数 据 由 B a x t e r BioScience疫苗开发组友情提供。

M a n f r e d R e i t e r和Wolfgang Mundt

工 艺 开 发 , B a x t e r Biomedical研究中心

Orth,奥地利

大规模微载体培养Vero细胞生产流感疫苗

流行性感冒是一种病毒引起的呼吸系统疾病，在人群中导致高发病率

和显著的死亡率。随着20世纪40年代流感疫苗的推广，流感疫苗已经

明显减低了发病率。流感疫苗是三价的，目前的组成含有A型流感病

毒菌株亚型H�N�、H3N2及B型流感病毒菌株。传统用于疫苗生产的流

感病毒在鸡胚内培养。使用这种传统的方法不得不对几百万个蛋胚逐

一接种和收获。生产过程很难自动化、劳动强度大、时间消耗多，且

有污染的可能。

流感病毒能够在多种动物细胞内繁殖, Baxter公司专注于Vero细胞，

一种可传代的猴肾细胞，其特征如表1所述。

表1.Baxter的Vero细胞平台背景资料

来源:

细胞库:

从ATCC (美国典型微生物菌种保藏中心) 获得的非洲

绿猴 (Cercopithecus aethiops) 肾细胞ATCC CCL8�，�988年，传代数为�24

MCB (主要种子细胞库) 传代数为�28(全面检测为无致

瘤性、无外源因子，同源一致性/遗传学稳定性)

WCB (工作种子细胞库) 传代数为�33标准质量控制检测项目：

- 细菌和真菌无菌检测

- 支原体

- 外源因子

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Vero细胞在过去的二十多年里已获准用于生

产人用疫苗 (例如脊髓灰质炎和狂犬病疫苗)。

虽然Vero细胞对多种病毒敏感，可是最初流

感病毒在Vero细胞上的努力失败了 (�，2 )。Baxter Healthcare现已开发出一种能够生产高

效价的季节性流感和禽流感人用疫苗的技术

(表2 )，也可以生产大多数其他的人用和兽用

疫苗 (表3)。在文献 (3，4，5) 中描述了Vero细胞技术用于疫苗开发和生产的原理和前景。

大流行流感疫苗制备禽流感病毒 (H5N�) 向人类的快速传播和蔓延

已经在世界上引起对新流行性病毒的恐慌，

更加担心流感疫苗生产方法和能否快速生产

和储备出足够的疫苗。Baxter现已开发出一种

成熟稳定并且灵活的生产策略，它使用生长

在Vero细胞中的野生型病毒。野生型全病毒

疫苗诱导和加强包括细胞免疫H5N�特异性免

疫应答 (在H5N�特异性应答中，疫苗中不含有

PR8、核蛋白和膜蛋白)。我们的大规模生产数

据证实了在短期内快速、高产量地生产大流

行流感疫苗是可行的。

表2.Vero细胞不同流感病毒株的血凝素效价

亚型宿主病毒株血凝素单位HAU

H�N�

人类 A/PR/8/34 256

人类 A/USSR/90/77 256

猪 A/Swine/�976/3� 256

鸭子 A/Duck/Bavaria/2/77 256人类 A/Singapore/�/57 �28H2N2人类 A/Hong Kong/�/68 �28

猪 A/Swine/HongKong/3/76 �28

猪 A/Swine/HongKong/�27/82 256

鸭子 A/Duck/HongKong/24/75 256

H3N2

鸭子 A/Duck/Singapore/3/97 256H5N3家禽 256H7N�家禽 A/Quail/Hongkong/G�/97 �28

人类 A/Hongkong/�073/99 256H9N2

人类 A/Vietnam/��94/2004 �024

人类 A/Vietnam/�203/200 �024

人类 A/SP83/2004 (Thailand) 5�2

人类 A/Indonesia/05/2005 �024

家禽 A/Turkey/Turkey/�/2005 �024

家禽 A/Chicken/Egypt/3/2006 �024

H5N�

微载体辅助大规模Vero细胞技术驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血

清无蛋白培养基内生长。带有详细传代记

录的Vero细胞冻存管被复苏；并传代到T形

瓶和滚瓶中，生产出足够数量的细胞以接种

Cytodex™3微载体生物反应器。细胞汇合后，

细胞按照大约�:7的比例传代到后面的生物反

应器。最终的细胞密度在2-3×�06/ml。中试

生产中最终的生物反应器规模是�200升。包

括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以

进一步放大到生产体积为6000升。在所有的

生产开发过程中，从小量实验生物反应器到

临床和商业化的生产用反应器，Vero细胞表

现出相同的工艺水平 (表4)。

表3.Vero细胞对不同病毒的敏感性

流感病毒 (粘病毒)

天花ACAM-2000 (痘病毒)

SARS CoⅤ (冠状病毒)

肝炎A病毒 (小核糖核酸病毒)

Ross River病毒 (α病毒)

日本脑炎病毒 (黄病毒)

西方尼罗河病毒 (黄病毒)

Chikungunya病毒 (α病毒)

病毒:

