식물생명공학 유전자 분석의 Tool

조 준 형 교수

Dept. of Biological & Environmental Science

상영바이오관 4층 403

Lab of Plant Resources & Biotechnology

생물의 기본단위인 세포는 다양한 종류의 biomolecule 로 이루어져 있다.

식물세포의 경우 아래 물질로 구성.세포벽 : 다당류 셀룰로스 등세포막 (세포 소기관 막) : 인지질리보좀 및 효소 : 단백질유전물질 : 핵산(뉴클레오타이드)

생물학적 유전정보를 갖는 물질은 DNA 혹은 RNA 등의 nucleotide 이며,이들 의 발현에 의해 단백질 (Protein)이 만들어 진다.

핵산은 생물개체의 유전적 정보(genetic information)를 담고 있으며, 생물간의 유전적 차이를 알아보거나, 유전자 발현에 의해 만들어지는 단백질에 대한 연구를 위해 전기영동기술이

필요하다.

Tools for BioTechnology

-Preparation of DNA & Electrophoresis-

Bio-molecule의 화학적 구조적 이해 (DNA 와 Protein)

Bio-molecule 분석을 통한 유전정보의 이해

분석방법의 원리와 결과의 해석

생물간의 유전적 차이 연구 : 유전자 단편의 차이 구명단백질의 서열차이 구명

유전자의 기능 및 발현산물의 연구 : 형질전환 기술 확립도입유전자의 확인, 발현 구명유전자 발현산물(final product) 연구유전자 발현에 의한 형질의 특성변화연구

목적

Extract DNA from the Plant Cell

Extract DNA from the Plant Cell

세포 (구성 : Carbohydrates, Lipids, Proteins, & Nucleic acids)

세포의 biomolecules는 종류에 따라 불용성 또는 수용성

1. 세포의 파괴 막자사발, 액체질소(-196C’)

2. 세포 내 물질의 용출 추출용액 (SDS, CTAB 세포벽, 세포막 분산, 단백질파괴)

SDS, CTAB extraction buffer 이용

Detergent

CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide)

SDS (Sodium dodecylsulfate)

3. Phenol/Chloroform treatment

4. Centrifugation 12,000 rpm

5. Supernatant

6. Ethanol precipitation

7. RNase

단백질 제거

세포 찌꺼기와DNA의 분리

DNA만 있는 부분

ETOH 에 의한DNA 응결(침전)

RNA 제거

당, 단백질, 셀룰로스, DNA, RNA

세포 찌꺼기, cellulose 등

DNA가 있는 상등액

단백질 등이 녹아있는페놀용액

DNA 농축 Ethanol 침전법 다량의 DNA일 경우 직접 건져내거나 원심분리

DNA 농도 정량

10. PCR 분석 (10-50ng/rxn) Southern blot (1-5ug/rxn)

8. Ethanol or isoprophyl alcohol

9. TE buffer

DNA 응결

DNA희석 보관

DNA 분석

Extract DNA from the Plant Cell

Collect Plant tissue(leaves, shoot, root)

Grind the Plant tissues with Liquid nitrogen

Treat Extraction Buffer containing CTAB or SDS for 30 mins. at 55’C

Centrifugation at 12,000xg and take the supernatant(=upper aqueous phase)

Extraction bufferPlant tissue

Extraction bufferPlant tissue

DNA, protein / buffer

Grind Plant tissue

Eliminate Carbohydrates

SDS 또는 CTAB대신 가정용 세제 이용

1. 찬물 1컵, 소금 ¼티스푼 믹서로 간다

2. 커피필터 또는 헌스타킹으로 식물조직 걸러내고용액만 모은다.

3. 걸러진 용액에 세제희석액 (물:세제=4:1, 1/5컵)넣고 잘 혼합한 후 5분간 방치

4. 용액을 시험관에 1/3 정도 담아 60-70도 뜨거운 물에 15분간,찬물에 5분간 넣어둔다.

