分解シグナルをつけてバックグ

ラウンドを下げた細胞小器官観

察用の蛍光タンパク質

岡山大学 異分野融合先端研究コア准教授 守屋央朗

緑色蛍光タンパク質（GFP）

下村 脩

Green Fluorescent Protein : GFP

GFPの三次構造（タンパク質の立体構造）

GFPは生物学に革命をもたらした

真核細胞の内部には細胞小器官がある

蛍光タンパク質による観察は、一般的にどのように改善されるか？

• 顕微鏡の性能を上げる（一般的に高価）

– 光源の強度を上げる → 細胞へのダメージ

– カメラの感度を上げる

– 露光時間を長くする → 解像度が下がる

• 蛍光タンパク質の性能を上げる

– → 飛躍的な性能向上は望めない

蛍光タンパク質の改善は、大したことない

PYK1 promoter PYK1 terminatorATG STOP

GFP*

蛍光緑に見えるコロニー

細胞のキャパシティの限界までGFPを発現させる

*yEGFP3: Cormack et al., 1997

30-1-100

Kintaka et al. Sci. Rep. 2016

CC: 細胞膜局在GFP

GFP

Cyt: 細胞質GFP

GFPMTS

MTS: ミトコンドリア輸送GFP

GFP

SS: 小胞輸送GFP

SS

GFP

NLS: 核輸送GFP

NLS

GFP CC

GFP

NES: 核外輸送GFP

NES

局在化 (輸送) キャパシティの限界までGFPを発現する

Kintaka et al. Sci. Rep. 2016

CC: 細胞膜局在GFP

GFP

Cyt: 細胞質GFP

GFPMTS

MTS: ミトコンドリア輸送GFP

GFP

SS: 小胞輸送GFP

SS

GFP

NLS: 核輸送GFP

NLS

GFP CC

GFP

NES: 核外輸送GFP

NES

局在化 (輸送) キャパシティの限界までGFPを発現する

Kintaka et al. Sci. Rep. 2016

14.7 4.1 1.0 16.1 0.7 %

2,000,000 m/c 350,000 m/c

Total proteome = 50,000,000 molecules/cell

5500-5-100*1900-5-255

Mitochondria (Om45-GFP)

ER(Spf1-GFP) 6,901 m/c4,289 m/c

いわゆる局在マーカーは、暗い

2,000,000 / 4289 = 466 fold 350,000 / 6901 = 50 fold

キャパシティの限界まで発現したら？

Exposure time (msec) – Gain - Sensitivity

100-1-100 500-1-100

MTSAdh3

-GFP

Om45-GFP

500-1-100 1900-5-255

キャパシティの限界近くまで発現させると、明るい（肉眼でもよく見える）

Exposure time (msec) – Gain - Sensitivity

RpsL 1 MATVNQLVR---KPRARKVAKSNVPALEACP 28AT+NQ+ R PR +K+ S P L+ CP

Mrps12 1 MLSRFMSNTWCTPLRQAQRLFSSTTTMQATATLNQIKRGSGPPRRKKI--STAPQLDQCP 58

RpsL 29 QKRGVCTRVYTTTPKKPNSALRKVCRVRLTNGFEVTSYIGGEGHNLQEHSVILIRGGRVK 89 Q++GV RV PKKPNSA RK CRVRLTNG V++YI GEGH+ QEHS++ +RGGR +

Mrps12 59 QRKGVVLRVMVLKPKKPNSAQRKACRVRLTNGNVVSAYIPGEGHDAQEHSIVYVRGGRCQ 119

RpsL 90 DLPGVRYHTVRGALDCSGVKDRKQARSKYGVKRPKA* 126DLPGV+YH +RGA D SGV +R +RSKYG K+P

Mrps12 120 DLPGVKYHVIRGAGDLSGVVNRISSRSKYGAKKPSKS* 157

MitoFatesによる予測

ミトコンドリアリボソームタンパク質Mrps12のミトコンドリア局在化

シグナル（MTSMrps12）

Mrps12とRpsL (大腸菌) のアラインメント

MaturedPrecursor

MTS-GFP

GFPMitochondria

(Mitotracker Red CMXRos)

