優秀発表賞

状

殿

あなたは日本薬学会第一三三

年会において優れた研究発表

を行いました

よってこれを表彰し、優秀発

表賞を授与します

平成二十五年三月三十日

日本薬学会第一三三年会

組織委員長

松木則夫

南 知尋

質量分析計を用いた神経細胞接着分子 L1 (L1CAM) の糖鎖修飾構造の解析

Mass spectrometric characterization of the glycosylation sites and pattern ofneural cell adhesion molecule L1 expressed in murine brain

○ 南知尋, 渡邊正知, 伊藤康一 (徳島文理大学・香川薬学部・薬物治療学)○ Chihiro Minami, Masatomo Watanabe, Kouichi Itoh

(Lab of Mol & Cell Neurosci Kagawa Sch of Pharmaceutical Sci Tokushima Bunri Univ )

29pmC-215

結果

(Lab of Mol & Cell Neurosci, Kagawa Sch of Pharmaceutical Sci, Tokushima Bunri Univ.)

要旨【目的】神経細胞特異的に発現する神経細胞接着分子 L1 (L1CAM) は、細胞接着・細胞移動・軸索伸長・軸索線維束形成など脳の高次構造形成過程において重要な役割を担う。その機能調節には L1CAM の糖鎖修飾構造の関与が示唆されているが、詳細な構造は未だ不明である。そこで本研究では、質量分析計を用い、L1CAM の糖鎖修飾部位および糖鎖修飾構造の同定を目的とした。【方法】1. 糖鎖結合部位の同定: マウス脳ホモジネートから免疫沈降によりL1CAMを精製した。糖鎖を含む L1CAM ペプチドは、トリプシンにて消化後Sepharose CL-4B を用いて精製した。糖鎖結合部位は、MALDI-TOF (AXIMA-CFRplus), MALDI-QIT/TOF (AXIMA-QIT) にて解析した。2. 糖鎖構造の同定: L1CAMの糖鎖は、Peptide-N-glycosidase F にて消化後、BlotGlyco (住友ベークライト)にて還元末端をラベル化し精製した。精製した糖鎖の構造は、質量分析計にて解析した

L1CAM の糖鎖結合部位の同定

L1CAM の糖鎖修飾構造の同定

Sepharose CL-4B(4% 架橋アガロース)

L1CAM tryptic fragments

+

L1CAM glycopeptides

(A)

(B)

Sup

Ppt

(B) 1664.35 m/z の MS2 スペクトル

651 06

(A) L1CAM の糖鎖の MSスペクトル

1664.4

2403.1

2216.82257.1

2606.1 2768.1

0

50

100

Inte

nsity

(%)

1000 1500 2500 3000 3500 4000m/z

2000

★

★

★★

★ ★

背景と目的

析した。【結果及び考察】1. 糖鎖結合部位: 精製した糖ペプチドの MS2 解析を行ったところ、N 結合型糖に特徴的な環開裂ピークが認められた。次に、コアペプチドのMS3 解析を行い MASCOT 検索を行ったところ、L1CAM 473FFPYANGTLSIR484 として同定された。さらに、コア+83m/z の MS3スペクトルを解析したところ、y イオンおよび b イオンともに環開裂に起因するシグナルシフトが認められた。以上より、免疫グロブリン C2 様ドメイン構造内にある Asn478 に N 結合型糖鎖が結合していることが明らかとなった。2. 糖鎖構造: 精製した糖鎖の MS2 解析より、マウス脳内に発現する L1CAM は複数の複合型糖鎖とハイマンノース型糖鎖によって多様な翻訳後修飾を受けていることが明らかとなった。本知見より、L1CAM 糖鎖構造の詳細なプロセシング過程および関連する酵素群が推測可能となり、今後の糖鎖構造解析に有用な情報をもたらすことが期待された。

1984 年 R thj と S h h によ て発見されNH2

0

50

100

Inte

nsity

(%)