5. 차가운 알코올을 동량 혼합한 후 아주 천천히 흔든다.

6. 유리막대로 DNA를 건져낸다.

Liquid Nitrogen (-196’C) 대기압력하에서 -196도

물은 서서히 어는 과정에서 얼음입자에 의해 세포를 파괴한다. 액체질소에 의한급속한 세포의 동결은 세포내 얼음결정에 의한 세포파괴를 막거나, 세포내 물질(효소)등의 활성을 급속히 정지시킬 수 있다. 세포의 장기저장에 이용된다.

강력한 inonic detergent (세정제, 계면활성제)

세포막을 분산시키고 단백질을 파괴하는 기능

= 25 : 24 : 1

Phenol / Chloroform : 두 물질은 잘 섞이며, 단백질 제거에 쓰인다.Iso-amylalcohol : 거품방지, 넣지 않아도 무방

EtOH 이용한 DNA 침전시

DNA가 엉기는 작용을 도움즉, DNA 순도증가 역할

추출용액에 의해 파괴된 세포벽 파편, 지질성분 들을

원심력에 의한 중력 힘에 의해 침강시키는 역할

Rpm 단위는 분당 rotor의 회전 속도를 의미하며,Xg 값은 중력의 몇 배임을 나타내는 단위이다동일 속도로 회전하는 rotor라 할 지라도 지름이 큰 경우 g(중력값)이 크다

12,000rpm

3,000rpm

Rotor 크기에 따라속도와 중력가속도(g)값이 달라진다.

원심분리기의 이용 : 원심분리기는 세포의 침전, 시료의 침전 뿐만 아니라밀도구배에 따른 세포 내 biomolecule을 구분하여 분리 정제할 수 있다.

박테리아세포의 침전

CsCl DNA 분리

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Mix with Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (24:1) for 1min by inversion

Centrifugation at 13,000rpm and take the supernatant

Add Ammonium (potassium or sodium) acetate (50ul) and equal volume (500ul) of cold absolute EtOH

Gentle mix by inverting tube & take the DNA pellet

Eliminate Proteins(단백질제거)

Collecting DNA

세포 찌꺼기, cellulose 등

DNA가 있는 상등액

단백질 등이 녹아있는페놀용액

에탄올에 의한 DNA 침전식물 엽 조직 7ml벼의 경우 약10매

500ng=0.5ug/ul

에탄올 침전법 원리 : DNA 는 음전하이며, 물에 녹아있는 상태Na+ 또는 K+등으로 음전하를 blocking 하여 물에 녹지않게 하고, 에탄올은 물과 DNA 사이의 수소결합을 끊어주는 역할을 한다

Bio-molecule : DNA의 구조

Phospho-diester 결합

DNA의 구조

Na+

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

Na+

Na+

Na+

Na+Na+

Na+

Na+

Na+

DNA 분석

DNA의 정량

UV/VIS spectrophotometer 분광광도계의 이용

260nm260nm/280nm의 빛으로 시료를 투과시켜 농도를 측정. 260nm는 DNA의 퓨린과 피리미딘 링구조에서 최대 흡광율을 보인다. 자외선인260nm에서 1의 측정값을 얻었다면 DNA 이중나선 50ug 양이다. 반면 단백질의 경우 280nm에서 최대 흡광율을 보인다. 추출한 DNA 시료의 흡광도를 측정하였을 때260/280nm에서의 비율이 1.8 미만이면 DNA이 단백질 등 이물질이 혼합된 경우이다.

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(1) Bio molecule은…

고유의 크기와 모양이 있다.

그리고, … 고유의 양가(+) 혹은 음가(-)의 전하(electric charge)을 갖는다.

