肝炎ウイルス研究の今後

国立感染症研究所ウイルス第二部脇田 隆字

1946

1965

1973

1974

1989

マッカラン A型、B型の感染性肝炎

ブルンバーグ B型肝炎ウイルスの発見

ファインストン A型肝炎ウイルスの発見

プリンストン 非A非B型肝炎

ホートン C型肝炎ウイルス遺伝子の分離

~1900 “カタル性黄疸”

1912 コケイン 感染性肝炎

1983 バラヤン E型肝炎ウイルスの発見

肝炎ウイルス発見の歴史

肝炎ウイルス研究における最近の問題点

A型肝炎：今年度の流行、韓国における

大流行をどう考えるか、感染源の同定

B型肝炎：定期接種への導入、抗ウイルス療法、

臨床像の変化（慢性化、再活性化）

C型肝炎：新規抗ウイルス薬の導入による治療

の変化、キャリアの高齢化

E型肝炎：人獣共通感染症、ワクチン開発

肝炎ウイルスの感染経路（予防のポイント）

A型肝炎：汚染された飲料水、食物（飲食店から拡大）

B型肝炎：母児感染（垂直感染）、血液、体液、

血液製剤、性交渉、不適切な医療行為

（水平感染）

C型肝炎：血液、体液、血液製剤、その他

E型肝炎：汚染された飲料水、食物、特にイノシシ、

豚の生食（人獸共通感染症）

肝炎ウイルス感染症の予防と治療

A型肝炎：ワクチンあり、治療薬なし

B型肝炎：ワクチン、HBIGによる感染予防可能

インターフェロン、核酸アナログによる治療

C型肝炎：インターフェロン、リバビリンに加えてDAA

の導入による治療効果の劇的改善

ワクチンなし

E型肝炎：ワクチンなし、治療薬なし

今後の肝炎ウイルス研究のテーマ

A型肝炎：分子疫学、感染源の同定

B型肝炎：ワクチン定期接種に必要な研究、

ウイルス複製機構、病原性の解明、

新規治療薬の開発

C型肝炎：ウイルス根絶に向けた研究、ウイルス複製機構、

病原性の解明、より効果が高く、副作用のない

安価な治療薬開発、ワクチンの開発

E型肝炎：ワクチン、治療薬の開発

A型肝炎の分子疫学的手法による流行状況把握と日本への流入状況の検討

Anti-HAV prevalence

High

High/Intermediate

Intermediate

Low

Very Low

Ａ型肝炎の流行状況を示した世界地図。日本はＡ型肝炎超低頻度国。周辺は高頻度〜中程度、または都市低頻度、地方高頻度の混合型。

日本におけるＡ型肝炎患者報告数の推移

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1990 1994 1998 2002 2006 2010

case

/ 1

00

,00

0

Year

Ａ型肝炎ウイルス(HAV)による経口感染症。 急性肝炎。一度感染すると終生免疫獲得。 予後良好。ただし年齢とともに重症化しやすくなる。 潜伏期間は1ヶ月。このため原因食材の特定が困難。 予防は衛生管理とワクチン。

A型肝炎患者発生数の推移

0

50

100

150

200

250

300

350

400

2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014（年）

2014年は21週まで

342320

347

（患者数）

日本におけるＡ型肝炎抗体保有率の変化

0

50

100

0

50

100

0

50

100

0

50

100

0- 10- 20- 30- 40- 50- 60-

0

50

100

0- 10- 20- 30- 40- 50- 60-

0

50

100

0- 10- 20- 30- 40- 50- 60-

1973年

1984年

1994年

2003年

縦軸：抗体保有率、横軸: 年齢

感受性者

抗体保有者

流行減少↓

感染機会減少↓

抗体保有者減少↓

感受性者増加↓

感受性者高年齢化↓

重症化

年 2008 2009 2010 2011 2012

患者報告数 169 115 346 175 158

海外感染者 61 39 52 40 49

（％） 36.1 33.9 15.0 22.9 31.0

上位渡航先※ インド* 韓国 インド インド フィリピン

韓国 東南アジア 韓国 フィリピン インド

フィリピン 南アジア インドネシア 韓国* パキスタン*

パキスタン アフリカ タイ カンボジア インドネシア

カンボディア 南米 フィリピン 中国 エジプト*

インドネシア 中央アジア 中国 東南アジア ペルー*

* 集団感染（ツアー、家族内）を含む

感染症発生動向調査：2013年1月10日現在

A型肝炎患者の約3割は渡航時の感染で、特にアジアでの感染例が多い。また、日本はアジア諸国から多くのカキ、エビなどの魚介類を輸入しているが、それらの海産物からHAVが検出された報告もある。