2084.21

2255.36

1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000m/z

(A) L1CAM の Trypsin 消化断片の MS スペクトル

トリプシン消化ペプチド由来のピーク

(C) 2216.77 m/z の MS2 スペクトル

0

50

100

Inte

nsity

(%)

1000.40

1486.64

797.37

1851.64651.31

1689.74 2054.80

203 203162 162 162 162146 203 162

★

（複合型）

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700m/z

0

50

100

Inte

nsity

(%) X5

651.06

448.021502.10

854.02 1178.021340.10

203 203 162 162162 162 162

★ （ハイマンノース型）

(B) Sepharose CL-4B 非吸着分画の MS スペクトル

100

ty (%

)

2084.13

2255.48

ロネ

クチ

ンⅢ

FNⅢ

) 様メ

イン

構造

免疫

グロ

ブリ

ンC

2(Ig

C2)

様ド

メイ

ン構

造

細胞

外領

域

140 kDa

210 kDa

1984 年 Rathjen と Schahner によって発見された神経細胞接着分子 L1 (L1CAM) は、6 個の免疫グロブリン C2 (IgC2) 様ドメインと 5 個のフィブロネクチンⅢ (FNⅢ) 様ドメインからなる細胞外領域、1 回膜貫通領域および細胞内領域から構成される分子量約 210 kDa の細胞接着分子である。また、細胞外領域には 22 箇所の N 結合型糖鎖修飾部位が予測されている (図 1)。

神経細胞特異的に発現する L1CAM は、ホモフィリックあるいはヘテロフィリックな結合を介して、細胞接着・細胞移動・軸索伸長・軸索線維束形成など脳の高次構造形成過程において重要な役割を担う(Fields and Itoh, Trends Neurosci, 1996)。それゆえ、L1CAM の機能・発現異常 (IgC2 様ドメイン領

域におけるミスセンス変異によるホモフィリック結合能の欠損や FNⅢ様ドメイン領域におけるミス

NH2

SS|

SS|

S|

SS|

SS|

SS|

S

ⅢⅢⅢⅢ

(E) 2403.14 m/z の MS2 スペクトル

100

%)

X2797.07

146203162203203 203162 162 162146

162

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

(D) 2257.11 m/z の MS2 スペクトル

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

50

100

Inte

nsity

(%)

797.07

651.05

1000.041689.071162.00

1324.03

1892.192054.10

203162203203 203162 162 162146

★

（複合型）

0

50

Inte

nsit

1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000m/z

(C) Sepharose CL-4B で精製した糖ペプチドの MS スペクトル

0

50

100

Inte

nsity

(%)

1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000

1468.81

2601.90

1588.87

糖ペプチド由来のピーク

m/z

★

2 クト

2601.53

方法L1CAM の精製

12-16 週齢の雄雌マウス (ICR, 35-45 g) マウスより摘出した脳組織は、0.32 MSucrose を含む 3 mM HEPES NaOH (pH 7 3) buffer にてホモジナイズ 後 細胞質

フィ

ブ ( Fド

メ

細胞

内領

域

80 kDa

合能の欠損や、FNⅢ様ドメイン領域におけるミスセンス変異によるフォールディング異常) は、水頭症などの重篤な脳神経疾患を引き起こす。

細胞接着分子の糖鎖修飾構造は、細胞間の相互作用など分子機能の発現に重要な役割を担う。しかしL1CAM は、糖鎖修飾構造の詳細が未だ不明なため、糖鎖を介した L1CAM機能的多様性はこれまでほとんど報告されていない。

そこで本研究では、脳内に発現する L1CAM の糖鎖結合部位および糖鎖修飾構造の同定を目的とした。

COOH

細胞膜

ⅢⅢ

(G) 2768 08 m/z の MS2スペクトル

(F) 2606.09 m/z の MS2スペクトル

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

50

100

Inte

nsity

(%)