GFP

Bright field

MTS-GFP

GFP

MTSMrps12-GFPの大量発現はミトコンドリアに障害を起こす

Kintaka et al. Sci. Rep. 2016

SS-GFPの大量発現は小胞輸送に障害を起こす

GFP

SS-moxGFP

GFPER

(mRFP-Sec12)

STE24 Vector

GFP

moxGFPSS-GFP

SS-moxGFP

ste24Δ Vector

GFP

moxGFPSS-GFP

SS-moxGFP

Signal-GFP

1. クロギングした分子

2. 毒性のあるプレカーサー

オルガネラ

細胞質

Signal-GFP-Deg プロテアソーム依存的な分解

オルガネラ

細胞質

細胞質のプリカーサーをcODC1デグロンにより特異的に分解する

cODC1デグロン (Deg)Jungbluth et al. 2010

-LPMSCAQESITSLYKKAGSENLYFQ*Degron Linker TEV site

• マウス・オルニチンカルボキシラーゼ (ODC)のC

末にあるデグロン

• プロテアソームに直接認識される

MTSMrps12

-GFP

GFP Mitochondria(Mitotracker Red CMXRos)

MTSMrps12-GFP-Deg

10 µm

Bright field

Degの付加により、MTSMrps12-GFPのミトコンドリア局在が観察できた

Kintaka et al. Sci. Rep. 2016

MTS-GFP

Degによりミトコンドリア局在化観察が改善された

MTSMdh1

MTSMmf1

MTSMdh1-Deg

MTSMmf1-DegMTS-GFP-deg細胞質でのバックグランドを下げ毒性を減らす

Unpublished

PPYK1 MTSMrps12-GFP PPYK1 MTSMrps12-GFP-Deg PPYK1-500 MTSMrps12-GFP

1000-3-100 1000-3-100* 5000-5-100

PPYK1 GFP PPYK1-500 GFP-Deg

30-1-100 1000-2-100

発現量を下げただけでは局在が改善しない場合もある

Unpublished

260 msec – 25% 260 msec – 25%

SS-moxGFP SS-moxGFP-Deg

デグロンの付加によりSS-GFPの局在化が改善された

Unpublished

→ デグロンの付加により、分泌性タンパク質の生産が向上するかもしれない

500-1-100*

SS-moxGFP-HDEL SS-moxGFP-Deg-HDEL

1000-1-100*

デグロンの付加により小胞体観察が改善された

...LYKLPMSCAQESITSLYKKAGSHDEL*

Unpublished

500-1-100100-1-100

ペルオキシソームへの局在化も改良する

GFP-ePTS1 GFP-Deg-ePTS1

...LYKLPMSCAQESITSLYLGRGRRSKL*ePTS1 (peroxisome localization signal) ; DeLoache et al., 2016

Unpublished

作成した蛍光タンパク質 (ベクター)

• 細胞質・ミトコンドリア・ペルオキシソーム・輸送小胞・小胞体

• GFP (moxGFP)・ｍRuby3

• 多コピー (pTOW40836)・シングルコピー (pRS413)

• 高い分解能を求めている場合

• 長時間の観察を行いたい場合

• 局在化シグナルの活性を知りたい場合

• あまりいい蛍光顕微鏡システムを持っていない場合

• 教育現場

利用が想定される状況

今後の研究方針

• 酵母以外の細胞、特に哺乳類細胞でも使用可能かを調査

• 局在化シグナルや蛍光タンパク質のさらなる改善

• 蛍光タンパク質以外のタンパク質の局在が改善されるかを調査

企業との連携の実績

• 今のところありません

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：細胞小器官局在性融合タンパク質

• 出願番号 ：特願2016-106328

• 出願人 ：岡山大学

• 発明者 ：守屋央朗

お問い合わせ先

岡山大学

異分野融合先端研究コア

守屋 央朗

ＴＥＬ 086－251 － 8712

ＦＡＸ 086－251 － 8717

e-mail hisaom＠cc.okayama-u.ac.jp