(2) 초등학교 때 배운 물질의 분리

분필

용매 물

분필의 체 거름 현상

분자 크기에 따른 물질의 분리

모세관 현상에의한 물의 이동

체거름 효과(Sieve Effect)

전기 영동 원리

크로마토 그래피와 전기영동의 기본원리

동일한 용매의 이동 (크로마토 그래피) 또는

동일한 전기장 (전기영동) 조건에서

동일한 시간에 분자의 크기 및 모양에 따라

체거름 효과에 의해 biomolecule을 분리

전기영동(electrophoresis)은 …

Gel 상의 구멍에 의한 체거름 효과

DNA혹은 Protein(단백질)을 크기 별로 구별할 수 있는 실험방법이다. 전기영

동 시 Gel은 DNA나 Protein이 지나가는 도로 역할을 며, Gel에는 미세한 구

멍이 존재한다.

이러한 구멍의 크기는 gel을 만들 때 gel의 주성분 함량조절로 바꿀 수 있다.

즉, 이러한 구멍의 크기로 인해 고유의 크기(분자량)를 갖는 biomolecule 들

은 일정 시간 내에 도달하는 거리가 달라지게 된다. 이를 체거름 효과라 한

다.

전기장과 분자량에 따른 전기영동 이동거리

DNA나 Protein은 각각 (-) 또는 (+) 전하를 띠므로 전기영동 시 gel의 한 끝지점

에 샘플을 로딩한 후 전기장을 걸어주면 bio-molecule 들은 서로 다른 전하를 향

해 움직인다.

이러한 특성을 이용해 DNA나 Protein은 gel상에 존재하는 여과구멍에 의해 이동

거리가 달라진다. 즉 샘플의 크기가 작을 수록 구멍을 통과할 수 있는 속도가 빨

라져서 멀리까지 가게 되며, 클 수록 이동하는데 많은 시간이 걸리게 된다.

분자의 모양에 따른 전기영동 이동거리

또한, 분자의 크기 뿐만 아니라 모양에 따라서도 이동 거리가 달라진다.

동일 분자량인 경우 linear형태이냐, circular형태이냐에 따라 이동거리가 달라지

는데, circular 또는 globular 형태가 linear형 보다 더 멀리 이동될 수 있다.

Gel 대신 paper를 이용한 전기영동의 원리

전기영동 시 분자 이동에 관련된 factor 들…

분자량 Protein의 경우 (달톤, dalton)

DNA 의 경우 (베이스 페어, base pair)

분자의 모양 Protein의 경우 3차원 구조의 특징에 따라 다름

원형 구조, 선형구조

DNA 의 경우 linear, circular, or open frame…

Electric charge Protein의 경우 (+) or (-)

DNA 의 경우 (-)

Gel의 종류 starch, agarose, polyacrylamide gel… etc

Gel의 농도 pore size를 결정

전기영동 kit 모양에 따라…

주로 DNA 전기영동에 이용

Gel 종류 : agarose

주로 단백질 (or DNA) 전기영동에 이용

종류 : polyacrylamide

(acrylamide+bis-acrylamide)

우뭇가사리 아가로스의 원료

수평형 전기영동장치 (1)Power supplier

(-)

(+)

수평형 전기영동장치 (2)

Gel 을 만들기 위한 agarose 의 정량

가열하여 녹인 후 틀에 붓는다

Comb

Gel

수평형 전기영동에는 아가로스 gel이 이용된다.

최대 10bp～50kb의 DNA 단편 분석

전기영동에 이용되는 Agarose gel의 전자현미경 사진

Agarose의 pore

Gel이 굳은 후 전기영동장치에 안착한 모습

Well (홈) : Comb이 끼워졌던 자리

Well

DNA 를 gel 에 loading 시 파란색의 dye(염색시약)을 함께 넣는데 이는 전기영동시 DNA의 이동을 육안으로 관찰하고자 함이다.

DNA 희석 과정/TE buffer

DNA 농도 : 50-100ng/ul (PCR) – PCR 증폭에 의한 DNA의 양 증가500ng(0.5ug)-1,000ng(1ug)/ul (RFLP) – 제한효소에 의한 DNA

절단 (DNA 양 증가 없음)

(-)(-) (+)

(-)