X2

797.08

1000.11 2460.14651.031690.06 1892.12

2095.142257.04

203203203 146203 203162 162 162146 162

★

2244.16

162

（複合型）

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

50

Inte

nsity

(%

2257.151000.09 1892.11651.07

1689.73 2054.08

146203162203203 203162 162 162146

★2241.18

（複合型）

図 1 L1CAM の 2 次構造L1CAM の細胞外ドメインには、N 結合型糖鎖修飾の予測配列 (Asn-X-Ser/Thr)が 22 か所存在する ( )。

X2

y5

★-H2O

PYAN

y6

y7y8

10

473F F P Y A N G T L S I R484

y5y6y7y8

b9

y10y11

50

100

sity

(%)

(E) 1385.68 m/z の MS3 スペクトル 473FFPYANGTLSIR484

(D) 2601.90 m/z の MS2 スペクトル

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000m/z

0

50

100

Inte

nsity

(%)

X10

1385.68

1468.68

2439.85

2115.87

2601.90

1588.72

83 120 203 162 162 162 162 162

環開裂

1791.712277.91

NXS/T

★

★

★

: N-acethylglucosamine

: Mannose

L1CAM の糖鎖は BlotGlyco にて精製・ラベル化した。得られた糖鎖の質量をAXIMA-CFRplus にて分析したところ、複数のピークが検出された (A)。

(A) で検出された代表的な糖鎖ピークのうち、1664.4 m/z (★), 2216.8 m/z (★),2257.1 m/z (★), 2403.1 m/z (★), 2606.1 m/z (★) および 2768.1 m/z (★) それぞれについて、AXIMA-QIT にて MS2 解析を行い、各スペクトルのピーク間隔とその強度から、結合している糖鎖の種類と構造を推定した (B-G)。

Sucrose を含む 3 mM HEPES-NaOH (pH 7.3) buffer にてホモジナイズ 後、細胞質分画 (上清) と膜分画 (沈査) とに分離した。得られた膜分画 (沈査) を、1% NP-40,0.5% Sodium Deoxycholate を含む 20mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer にて可溶化し、膜タンパク質分画とした。 L1CAM は、抗 L1CAM抗体 (pAb-L1Y3) を用いた免疫沈降法により膜タンパク質分画中から精製した (図2)。

L1CAM の 糖 ペ プ チ ド は 糖 鎖 の 親 水 性 を 利 用 し た

210 kDaL1CAM

250

150

100

80

Mr(kDa)

140 kDaL1CAM

IP: anti-L1CAM

250

150

100

80

Mr(kDa)

Input(25 g)

IP: anti-L1CAM

非吸着 溶出

(A) (B)

NH2

(G) 2768.08 m/z の MS2スペクトル

（複合型）

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

50

100

Inte

nsity

(%)

X2

797.06

1000.092403.11

651.04 2257.161892.25

1486.131688.99

2095.13

146 162203203203 203162 162 162146 162 203

★2606.12

146

2622.17

図 2 抗L1CAM抗体による L1CAM の精製マウス脳膜タンパク質分画 から抗

L1CAM 抗体 (pAb-L1Y3) を用いた免疫沈降により L1CAM を精製した。得られたL1CAM は 5% SDS-PAGE にて分離後、抗L1CAM 抗体によるイムノブロット (A) およびSYPRO Ruby 染色 (B) にて検出した。