表4.在Cytodex3上的Vero细胞工作体积和传代水平

接种细胞 0.2 0.2* 0.2* 0.2* �38

第一个生物反应器 0.7 2.0 24 �20 �39.5

第二个生物反应器 4.6 �4.3 �70 950 �4�

第三个生物反应器 32 �00 �200 6000 �42.5

体积(L) 传代数

*多个滚瓶

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A B C

图1.在�20L (A)、950L (B) 和6000L (C) 反应器中Cytodex 3 微载体上生长的Vero细胞。

Vero细胞大规模生产潜能

贴壁依赖性Vero细胞生长达到很高的细胞数，最大规模6000

L的批次培养能获得�.8×�0�3个细胞。商业生产中使用多个并

行的生物反应器。Vero细胞在不同规模的生物反应器内贴附

在Cytodex 3微载体上生长的照片如图1所示。

Vero微载体细胞培养工艺放大到最大的生产规模中验证有

效，测定了代谢参数如残留葡萄糖和氧消耗速率图。图2提供

了连续运行的实例。

0

2040

60

80

�00�20

�40

�2 36 60

IB/SD97/O/03/07

IB/SD97/O/03/�0

IB/SD97/O/03/�4

00,5

��,5

22,5

33,5

44,5

5

0 � 2 3 4 5 6

IN/O/03/05IN/O/03/06IN/O/03/07IN/O/03/08IN/O/03/09IN/O/03/�0IN/O/03/��IN/O/03/�2IN/O/03/�3IN/O/03/�4IN/O/03/�5

A B

葡萄糖(第三个发酵罐)

葡萄糖[g/l]

天

％OU

R

耗氧速率

时间(小时)

图2.在最终生产规模为6000升时Vero细胞培养的代谢图。(A) 在多轮运行的灌注培养中代谢的葡萄糖浓度，(B) 在病毒

繁殖期的相对氧消耗速率。

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A B C

图3.大规模流感病毒生产中细胞病变影响图片。(A) 未感染的细胞，(B) 早期细胞病变影响，(C) 收获前的晚期细胞病变。

大规模流感病毒生产工艺为生产病毒，使用�42.5代数的Vero细胞接种不同的病毒株，

MOI为 0.0�TCID50/细胞。病毒吸附�小时，然后加入胰酶并在

32℃－35℃下进一步孵育48-72小时。大流行流感疫苗和季节

性流感疫苗的病毒株都能在这些条件下生长。病毒生产动力

学和细胞病变效应的评估 (图3) 使得我们能够建立一个稳定的

且可重复的生产工艺。

大流行流感和季节性流感疫苗的生产工艺用于生产的病毒株的准备是关键的一步。病毒扩增按三步进

行，命名为病毒种子库、工作库和生产库。这使得我们可以确

保一种为商业生产持续和长期的病毒供应。最后，生产病毒库

被用于感染6000升规模的生物反应器生产，紧接着进行许多

已经建立完善的下游单元操作 (图4)。

在滚瓶中的接种准备（代数�33－�38）

在Cytodex3微载体上的细胞扩增（生物反应器步骤�、2、3）

病毒繁殖（裂解过程）

细胞分离（收获）

灭活（福尔马林和UV）

蔗糖梯度纯化（纯化－�）

超滤洗滤（纯化－2）

制剂和填充（多种菌株混合）

图4.Vero细胞流感疫苗生产

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A B C

图5.流感疫苗生产的大规模生产区域。(A) 细胞培养 (B) 离心分离，(C) 超滤、洗滤。

微载体上汇合了的Vero细胞，用不同的亚型

病毒株感染，再培养2-3天。用连续流离心收

获和细胞分离澄清，上清液中含有病毒。活

病毒用福尔马林处理并应用UV照射进行第二

步灭活步骤。灭活的病毒进一步通过连续的

蔗糖密度离心纯化 (纯化-�) ，去除可溶性的宿

主细胞蛋白。这中间产物称为纯化的病毒，

并含有大约42%的蔗糖浓度。超滤减少蔗糖浓

度并完成精细纯化 (纯化-2) 。这步的最终产物

称为单价疫苗。最后不同的单价疫苗被无菌

混合制剂和填充成最终的疫苗针剂。在图5中显示6000升规模的发酵、离心和超滤的生产

区域。

Vero细胞季节性和大流行流感疫苗的临床实验数据

Vero细胞季节性流感裂解苗和野生型大流行流

感全病毒疫苗已经成功地通过了临床试验。

裂解疫苗最常用于季节性流感疫苗生产。

Baxter研究的大流行H5N�疫苗，目前在欧洲

已上临床Ⅲ期，使用全病毒工艺进行开发。

Vero细胞H5N�全病毒疫苗的是安全的，且在

使用550个对象的试验Ⅰ/Ⅱ期研究中有极好

的耐受性图。低至3.75 μg或7.5 mg剂量的疫

苗就有高的免疫原性并显示出交叉中和抗3价毒株 (香港/�56/�997) 和一种最近的2价毒株

(印度尼西亚/05/2005)。

使用季节性候选裂解病毒疫苗在欧洲临床试

验Ⅰ/Ⅱ期研究中得到的数据显示出很强的抗

体应答和良好的耐受性。设计了多中心研究

来评估候选疫苗在对象中的安全性和免疫原

性，大约有940个年龄分布在�8-49岁和50岁以上之间的对象。在�8-49岁年龄的对象人口

中，99.6%的对象获得针对病毒毒株H1N1和

H3N2的保护性抗体水平，92.9%获得针对B毒株的抗体。在50岁以上的人口中，96.6%的

对象获得针对病毒毒株H1N1的保护性抗体水

平，73.3%获得针对B毒株的抗体。

概要相对于传统的基于鸡蛋孵育的技术，用微载

体Vero细胞技术生产流感病毒疫苗具有许多优

点。我们已经示例证明了不光是Vero细胞培养

工艺而且包括相关的失活和纯化步骤的成功的

放大。使用一个Vero细胞种子和工作细胞库系

统使得细胞接种培养不需要推迟就可以进行准

备。放大达到多个6000升生物反应器提供了

两次流感爆发之间病毒的稳定的高产量生产，

并能够对出现的全国流行性病毒变异株作出快

速的反应。在随后和Marc van Regenmortel博士会面讨论关于疫苗工业所面临的挑战中，将

讨论生物传感器对新疫苗开发和生产的贡献。

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