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

韓国のA型肝炎患者数

information provided by KCDC(2010年、2011年は暫定値）

2006年からＡ型肝炎患者が増加し、全国的な大流行を引き起こした。

本流行のGenotypeはIIIAであり、従来韓国で流行していたGenotypeであるIAとは異なっている。

広範囲なHAワクチン接種の徹底により、2010年以降患者数は減少傾向にある

（人）

（年）

• 分子疫学的に、日本と近隣諸国のＡ型肝炎流行の関連が疑われた。

• Ａ型肝炎は潜伏期が長く、また、ウイルス分離も難しいので、原因食材および感染経路の特定は難しい。

• 発症したときにはすでに感染から1ヶ月経過しているので、患者情報から対応策を講じるのは後手に回ってしまう。

• 常日頃からの近隣諸国との情報交換は重要である。

• 近隣諸国との連携で得た情報を、食品取り扱い業者、常在地・流行地への渡航者等のハイリスク群へ積極的に発信することも重要である。

まとめ

Hepatitis B Virus

3200/1

HBV DNA

~3200bp

1600

2400 800

2800 400

2000 1200

DR2

X gene

HBxタンパク）

strand

strand

Structure of HBV genome

Translation

Pregenomic RNA

packaging

- strand

DNAsynthesis

RNA transcription

cccDNA

Virus entry Virus particle secretion

Recycling

buddingER

+ strand

DNA synthesis

3.5kb mRNA

2.4kb mRNA

2.1kb mRNA

0.7kb mRNA

Infectious HBV particle

HBsAg

HBcAg

HBeAg

HBxAg

Viral RNA Viral Proteins

Hepatocyte

Nucleus

Core particle

Hepadnaviral life cycle

核酸アナログ

Mechanisms of cccDNA formation

Mechanisms of virus entry

1. 小児のHBs抗原保有率調査

2. 若年層のHBc抗体保有率調査

1. 小児のHBs抗原保有率調査

本調査には以下の制限があった。

１）使用可能な検体量がエンザイグノストHBsAg5.0キット規定量の半分、50μｌである。２）検体の匿名性のため患者背景（既往歴、状態、採血前後の血清検査数値等）が不明である。

本調査の目的であるキャリア率の算定を鑑み、１）については50μｌで実施する変法のバリデーションを行い、信頼性を確認した。２）については、疑陽性を避けるため、エンザイグノストHBsAg5.0キット変法でHBs抗原100mIU/ml以上の検体を抽出し、その中からHBV-genomeが検出された検体をHBs抗原陽性と判定した。

2. 若年層のHBc抗体保有率調査

• 小児のHBs抗原保有率が予想以上に高かった。

• 健康診断受診者のHBs抗体陽性率20-30代： 17％40代： 21％50代： 41％

という報告があった。(平成25年 第49回日本肝臓学会、演題番号O-269)

もしかしたら、思っている以上に既往歴も高い?

10〜30代の既往歴調査を実施した。

既往歴のマーカーはHBc抗体とした。

Ｂ型肝炎ウイルスの基礎研究

NTCP発現細胞を用いた初期感染機構の解析

Problems

・Low transfection efficiency

・Poor reproducibility

・Costly and time-consuming

PHH, PTH, HepaRG cells

Aim

・Establishment of more useful cell line for analyzing HBV entry

・multiple transmembrane transporter predominantly expressed in the liver

・mediates the transport of bile acids

・candidate of HBV receptor

2 daysadd G418 3 weeks

HepG2 cells

transfection

Establishment of HepG2-NTCP cells

Evaluation of HBV infection

isolating expandingDetection of NTCP

NTCP

RT-PCR

NTCP

GAPDH

HepG2HepG2

-NTCP

Black：HepG2

Red：HepG2-NTCP

Detection of NTCP

FCM

NTCPcell c

ou

nt

wash out

Myrcludex-B

medium HBs, HBe

HBV

12 days

16 h

cell HBV DNA ,HBc

HepG2 orHepG2-NTCP cells

3 h

Myrcludex-B

HBV infection

HBs in the medium

HB

s (

ng

/ml)

0

10

20

He

pG

2

co

ntr

ol

HepG2-NTCP

He

pG

2

co

ntr

ol

HepG2-NTCP

HBe in the medium

HB

e (

S/C

O)