マウス脳神経細胞に発現する L1CAM は

m/z

(F) 1468.68 m/z の MS3 スペクトル

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 16000

50

100

Inte

nsity

(%) X2

y4 y5

PYAN+83y6

y7+83y8+83

b9+83y10+83

★-H2O**

★

473F F P Y A N G T L S I R484

y5y6y7y8

b9

y10 y4

473FFPYANGTLSIR484

PYA b9y10

y11

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600m/z

0

50

Inte

n ★

1664.4

2403.1

2216.82257.1

2606.1 2768.1

0

50

100

1000 1500 2500 3000 3500 4000m/z

2000

★

★

★★

★★

糖ペプチドの精製精製した L1CAM は、5％ SDS-PAGE にて分離後、トリプシンを用いゲル内で

消化した。トリプシン消化したペプチド断片は、Speed Vac で完全に乾燥させ、Solution A (1-Butanol : Ethanol : DW = 4 : 1 : 1) 100 L にて再溶解した。再溶解したサンプルに Sepharose CL-4B (SIGMA) 10 L を加え、室温で 1 時間激しく攪拌した。Sepharose CL-4B に結合した糖ペプチドは、50% Ethanol 100 L にて抽出した 。抽出した糖ペプチドは、Speed Vac にて乾燥させた後、DW 10 L にて再溶解し質量分析用サンプルとした。

糖鎖の精製糖鎖精製およびラベル化は、住友ベークライトの糖鎖精製キット BlotGlyco (プ

ロトコ ル 部改編) に準じた 精製した L1CAM は トリプシンを用いたゲル内

L1CAM の 糖 ペ プ チ ド は 、 糖 鎖 の 親 水 性 を 利 用 し たSepharose CL-4B を用いて精製濃縮した (C)。

糖ペプチド由来と思われるピーク2601.90 m/z (★) の MS2 解析を行ったところ、 右図に示すような、N 結合型糖鎖結合に特徴的な 83 m/z と 120 m/z間隔の環開裂ピークが認められた (D)。

さらに、環開裂に起因する 1385.68 m/z, 1468.68 m/z の MS3

解析を行った。1385.68 m/z (★) の MS3 解析データを基にMASCOT 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、 L1CAM の473FFPYANGTLSIR484 と同定された (E)。

次に、1468.68 m/z (★) の MS3 スペクトルを解析したところ、y シリーズおよび b シリーズともに +83 の MS シフトが認めら

が が

IP: Rabbit pAb-L1CAM (pAb-L1Y3)1st Ab: Goat pAb-human L1CAM2nd Ab: anti-Goat IgG (HRP-labeled) Detection: Supersignal West Pico

IP: pAb-L1Y3Detection: SYPRO Ruby staining

IgG SS|

SS|

S|

SS|

SS|

SS|

S

ⅢⅢⅢⅢ

: N-acetylglucosamine (203)

: Label (447.22)

Inte

nsity

(%)

1825.61892.6

1988.1

2054.7 2913.03075.3 3382.4

: Fucose (146)

: Mannose (162)

: Galactose (162)

マウス脳神経細胞に発現する L1CAM は分子量 210 kDa として検出される (A, B)。またL1CAM は、3番目の FNⅢ様ドメイン内で内因性の Plasmin や Neuropsin によ

