단백질 분석

Outline

1. 단백질 정제는 단백질 기능을 이해하는데 꼭 필요한 단계임

2. 아미노산의 순서가 어떻게 단백질을 구성하여 개개의 단백질이 특수한 기질, 분자들과 결합하여, 어떻게 촉매 작용을 매개하며, 어떻게 에너지와 정보를 변환하는 것을 배우는 것임(생화학의 목적)

The Purification of Proteins(단백질정제) Is an Essential First Step in Understanding Their

Function

-Proteins must be released from the cell to be purified(단백질은 세포에서부터 얻어져야 함) -원심분리법(differential centrifugation): 밀도가 더 큰 물질은 밀도가 덜 큰 물질보다 침전하는 원심력보다 더 높다

염석법: 수많은 단백질 중에서 일정 염농도에서 침전되거나 아직 solution상태에 있는 단백질을 획득하는 방법. 사용하는 염은 Ammonium sulfate를 서서히 solution상태에 있는 단백질 샘플에 넣어주어 일정 농도가 될 때까지 넣어주어 원하는 농도에서 침전되거나 아직 침전되지 않은 상태의 단백질 용액을 얻어냄 다음 단계인 투석법 넘어감.

the coagulant used is nigari, which is a sea water precipitate rich in minerals such as magnesium and calcium chlorides. But modern manufacturers use either calcium sulfate or magnesium chloride

Proteins can be purified according to solubility, size, charge, and binding affinity (단백질은 용해도, 크기,

전하, 결합 친화성에 의해 분리 될 수 있음)

투석 (Dialysis) 셀룰로오스 막의 구멍보다 더 큰 단백질은 내부에 남게 됨. 더 작은분자들과 이온들은 막의 구멍을 통과하게 됨

Gel-filtration chromatography

혼합물 중 각 성분이 이동상(移動狀)(기체 ,액체)과 정지상(停止狀)(Column,

Affinity에 분배되는 정도의 차이로 각각 분리되는 분리 분석법. 흔히 기체 및 액체

크로마토그래피로 나눈다.

Ion-exchange chromatography

단백질의 양이온과 음이온에 대한 차이로 분리 가능

카르복시메틸 디에틸아미노에틸

음으로하전된단백질은

흘러지나감

Affinity chromatography (친화크로마토 그래피)

많은양의 glucose는 붙어있는 단백질을 분리 시킨다

High-pressure(performance) liquid chromatography

고압액체크로마토 그래피:압력을 가해 단백질을 대롱을 통과시키고 220 nm 에서 검출함

1) Solvent reservoirs, 2)Solvent degasser, 3) Gradient Valve, 4) Mixing vessel for delivery of the mobile phase, 5) High Pressure pump, 6) Switching valve in “injection position”, 7) and “load position, 7)Sample injection loop, 8)Pre-column, 9)Analytical column(affinity, ion, size), 10)Detector (UV), 11)Data Acquisition, 12)Waste collector

Polyacrylamide gel electrophoresis.

Gel electrophoresis

메틸렌비스아크릴아미드

Sodium dodecyl sulfate, SDS(황산도데실 나트륨)

The Coomassie dyes bind to proteins through ionic interactions between dye sulfonic acid groups and positive protein amine groups as well as through Van der Waals attractions

Coomassie blue

Small proteins move rapidly through the gel, whereas large proteins stay at the top, near

the point of application of the mixture.

Figure 3.9 Staining of protein after

electrophoresis.

Isoelectric focusing(등전점전기이동)

Figure 3.12 Two-dimensional gel electrophoresis.

(A) (B)

Two-dimensional electrophoresis(이차원전기이동)

Figure 3.13 Alterations in protein levels detected by two-dimensional gel

electrophoresis. 글리세르알데히드 3 인산 탈수소 효소의 증가

Amino Acid Sequences of Proteins Can Be Determined Experimentally(아미노산의 순서를 실험적으로

결정할 수 있다)

1. 원하는단백질의 아미노산 순서를 알고 단백질간의 유사성을 알 수 있다

2. 단백질의 기능을 예측 할 수 있다.

Figure 3.17 Repeating motifs in a protein chain.

Figure 3.18 Determination of amino acid composition.

Peptide sequences can be determined by automated Edman degradation

(에드만분해법) Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly (6M HCl에서 24시간 가열)

이온크로마토 그래피- 흡광도로 측정)

아미노산의 조성은 알 수 있지만 순서는 알 수 없다

펩티드 가수분해물의 용리도

Figure 3.19 The Edman degradation.

Figure 3.20 Separation of PTH-amino acids.

이소티오시안산 페닐

이소티오시안산 페닐이 펩티드의 하전되지 않은 말단의 아미노기와 반응하여 페닐티오카르바모일 유도체 형성후 고리형 유도체로 분리(페닐티오히단토인(phenylthiohydantoin))

Ala-Gly-Asp

Proteins can be specifically cleaved into small peptides to facilitate analysis

Figure 3.21 Overlap peptides. Figure 3.22 Disulfide-

bond reduction.

요오도아세트산

디티오트레이톨(과량)

chymotrypsin

trypsin

Figure 3.34 MALDI-TOF mass spectrometry.

Mass Spectrometry Is a Powerful Technique for the Identification of Peptides and

Proteins

Figure 3.35 MALDI-TOF mass spectrum

of insulin and β-lactoglobulin.

The mass of a protein can be precisely determined by mass spectrometry

Figure 3.36 Peptide sequencing by tandem mass spectrometry.

Peptides can be sequenced by mass spectrometry

헬륨, 아르곤 비활성 원자로 펩타이드 사슬을 쪼갤 수 있다

Figure 3.37 Proteomic analysis by mass spectrometry.

Individual proteins can be identified by

mass spectrometry