0

5

10

15

HBV cccDNA

co

ntr

ol

HB

V c

ccD

NA

(10

3c

op

ies

/well)

0

5

10

15

20

rcDNA

dslDNA

ssDNA

co

ntr

ol

Evaluation of HBV infection in HepG2-NTCP cells

HBV DNAs

Myrc

lud

ex

-B

Myrc

lud

ex-B

Myrc

lud

ex

-B

Myrc

lud

ex

-B

Red:HBc

Blue:DAPI

Detection of HBV positive cells

HBc

HepG2-NTCP

(control)

HepG2

(control)

HepG2-NTCP

(Myrcludex-B)

RT-PCR

si-

GA

PD

H

si-

NT

CP

siR

NA

(-)

GAPDH

NTCP

Detection of NTCP

Green：HepG2

Red：si-NTCP

(HepG2-NTCP)

Blue：si-GAPDH

(HepG2-NTCP)

NTCP

FCM

HBs in the medium

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2s

i-G

AP

DH

si-

NT

CP

siR

NA

(-)

0

HB

s (

fold

)

HBc

si-GAPDH si-NTCP

Blue：DAPI

Red：HBc

HBV cccDNA

0

0.5

1

1.5

si-

GA

PD

H

si-

NT

CP

siR

NA

(-)

HB

V c

cc

DN

A (

fold

)

00

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2HBe in the medium

si-

GA

PD

H

si-

NT

CP

siR

NA

(-)

HB

e (

fold

)0

siRNA (-)

HBV infection was mediated by NTCP in HepG2-NTCP cells

NTCP inhibitors

co

ntr

ol

urs

od

eo

xyc

ho

late

ch

ola

te

pro

ge

ste

ron

bro

mo

su

lfo

ph

ya

lein

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

HB

s (

fold

)

Evaluation of anti-HBV compounds in HepG2-NTCP cells

attachment inhibitors

co

ntr

ol

he

pa

rin

de

xtr

an

su

lfa

te

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

HB

s (

fold

)

CsA analogs

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2c

on

tro

l

CsA CsB CsC CsD CsH

HB

s (

fold

)

anti-HBV antibody

co

ntr

ol

an

ti-H

Bs

an

ti-F

LA

G

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

HB

s (

fold

)

Myrc

lud

ex

-B

Myrc

lud

ex-B

Myrc

lud

ex

-B

Myrc

lud

ex

-B

0

1

2

3

4

5

6

fold

red

ucti

on

(fo

ld)

HBs in the medium

treated compounds

reduced HBs protein : (< 1/5 fold) : 6

Selleckchem

(FDA-approved chemical library)