り加水分解されるため、細胞外ドメインで構成される 140 kDa の分子量を呈する (B)。

O

O

CH2OHHO

AcHN

~Asn-X-Ser/Thr~

O

CH2OHHO

AcHN

環開裂

83

120

~~~O

GlcNAc

GlcNAc

GlcNAc の環開裂

: N-glycolylneuraminic acid (307)

MS2 解析によって同定された糖鎖構造（スペクトル上段, B-G）および予想された糖鎖構造（スペクト下段）を AXIMA-CFRplus で検出したスペクトル (A) に帰属させた。

ロトコール一部改編) に準じた。精製した L1CAM は、トリプシンを用いたゲル内消化後、N 結合型糖鎖修飾消化酵素である PNGase F (5 Unit, Roche) を用いて糖鎖を消化した (37℃, over night) 。糖鎖消化反応後、BlotGlyco ビーズ 50 L を添加し、2% 酢酸/アセトニトリルにて糖鎖をビーズへ固相化した。固相化した糖鎖は、500 mM 1-methyl-3-p-tolyltriazene (MTT) にてシアル酸のメチルエステル化処理を行った後、 N-((Aminooxy)acetyl)tryptophanylarginine Methyl Ester (aoWR(H) ) Hydrochloride により糖鎖の回収および糖鎖還元末端のラベル化を行った (図3)。ラベル化された糖鎖は、NuTip Carbon (Glygen) にて濃縮・精製し、質量分析用サンプルとした。

れ、 478Asn に N 結合型糖鎖が結合している事が明らかとなった (F)。

以上より、L1CAM を構成する 5 番目の免疫グロブリン C2様ドメイン構造内にある 478Asn に N 結合型糖鎖が結合していることが明らかとなった。

COOH

細胞膜

ⅢⅢ

糖鎖予想構造

ゴルジ 細胞膜

GlcNAc転移酵素 II

ゴルジマンノシダーゼ II

GlcNAc転移酵素 I

ゴルジマンノシダーゼ IC

ゴルジマンノシダーゼ IB

小胞体

1825.61988.1 1664.4 1892.6

2054.7 2216.3 2257.1

結論

☆糖鎖結合部位解析より

L1CAM を構成する 5 番目の免疫グロブリン C2 様ドメイン構造

内にある 478Asn に N 結合型糖鎖が結合している。

☆糖鎖修飾構造解析より

図 3 aoWRs によるオリゴサッカライドのラベル化反応。ヒドラゾン−オキシム交換反応により、BlotGlyco ビーズから固相化された糖鎖を再遊離させ、同時に糖鎖還元末端を aoWR (H) にてラベルする。

質量分析サンプルを Focus plate (f 600 nm, SIMADZU) にアプライした後、Matrix とし

て 10 mg/mL 2,5- hydroxybenzoic acid (DHBA, SIGMA) in 0.1% TFA, 50%CH3CN を 0.5 L 重層した。完全に風乾させた後、MALDI-TOF (AXIMA-CFR,SIMADZU)、MALDI-QIT/TOF (AXIMA-QIT, SIMADZU) により質量分析を行った。質量分析計のキャリブレーションは、10 pmol 副腎皮質刺激ホルモン (ACTH) と 10pmol アンギオテンシン II (Ang II) にて行った。

質量分析計の測定条件を以下に示す。Exp.Tech.; Tuning mode: positive, Detection Mass Range: 100.0-5000.0.Firing; Power: 50-80, Focus Mass Range: Mid 750 or High 2k.CID; Resolution: Std, Isotopic Selection (~250) , CID Control: 150~250.Peak Processing; Peak width: 1, Smoothing method: off,

Peak detection method: Threshold -25% Centroid.

フコース転移酵素

ガラクトース転移酵素

フコース転移酵素

シアル酸転移酵素

ガラクトース転移酵素

GlcNAc転移酵素 II

GlcNAc転移酵素 II

2403.1 2606.1 2768.1

2913.0 3075.3 3382.4

☆糖鎖修飾構造解析より

L1CAM は、複数種類の複合型糖鎖, ハイマンノース型糖鎖によっ

て多様な糖鎖修飾を受けている。

同定された糖鎖情報から、L1CAM 糖鎖構造の詳細なプロセシン

グ過程および関連する酵素群を図 4 に予想した 。これらは今後糖鎖

構造解析に有用な情報をもたらすことが期待される。

また、今回、ゴルジ体に存在すると考えられるハイマンノース型

糖鎖構造を有する L1CAM が検出された。このことは、L1CAM の機能と糖鎖プロセシングとの関連性を解明する上で、重要な知見と

なることが期待される。

図 4 L1CAM の N 結合型糖鎖修飾におけるプロセシング予想図

今回同定された糖鎖構造と MS ピーク間

隔より予想される糖鎖構造情報をもとに、L1CAM の糖鎖プロセシング及び動態を予測した。

Molecular & Cellular Proteomics 4: 1977–1989, 2005.