, A.: Zbl. Path., 19, 3-6, 1908.

14) Gomori, G.: Microscopic Histochemistry.

Univ. Chicago Press, 1952.

15) Pearse, A. G. E.: Histochemistry. Churc

hill, London, 1953.

16) Brenner, S.: South African J. M. Sc., 13,

320, 1947.

17) 岡 崎 博 明:　 岡 山 医 学 会 雑 誌, 71, 1959.

18) 岡 崎 博 明:　 岡 山 医 学 会 雑 誌, 71, 1959.

19) Oda, T. and Okazaki, H.: ActaMed. Oka

yama, 12, 193-204, 1958.

20) 小 田 琢 三:　 細 胞 化 学 シ ン ポ ジ ウ ム8, 173-190,

1958.

21) Oda, T., Okazaki, H., and Seki, S.: Acta

Med. Okayama, 12, 302-309. 1958.

附 図 説 明

第1～2図.腎 のチ トクロームC酸 化酵素活性の組織化学的証明,反 応は組織塊で1時 間施行し, 10%フ オルマ

リン水固定,カ ーボワックス包埋切片となし, 0.1M硫 酸で洗い,後 染せず,グ リセリン浸で検鏡,写 真撮影.反

応は腎細尿管上皮,就 中皮質の曲細尿管,及 び皮質及び髄質上部のヘンレ氏管に強陽性で,糸 球体や集合管には極

めて微弱である.

第3～12図.チ トクロームCチ トクローム酸化酵素活性の組織化学的証明,酵 素反応液にチ トクロームCを 添加

してないがその他の術式は同上.

第3図.心 筋.筋 細線維間のミトコンドリアに一致して顆粒状に強い反応が 出現している.核 は陰性である.

第4～6図.骨 格筋(比 目魚筋).赤 筋線維は一般に細くて活性が強 く,白 筋線維は太 くて活性が弱い.赤 筋線維

と白筋線維との他にその中間の活性を示す1～2種 類の筋肉線維が認められ る.ネ オテ トラソリウムの還元生成物

たるヂフオルマザンは筋細線維の間に列をなして存在するミトコン ドリアに一致して沈着している.筋 線維内の反

応の強さはその中に含まれ るミトコンドリアの数とその活性に支配 され,そ れは赤筋線維と白筋線維 とで著 しく異

る.前 者は多数で強 く.後 者は少数で弱い.

第7図.肝,肝 細胞及び星細胞の細胞質内に卵円形又は桿状のミ トコン ドリアと思われる小器官に一致して反応

顆粒の沈着が認められる.核 は全く陰性で丸く抜けて見える.

第8図.脾,細 網細胞は中等度の活性を示し,リ ンパ球は弱い活性を示す.一 般に脾のチ トクローム酸化酵素系

活性はコハク酸脱水素酵素系に比して強い.

第9図.腎 皮質,細 尿管上皮は活性強く,糸 球体は極めて弱い.

3618　 岡 崎 博 明

第10図.腎 髄質上部,ヘ ンレー氏管は可成 り活性が強いが,集 合管ほ極めて弱い.

第11図.小 脳,図 の左半は小脳顆粒層で右半は分子層である.両 層の間にプルキニエ細胞層があり上,下 に2個

のプルキニ エ細胞で示されている.反 応は神経細胞や神経膠細胞の細胞質や線維内に顆粒状に現われている.核 は

陰性である.分 子層には一部針状の色素結晶が散在性に見られる.こ のような色素の結晶形成は凍結切片で反応さ

すと特に屡々現れるものである.顆 粒層には活性の明らかに異なる2種 類の細胞が認められ る.

第12図.ラ ットの腹水肝癌細胞,反 応は浮游細胞の状態で施行した.次 で塗沫標本を作り,後 染色せず,グ リセ

リン浸で観察した.反 応は細胞質内においてミトコンドリアに一致して現われている癌細胞の本酵素活性は一般に

不規則で細胞の起源と分化度によつて異なる.又 一細胞内においても反応は不規則で活性の強いミトコンドリアと

弱いミトコン ドリアとが混在している.本 酵素活性をラットの腹壁に腫瘤 を形成 して増殖 した腹水肝癌細胞(AH

130)と,同 じ動物の肝細胞についてホモヂネイトで定量的に測定してみると,活 性の強さは0.33:0.90,即 ち癌

細胞の活性は同族正常細胞のそれより遙かに低 く約35で あつた.

Histochemical and Biochemical Studies on the Respiratory Enzymes

Part 3. Histochemical Studies on Cytochrome Oxidase System

in Various Tissues

Hiroaki OKAZAKI

Department of Pathology, Okayama University Medical School

(Director: Prof.S. Seno)

Basing on the theory presented in the previous report, the author described the new

methods for the histochemical and cytochemical demonstration of cytochrome c oxidase and

of cytochrome c-cytochrome oxidase system using neotetrazolium chloride in the presence

of p-phenylenediamine with or without additional cytochrome c, respectively. The reaction

in fresh cell suspensions or in fresh tissue blocks appears as a distinct violet granules

coinciding with the sites of mitochondria. The reaction in frozen tissue sections is not so

distinct as that in cell suspensions and fresh tissue blocks, but histochemical observation

on the distribution of the enzyme activity in the tissue can be made. By the combination

of the histochemical method and the colorimetric method for the estimation of the enzyme

activity, integrating studies on the morphologic structure and biochemical function in the

respiratory activity in the living tissues are possible.

呼吸酵素系の組織化学的並に生化学的研究　 3619

岡 崎 論 文 附 図

3620　 岡 崎 博 明

岡 崎 論 文 附 図

呼吸酵素系の組織化学的並に生化学的研究 3621

岡 崎 論 丈 附 図