414 compounds

Screening for compounds inhibiting HBV infection

using HepG2-NTCP cells

Summary

・We established HepG2-NTCP cells that were susceptible

for HBV infection

・HepG2-NTCP cells are useful for screening of anti-HBV compounds

Translation

Pregenomic RNA

packaging

- strand

DNAsynthesis

RNA transcription

cccDNA

Virus entry Virus particle secretion

Recycling

buddingER

+ strand

DNA synthesis

3.5kb mRNA

2.4kb mRNA

2.1kb mRNA

0.7kb mRNA

Infectious HBV particle

HBsAg

HBcAg

HBeAg

HBxAg

Viral RNA Viral Proteins

Hepatocyte

Nucleus

Core particle

Hepadnaviral life cycle

核酸アナログ

Mechanisms of cccDNA formation

Mechanisms of virus entry

Hepatitis C virus

Family: Flaviviridae

Genus: Hepacivirus

Virus particle: Enveloped virus, spherical

Virus genome: positive single strand RNA, ~9.6 kb

Stable 2nd structures in 5’ and 3’UTR

Long ORF encoding ~3,000 aa

Virus proteins: 10 proteins processed

by host and viral proteases

Pathogenesis: hepatitis, cirrhosis, hepatocellular carcinoma

metabolic syndrome, etc

ＨＣＶ感染症

感染 肝硬変 肝臓癌慢性肝炎

•日本では100万人の感染者•世界では17,000万人の感染者

慢性化 癌化

ＨＣＶの臨床経過

10-30年•検診による感染者のスクリーニング•より効果の高い治療法の開発

Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療

1.インターフェロンおよびリバビリン

2.約50％の患者に有効（→70-80％へ改善）

3.抗NS3、抗ＮＳ５Ａ薬、抗NS5B薬が開発中

（2011年9月に最初の抗NS3薬が承認）

我が国の年齢別HCV抗体陽性率

初回献血者 節目検診

広島大学 田中純子教授

肝炎ウイルス検査促進

治療促進：医療費助成

節目健診の対象者の約３割しか検査を受けていない

受診者の約１％が検査陽性だが、専門医療機関受診はHBV約６割、HCV約７割と低値、受診したHCV陽性者のうち約３割しかIFN治療を受けていない

肝炎ウイルス検査陽性者

自治体（個人情報）

肝専門医療機関

肝炎ウイルス検査陽性者

自治体（個人情報）

肝専門医療機関

慢性ウイルス性肝疾患患者の情報収集の在り方等に関する研究

研究班

自治体（保健所）

封筒送付（受診勧奨）

同意した肝炎ウイルス検診陽性者

調査票返送医学的な相談

苦情

陽性者の個人情報は自治体が保管

追跡システムの人的・予算負担

アンケート解析結果

肝疾患診療連携拠点病院（分担研究者）

厚労省感染研 事務局

宛名書き以外の事務代行

(1) アンケート用紙(2) 受診勧奨を呼びかける手

紙(3) 肝疾患相談室の相談体

制のリスト(4) 専門医療機関リスト(5) 日本肝臓学会専門医リス

ト(6) 切手付き返信用封筒

切手付き送付用封筒

ナンバーリングした

ナンバーリングした

個々の陽性者の現状を把握

ナンバーリングした

陽性者フォローアップシステム

（１）肝炎検診陽性者の個人情報の取り扱いやフォローアップに伴う

人的・予算的な問題等を解決でき、多くの自治体が導入しやすい

「陽性者フォローアップシステム」の構築が必要

（２）モデル地区での検討により、本システムは有効に機能している

と考えられた。

（３）本システムは、陽性者にオーダーメイドな受診勧奨・情報提供

が可能である。

42

新規抗HCV薬の開発

PolyU/C

5'UTRC NS3

4A 4B NS5A NS5B

3 'UTRE1 E2 NS2

ＨＣＶのゲノム構造

コア蛋白

エンベロープ蛋白

イオンチャンネル

システインプロテアーゼ

p7

セリンプロテアーゼRNA ヘリカーゼ

RNA依存性RNA ポリメラーゼ

RNA結合蛋白、リン酸化蛋白

NS3の共役因子

Membranous webの形成

5BSL3.2 SL2

5’ 3’

EMBO Molecular Medicine 16 SEP 2013 DOI: 10.1002/emmm.201303131

HCVのDAA開発は複製ステップに集中している

Life cycle of hepatitis C virus (HCV)

Entry

Translation Replication

Assembly

Secretion

Attachment

Trafficking

ER

Cytoplasm

Nucleus

Lipid

dropletEarly step

Middle step

Late step

Ｃ型肝炎ウイルスの生活環を標的とした抗ウイルス薬スクリーニング

Huh-7-25 cells, deficient for CD81 expression

Huh-7-25 cells [CD81 (-) cells]

Huh-7 cells

single-cell cloningcount

CD81 expression

Akazawa D et al. J Virol (2007)

Huh-7 (parental )

Huh-7-25

Screening system using Huh-7-25 cells

electroporation

J6/JFH1 RNAcompounds

Huh-7-25 cells [CD81 (-)]

no reinfection3 days

entry, uncoating

translation genome replication

assembly

releaseattachment

budding

ER

LD

cytoplasm

middle to late steps(translation ~ release)

infectivity ?

EMBO Molecular Medicine 16 SEP 2013 DOI: 10.1002/emmm.201303131

新規阻害薬

エントリー阻害薬

抗ウイルス効果が高く副作用の少ない組み合わせが必要

培養細胞由来HCV粒子ワクチンの免疫

によるHCV感染阻害活性の誘導

Lavillette D, JVI 2005

Houghton M Nature 2005

急性Ｃ型肝炎における感染制御と中和抗体

Copyright ©2007 by the National Academy of Sciences

Pestka, Jan M. et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 6025-6030

急性Ｃ型肝炎から回復した患者と持続感染化した患者の中和抗体価

感染性HCV粒子の作製

pJFH1

pJ6CF

pJ6/JFH1

合成RNAをHuh7細胞へトランスフェクション

CellSTACK™（Corning社）による大量培養

培養上清（感染性HCV粒子）

NS3 4B NS5A NS5B

T7

C E1 E2

p7

4A

HCV

IRES

NS2

C E1 E2

Hollow Fiber (500 K MWCO)

diafiltration

60% sucrose

diafiltrated

media

Sucrose

cushion

20% sucrose

Sucrose

gradient

diafiltrated

media

10% sucrose

60% sucrose

28,000 rpm (SW28),

4ºC, 4h

1mL フラクション

① HCV-RNA

② HCV-core

③ infectivity

④ total proteinMethod 1 Method 2

HCVの精製

Electron microscopic analysis of purified HCV particles

50nm50nm

JFH-1 J6/JFH-1

negative staining of purified HCV particles

28k rpm, 4h

4˚C

(SW28 rotor)

HCV-core

HCV-RNA

Infectivity

Total protein

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

density

(g/mL)

HCV-RNA

(copies/mL)

HCV-core

(fmol/L)

specific

infectivity

(FFU/

fmol core)J6/JFH1 (2% FBS)

0.E+00

1.E+02

2.E+02

3.E+02

4.E+02

5.E+02

6.E+02

7.E+02

8.E+02

FF

U /

co

py R

NA

specific infectivityfor HCV-core

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

4.0E+06

4.5E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

HC

V-R

NA

(co

pie

s/m

L)

fraction

HCV-RNA HCV-core

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

total protein

total protein

protein

(mg/mL)

● buoyant density■ specific infectivity

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

4.0E+06

4.5E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

HC

V-R

NA

(co

pie

s/m

L)

fraction

HCV-RNA HCV-coreHCV-RNA

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

4.0E+06

4.5E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

HC

V-c

ore

(fm

ol/

L)

HC

V-R

NA

(c

op

ies

/mL

)

fraction

HCV-RNA HCV-coreHCV-core 系列1proteininfectivity

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

density

(g/mL)

HCV-RNA

(copies/mL)

HCV-core

(fmol/L)

specific

infectivity

(FFU/

fmol core)J6/JFH1 (2% FBS)

0.E+00

1.E+02

2.E+02

3.E+02

4.E+02

5.E+02

6.E+02

7.E+02

8.E+02

FF

U /

co

py R

NA

specific infectivityfor HCV-core

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

4.0E+06

4.5E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

HC

V-R

NA

(co

pie

s/m

L)

fraction

HCV-RNA HCV-core

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

total protein

total protein

protein

(mg/mL)

● buoyant density■ specific infectivity

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

4.0E+06

4.5E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

HC

V-R

NA

(co

pie

s/m

L)

fraction

HCV-RNA HCV-coreHCV-RNA

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

4.0E+06

4.5E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

HC

V-c

ore

(fm

ol/

L)

HC

V-R

NA

(c

op

ies

/mL

)

fraction

HCV-RNA HCV-coreHCV-core 系列1protein

ショ糖密度による分画精製（sucrose cushion）

60%

sucrose

diafiltrated

media

20%

sucrose

HCV-RNA

(x109 copies/mL)

6

5

4

3

2

1

0

6

5

4

3

2

1

0

density (g/mL)

0.0E+00

1.0E+06

2.0E+06

3.0E+06

4.0E+06

5.0E+06

6.0E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

3.0E+09

3.5E+09

4.0E+09

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

HC

V-R

NA

(co

pie

s/m

L)

fraction

HCV-RNA

(copies/mL)

HCV-core

(fmol/L)

6.0E+05

5.0E+05

4.0E+05

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

3.0E+05

2.0E+05

1.0E+05

0.0E+00

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

1200

1000

800

600

400

200

0

infectivity

(FFU/mL)

protein

(mg/mL)

1200

1000

800

600

400

200

0

density (g/mL)

0.0E+00

1.0E+06

2.0E+06

3.0E+06

4.0E+06

5.0E+06

6.0E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

3.0E+09

3.5E+09

4.0E+09

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

HC

V-R

NA

(co

pie

s/m

L)

fraction

HCV-RNA

(copies/mL)

HCV-core

(fmol/L)

6.0E+05

5.0E+05

4.0E+05

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

3.0E+05

2.0E+05

1.0E+05

0.0E+00

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

1.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

bu

oy

an

t d

en

sit

y (

g/m

L)

fraction

J6/JFH1 (2% FBS)

1200

1000

800

600

400

200

0

infectivity

(FFU/mL)

protein

(mg/mL)

infectivity

(x106

FFU/mL)

Protein

(mg/mL)HCV-core

(nM)

0.0E+00

1.0E+06

2.0E+06

3.0E+06

4.0E+06

5.0E+06

6.0E+06

0.0E+00

5.0E+08

1.0E+09

1.5E+09

2.0E+09

2.5E+09

3.0E+09

3.5E+09

4.0E+09

HC

V-c

ore

(fm

ol/L

)

HC

V-R

NA

(co

pie

s/m

L)

fraction

4

3

2

1

0

HCV fraction

Buoyant density (g/mL)

マウス(BALB/c, n=3)免疫スケジュール

Sample

1．Saline

2．Sucrose Cushion J6/JFH-1 (2 pmol HCV-core／head)

3．Sucrose Cushion J6/JFH-1 (5 pmol HCV-core／head)

4．Sucrose Gradient J6/JFH-1 Frac 6 (2 pmol HCV-core／head)

5．Sucrose Gradient J6/JFH-1 Frac 8 (2 pmol HCV-core／head)

Serum

(pre)

Serum

(1w)

Serum

(3w)

Serum

(5w)

Serum

(7w)

Adjuvant：Sigma Adjuvant system (MPL)

5wks,♀

i.p. i.p. i.p. i.p.

HCV感染阻害活性の評価 (HCVpp)

精製HCV粒子免疫マウス血清は異なる遺伝子型のHCV

感染阻害活性を示した

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6

0

20

40

60

80

100

120

140

1 2 3 4 5 6

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6

J6CF (genotype 2a) H77 (genotype 1a) TH (genotype 1b)

cushion gradient cushion gradient cushion gradient

mean±SEM

Infe

cti

on

%

マウス血清 1:100 での感染阻害活性

IgGの精製と HCV感染阻害活性の測定

15

20

25

37

50

75100150250

MW

(kDa)

IgG-H

IgG-L

IgG concentration (mg/mL)

0

20

40

60

80

100

120

140

0.1 1 10 100 1000

%in

fec

tio

n

IgG concentration (mg/mL)

normal IgG

G8-1 mouse IgG

anti-CD81 Ab

normal IgG

Immunized mouse IgGa-CD81

HCV(J6/JFH-1) inhibition

HCV粒子免疫マウス血清由来 IgG は感染中和作用を示した

Infe

cti

on

%

0

20

40

60

80

100

120

1 10 100 1000

IgG concentration (mg/mL)

%in

fec

tio

n

Cont-IgG

iHCV-IgG (pre)

iHCV-IgG

(absorbed)iHCV-IgG (ori)

Inhibitory effect of E1E2-absorved iHCV-IgG in vitro

HCV protection assay using uPA/SCID mice

HCV challenge（uPA/SCID）1． J6/JFH-1HCVcc+control IgG

2． J6/JFH-1HCVcc+immunized mouse IgG

BALB/cマウス

iHCVi.p. IgG

i.p.

Ab induction（BALB/c）1．Saline

2．Sucrose Cushion J6/JFH-1 (2 pmol HCV-core／head)

Adjuvant：Sigma Adjuvant system (MPL)

Serum Purified

IgGHCVcc

Mixed with IgG i.v.

Serum HCV RNA titration by RTD-RT-PCR after HCVcc （10^3 copy/head) inoculation

Group Day 0 Day 7 Day 14 Infected mice

IgG from Vaccinated mice

Exp 1 ND ND ND 0/6=0%

ND ND ND

ND ND ND

Exp 2 ND ND ND

ND ND ND

ND ND ND

IgG from control mice

Exp 1 ND 3.8x10^6 copy/ml 4.7x10^5 copy/ml 4/6=66.7%

ND 1.3x10^7 copy/ml 2.9x10^6 copy/ml

ND ND ND

Exp 2 ND 3.6x10^5 copy/ml 1.8x10^6 copy/ml

ND ND ND

ND 2.7x10^5 copy/ml 3.1x10^6 copy/ml

HCV protection assay using uPA/SCID mice

• HCV粒子を限外濾過膜およびショ糖密度遠心で、高純度に精製した

• 精製HCV粒子の免疫マウスの血清には抗エンベロープ抗体が誘導され、HCV感染阻害活性も有していた．また精製IgGには感染中和活性をみとめた

• HCV粒子は組換えE2タンパク質よりも抗体誘導能が高い

• ヒト肝細胞キメラマウスによる感染防御実験により、生体での感染防御抗体を誘導したことが示唆された

まとめ